KR101364704B1 - 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법 - Google Patents

골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

골재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법이 개시되어 있다. 본 발명은, 젤라틴을 증류수에 용해시켜 젤라틴 용액을 준비하는 단계; 펙틴 용액을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 혼합슬러리를 제조하는 단계; 상기 혼합슬러리를 교반하는 단계; 교반된 혼합슬러리를 몰드에 주입하는 단계; 상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 냉동시킨 후 -70℃에서 동결 건조시키는 단계; 및 건조된 상기 혼합슬러리를 가교 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하여, 우수한 생체적합성과 생분해성을 가진 생체모방성 지지체를 획득할 수 있다.

Description

골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법{METHOD OF POROUS HYDROGEL SCAFFOLD FOR OSTEANAGENESIS}
본 발명은 골재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 젤라틴-펙틴 하이드로젤과 이상인산칼슘(BCP)을 이용하여 생체적합성이 우수하고, 생분해성과 생체모방성 미세환경을 가지며, 골재생 공학에 응용가능한 새로운 구조를 갖는 골재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법에 관한 것이다.
하이드로젤은 고분자로 이루어진 3D 네트워크 형태로 많은 양의 수분을 흡수하고 있다. 이러한 하이드로젤은 높은 수분 흡수량과 우수한 생분해성, 약물과 영양분의 저장 공간 확보 및 세포의 부동화, 세포의 부착 및 조직의 생성을 증진시키기 위해 적합한 기계적 강도, 우수한 생체적합성을 가지고 있다. 그리고, 독성이 없어 동물 실험에도 수행되고 있으며 세포 배양을 위한 영양분 및 세포의 대사산물의 확산을 위한 미세환경을 생성하는 등의 특성으로 최근까지 조직 공학 분야에서 널리 사용되고 있다.
또한, 하이드로젤을 제조하기 위하여 온도 감응성 고분자를 사용하며 물리적 또는 화학적 가교를 기초로 하는 다양한 방법이 있으며, 최근에는 조직의 상호작용을 증진시키기 위한 목적으로 고분자와 세라믹을 혼합하여 개발하는 방법이 적용되고 있다.
이상인산칼슘(BCP: biphasic calcium phosphate) 세라믹은 수산화인회석(Hydroxyapatite(HAp))와 인산삼칼슘(Tricalcium Phosphate(TCP))가 혼합된 물질로서 분해성이 조절 가능하며 우수한 생물학적 특성으로 이상적인 치과 임플란트 및 본 필러(bone filler) 등 정형외과용 골 충진제로 적용되고 있다.
젤라틴(Gelatin: GE)은 가수분해에 의하여 콜라겐의 3층 나선구조를 파괴하여 얻어지며, 세포의 부착 및 이동, 분화 및 증식을 증진시키는 특성을 가진다.
펙틴(Pectin: P)은 대부분 일차 식물의 세포벽에서 다량으로 발견되며 거대분자량을 가져 지지체를 코팅할 수 있어 세포 실험 및 동물 실험에 적합한 특성을 가진다.
생체재료로 사용되는 천연 고분자로 콜라겐, 젤라틴, 산화 알긴산염(oxidized alginate), 황산콘드로이틴(chondroitin sulphate), 키토산(chitosan), 피브린(fibrin)과 히알루론산(hyaluronic acid) 등이 있다.
콜라겐은 세포외기질(ECM)에 적용되는 생체재료로 널리 사용되고 있으나, 여전히 몇몇 연구에서 면역반응을 일으키는 것으로 보고된 바 있어, 본 발명에서는 젤라틴(GE)을 사용하였다.
하이드로젤을 가교하는 방법으로 물리적 방법과 화학적 방법이 있는데, 물리적 방법을 사용하게 되면 하이드로젤 지지체의 약한 기계적 강도를 개선하지 못하는 한계점과 pH 및 온도, 이온강도 등의 외부 환경에 의한 많은 물성 변화가 야기되므로 이를 해결하기 위하여 화학적 가교방법을 사용하였다.
