KR101943432B1

KR101943432B1 - 서방성 주사용 골 이식재의 제조방법

Info

Publication number: KR101943432B1
Application number: KR1020170088551A
Authority: KR
Inventors: 이병택; 이건희; 마커 프리티; 장동우
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2019-04-18
Also published as: KR20180069665A

Abstract

본 발명은 폴리도파민-심바스탄틴-젠타마이신이 차례대로 코팅 도는 고정된 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 생리식염수에 혼합하여 골 이식용 주사제로 제조하는 단계를 포함하는, 서방성 주사용 골 이식재의 제조방법에 관한 것으로서, 상기와 같은 골 이식재는 생체 적합성이 우수하고 골 이식재와 세포간 상호작용을 통해 세포 증식 및 골 재생 효과가 우수하고, 항균 효과를 보유할 수 있으며, 서방성으로 약물을 방출할 수 있어 효과적인 골 이식재로 사용될 수 있다.

Description

서방성 주사용 골 이식재의 제조방법{Method for preparing sustained release bone graft for injection}

본 발명은 폴리도파민-심바스탄틴-젠타마이신이 차례대로 코팅 또는 고정된 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 포함하는, 서방성 주사용 골 이식재의 제조방법에 관한 것이다.

골 조직은 인체의 골격을 유지시키는 중요 조직으로 골 조직 재생을 위해서 다양한 재료와 형태의 골 조직 대체용, 재생용 골 이식재가 연구 개발되고 있다. 골 이식재의 경우 골 치유기전에 따라 골 형성 재료, 골 전도성 재료, 골 유도성 재료로 분류할 수 있으며, 골 이식(transplataion)이나 매식(implantation)에 사용되는 이식재에 따라 자가이식, 동종이식, 타종이식 등의 방법을 주로 사용하고 있다.

이중 면역반응을 최소화할 수 있는 방법은 자가이식으로서, 자가골을 이용하여 골 손상부위에 이식을 할 경우 면역반응이 최소화되어 안정적인 골 조직 재생이 가능한 장점이 있다. 그러나, 자가골의 채취로 인한 다른 부위의 2차 골 손실과 회복기간 등의 불편을 가지고 있으며 양이 매우 한정되어 있다는 단점이 있다. 이를 보완하기 위하여 다른 사람의 골을 사용하는 타종이식이 있으나, 이는 자가골과 달리 많은 면역반응을 일으키고, 가격도 매우 비싸다는 단점이 있다. 따라서, 면역반응을 최소화하면서 많은 사람들에게 이용되기 위해 합성골을 제조하여 이식하고자 하는 골 조직공학 연구가 많이 진행되고 있다.

골 조직 공학에 적용하기 위한 지지체는 숙주 조직의 최적화된 조직 형성을 위해 핵심적인 몇 가지 조건을 만족해야 한다. 이 조건은 세포 친화력, 영양분과 산소가 투과하기 위한 적절한 공극률, 세포 부착 및 분화를 촉진시키기 위한 계면 활성 등을 포함한다. 또한, 이상적으로 지지체는 연속적으로 분해되어 숙주 세포에 의해 대체되어야 한다.

부상, 골 종양, 치주 질환 등으로 인한 골 결손의 치료를 위해 상기와 같은 골 지지체의 임상적 필요성이 세계적으로 증대되고 있다. 또한, 자가골, 동종골, 이종골이 가진 제한된 유용성, 기증자의 사이트 병적 상태(donor site morbidity), 면역거부반응, 감염 등의 문제점을 최소화하기 위한 방법으로 인공골을 이식하여 사용하고 있다. 이와 같은 인공골의 재료로 세라믹, 폴리머 또는 그 혼합물 등과 같은 다양한 생체재료가 테스트되고 있다.

일반적으로, 수산화인회석(hydroxyapatite, HAP), 인산 삼칼슘(tricalcium phosphate, β-TCP)로 구성된 다공성 이상 인산 칼슘 과립(Multichannel biphasic calcium phosphate granules, MCG)는 천연골을 모방하며, 우수한 기계적 강도, 골 전도성 및 생분해성이 조절될 뿐만 아니라 높은 생체흡착률과 같은 유리한 생물학적 성질을 가진다. 또한, 다공성 구조의 상호 연결된 미세 기공들은 체내 순환 및 내부 골 성장을 촉진시킬 수 있다.

