KR20100041237A - 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조 방법 및 이를 이용한 기능성 골이식재의 제조방법 - Google Patents

다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조 방법 및 이를 이용한 기능성 골이식재의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조 방법 및 이를 이용한 기능성 골이식재의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법은 기공 전구체, 분산매, 유기용매를 사용하지 않고, 칼날을 가진 믹서를 회전시키면서 인산삼칼슘계 슬러리에 인산삼칼슘계 분말을 첨가하는 단계를 반복하여 인산삼칼슘계 과립을 형성시키고, 인산삼칼슘계 과립의 크기를 조절하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명에 따른 기능성 골이식재의 제조방법은 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 골형성 단백질 용액에 침지하여 골형성 단백질을 다공성 인산삼칼슘계 과립의 기공에 결합시키고 이를 동결건조시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법은 공정이 간편하고 인체에 무해한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 생성시킬 수 있으며, 제조 공정 내(in-situ)에서 다공성 인산삼칼슘계 과립의 크기를 용이하게 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 골이식재 제조방법은 골형성 단백질의 손상을 최소화시키고, 특히, 동결건조에 의해 수분을 완전히 제거함으로써 수분에 의한 단백질 불활성 가능성을 줄이고, 세균의 번식을 억제할 수 있다.
인산삼칼슘계 과립, 다공성, 골이식재, 동결건조, 골형성 단백질, BMP-2

Description

다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조 방법 및 이를 이용한 기능성 골이식재의 제조방법{Preparation method of porous Tricalcium phosphate-based granules and preparation method of functional bone graft}
본 발명은 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조 방법 및 이를 이용한 기능성 골이식재의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인산삼칼슘계 슬러리에 첨가하는 인산삼칼슘계 분말에 의해 인산삼칼슘계 과립을 형성시키고, 인산삼칼슘계 과립의 크기를 조절하는 것을 특징으로 하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조 방법과 골형성 단백질을 다공성 인산삼칼슘계 과립의 기공에 결합시키고 동결건조를 이용하여 건조하는 것을 특징으로 하는 기능성 골이식재의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 외상, 종양, 기형 혹은 생리학적 현상 등에 의해 뼈조직이 손상된 경우, 그 부위에 골을 채워서 신생골을 생성시킨다. 골 결손부의 회복을 위한 가장 보편적인 방법은 다른 부위의 자신의 골을 일부 채취하여 이식하는 자가 이식방법(autograft), 다른 사람의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 동종 이식방법(allograft), 동물의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 이종 이식방법(xenograft) 등이 있다. 일반적으로 가장 좋은 이식 방법인 자가 이식방법은 이차적인 수술이 필 요하고 그에 따른 감염 및 혈액 손실의 위험을 증가시키고, 필요한 만큼의 양을 얻기가 힘들다는 단점이 있다. 동종 이식방법은 질환 전달 및 면역반응이 일어날 수 있는 위험이 있다. 이종 이식방법 역시 면역반응이 일어날 수 있고 확률은 낮지만 광우병 등의 문제가 발생할 수 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 충분한 양의 골을 쉽게 얻을 수 있으며, 질병에 대한 전염 가능성이 없고, 기존 이식재를 대체할만한 성능을 갖는 생체친화성이 우수하고 이식시 적절히 흡수되어 재생골로 치환될 수 있는 생분해성 골이식재가 요구되고 있다.
대표적인 인공골 물질로 수산화아파타이트(Hydroxyapatite, HA), 인산삼칼슘(Tricalcium phosphate, TCP) 등의 인산칼슘계 세라믹, 바이오글래스(Bioglass), 칼슘카보네이트(calcium carbonate) 등이 있다. 이 중 인산칼슘계 세라믹인 수산화아파타이트와 인산삼칼슘(TCP)은 대표적인 생체재료이고, 인공골의 원료로서 각광받고 있다.
수산화아파타이트는 실제 뼈를 구성하는 무기성분과 결정학적, 화학적으로유사하고 뼈와 직접 결합하는 특성이 있으나, 생체 내 낮은 용해성으로 인하여 계면에서 결합한 뼈가 더 이상 안으로 자라 들어가지 못해 완전히 뼈로 치환되지 못하고 끝까지 남아있는 단점이 있다. 인산삼칼슘은 뼈와 직접 결합한다는 특성은 수산화아파타이트와 비슷하지만 생체 내에서 점점 용해되어 결국 없어지는 특성을 지니고 있다. 골수 복재용 인산삼칼슘은 치밀한 벌크 형태로 이용되기도 하고 다공성 구조나 과립의 형태로 이용되기도 하는데, 다공성 구조의 인산삼칼슘 과립을 인공골로 이용하기 위해서는 충분한 강도를 유지해야 한다.
한편, 인산삼칼슘은 동질이형이 없는 수산화아파타이트와는 달리 크게 β상과 α상의 동질이형을 갖는데, β상은 저온상으로 육방정계결정을 갖고, 일반적으로 이 저온상 β상을 1180℃ 초과의 온도에서 열처리하면 단사정계를 갖는 고온상α상으로 상전이 한다. 이 고온형 α상은 물과 격렬히 반응하기 때문에 생체 이식체로 쓰기에는 부적합하다. 또한, 밀도가 높은 β상에서 밀도가 낮은α상으로의 상전이는 소결체의 미세한 균열을 유발하여 전체적인 재료의 강도저하를 초래한다. 상기의 이유로 인공골 재료로는β상의 인산삼칼슘이 선호되고 있으며, 생체 흡수성이 뛰어난 인산삼칼슘의 β상을 생체 재료로 응용하기 위해서는 고밀도의 소결체를 얻는 것이 필수적이다.
다공성 구조의 인산삼칼슘 과립을 제조하는 종래의 방법을 살펴보면, 대한민국등록특허공보 제10-0807108호에는 물에 젤라틴 분말을 혼합하여 젤라틴 용액을 준비하는 단계; 인산삼칼슘 전구체 분말과 기공 전구체를 혼합한 후, 상기 젤라틴 용액을 첨가하여 인산삼칼슘 슬러리를 준비하는 단계; 상기 혼합된 인산삼칼슘 슬러리를 교반중인 분산매에 첨가하여 구형의 과립을 형성하여 겔화시키는 단계; 상기 겔화된 구형의 과립 표면을 유기용매로 분리, 세척하는 단계; 및 상기 구형 과립을 하소 및 소결하여 인산삼칼슘 이외의 첨가물을 제거하는 단계를 포함하는 다공성의 β-인산삼칼슘 과립의 제조 방법이 기재되어 있으나, 기공 전구체로서 중공구형 고분자, 나프탈렌, 전분등의 기공 전구체를 필요로 하고, 미네랄 오일, 또는 일반 식용유인 분산매로부터 겔화된 구형의 과립을 분리, 세척하기 위하여 클로로포름, 아세톤 등의 유기용매를 사용하기 때문에 하소 및 소결 과정에서의 온도 프 로파일이 복잡하고, 유기용매가 완전히 제거되지 않는 경우 인체에 대한 감작성 내지 독성을 가질 수 있는 문제점이 있다.