본 발명의 목적은 상기의 문제점들을 해결하기 위하여 이루어진 것으로 골 재생 공학에 적용하기 위해 젤라틴과 펙틴이 혼합된 다공성 하이드로젤에 이상인산칼슘 입자를 로딩하여 우수한 생체적합성과 생분해성을 가진 생체모방성 지지체를 획득할 수 있도록 한 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법은,
젤라틴을 증류수에 용해시켜 젤라틴 용액을 준비하는 단계; 펙틴 용액을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 혼합슬러리를 제조하는 단계; 상기 혼합슬러리를 교반하는 단계; 교반된 혼합슬러리를 몰드에 주입하는 단계; 상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 냉동시킨 후 -70℃에서 동결 건조시키는 단계; 및 건조된 상기 혼합슬러리를 가교 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 혼합슬러리를 제조하는 단계에, 이상인산칼슘(BCP)을 상기 혼합슬러리에 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.

상기 가교 반응 단계는, 80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)를 용해시켜 혼합용액을 준비하는 단계; 상기 혼합용액을 사용하여 상기 혼합슬러리를 가교반응시키는 단계; 및 가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
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상기 젤라틴(GE)용액과 펙틴(P)용액의 혼합비율은 80:20인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 골재생 공학에 적용하기 위한 새로운 구조를 갖는 지지체로서 우수한 생체적합성과 생분해성을 가진 생체모방성 지지체를 얻을 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 이상인산칼슘(BCP)입자가 젤라틴-펙틴(GE-P) 하이드로젤에 분산되어 있는 구조로서 완벽하게 상호 연결된 삼차원적 기공을 생성함으로써 세포의 증식율을 획기적으로 증대시키는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 GE-P, GE-P-B-5, GE-P-B-10의 주사전자현미경 사진으로서, (a)는 GE-P, (b)는 GE-P-B-5, (c)는GE-P-B-10의 사진이고, (d),(e),(f)는 각각 (a), (b), (c)의 확대사진이다.
도 2는 하이드로젤 지지체의 세포증식 정도를 MTT분석법으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 (a, d) GE-P, (b, e) GE-P-B-5, (c, f) GE-P-B-10에 전조골세포 MC3T3-E1를 1, 3일 동안 배양한 후의 증식율을 나타낸 주사현미경 이미지이다.
도 4는 (a1-a3) GE-P (b1-b3) GE-P-B-5, (c1-c3) GE-P-B-10에 전조골세포 MC3T3-E1 전조골세포를 1, 3일 동안 배양한 후의 증식 정도를 공초점 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 5는 GE-P, GE-P-BCP-5와 GE-P-B-10에 MC3T3-E1 전조골세포를 3, 7일 동안 배양한 후 collagen Type I (Col-I)과 osteopontin의 발현 정도를 면역학적 블로팅 방법으로 관찰한 이미지이다.
도 6은 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체를 이식한 대퇴부를 적출한 뒤, Micro-CT를 사용하여 분석한 이미지이다.
도 7은 GE-P과 GE-P-B-10 하이드로젤을 2개월 동안 이식 후, 조직염색을 수행하여 관찰한 이미지이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
다공성 젤라틴-펙틴( GE -P) 하이드로젤 지지체의 제조방법
젤라틴을 증류수에 용해시켜 젤라틴 용액을 준비하고, 펙틴용액을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 혼합슬러리를 제조한다. 이때, 젤라틴(GE)용액과 펙틴(P)용액의 혼합비율은 80:20인 것이 바람직하다.
상기 혼합슬러리는 30℃에서 2시간 동안 교반된 후에, 폴리에틸렌 몰드에 주입된다.
그 후에, 다공성 구조의 지지체를 만들기 위하여 상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 2시간 동안 냉동시킨 후 -70℃에서 밤새 동결 건조시킨다.
동결 건조 후, 80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)을 용해시킨 뒤, 이 용액을 사용하여 4℃에서 밤새도록 상기 젤라틴-펙틴(GE-P) 하이드로젤 지지체를 가교반응시켰다.