이러한 골 재생용 지지체에 골 유도성 분자가 혼합되는 경우, 골 지지체의 골 형성능력을 크게 향상시킬 수 있다. 상기와 같은 골 유도성 분자의 예로는 rhBMP-2(Recombinant human bone morphogenetic protein 2)가 있는데, rhBMP-2는 값이 비싸고 반감기가 짧으며, 표적 세포에 비효율적으로 전달될 뿐 아니라 낮은 수율성으로 인해 골 재생 기능을 향상하기 위한 임상에 적용하는 데, 제한이 있었다.

한편, 콜레스테롤 저하제인 심바스타틴은(simvastatin)은 골다공증 치료 및 골절 치유를 개선하기 위한 약물로써 이미 쥐의 두개골이나 토끼의 대퇴골에서 골 형성을 촉진하는 효과가 확인된 바 있다. 그러나, 담체의 물리 화학적 성질에 따라 치료 효과를 나타내지 않는 경우도 있어서, 심바스타틴(simvastatin)을 임상에 적용하기 위한 적절한 국소 전달 시스템의 개발이 필요한 실정이다.

또한, 골 재생을 위한 지지체를 삽입시 환자의 피부 또는 점막에 존재하는 박테리아에 감염이 되기 쉽다. 상기 골 재생용 지지체에 박테리아가 부착되어 성장을 하면, 박테리아 세포는 두꺼운 생체필름을 형성하게 되고, 이는 숙주방어 메커니즘과 투여된 항생제의 확산, 침투를 막는 주요 장애물 역할을 한다. 이러한 이식된 지지체에 부착된 박테리아는 숙주 방어 및 항생효과를 방해하여 신진대사 속도를 매우 낮추게 되고, 골 감염을 유발시키게 된다. 이에 골 재생을 위한 지지체 삽입시 발생하는 골 감염을 치료하기 위하여, 장기간에 걸친 다량의 항생제를 투여해야 하고, 이와 더불어 상처 부위를 반복적으로 소독해야 했다.

이에 생분해 가능한 세라믹/고분자를 기반으로 골 재생을 촉진하는 물질이 지속적으로 방출될 수 있으면서, 항생 효과를 가진 약물을 방출할 수 있는 골 이식재를 개발하고자 하였다.

대한민국 등록특허 10-1427305호

본 발명의 목적은 발명은 폴리도파민-심바스탄틴-젠타마이신이 차례대로 코팅 또는 고정된 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 포함하는, 서방성 주사용 골 이식재의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 생분해 가능한 세라믹/고분자를 기반으로 골 재생을 촉진하는 물질이 지속적으로 방출될 수 있으면서, 항생 효과를 가진 약물을 방출할 수 있는 골 이식재를 개발하고자 하였으며, 이에, BCP(biphasic calcium phosphate) 과립을 기반으로 다공성 이상 인산 칼슘 과립(multichannel biphasic calcium phosphate granule, MCG)에 폴리도파민-심바스탄틴-젠타마이신이 차례대로 코팅 또는 고정된 다공성 이상 인산 칼슘 과립이 골 감염을 억제하는 항생 효과와 함께 우수한 생체적합성, 골 전도성, 골 유도성 및 서방성 약물방출 특성을 보이며, 골 결함을 치유하고 골 재생을 촉진하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서,

본 발명은 다공성 이상 인산 칼슘 과립(multichannel biphasic calcium phosphate granule, MCG)의 표면을 처리하는 1단계;

상기 표면 처리된 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 폴리도파민으로 코팅하여 폴리도파민 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 형성하는 2단계;

상기 폴리도파민 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립에 심바스타틴을 고정하여 심바스타틴 고정 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 형성하는 3단계;

상기 심바스타틴 고정 다공성 이상 인산 칼슘 과립에 젠타마이신을 코팅하여, 젠타마이신 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 형성하는 4단계; 및

상기 젠타마이신 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 생리식염수에 혼합하여 골 이식용 주사제로 제조하는 5단계를 포함하는, 서방성 주사용 골 이식재의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다공성 골 이식재의 제조방법은 다공성 이상 인산 칼슘 과립(multichannel biphasic calcium phosphate granule, MCG)의 표면을 처리하는 1단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에서는 골 이식재를 제조하기 위하여, 다공성 이상 인산 칼슘 과립 표면의 유용물질의 효과적인 코팅 또는 고정을 위하여, 탈 이온수(DI)에 세척하고 동결 건조 및 멸균 소독하여 표면을 처리하였다.