또한, 미국등록특허공보 제5,017,5181호에는 다공성의 β-인산삼칼슘 과립의 제조 방법으로 대한민국등록특허공보 제10-0807108호와 유사한 방법 또는 다른 방법으로 인산삼칼슘과 기공 전구체의 혼합물을 가압 회전 타정 기계를 사용하여 덩어리 상태(slug)로 만들고 하소 및 소결하는 방법이 기재되어 있으나, 여전히 기공 전구체를 필요로 하고, 타정하는 경우 과립의 크기를 조절하기 위하여 미리 크기가 조절된 타정 금형을 이용하여야 하므로 다공성 인산삼칼슘 과립 제조 공정 내에서 과립의 크기를 조절하기 힘들다는 문제점이 있다.
한편 골형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein, BMP)은 뼈와 연골의 생성을 유도할 수 있는 성장 인자로서, 골 손실 부위의 신생골 성장을 유도하기 위하여 주로 BMP-2, 또는 BMP-7가 이용된다. 이러한 골형성 단백질은 단독으로 사용되지 않고 주로 매질과 혼합되거나 담체에 결합되어 사용되는데, 담체로는 젤라틴, 수산화아파타이트, 인산삼칼슘 등이 있다.
BMP를 담체에 결합시키는 방법으로 BMP 완충액을 스프레이 분사에 의해 담체 표면에 코팅하는 방법이 있으나, BMP가 주로 담체의 표면에 코팅되어 안정성이 떨어지는 문제점이 있다. 또한, 대한민국공개특허공보 특2000-0052723호에는 BMP 완충액을 담체에 침지시켜 주입시키는 방법이 기재되어 있으나, 건조과정이 기재되어 있지 않고, 고온으로 건조하는 경우 BMP가 열에 의해 변성될 우려가 있고, 상온에서 건조할 경우 시간이 너무 오래 걸리고, 수분을 완전히 제거하지 못하는 경우 세 균 번식 등의 문제가 발생할 수 있다.
본 발명은 상기 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 기공 전구체, 분산매, 유기용매를 사용하지 않아 인체에 무해한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 생성시킬 수 있고, 공정이 간편하며, 제조 공정 내에서 과립의 크기를 쉽게 조절할 수 있는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 골형성 단백질의 손상을 최소화시키면서 담체인 다공성 인산삼칼슘계 과립에 안정적으로 결합시킬 수 있는 기능성 골이식재의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 상기 목적은
(a) 칼날을 가진 믹서에 인산삼칼슘계 분말 및 젤라틴 용액을 첨가하고 교반시켜 인산삼칼슘계 슬러리를 준비하는 단계; (b) 상기 칼날을 가진 믹서를 회전시키면서 인산삼칼슘계 슬러리에 인산삼칼슘계 분말을 첨가하는 단계; (c) (b) 단계를 반복하여 인산삼칼슘계 과립을 형성시키고, 인산삼칼슘계 분말의 첨가량 또는 첨가 회수에 의해 인산삼칼슘계 과립의 크기를 조절하는 단계; (d) 체(sieve)를 이용하여 인산삼칼슘계 과립과 과립을 형성하지 않은 인산삼칼슘계 분말을 분리하는 단계; (e) 분리된 인산삼칼슘계 과립을 건조하는 단계; 및 (f) 건조된 인산삼칼슘계 과립을 600~1000℃의 온도로 소결하여 젤라틴을 제거하고 인산삼칼슘계 과립에 기공을 형성시키는 단계;를 포함하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법을 제공 함으로써 달성될 수 있다. 여기서, 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법은 바람직하게는 (g) 소결된 인산삼칼슘계 과립을 증류수에 첨가하고 초음파로 세척하는 단계; 및 (h) 초음파로 세척된 인산삼칼슘계 과립을 건조하는 단계;를 더 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 (f) 단계와 (g) 단계 사이에 체(sieve)를 이용하여 소결된 인산삼칼슘계 과립을 크기별로 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 상기 목적은 본 발명의 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 골형성 단백질 용액에 침지하여 골형성 단백질을 다공성 인산삼칼슘계 과립의 기공에 결합시키는 단계; 및 상기 다공성 인산삼칼슘계 과립이 골형성 단백질 용액에 침지된 것을 동결건조하는 단계;를 포함하는 골이식재의 제조방법을 제공함으로써 달성될 수 있다. 여기서, 골형성 단백질은 바람직하게는 BMP-2인 것을 특징으로 하며, 더 바람직하게는 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2)인 것을 특징으로 한다. 또한, 재조합 인간 BMP-2와 다공성 인산삼칼슘계 과립의 중량비는 1:500~1:2000인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법은 기공 전구체, 분산매, 유기용매를 사용하지 않아 공정이 간편하고 인체에 무해한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 생성시킬 수 있다. 또한, 인산삼칼슘계 슬러리에 첨가하는 인산삼칼슘계 분말의 양으로 제조 공정 내(in-situ)에서 다공성 인산삼칼슘계 과립의 크기를 용이하게 조절할 수 있다.
또한, 본 발명의 골이식재 제조방법은 침지공정과 동결건조 공정을 사용함으 로써 골형성 단백질을 담체인 다공성 인산삼칼슘계 과립에 안정적으로 결합시키고, 골형성 단백질의 손상을 최소화시킬 수 있다. 특히, 동결건조에 의해 수분을 완전히 제거함으로써 수분에 의한 단백질 불활성 가능성을 줄이고, 세균의 번식을 억제할 수 있다.
본 발명은 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조 방법에 관한 것으로서,
(a) 칼날을 가진 믹서에 인산삼칼슘계 분말 및 젤라틴 용액을 첨가하고 교반시켜 인산삼칼슘계 슬러리를 준비하는 단계;
(b) 상기 칼날을 가진 믹서를 회전시키면서 인산삼칼슘계 슬러리에 인산삼칼슘계 분말을 첨가하는 단계;
(c) (b) 단계를 반복하여 인산삼칼슘계 과립을 형성시키고, 인산삼칼슘계 분말의 첨가량 또는 첨가 회수에 의해 인산삼칼슘계 과립의 크기를 조절하는 단계;
(d) 체(sieve)를 이용하여 인산삼칼슘계 과립과 과립을 형성하지 않은 인산삼칼슘계 분말을 분리하는 단계;
(e) 분리된 인산삼칼슘계 과립을 건조하는 단계; 및
(f) 건조된 인산삼칼슘계 과립을 600~1000℃의 온도로 소결하여 젤라틴을 제거하고 인산삼칼슘계 과립에 기공을 형성시키는 단계;를 포함한다.