또한, 가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 2시간 동안 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시켰다.
상기 가교 단계는 지지체의 세포실험 평가를 수행할 시, 지지체의 안정성을 유지하기 위하여 2번 반복할 수도 있다.
이와 같은 제조방법을 통해서, 본 발명에 따른 다공성의 젤라틴-펙틴 하이드로젤(GE-P) 지지체가 얻어진다.
다공성 젤라틴-펙틴-5% BCP ( GE -P-B-5) 하이드로젤 지지체의 제조방법
젤라틴을 증류수에 용해시켜 젤라틴 용액을 준비하고, 펙틴용액을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 슬러리를 제조한 후에, 그 슬러리에 이상인산칼슘(BCP) 5w/v% 수용액을 투입하여 혼합슬러리를 제조한다. 이때, 젤라틴(GE)용액과 펙틴(P)용액의 혼합비율은 80:20인 것이 바람직하다. 상기 5w/v% 이상인산칼슘(BCP)는 상기 젤라틴-펙틴 혼합용액에 대한 BCP의 중량을 나타낸 것이다.
상기 혼합슬러리는 30℃에서 2시간 동안 교반된 후에, 폴리에틸렌 몰드에 주입된다.
그 후에, 다공성 구조의 지지체를 만들기 위하여 상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 2시간 동안 냉동시킨 후 -70℃에서 밤새 동결 건조시킨다.
동결 건조 후, 80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)을 용해시킨 뒤, 이 용액을 사용하여 4℃에서 밤새도록 상기 GE-P-B-5 하이드로젤 지지체를 가교반응시켰다.
또한, 가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 2시간 동안 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시켰다.
상기 가교 단계는 지지체의 세포실험 평가를 수행할 시, 지지체의 안정성을 유지하기 위하여 2번 반복할 수도 있다.
이와 같은 제조방법을 통해서, 본 발명에 따른 5w/v% BCP가 로딩된 다공성의 젤라틴-펙틴 하이드로젤(GE-P-B-5) 지지체가 얻어진다.
다공성 젤라틴-펙틴-10% BCP ( GE -P-B-10) 하이드로젤 지지체의 제조방법
젤라틴을 증류수에 용해시켜 젤라틴 용액을 준비하고, 펙틴용액을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 슬러리를 제조한 후에, 그 슬러리에 이상인산칼슘(BCP) 10w/v% 수용액을 투입하여 혼합슬러리를 제조한다. 이때, 젤라틴(GE)용액과 펙틴(P)용액의 혼합비율은 80:20인 것이 바람직하다. 상기 10w/v% 이상인산칼슘(BCP)는 상기 젤라틴-펙틴 혼합용액에 대한 BCP의 중량을 나타낸 것이다.
상기 혼합슬러리는 30℃에서 2시간 동안 교반된 후에, 폴리에틸렌 몰드에 주입된다.
그 후에, 다공성 구조의 지지체를 만들기 위하여 상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 2시간 동안 냉동시킨 후 -70℃에서 밤새 동결 건조시킨다.
동결 건조 후, 80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)을 용해시킨 뒤, 이 용액을 사용하여 4℃에서 밤새도록 상기 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체를 가교반응시켰다.
또한, 가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 2시간 동안 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시켰다.
상기 가교 단계는 지지체의 세포실험 평가를 수행할 시, 지지체의 안정성을 유지하기 위하여 2번 반복할 수도 있다.
이와 같은 제조방법을 통해서, 본 발명에 따른 10w/v% BCP가 로딩된 다공성의 젤라틴-펙틴 하이드로젤(GE-P-B-10) 지지체가 얻어진다.
상기와 같이 제조된 다공성 하이드로젤 지지체의 생체적합성 평가를 위하여, 10%의 우태혈청과 1%의 항생제가 함유된 MEM배지에 배양한 MC3T3-E1 전조골세포를 사용하여 MTT분석법을 수행하여 세포의 증식율을 관찰하였으며, 주사전자현미경과 공초점현미경을 사용하여 지지체에 배양된 세포의 부착능 및 증식율을 관찰하였다.