상기 다공성 이상인산 칼슘 과립은 HAP(hydroxyapatite), TCP(tricalcium phosphate), BCP(biphasic calcium phosphate), CPC(calcium pyro phosphate), DCPA(dicalcium anhydrade), DCPD(dicalcium dehydrade), TTCP(tetra calcium phosphate), 지르코니아 및 알루미나로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 X-Ray 회절 패턴을 통해 다공성 BCP 과립(MCG)에서 hydroxylapatite (HAP, ICDD No: 01-072-1243)와 tricalcium phosphate (TCP, ICDD No: 01-072-7587)이 존재하는 것을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는 SEM 이미지를 통해, 상기 다공성 이상 인산 칼슘 과립은 직경이 1mm인 원기둥 형상을 가지고 있고, 170 내지 180 μm의 직경을 갖는 복수의 기공을 보유하는 것을 확인하였다.

본 발명의 다공성 골 이식재의 제조방법은 상기 표면 처리된 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 폴리도파민으로 코팅하여 폴리도파민 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 형성하는 2단계를 포함한다.

구체적으로, 상기 폴리도파민 코팅은 4mg/ml 도파민 하이드로 클로라이드 용액을 10 mM 트리스 (하이드록시메틸) 아미노 메탄 용액과 혼합하여 제조된 폴리도파민 용액에 1g/ml의 다공성 이상인산 칼슘 과립(MCG)을 침지하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 콜라겐, 헤파린 또는 폴라도파민으로 코팅하여 표면이 개질된 다공성 이상 인산 칼슘의 SEM, EDX 및 FTIR 스펙트럼을 분석한 결과, 다공성 BCP 과립(MCG)의 다공성 구조에 영향을 주지 않으면서, 표면 전체에 콜라겐, 헤파린 및 폴라도파민이 균일하게 코팅된 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일실시예에서는 상기와 같이 콜라겐, 헤파린 또는 폴라도파민으로 코팅하여 표면이 개질된 다공성 이상 인산 칼슘 과립의 경우, 코팅되지 않은 MCG에 비해 콜라겐 코팅의 C-MCG, 헤파린 코팅의 H-MCG, 폴리도파민 코팅의 PD-MCG에서 세포생존능이 증가하였으며, 1일에 비해, 3일, 7일로 기간이 경과할수록 세포 생존능은 더욱 증가된 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일실시예에서는 대퇴골 결손부의 골 재생능을 평가한 결과, 콜라겐, 헤파린이 코팅된 MCG에 비해 폴리도파민이 코팅된 MCG의 골 성장이 이식 6주 이후 현저히 증가된 것을 확인하였다. 또한, 대조군 및 MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 5가지 유형의 샘플에 대한 조직학적 염색을 통한 골 내부의 성장정도를 관찰한 결과, PD-MCG> C-MCG> H-MCG> MCG 순서의 골 재생 효능을 확인하여, 폴리도파민이 코팅된 PD-MCG가 생체적합성이 우수하고 골 이식재와 세포간 상호작용을 통해 세포 증식 및 골 재생 효과가 우수하여, 폴리도파민이 코팅된 PD-MCG 가 효과적인 골 이식재로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 다공성 골 이식재의 제조방법은 상기 폴리도파민 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립에 심바스타틴을 고정하여 심바스타틴 고정 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 형성하는 3단계를 포함한다.

이에 본 발명에서는 콜라겐, 헤파린 보다 골 재생 효과가 우수한 것으로 확인된 폴리도파민이 코팅된 PD-MCG를 이용하여 심바스타틴 고정을 위하여 사용하였으며, 심바스타틴을 고정한 SV-PD-MCG의 방출 프로파일을 폴리도파민을 코팅하지 않은 MCG와 비교하였다.

이에, 발명의 일실시예에서는 상기 폴리도파민 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립에 심바스타틴을 고정하여 심바스타틴 고정 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 제조하였다.