본 발명에 따른 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법은 바람직하게는,
(g) 소결된 인산삼칼슘계 과립을 증류수에 첨가하고 초음파로 세척하는 단계; 및 (h) 초음파로 세척된 인산삼칼슘계 과립을 건조하는 단계;를 더 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 (f) 단계와 (g) 단계 사이에 체(sieve)를 이용하여 소결된 인산삼칼슘계 과립을 크기별로 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
(a) 단계에서는 칼날을 가진 믹서에 인산삼칼슘계 분말 및 젤라틴 용액을 첨가하고 교반시켜 인산삼칼슘계 슬러리를 준비한다.
칼날을 가진 믹서는 원통형 믹서로서 바닥에 회전하는 칼날을 가진다. 칼날을 가진 믹서는 인산삼칼슘계 분말 및 젤라틴 용액의 혼합을 원활하게 하기 위해 바람직하게는 높이보다 직경이 더 크고 바닥에 회전하는 칼날을 적어도 2개 이상인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 제조방법에서 믹서에 부착되어 있는 칼날은 (c)의 인산삼칼슘계 과립 형성 과정에서 인산삼칼슘계 슬러리를 잘게 나누어 첨가되는 인산삼칼슘계 분말을 골고루 분산시키고, 과립 형성을 원활하게 하는 역할을 하기 때문에 이러한 기능을 수행할 수 있을 정도의 날카로움(sharpness)과 형태를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에서 인산삼칼슘계 분말은 인산삼칼슘을 주성분으로 포함하는 인산칼슘계 세라믹 분말을 의미하고, 일반적으로 인산삼칼슘 60~98 중량%, 및 수산화아파타이트 2~40 중량%로 이루어진 이 성분 인산칼슘계 분말 또는 상기의 이 성분 인산칼슘계 분말 80~50 중량%와 황산칼슘(Calcium Sulphate) 분말 20~50 중량%를 혼합한 삼 성분 인산칼슘계 분말을 포함하며, 바람직하게는 인산삼칼슘 단독으로 이루어진 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 인산삼칼슘계 분말은 젤라틴 용액과의 혼합을 원활하게 하기 위해 바람직하게는 전처리 과정으로 체(sieve) 눈의 크기가 0.18 ㎜ 이하인 체(sieve) 분리 과정을 거쳐, 분말의 크기가 0.18㎜ 이하인 것을 특징으로 한다.
젤라틴 용액은 증류수 100㎖ 당 젤라틴 분말 15~30g을 첨가하고 40~60℃의 온도에서 교반에 의해 용해시킴으로써 제조될 수 있는데, 젤라틴 용액은 고온에서 졸 상태로 존재하나 온도가 떨어지게 되면 겔화되는 성질이 있으므로 40~50℃의 온도에서 보관한다. 또한, 젤라틴 용액 제조시 증류수 100㎖ 당 젤라틴 분말 15~25g을 첨가하는 게 적당한데, 젤라틴 분말 첨가량이 15g 미만이면 인산삼칼슘계 슬러리의 점도가 너무 작아 인산삼칼슘계 과립을 형성하는데 어려움이 있고, 소결된 인산삼칼슘계 과립의 기공 형성이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다. 또한, 젤라틴 분말 첨가량이 30g을 초과하면 젤라틴 용액의 점도가 너무 커서 인산삼칼슘계 분말과의 혼합이 원활하게 이루지지 않아 인산삼칼슘계 슬러리를 준비하는데 어려움이 발생할 수 있다.
젤라틴 용액의 첨가량은 인산삼칼슘계 분말 100g 당 20~30㎖인 것이 바람직하다. 젤라틴 용액의 첨가량이 인산삼칼슘계 분말 100g 당 20㎖ 미만이면 젤라틴 용액의 양이 인산삼칼슘계 분말에 비해 상대적으로 작아 인산삼칼슘계 슬러리를 형성하기가 어렵고, 30㎖를 초과하면 인산삼칼슘계 과립을 형성하는 공정시간이 오래 걸리는 문제가 발생할 수 있다.
(b) 단계에서는 상기 칼날을 가진 믹서를 회전시키면서 인산삼칼슘계 슬러리에 인산삼칼슘계 분말을 소량 첨가하고, (c) 단계에서는 (b) 단계를 반복하여 인산 삼칼슘계 과립을 형성시키고, 인산삼칼슘계 분말의 첨가량 또는 첨가 회수에 의해 인산삼칼슘계 과립의 크기를 조절한다.
본 발명의 제조방법에서 먼저 슬러리 상태를 형성시키고, 이후 인산삼칼슘계 분말을 첨가하여 과립을 형성시키는데, 만약 처음부터, 즉, (a) 단계에서 과립을 형성할 정도의 인산삼칼슘계 분말과 젤라틴 용액을 교반시켜 과립을 형성시키는 경우 젤라틴 용액을 골고루 분산시키기가 어렵고, 젤라틴 용액이 일정 지역의 인산삼칼슘계 분말에 편향되어 과립이 원활하게 형성되지 않으며, 인산삼칼슘계 분말 사용 대비 생성되는 과립의 양이 매우 작아지는 문제점이 있다.
본 발명은 칼날을 가진 믹서를 회전시키면서 동시에 인산삼칼슘계 슬러리에 인산삼칼슘계 분말을 첨가하여 골고루 분산시키고 슬러리를 과립화시키는 공정을 포함하는데, 이때 인산삼칼슘계 분말을 소량으로 나누어 첨가함으로써 제조 공정 내(in-situ)에서 다공성 인산삼칼슘계 과립의 크기를 용이하게 조절할 수 있다. 또한, 인산삼칼슘계 슬러리에 인산삼칼슘계 분말을 첨가하여 과립화 시킬 때 특정 크기의 범위를 가지는 과립이 주로 형성되나, 그 범위 외의 크기를 가지는 과립도 형성되므로, 이후 체 분리 과정을 거쳐 입자의 크기별로 다공성 인산삼칼슘계 과립을 얻을 수 있다.
인산삼칼슘계 슬러리에 한번 첨가되는 인산삼칼슘계 분말의 양은 인산삼칼슘계 슬러리의 인산삼칼슘계 분말 100g 당 5~20g인 것이 바람직한데, 5g 미만인 경우 인산삼칼슘계 과립을 형성하는 데 소요되는 인산삼칼슘계 분말의 양을 최소화하고 인산삼칼슘계 과립의 크기를 미세하게 조절할 수 있으나, 첨가 회수의 증가에 따른 공정시간이 늘어나는 단점이 있고, 20g을 초과하는 경우 상기와 반대의 문제점이 발생한다. 또한, (b) 단계와 (c) 단계를 거친 후의 인산삼칼슘계 분말의 전체 첨가량은 인산삼칼슘계 슬러리의 인산삼칼슘계 분말 100g 당 40~80g인 것이 바람직한데, 40g 미만인 경우 인산삼칼슘계 과립의 형성이 원활하지 않고, 80g을 초과하는 경우 초과에 따른 과립의 형성 및 과립의 크기 증가가 미비하다.