또한, 생물학적 안전성을 평가하기 위하여 토끼의 대퇴부에 결손 부위를 만들어 직경이 3mm이고 길이가 5mm인 원통형의 GE-P 지지체와 GE-P-B-10 지지체를 이식하였다. 이식 2개월 후, 지지체가 이식된 대퇴부를 적출하여 H&E 조직 염색을 수행하여 염증반응 및 이식 부위의 새로운 골 생성을 관찰하였다.
이와 같은 결과의 그래프나 사진들이 도면에 도시되어 있다.
도 1은 주사현미경으로 관찰한 다공성 GE-P, GE-P-5 GE-P-10 하이드로젤 지지체의 형태를 나타낸 것으로, (a),(b),(c)는 각각 GE-P, GE-P-5 GE-P-10를 관찰한 사진이고, (d),(e),(f)는 각각 (a),(b),(c)를 확대한 사진이다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 하이드로젤 지지체는 높은 다공성을 가지고 각각의 기공이 서로 연결된 삼차원적 구조를 가지며, (e)와 (f)사진에서도 알 수 있듯이 BCP 입자는 다공성 GE-P 하이드로젤 지지체에 전체적으로 잘 분산되어 있다.
도 2는 MTT 분석법을 이용하여 다공성 하이드로젤 지지체에 배양된 세포의 증식율을 측정한 결과로 다공성 하이드로젤 지지체에 MC3T3-E1 전조골세포를 1일, 3일, 7일 동안 배양하였다. 배양 1일 후에는 모든 하이드로젤 지지체에 배양된 세포의 수가 처음 배양한 세포의 수(104 cells/well)보다 증가한 것을 확인할 수 있으며, GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에서 7일 동안 배양된 세포의 증식율이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과로 MC3T3-E1 전조골세포는 GE-P, GE-P-B-5와 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에서 지속적으로 증식함을 확인할 수 있다.
도 3은 GE-P, GE-P-B-5와 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에 각각 1일(사진 a, b, c), 3일(사진 d, e, f) 동안 배양한 세포의 증식율을 주사현미경으로 관찰한 결과로, 하이드로젤 지지체 표면에 증식하고 확산된 조골세포의 형태를 관찰할 수 있다. 또한, GE-P 지지체 보다는 GE-P-B-5 지지체에서, GE-P-B-5 지지체 보다는 GE-P-B-10 지지체에서 세포의 증식율이 우수함을 알 수 있다.
도 4는 GE-P, GE-P-B-5와 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에 세포를 배양 한 후, 공초점 현미경으로 관찰한 결과이며, 사진(a1, b1, c1)은 1일 배양한 후 관찰한 것이고, 사진(a2, b2, c2)은 3일 배양한 후 관찰한 것이고, 사진(a3, b3, c3)은 7일 배양한 후 관찰한 것이다. 이 사진을 보면, 세포를 배양한 기간이 증가할수록 세포의 증식율이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이 결과로 기공의 사이즈와 표면 형태가 세포 증식과 확산에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있다. 즉, 기공의 사이즈가 작은 것이 많거나 표면에 BCP 나노입자가 많은 지지체일수록 세포 증식이 잘 된다는 것을 알 수 있다.
사진에서 주황색 점으로 표시되고 있는 것들은 세포핵이고, 초록색부분은 세포 F-actin인데 배약기간이 길수록 그리고, BCP 나노입자가 많이 함유될 수록 그 확산정도가 큰 것을 알 수 있다.
도 5는 면역학적 블로팅 분석 결과로 모든 하이드로젤 지지체에 배양된 MC3T3-E1 전조골세포에서 Col-I 과 osteopontin이 발현된 것을 보여주지만, 발현 정도는 지지체의 종류와 배양 시간에 따라 다르게 나타났다.