본 발명의 일실시예에서는 구체적으로, 심바스타틴(Simvastatin) 0.6mg을 아세토니트릴(Acetonitrile) 1ml에 용해시켜 심바스타틴 용액을 제조하였으며, 1g의 MCG(직경 1mm)와 PD-MCG를 상기 제조된 1ml의 심바스타틴 용액에 2시간 동안 침지시켜, 심바스타틴이 고정된 샘플 SV-PD-MCG을 제조한 후, 심바스타틴의 방출 프로파일을 비교하였다. 폴리도파민을 코팅하지 않은 MCG에 심바스타틴을 고정한 SV-MCG에서는 simvastatin의 방출 양이 적었으며, 반면, 폴리도파민이 코팅된 PD-MCG에 심바스탄틴을 코팅한 SV-PD-MCG에서는 MCG와 그 인접 주위에 골 형성을 자극할 수 있을 정도의 simvastatin의 방출 프로파일이 확인되었다. 또한, 이러한 방출 프로파일은 MCG에 코팅된 Polydopamine과 Simvastatin의 공유결합을 통해 Simvastatin을 지속적으로 방출하게 되는 것이다. 따라서, SV-MCG에 비해, SV-PD-MCG는 심바스타틴의 지속 가능한 방출 프로파일을 보여줌으로써 서방성을 지니는 성장인자 방출의 좋은 매개체로서 적용 가능한 것을 알 수 있었다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 서방성 주사형 골 이식재에 고정되어 골 재생 기능을 가지는 심바스타틴이 5일 후 10~20%, 15일 후 20~30%, 25일 후 30~40%가 용출되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 상기 서방성 주사형 골 이식재는 심바스타틴이 5일 후 10~20%, 15일 후 20~30%, 25일 후 30~40%가 용출될 수 있다.

본 발명의 다공성 골 이식재의 제조방법은 상기 심바스타틴 고정 다공성 이상 인산 칼슘 과립에 젠타마이신을 코팅하여, 젠타마이신 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 형성하는 4단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에서는 20mg (2wt%) 히알루론산(HA)을 생리식염수에 용해하여, 히알루론산 용액을 제조한 후, 여기에 10mg (1wt%) 젠타마이신(gentamicin)을 혼합하여 젠타마이신이 용해된 히알루론산(HA) 용액을 제조하였다. 이후 심바스타틴이 고정된 SV-MCG와 SV-PD-MCG를 젠타마이신(gentamicin)이 포함된 HA 용액에 침지시켜 젠타마이신이 코팅된 G-SV-MCG와 G-SV-PD-MCG를 제조하였으며, 상기와 같은 서방성 방출 프로파일을 가지는 생체재료를 이용하여 항균 효과를 관찰하였다. 그 결과, P. aureginosa(녹농균)와 S. aureus(황색 포도상구균)에 대한 항균 효과를 확인하였으며, 폴리도파민이 코팅된 MCG에 심바스타틴을 고정한 후, 젠타마이신을 코팅하여도 젠타마이신의 항생 효과가 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.

본 발명의 다공성 골 이식재의 제조방법은 상기 젠타마이신 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 생리식염수에 혼합하여 골 이식용 주사제로 제조하는 5단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에서는 상기와 같이, 폴리도파민-심바스탄틴-젠타마이신이 차례대로 코팅 또는 고정된 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 생리식염수에 혼합하여 골 이식용 주사제로 제조하였으며, 이를 토끼에 이식하여 골 재생능을 분석한 결과, MCG, PD-MCG, SV-PD-MCG, G-SV-MCG에 비해 G-SV-PD-MCG가 재생 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다.

또한, 본 발명에서, 상기 서방형 골 이식재는 골 재생, 항염 또는 항균 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 폴리도파민 코팅에 의해 골 재생이 증가하는 것을 확인하였으며, 심바스타틴 역시 서방성 방출 거동을 가지며, 골 재생을 촉진할 수 있다. 또한 젠타마이신 코팅에 의해 항균 효과가 있는 것을 확인하였으며, 추가적으로 상기 G-SV-PD-MCG가 항염 효과를 가지는 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어 "골 이식재"는 골 결손부에 이식되어 이를 충진하는 재료, 즉 골 결손부 보충재로서 사용되는 재료를 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서, 골 이식재는 BCP(biphasic calcium phosphate) 과립을 기반으로 다공성 이상 인산 칼슘 과립(multichannel biphasic calcium phosphate granule, MCG)에 폴리도파민-심바스탄틴-젠타마이신이 차례대로 코팅 또는 고정된 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 기초로 한 골 이식를 의미한다.