(d) 단계에서는 체(sieve)를 이용하여 인산삼칼슘계 과립과 과립을 형성하지 않은 인산삼칼슘계 분말을 분리하고, (e) 단계에서는 분리된 인산삼칼슘계 과립을 건조한다.
(d) 단계에서 체는 바람직하게는 진동체(vibrating sieve)를 사용하는 데, 인산삼칼슘계 과립은 진동체에 의해 분리과정을 거친 후 더 단단해진다. 또한, 체 눈의 크기는 일반적으로 0.5㎛~2.4㎜ 까지 다양한 범위를 가지는데 인산칼슘계 과립을 크기별로 분리하여 이후의 공정을 진행할 수 있다.
(e) 단계에서 건조방법은 상온건조, 열풍건조 등을 사용할 수 있는데, 공정시간을 고려할 때 열풍건조가 바람직하며, 건조조건은 60~80℃의 온도에서 1~2 시간 정도이다.
(f) 단계에서는 건조된 인산삼칼슘계 과립을 600~1000℃의 온도로 소결하여 젤라틴을 제거하고 인산삼칼슘계 과립에 기공을 형성시킨다.
소결과정은 인산삼칼슘계 과립의 강도를 향상시키고, 인산삼칼슘계 과립에 균일하게 분포되어 있는 젤라틴을 태워 젤라틴이 위치하는 자리에 기공을 형성시기 위해 바람직하게는 상온에서 600℃의 온도로 승온하고 2~4시간 동안 유지하는 단계; 600℃에서 900℃의 온도로 승온하고 2~4시간 동안 유지하는 단계; 및 900℃에서 1000℃의 온도로 승온하고 2~4시간 동안 유지하는 단계;를 포함한다. 여기서, 승온속도는 상온에서 600℃의 온도로 승온하는 속도는 2.5℃/분이고, 상기 600℃에서 900℃의 온도로 승온하는 속도는 1.25℃/분이며, 상기 900℃에서 1000℃의 온도로 승온하는 속도는 0.5℃/분인 것을 특징으로 한다. 상기의 소결 온도범위, 소결 시간, 승온속도에서 β상의 인산삼칼슘이 α상의 인산삼칼슘으로 상전이 하는 것을 효과적으로 방지할 수 있고, 인산삼칼슘계 과립에 미세 기공과 거대 기공을 형성시켜, 다공성 인산삼칼슘계 과립을 골이식재로 사용하는 경우 골세포가 표면에 부착하는 것을 용이하게 하고 다공성 인산삼칼슘계 과립을 골형성 단백질의 담체로 사용하는 경우 골형성 단백질이 결합하는 것을 용이하게 한다.
본 발명에 따른 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법은 (f) 단계 이후에 체(sieve)를 이용하여 소결된 인산삼칼슘계 과립을 크기별로 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 체 눈의 크기는 일반적으로 0.5㎛~2.4㎜ 까지 다양한 범위를 가지는데 다공성 인산칼슘계 과립을 크기별로 분리하여 이후의 공정을 진행할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법은 (f) 단계 이후에 (g) 소결된 인산삼칼슘계 과립을 증류수에 첨가하고 초음파로 세척하는 단계; 및 (h) 초음파로 세척된 인산삼칼슘계 과립을 건조하는 단계;를 더 포함할 수 있는데, 소 결된 인산삼칼슘계 과립을 초음파로 세척함으로써, 다공성 인산칼슘계 과립의 미세 기공 내에 존재하는 이물질을 효과적으로 제거할 수 있다. 초음파 세척은 적정량의 증류수를 포함하는 소니케이터(sonicator)안에 소결된 인산삼칼슘계 과립을 넣고 2~3회를 반복하고 각 회마다 5~10분 동안 세척한다.
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립은 기공 전구체, 분산매, 유기용매를 사용하지 않아 동물에 대한 감작성, 급성 독성, 발열성이 없고, 유전 독성이 없으며, 골이식재로 사용하는 경우 염증 반응이나 이물 반응이 나타나지 않으며 골융합성이 양호한 특성을 가진다. 또한, 과립 표면과 과립 내에 형성된 미세 기공 및 거대 기공에 골형성 단백질, 섬유아세포 성장인자를 결합시키는 경우 체내로 전달하는 할 수 있는 담체로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 기능성 골이식재의 제조방법에 관한 것으로서,
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 골형성 단백질 용액에 침지하여 골형성 단백질을 다공성 인산삼칼슘계 과립의 기공에 결합시키는 단계; 및
상기 다공성 인산삼칼슘계 과립이 골형성 단백질 용액에 침지된 것을 동결건조하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 기능성 골이식재 제조방법에서 사용되는 골형성 단백질은 일반적으로 BMP(Bone morphogenetic protein)알려진 단백질의 하위 클래스로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 포함하는 데, 바람직하게는 뼈와 연골의 생성을 효과적으로 유도할 수 있는 BMP-이고, 더 바람직하게는 인간에게 이식적합성이 뛰어난 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2)이다. 골형성 단백질로 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2)를 사용하는 경우 재조합 인간 BMP-2와 다공성 인산삼칼슘계 과립의 중량비는 1:500~1:2000인 것을 특징으로 하는데, 1:2000 미만이면 재조합 인간 BMP-2의 양이 상대적으로 적어 다공성 인산삼칼슘계 과립의 기공을 전체적으로 이용할 수 없고, 1:500을 초과하면 다공성 인산삼칼슘계 과립의 기공에 결합할 수 있는 재조합 인간 BMP-2의 양이 포화상태에 이르러 초과에 따른 효과가 미비하다.
또한, 본 발명의 기능성 골이식재 제조방법에서 골형성 단백질 용액이란 골형성 단백질이 적절한 용매에 용해되어 있는 것을 의미하는 데, 일반적으로 사용되는 용매에는 글루탐산(Glutamic acid), 글리신(Glycine), 염화나트륨, 트윈-80(Tween-80), D-솔비톨(D-Sorbitol)로 이루어진 혼합물 또는 MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] 완충액이 있다. 특히, 골형성 단백질로 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2)를 사용하는 경우 골형성 단백질 용액의 용매로 글루탐산(Glutamic acid) 5mM, 글리신(Glycine) 2.5 중량%, 염화나트륨 5mM, 트윈-80(Tween-80) 0.015 중량%, D-솔비톨(D-Sorbitol) 0.5 중량%로 이루어진 혼합물 또는 MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] 50mM 완충액을 사용할 수 있다. 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2)는 상기의 용매에 용해되어 변형없이 안정적으로 보존된다.