세포 배양 3일 후, GE-P-B-10 하이드로젤 지지체에서의 발현 정도는 GE-P와 GE-P-B-5에 비해 높은 것을 관찰할 수 있다. 또한, 배양 7일 후의 Col-I의 발현 정도는 배양 3일 후의 하이드로젤 지지체보다 높았지만, 하이드로젤의 종류에 따른 차이는 크지 않은 것을 확인할 수 있다.
그러나 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체의 경우, osteopontin 발현 정도가 다른 하이드로젤 지지체보다 우수한 것을 확인할 수 있다.
이러한 결과로 MC3T3-E1의 생존율 및 증식율이 Col-I 과 osteopontin 합성에 영향을 준다는 것을 알 수 있다.
Collagen은 ECM에서 조골세포의 형질에 의해 합성되는 필수적인 골 형성 단백질이며, 골 단백질의 90% 이상을 차지하는 Col-I은 골 기질의 템플릿으로 쓰이고, 핵 형성을 조절한다.
Osteogenesis Imperfect (OI)와 같은 불완전한 콜라겐 발현은 골격계에 직접적으로 영향을 주는 Col-I 사슬의 변이에 의해 나타나며, osteogenesis와 조골세포 확산의 초기단계에 나타난다.
다른 몇몇 연구에서 Col-I 은 골 세포 형질 발현에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있으며, 본 발명에서는 하이드로젤 지지체에 배양된 MC3T3-E1 세포에서 collagen과 osteopopin 발현을 Col-I 과 osteopontin 항체를 이용한 면역학적 블로팅 방법으로 분석하였다.
도 6는 GE-P와 GE-P-B-10 하이드로젤 지지체를 토끼의 대퇴부에 2개월 동안 이식한 사진과 직경 3 mm, 길이 5 mm의 원형 하이드로젤 지지체의 생분해성을 확인하기 위하여 Micro-CT로 관찰한 결과이다. 두번째 사진에서 흰색으로 나타나는 부분이 본 발명에 따른 하이드로젤 지지체이다.
도 7을 통해 천연골 생성 및 천연골과 하이드로젤 지지체 표면의 접촉면을 확인할 수 있다. 조직염색을 통해 GE-P-B-10 지지체의 기공과 내부에서 천연골이 생성된 것을 관찰할 수 있다. 서로 연결된 기공과 하이드로젤 지지체 경계에서 생성된 천연골의 생성 정도는 하이드로젤 지지체 종류마다 큰 차이가 있으며, 천연골과 하이드로젤 지지체 사이의 경계가 모호한 것은 염증반응이 없고, 천연골을 포함한 하이드로젤 지지체가 매우 조밀하다는 것을 보여준다.

Claims (5)

  1. 젤라틴을 증류수에 용해시켜 젤라틴 용액을 준비하는 단계;
    펙틴 용액을 상기 젤라틴 용액에 혼합하여 혼합슬러리를 제조하는 단계;
    상기 혼합슬러리를 교반하는 단계;
    교반된 혼합슬러리를 몰드에 주입하는 단계;
    상기 혼합슬러리가 주입된 폴리에틸렌 몰드를 -80℃에서 냉동시킨 후 -70℃에서 동결 건조시키는 단계; 및
    건조된 상기 혼합슬러리를 가교 반응시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 혼합슬러리를 제조하는 단계에,
    이상인산칼슘(BCP)을 상기 혼합슬러리에 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 가교 반응 단계는,
    80% 에탄올에 EDAC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 NHS(N-Hydroxyl succinimide)를 용해시켜 혼합용액을 준비하는 단계;
    상기 혼합용액을 사용하여 상기 혼합슬러리를 가교반응시키는 단계; 및
    가교된 지지체로부터 가교제를 제거하기 위하여 증류수로 초음파 세척한 후에, -20℃에서 냉동하고, -70℃에서 동결 건조시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 젤라틴(GE)용액과 펙틴(P)용액의 혼합비율은 80:20인 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 다공성 하이드로젤 지지체의 제조방법.
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