따라서, 상기와 같은 G-SV-PD-MCG는 골 이식재로서, 생체 적합성이 우수하고 골 이식재와 세포간 상호작용을 통해 세포 증식 및 골 재생 효과가 우수하고, 항균 효과를 보유할 수 있으며, 서방성으로 약물을 방출할 수 있어 효과적인 골 이식재로 사용될 수 있다.

도 1은 다공성 BCP 과립(MCG)의 과립구조 및 EDX의 형태학적인 특징을 나타낸 것이다. 도 1의 (a)는 저배율, (b)는 고배율, (c)는 세로 전달면 (고배율)의 SEM 현미경 사진이며, (d) XRD 스펙트럼, (e) EDX 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 표면개질된 다공성 BCP 과립(MCG)인, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 형태학적 및 화학적 조성을 분석한 것이다. 구체적으로, 도 2는 (a) C-MCG, (b) H-MCG, (c) PD-MCG의 SEM 및 EDX 이미지를 나타낸다.
도 3은 MCG와 표면개질된 C-MCG, H-MCG 및 PD-MCG 표면의 화학구조 분석을 위해 FTIR 분광학 분석을 수행한 것이다. 도 3은 MCG; C-MCG; H-MCG; PD-MCG의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 (a) 1일, 3일 그리고 7일 이후의 세포 생존능; (b) 7일 이후의 공 초점 현미경 이미지를 나타낸다.
도 5는 3주 그리고 6주 후 결손부 (대조군) 및 MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG가 이식된 대퇴골 결손부의 절단된 Micro-CT 2D 이미지를 나타낸다. 구체적으로, 이식 3주 그리고 6주 후 대조군 (결손부위), MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 2차원 micro-CT 이미지이다(빨간색 원은 경계선을 나타내며, 화살표는 새로 생성된 골을 나타냄).
도 6은 도 5의 Micro-CT 영상으로부터 계산된 이식 3주 그리고 6주 후에 형성된 신생 골의 부피 (BV/SV) 퍼센트를 나타낸 것이다.
도 7은 대조군 및 MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 5가지 유형의 샘플에 대한 조직학적 염색을 통한 골 내부의 성장정도를 관찰한 것이다. 구체적으로, 이식 3주 그리고 6주 후 hematoxylin and eosin과 Masson's Tricrome 염색법을 통한 대조군, MCG, C-MCG, H-MCG, PDMCG의 조직학적 저배율 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 이식 6주 후 hematoxylin and eosin과 Masson's Tricrome 염색법을 통한 MCG, C-MCG, H-MCG, PDMCG의 조직학적 고배율 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 SV-MCG와 SV-PD-MCG의 30일간의 Simvastatin (SV) 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 10은 P. aureginosa(녹농균) (A)와 S. aureus(황색 포도상구균)(B)와 다양한 농도의 MCG, SV-PD-MCG 및 G-SV-PD-MCG 디스크를 이용하여 얻어진 억제 영역(zones of inhibition)을 나타낸 것이다. 200mg/ml(w/v)의 MCG, SV-PD-MCG 및 G-SV-PD-MCG를 분쇄한 후 10배 희석하여 처리한 것이다. 사진은 Bio-Rad Chemidoc 및 ImageLab 2.0.1 소프트웨어 버전으로 촬영했다.
도 11은 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 염증 억제 효과를 MCG, SV-PD-MCG 및 G-SV-PD-MCG 재료를 이용하여 qRT-PCR을 사용하여 확인한 것이다. 도 12는 G-SV-PD-MCG를 식염수가 함유된 주사기에 넣어 주사용 골 이식재 형태로 제조하는 과정을 나타낸다.
도 13은 토끼를 이용한 주사형 골 이식재 이식과정을 나타낸다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1: 다공성 BCP 과립( multichannel BCP( biphasic calcium phosphate) granule, MCG)의 표면 처리

본 발명에서 다공성 과립(MCG)는 ㈜이노본(제품번호:OGFB100500)에서 구입하여 사용하였다.