골형성 단백질을 담체인 다공성 인산삼칼슘계 과립에 결합시키기 위해 일반 적으로 골형성 단백질 완충액을 스프레이 분사에 의해 담체 표면에 코팅하는 스프레이 분사 방법이 사용되는데, 골형성 단백질이 주로 다공성 인산삼칼슘계 과립의 표면에 형성되어 있는 기공에 결합되기 때문에 다공성 인산삼칼슘계 과립 당 결합되는 골형성 단백질이 제한된다. 이에 반해 본 발명의 기능성 골이식재 제조방법은 침지공정을 사용함으로써 골형성 단백질을 담체인 다공성 인산삼칼슘계 과립의 표면뿐만 다공성 인산삼칼슘계 과립 내에 형성되어 있는 기공에 안정적으로 결합시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 기능성 골이식재 제조방법은 다공성 인산삼칼슘계 과립을 골형성 단백질 용액에 침지하여 골형성 단백질을 다공성 인산삼칼슘계 과립의 기공에 결합시킨 후 수분을 제거하는 방법으로 동결건조(freeze drying) 방식을 사용한다. 동결건조는 수용액이나 다량의 수분을 함유한 재료를 동결시키고 감압함으로써 얼음을 승화시켜 수분을 제거하여 건조물을 얻는 방법으로써, 조작이 저온에서 이루어지므로 열에 약한 물질, 특히 단백질의 건조법으로 유용하다. 따라서, 본 발명의 골이식재 제조방법은 골형성 단백질의 손상을 최소화시키고, 특히, 동결건조에 의해 수분을 완전히 제거함으로써 수분에 의한 단백질 불활성 가능성을 줄이고, 세균의 번식을 억제할 수 있다. 본 발명의 기능성 골이식재 제조방법에서 사용되는 동결건조 조건은 크게 제한되지 않으나, 수분이 많을 때는 불안정하고 또한 열에 극히 민감한 재료, 예를 들면 세균, 바이러스, 혈장, 혈청, 백신, 항생물질 등을 동결건조하는 조건과 유사한 조건이 바람직하고, 보다 구체적으로는 골형성 단백질이 결합된 다공성 인산삼칼슘계 과립을 -40℃의 온도에서 2~4시간 동안 유지한 후 20℃의 온도로 승온하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일뿐, 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
1. 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조
(1) 인산삼칼슘계 슬러리의 제조
인산삼칼슘계 분말을 0.18㎜ 이하의 체 눈을 가진 체로 쳐서 크기가 0.18㎜ 이하인 인산삼칼슘계 분말을 준비하였다.
증류수 100㎖에 젤라틴 분말 20g을 첨가하고 50℃의 항온 수조에서 중탕으로 녹여 졸(sol) 상태의 젤라틴 용액으로 만든 후 40℃에서 보관하였다.
크기가 0.18㎜ 이하인 인산삼칼슘계 분말 25g을 바닥에 2개의 칼날을 가진 원통형 믹서(높이 6㎝, 직경 10㎝)에 넣고 여기에 젤라틴 용액 6㎖를 첨가한 후 교반시켜 인산삼칼슘계 슬러리를 제조하였다.
(2) 인산삼칼슘계 과립의 제조
인산삼칼슘계 슬러리가 담겨져 있는 원통형 믹서를 3000~4000rpm으로 회전시키면서 크기가 0.18㎜ 이하인 인산삼칼슘계 분말 3g을 첨가하였다. 인산삼칼슘계 분말 3g을 3회 첨가하였을때 인산삼칼슘계 과립이 형성되기 시작하였으며, 5회 첨가하였을 때 구형에 가깝고 적절한 크기를 가진 인산삼칼슘계 과립이 형성되었다. 인산삼칼슘계 과립을 원형의 체로(sieve) 쳐서 과립을 형성하지 않은 인산삼칼슘계 분말을 분리하고 인산삼칼슘계 과립을 크기별로 분별하였다. 분리된 인산삼칼슘계 과립 중 0.2~3㎜의 입자 크기를 가지는 과립을 60~80℃의 온도에서 1시간 동안 열풍건조 하였다.
(3) 인산삼칼슘계 과립의 소결
알루미나 도가니에 건조된 인산삼칼슘계 과립을 5㎜의 두께로 펼쳐서 넣은 후 전기로에서 소결과정을 진행하였고, 이때 사용되는 온도 프로파일은 다음과 같다. ①상온에서 600℃까지 2.5℃/분의 속도로 승온하고 600℃에서 3시간 동안 유지하였다. ② 600℃에서 900℃까지 1.25℃/분의 속도로 승온하고 900℃에서 3시간 동안 유지하였다. ③ 900℃에서 1000℃까지 0.5℃/분의 속도로 승온하고 1000℃에서 3시간 동안 유지하였다. ④ 소결이 끝난 후 온도를 자연적으로 하강시켰다.
(4) 소결된 다공성 인산삼칼슘계 과립의 체분리, 초음파 세척, 열풍건조
소결된 다공성 인산삼칼슘계 과립을 원형의 체로(sieve) 쳐서 크기별로 분별한 후 인산칼슘계 과립 중 0.2~3㎜의 입자 크기를 가지는 과립을 초음파 세척기로 2~3회 세척하여 인산칼슘계 과립의 미세 기공 내에 존재하는 이물질을 제거하였다. 이때 각 회마다 사용된 증류수의 양은 300㎖이고, 세척 시간은 5~10분이었다. 세척된 다공성 인산삼칼슘계 과립을 60~80℃의 온도에서 1시간 동안 열풍건조 하였다.
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립 중 체 눈의 크기가 0.2 ~ 1.0㎜인 체에 의해 분별된 과립을 물리, 화학적 특성 분석, 생물학적 특성 분석, 기능성 골이식재의 제조에 사용하였다.
2. 다공성 인산삼칼슘계 과립의 물리, 화학적 특성 분석
(1) 주사전자현미경에 의한 표면 분석
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립의 표면을 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 관찰하고, 그 결과를 도 1 내지 도 5에 나타내었다. 도 1은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다공성 인산삼칼슘계 과립들의 30 배율 주사전자현미경 사진이다. 도 1에서 보이는 바와 같이 약 0.2~1㎜의 입자 크기를 가진 다공성 인산삼칼슘계 과립들이 존재하였다. 도 2는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다공성 인산삼칼슘계 과립 하나의 250 배율 주사전자현미경 사진이고, 도 3은 도 2의 3,000 배율 주사전자현미경 사진이다. 또한, 도 4는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다른 다공성 인산삼칼슘계 과립 하나의 250 배율 주사전자현미경 사진이고, 도 5는 도 4의 3,000 배율 주사전자현미경 사진이다. 도 2의 다공성 과립은 구형이고, 약 0.25㎜의 입자 크기를 가지며, 표면에 미세 기공과 거대 기공이 혼재되어 있다. 한편 도 4의 다공성 과립은 구형은 아니나 구형에 형태를 가지고, 약 0.35㎜의 입자 크기를 가지며, 표면에 주로 미세 기공이 형성되어 있다.
(2) 엑스선 회절 분석에 의한 결정 및 조성 특성
엑스선 회절 분석기(X-Ray Diffractometer, 모델명: D/MAX 2 Rint 2700, Rigaku Co., Japan, 이하 XRD)로 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립의 수산화아파타이트와 β상의 인산삼칼슘 함량을 분석하였다. 다공성 인산삼칼슘계 과립을 분말 형태(입도 40㎛ 이하)로 만들어 시험시료로 사용하고, 표 준 시료로 수산화아파타이트(CAS No. 12167-74-7, Sigma)와 β-인산삼칼슘(Lot. 1338057, Fluka)을 일정한 비율(9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9)로 혼합하여 사용하였다. 표준 시료의 XRD 분석 값을 이용하여 표준 곡선을 그리고, 시험시료의 XRD 분석값을 표준 곡선과 비교하였다. XRD 분석 결과, 3번의 실험에서 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립은 수산화아파타이트 27.3~28.6 중량%, β-인산삼칼슘 71.4~72.7 중량%의 함량을 보였다.
(3) 기공 특성 분석
BET 다공성 측정기(nova 2000 & autosorb-1-c, USA)에 질소 가스를 주입하고 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 넣었다. 일정량의 질소 가스가 다공성 인산삼칼슘계 과립에 흡착되면 압력의 변화를 측정하여 기공율을 구하였다. 분석 결과, 다공성 인산삼칼슘계 과립의 기공율은 70%이었고, 평균 기공 크기는 0.18㎛ 이었다.
(4) 이물질 분석
아미노산 분석
아미노산 분석기(Amino acid Analyser S433, SYKAM, Germany)를 이용하여 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립에 아미노산이 존재하는지 여부를 분석하였다. 분석 결과, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 트레오닌, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신, 프롤린 등의 아미노산이 검출되지 않았다.
지질 분석
조지방 분석기(Tecator Soxtec System 1046, FOSS Analytical AB, Sweden)를 이용하여 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립에 지질이 존재하는지 여부를 분석하였다. 분석 결과, 지질이 검출되지 않았다.
중금속 분석
ASTM F 1088에 의거하여 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 염산으로 전처리 한 후 유도결합플라즈마 원자방출분광기(ICP-AES, JY ACTIVA, JY HORIVA, France)를 사용하여 중금속 존재 여부를 분석하였다. 분석 결과, 납, 카드뮴, 비소, 수은 및 기타 중금속이 검출되지 않았다.
3. 다공성 인산삼칼슘계 과립의 생물학적 특성 분석
(1) 감작성 실험
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립 4g을 생리식염수 20㎖에 넣고 50℃의 온도에서 72시간 동안 용출하여 검액을 제조하였다. 공시험액은 생리식염수를 사용하였다. 실험동물로는 알비노(Albino) 타입의 기니픽(Guinea-Pig, 제공회사 : 효창사이언스)을 시험군에 10마리, 대조군에 5마리를 사용하였다. 실험방법은 ISO 10993-10, 6.2 "Maximization sensitization test" 항을 따랐으며, 구체적으로 다음과 같다.
① 기니픽 등부분의 견갑내부 주사부위를 시험 전 날 제모하였다.
② 피하유도단계(Intradermal induction phase) : 다음 3가지 용액을 0.1㎖씩 26G 주사침을 장착한 주사기를 이용하여 각 동물의 견갑내부의 주사부위에 대칭 으로 피내 주사하였다.
a. 생리식염수와 프루인트 완전보조약(Freund's complete adjuvant)을 동일한 부피 분율로 혼합한 용액
b. 시험군에는 검액, 대조군에는 공시험액(즉, 생리식염수)
c. a와 b를 동일한 부피분율로 혼합한 용액
③ 국소유도단계(Topical induction phase) : 피내 투여 7일 후에 피내 주사부위를 덮을 수 있도록 시험군에는 검액이 도포된 패치(patch)를, 대조군에는 공시험액이 도포된 패치를 적용하고 폐쇄붕대(Closed dressing) 방법으로 적용부위를 안전하게 보호하였다. 48시간 후에 붕대와 패치를 제거하고 염수(saline)를 이용하여 적용부위를 세척하였다.
④ 시도단계(Challange phase) : 피내 투여 14일 후에 동물의 한쪽 옆구리를 제모하고 시험군에는 검액이 도포된 패치(patch)를, 대조군에는 공시험액이 도포된 패치를 적용하고 폐쇄붕대(Closed dressing) 방법으로 적용부위를 안전하게 보호하였다. 24시간 후에 붕대와 패치를 제거하고 염수(saline)를 이용하여 적용부위를 세척하였다. 세척 후 24시간, 48시간 후에 시험군과 대조군의 적용부위 양상을 관찰하였다.
감작성 실험 결과 시험군 10마리와 대조군 5마리 모두에서 24시간, 48시간이 지나도 홍반 및 부종이 나타나지 않았다.
(2) 발열성 시험
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립 4g을 생리식염수 20㎖에 넣고 50℃의 온도에서 72시간 동안 용출하여 검액을 제조하였다. 실험동물로는 래빗(Rabbit, Newzealand White, 제공회사 : 효창사이언스)을 시험군에 3마리를 사용하였다. 실험방법은 대한약전의 발열성 실험방법을 따랐으며, 구체적으로 다음과 같다.
① 직장 체온계를 직장 내에 75㎜ 이상 삽입하고, 실험하는 동안 일정한 깊이를 유지하였다.
② 실험동물이 안정되었을 때의 체온을 대조 체온으로 하고 검액을 10㎖/kg(실험동물의 몸무게) 용량으로 실험동물에 투여하였다.
③ 투여 후 1~3시간 사이에 30분 간격으로 체온을 측정하여 대조 체온과 최고 ℃체온과의 차이를 비교하였다.
발열성 실험 결과, 검액 투여 후 3시간 동안 시험군의 최고 체온과 대조 체온의 차는 0~0.2℃로 미미하였고, 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립은 평가 기준에 적합하였다.
(3) 급성 독성 실험
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립 4g을 생리식염수 20㎖에 넣고 50℃의 온도에서 72시간 동안 용출하여 검액을 제조하였다. 공시험액은 생리식염수를 사용하였다. 실험동물로는 알비노(Albino) 타입의 마우스(제공회사 : 효창사이언스)을 시험군에 5마리, 대조군에 5마리를 사용하였다. 실험방법은 ISO 10993-11, 6.5 "Acute systemic toxicity" 항을 따랐으며, 구체적으로 다음과 같다.
① 마우스에 검액 및 공시험액을 50㎖/㎏(실험동물의 몸무게) 용량으로 1회 투여하였다.
② 투여 후 4시간, 24시간, 48시간, 72시간 후에 일반 임상증상을 관찰하고 투여 전과 투여 후의 체중을 측정하였다.
③ 시험군 또는 대조군 각각을 기준을 2마리 이상의 마우스가 죽거나 3마리 이상의 마우스에서 2g 이상의 체중 감소, 또는 2마리 이상의 마우스에서 경련이 나타나면 평가 기준에 적합하지 않은 것으로 판단하였다.