다공성 BCP(biphasic calcium phosphate) 과립(MCG)의 표면처리는 효과적인 코팅을 위해 매우 중요하다. 이에, 다공성 BCP 과립(MCG)를 탈 이온수(DI)에 3번 완전히 세척시켰으며, 세척된 다공성 BCP 과립(MCG)을 -20℃에서 24시간 동안 동결 시킨 후 밤새 동결 건조시켰다. 상기 동결 건조된 다공성 BCP 과립(MCG)을 120℃에서 15시간 오토클레이브(멸균 소독)시켰으며, 오토클레이브된 다공성 BCP 과립(MCG)이 표면 코팅에 사용되었으며, 그 형태는 도 1a 에 도시되어 있다.

실시예 2: 다공성 BCP 과립( MCG )에 콜라겐 코팅

우선 0.1% (W/V)의 콜라겐 용액을 준비하기 위해 4mg/ml 콜라겐을 17.5 mM 아세트산에 희석하였다. 별도로 1% (W/V)의 BSA 용액을 약 2시간 동안 80℃에서 변성시켰다. 1g/ml의 다공성 BCP 과립(MCG)를 먼저 상기 변성된 1% (W/V)의 BSA 용액에 담그고 실온에서 약 2시간까지 쉐이커에 흔들어 주었다. 다음으로 BSA 용액을 제거한 후 상기 아세트산에 희석된 콜라겐 용액에 다공성 BCP 과립(MCG)를 침지했다. 상기 콜라겐 용액에 침지된 다공성 BCP 과립(MCG)를 4℃에서 12시간 동안 배양시켰다. 가교액을 준비하기 위해, 4mg EDC/2.4mg NHS를 0.05M MES 완충액 (pH 5.6) 2ml에 용해시켰다. 콜라겐이 도포된 다공성 BCP 과립(MCG)는 상기 용해된 EDC/NHS 가교 용액과 함께 혼합되었다. 마지막으로 상기 혼합된 다공성 BCP 과립(MCG)를 건조시키고 12시간 동안 동결 건조시켜서, 콜라겐이 코팅된 다공성 BCP 과립(MCG)을 얻었으며, 이를 C-MCG로 명명하였다.

실시예 3: 다공성 BCP 과립( MCG )에 헤파린 코팅

우선 1g/ml 다공성 BCP 과립(MCG)를 10% (w/v)의 헤파린 용액에 담그고 4℃에서 12시간 동안 침지시켰다. 이어서 헤파린이 도포된 다공성 BCP 과립(MCG)를 EDC/NHS 가교 용액에 침지시킨 후 이전과 동일한 세척과정을 진행하였다. 상기 세척된 헤파린이 코팅된 다공성 BCP 과립(MCG)을 건조시킨 후 12시간 동안 동결 건조 건조시켜서, 헤파린이 코팅된 다공성 BCP 과립(MCG)을 얻었으며, 이를 H-MCG로 명명하였다.

실시예 4: 다공성 BCP 과립( MCG )에 폴리도파민 코팅

4mg/ml 도파민 하이드로 클로라이드 용액을 10 mM 트리스 (하이드록시메틸) 아미노 메탄 용액과 혼합하여 폴리도파민 용액을 제조하였다. 1g/mL 다공성 BCP 과립(MCG)를 상기 제조된 폴리도파민 용액에 침지하고, 이를 24시간 동안 쉐이커에서 두고, 다공성 BCP 과립(MCG의 표면)에 폴리도파민을 고정시켰다. 이후 약 6~10회 정도의 반복적인 세척과정을 거친 후 코팅된 다공성 BCP 과립(MCG)를 4℃에서 건조시킨 후 24시간 동안 동결 건조시켜서, 폴리도파민이 코팅된 다공성 BCP 과립(MCG)을 얻었으며, 이를 PD-MCG로 명명하였다.

실시예 5: 다공성 BCP 과립( MCG )과 PD- MCG에 심바스타틴 고정

심바스타틴(Simvastatin) 0.6mg을 아세토니트릴(Acetonitrile) 1ml에 용해시켜 심바스타틴 용액을 제조하였다. 1g의 MCG(직경 1mm)와 PD-MCG를 상기 제조된 1ml의 심바스타틴 용액에 2시간 동안 침지시켰다. 이렇게 심바스타틴이 고정된 MCG와 PD-MCG를 -80℃에서 2시간 동안 동결하였으며, 이후 밤새 동결 건조하였다. 상기 심바스타틴이 고정된 샘플을 각각 SV-MCG와 SV-PD-MCG로 명명하였다.