급성 독성 실험 결과 시험군 5마리와 대조군 5마리 모두에서 투여 후 72시간 동안 사망, 체중 감소, 경련이 일어나지 않았다. 따라서, 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립은 급성 독성 기준을 만족하는 것으로 판단된다.
(4) 무균 실험
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 특정 배지에 첨가한 시험군과 특정 배지만으로 이루어진 대조군을 삼각 플라스크에서 배양시키면서 시간의 경과에 따른 균의 발육 유무를 관찰하였다. 표 1에 무균 실험에 사용된 배지의 종류, 배양 온도 등을 나타내었다.
시험군 멸균 액상치오글리콜산 배지 200㎖, 35℃
멸균 대두카제인소화배지 200㎖, 25℃
대조군 멸균 액상치오글리콜산 배 지 200㎖, 35℃ 다공성 인산칼슘계 과립 첨가
멸균 대두카제인소화배지 200㎖, 25℃ 다공성 인산칼슘계 과립 첨가
배양 시작 후 7일 및 14일에 균의 발육 유무를 관찰한 결과, 시험군과 대조군 모두에서 균의 발육이 나타나지 않았다.
(5) 유전 독성 실험(Ames Test)
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립 2g을 증류수 10㎖에 넣고 121℃의 온도에서 1시간 동안 용출하여 얻은 용출물을 시험군으로 하고 증류수를 음성대조군으로, 돌연변이원(mutagen) 물질을 양성대조군으로 하여 유전 독성 실험을 수행하였다. 이때, 사용되는 살모넬라 균주의 종류에 따라 표 2와 같이 돌연변이원 물질을 달리 사용하였다.
사용 균주 TA1537 TA98 TA100 TA1535 TA102
돌연변이원 물질 9-aminoacridine 2-nitrofluorene sodium azide sodium azide mitomycin
유전 독성 실험은 "Ames Test" 방법을 따랐으며, 구체적으로 다음과 같다.
① 균주를 영양배지(Vogel-Bonner medium)에 접종하고 진탕 배양기(Shaking incubator)에서 12시간 배양하였다(37℃, 100rpm).
② 균주 배양액 100㎕, 시험군 또는 대조군 물질, 인산완충용액(Phosphate buffered solution, PBS) 500㎕(단, 양성 대조군에서는 590㎕임), 및 히스티딘/바이오틴 용액(histidine/biotin solution) 500㎕를 유리시험관에 첨가한 후, 상층 한천(Top agar) 2㎖를 첨가하여 혼합하였다.
③ 상기의 혼합액을 글루코오스 배지(Glucose Plate)에 골고루 분주하고 37℃의 배양기에서 72시간 보관한 후 형성된 콜로니(colony)의 수를 통계처리 하여 유전 독성 여부를 평가하였다.
표 3은 유전 독성 실험에서 시험군 및 대조군의 실험 조건 및 실험 결과를 나타낸 것이다. 유전 독성 실험에서 균주의 콜로니의 수는 3번의 반복실험에 대한 평균값이다.
구분 균주 시험군 또는 대조군물질 콜로니의 수 신뢰수준
음성대조군 1 TA1537 증류수 100㎕ 34.0 균주 각각에서 음성대조군-시험군, 양성대조군- 시험군, 음성대조군-양성대조군사이에서의 P-value가 0.28 이하이고, 95% 이상의 신뢰수준을 가짐
시험군 1 용출물 100㎕ 44.3
양성대조군 1 9-aminoacridine 10㎕ 154.7
음성대조군 2 TA98 증류수 100㎕ 84.0
시험군 2 용출물 100㎕ 109.7
양성대조군 2 2-nitrofluorene 10㎕ 488.3
음성대조군 3 TA100 증류수 100㎕ 96.0
시험군 3 용출물 100㎕ 110.3
양성대조군 3 sodium azide 10㎕ 542.7
음성대조군 4 TA102 증류수 100㎕ 108.0
시험군 4 용출물 100㎕ 95.3
양성대조군 4 mitomycin 10㎕ 232.7
음성대조군 5 TA1535 증류수 100㎕ 30.7
시험군 5 용출물 100㎕ 33.7
양성대조군 5 sodium azide 10㎕ 605.7
표 3에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립은 95%의 신뢰수준에서 유전 독성이 거의 없음을 알 수 있다.
(6) 이식 실험
본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 시험군으로, 100% 순수 β-인산삼칼슘으로 만든 합성골 이식재인 Syncera®(오스코텍, 한국)를 대조군으로 하여 이식 실험을 수행하였다. 실험동물은 래빗(Rabbit, Newzealand White, 제공회사 : 효창사이언스)을 사용하였고, 실험방법은 ISO 10993-6을 따랐으며, 구체적으로 다음과 같다.
1) 수술
① 진통, 진정 효과와 근육이완 효과를 얻기 위하여 럼푼 주사액(Rompun inj., 바이엘코리아, 한국) 5㎎/㎏(실험동물의 몸무게)을 근육주사 하고 거담제로 황산아트로핀주(대원제약, 한국) 0.12~0.15㎖를 주사하였다. 5분 후 케이란주(Keiran inj., Ketamine HCl, 한국유나이티드제약, 한국) 0.12~0.15㎖를 피하주사하여 전신마취를 유지하였다.
② 전신마취가 끝난 후 수술부위로서 좌,우측 경골부(tibia) 내측 부위를 제모하고 자이레스테인 에이 주(3M ESPE AG, ESPE Platz 8229 Seefeld Germany, g한국쓰리엠) 2㎖ 정도를 무릎관절의 경골 골간단에 주사하여 국소마취와 함께 지혈작용이 나타나게 하고, 피부를 포비돈 요오드액으로 문지르고, 경골 골간단의 전내측 쪽에 절개를 행한 뒤 피부, 근육, 근막, 및 골막을 거상하여 이식될 골을 노출시켰다.
③ 골이식재로 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립(시험군)을 담은 폴리에틸렌 튜브를 래빗의 우측 경골에 3개 식립하고 골이식재로 Syncera®(대조군)를 담은 폴리에틸렌 튜브를 래빗의 좌측 경골에 3개 식립하였다(총 4마리를 사용하였으며, 한 마리에 총 6개의 골이식재가 식립됨).
④ 골막과 피부를 흡수성 봉합사와 블랙 실크 봉합사로 봉합한 후 압박 드레싱을 행하고 겐타마이신 항생제 1㎖를 근육주사 하고, 이후 3일간 동일한 방법으로 항생제를 주사하였다.
2) 희생 및 조직 분석
① 12주의 치유기간을 거친 뒤 래빗을 희생시키고 골이식재와 그 주위의 골조직을 블록 형태로 분리하였다.
② 5% 중성 포르말린에 2일간 고정한 후 에탄올로 탈수시키고 프로필렌 옥사이드(Propylene Oxide)로 치환한 후 에폰 수지(Epon resin)로 포매하였다.
③ 포매한 시편을 최종 두께가 10~20㎛가 되도록 연마하고 0.5% 빌라누에바 용액(Vilanueva solution)에 12일간 염색한 후 광학 현미경으로 관찰하였다.
도 6은 이식 실험에서 시험군의 20배 및 100배 광학 현미경 사진이고, 도 7은 이식 실험에서 대조군의 20배 및 100배 광학 현미경 사진이다. 도 6에서 보이는 바와 같이 시험군의 경우 골이식재 주위로 탐식세포들이 관찰되었고, 신생골의 형성이 국소적으로 관찰되었으며, 특기할 염증 소견은 보이지 않았다. 또한, 도 7의 대조군에서는 골이식재가 조혈성 골수내에 분포되어 있으며, 이식체 주위로 신생골 형성이 관찰되었으며, 특기할 염증 소견은 보이지 않았다.
4. 기능성 골이식재의 제조
(1) 본 발명의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립 1g을 유리 바이알에 분주하고 실리콘 마개로 캡핑(capping)한 후 감마선으로 멸균하였다. 1㎎의 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2)를 글루탐산(Glutamic acid) 5mM, 글리신(Glycine) 2.5 중량%, 염화나트륨 5mM, 트윈-80(Tween-80) 0.015 중량%, D-솔비톨(D-Sorbitol) 0.5 중량%로 이루어진 용매에 용해시킨 후 다공성 인산삼칼슘계 과립이 담겨져 있는 유리 바이알에 첨가하여 다공성 인산삼칼슘계 과립을 침지하였다. 상기 유리 바이알을 초저온 냉동기(Deep Freezer)에 넣어 즉시 냉동시키고 진공동결건조기(Vacuum Freezer Dryer Oven)에 넣어 -40℃에서 3시간 동안 유지한 후 점진적으로 20℃로 승온하였다. 동결건조된 유리 바이알을 무균환경에서 캡핑하였다.
(2) 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2)의 용매로 MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] 50mM 완충액을 사용한 것을 제외하고는 (1)의 방법과 동일하였다.
도 1은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다공성 인산삼칼슘계 과립들의 30 배율 주사전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다공성 인산삼칼슘계 과립 하나의 250 배율 주사전자현미경 사진이고, 도 3은 도 2의 3,000 배율 주사전자현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다른 다공성 인산삼칼슘계 과립 하나의 250 배율 주사전자현미경 사진이고, 도 5는 도 4의 3,000 배율 주사전자현미경 사진이다.
도 6은 이식 실험에서 시험군의 20배 및 100배 광학 현미경 사진이고, 도 7은 이식 실험에서 대조군의 20배 및 100배 광학 현미경 사진이다.

Claims (15)

  1. (a) 칼날을 가진 믹서에 인산삼칼슘계 분말 및 젤라틴 용액을 첨가하고 교반시켜 인산삼칼슘계 슬러리를 준비하는 단계;
    (b) 상기 칼날을 가진 믹서를 회전시키면서 인산삼칼슘계 슬러리에 인산삼칼슘계 분말을 첨가하는 단계;
    (c) (b) 단계를 반복하여 인산삼칼슘계 과립을 형성시키고, 인산삼칼슘계 분말의 첨가량 또는 첨가 회수에 의해 인산삼칼슘계 과립의 크기를 조절하는 단계;
    (d) 체(sieve)를 이용하여 인산삼칼슘계 과립과 과립을 형성하지 않은 인산삼칼슘계 분말을 분리하는 단계;
    (e) 분리된 인산삼칼슘계 과립을 건조하는 단계; 및
    (f) 건조된 인산삼칼슘계 과립을 600~1000℃의 온도로 소결하여 젤라틴을 제거하고 인산삼칼슘계 과립에 기공을 형성시키는 단계;를 포함하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법은 (g) 소결된 인산삼칼슘계 과립을 증류수에 첨가하고 초음파로 세척하는 단계; 및 (h) 초음파로 세척된 인산삼칼슘계 과립을 건조하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법은 (f) 단계와 (g) 단계 사이에 체(sieve)를 이용하여 소결된 인산삼칼슘계 과립을 크기별로 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 젤라틴 용액은 증류수 100㎖ 당 젤라틴 분말 15~30g을 첨가하고 40~60℃의 온도에서 교반하여 용해시키고 30~50℃의 온도에서 보관하여 준비되는 것을 특징으로 하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 (a) 단계의 젤라틴 용액의 첨가량은 인산삼칼슘계 분말 100g 당 20~30㎖인 것을 특징으로 하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 인산삼칼슘계 분말의 1회 첨가량은 인산삼칼슘계 슬러리의 인산삼칼슘계 분말 100g 당 5~20g인 것을 특징으로 하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 (c) 단계의 인산삼칼슘계 분말의 전체 첨가량은 인산삼칼슘계 슬러리의 인산삼칼슘계 분말 100g 당 40~80g인 것을 특징으로 하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법.
  8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (f) 단계의 소결과정은
    상온에서 600℃의 온도로 승온하고 2~4시간 동안 유지하는 단계;
    600℃에서 900℃의 온도로 승온하고 2~4시간 동안 유지하는 단계; 및
    900℃에서 1000℃의 온도로 승온하고 2~4시간 동안 유지하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 상온에서 600℃의 온도로 승온하는 속도는 2.5℃/분이고, 상기 600℃에서 900℃의 온도로 승온하는 속도는 1.25℃/분이며, 상기 900℃에서 1000℃의 온도로 승온하는 속도는 0.5℃/분인 것을 특징으로 하는 다공성 인산삼칼슘계 과립의 제조방법.
  10. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조한 다공성 인산삼칼슘계 과립을 골형성 단백질 용액에 침지하여 골형성 단백질을 다공성 인산삼칼슘계 과립의 기공에 결합시키는 단계; 및
    상기 다공성 인산삼칼슘계 과립이 골형성 단백질 용액에 침지된 것을 동결건조하는 단계;를 포함하는 골이식재의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 골형성 단백질은 BMP-2인 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  12. 제 11항에서 있어서, 상기 BMP-2는 재조합 인간 BMP-2(rhBMP-2)인 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 재조합 인간 BMP-2와 다공성 인산삼칼슘계 과립의 중량비는 1:500~1:2000인 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 재조합 인간 BMP-2 용액의 용매는 글루탐산(Glutamic acid) 5mM, 글리신(Glycine) 2.5 중량%, 염화나트륨 5mM, 트윈-80(Tween-80) 0.015 중량%, D-솔비톨(D-Sorbitol) 0.5 중량%로 이루어진 혼합물 또는 MES[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] 50mM 완충액인 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
  15. 제 10항에 있어서, 상기 동결건조는 -40℃의 온도에서 2~4시간 동안 유지한 후 20℃의 온도로 승온하는 것을 특징으로 하는 골이식재의 제조방법.
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