실시예 6: SV - MCG와 SV -PD- MCG에 젠타마이신 코팅

20mg (2wt%) 히알루론산(HA)을 생리식염수에 용해하여, 히알루론산 용액을 제조한 후, 여기에 10mg (1wt%) 젠타마이신(gentamicin)을 혼합하여 젠타마이신이 용해된 히알루론산(HA) 용액을 제조하였다. 심바스타틴이 고정된 1g의 SV-MCG와 SV-PD-MCG를 젠타마이신(gentamicin)이 포함된 HA 용액에 침지시켰다. 마지막으로 이를 2~3시간 동안 진공오븐에 건조시켜서 샘플을 준비하였으며, 이를 G-SV-MCG와 G-SV-PD-MCG로 명명하였다.

실시예 7: 항생제 효과 검사

a) 박테리아

그램 (+) 박테리아인 황색 포도상구균 (ATCC 6538)와 그램 (-) 박테리아인 녹농균 (ATCC 9027)를 Mueller-Hinton 한천배지에 배양시켰다. 이후 싱글 콜로니를 LB 배지에 접종하여, 37℃에서 2시간 배양한 후에, 이를 Mueller-Hinton 아가(agar) 플레이트에 접종하였다.

b) 세포배양

Mouse macrophage Raw 264.7 세포를 ATCC (VA, USA)에서 구입했으며, 10% 태아 소 혈청 및 1% (v/v) 항생제/항균용액 (100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토 마이신)을 함유하는 고포도당의 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)에서 배양하였다.

c) 양적 RT-PCR(Quantitative Reverse-Transcription-Polymerase Chain Reaction)

Mouse macrophage Raw 264.7 세포에 2시간 동안 LPS (2g/ml)를 처리한 후, 상기 실시예들에서 제조된 생체재료 MCG, SV-PD-MCG, G-SV-PD-MCG (10mg/ml)를 분쇄하여 처리하여 24시간 동안 세포를 배양한 후에, RNA 추출 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 RNA를 추출하였으며, RNA 전체의 농도는 scandrop analytik jena AG 분광 광도계(Jena, Germany)를 통해 측정하였다. 추출된 RNA (1 μg)는 Maxime RT PreMix 키트(Intron Biotechnology, Seoul, Korea)로 cDNA를 합성하기 위해 RT-PCR을 수행하였으며, 이 반응은 Veriti 96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystems, Singapore) 내에서 수행되었다. 정량적 실시간 PCR(Quantitative real-time PCR)은 iQ™ SYBR Green Supermix 키트(Bio-Rad, Singapore)를 사용하여, CFX96™ RT-PCR 검출 시스템(Bio-Rad, Singapore)에서 수행되었다.

본 발명에서 사용된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다. 표적 유전자 발현 양은 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(Gapdh)의 양으로 정상화시켰다(normalized).

	Primer Sequences (mouse) (5'-3′')
Name	Forward	Reverse
Tnfa	TGTCTCAGCCTCTTCTCATT	AGATGATCTGAGTGTGAGGG

d) 통계 분석-정량화는 두 번의 실험의 평균 ± SD로써 정의되며, 대조군의 배수 변화로 표시했다. 본 연구의 Student's t test를 통해 통계적으로 유의한 차이를 계산하였으며, 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의하다고 간주된다.

실험예 1: 다공성 BCP 과립(MCG)와 폴리도파민이 코팅된 MCG (PD- MCG ) 분석

도 1은 다공성 BCP 과립(MCG)의 과립구조 및 EDX의 형태학적인 특징을 나타낸 것이다. 도 1의 (a)는 낮은 배율, (b)는 높은 배율, (c)는 세로 전달면 (높은 배율)의 SEM 현미경 사진이며, (d) XRD 스펙트럼, (e) EDX 스펙트럼을 나타낸다.

도 1의 (a)를 참고하면, 낮은 배율에서의 SEM에서 다공성 BCP 과립(MCG)는 직경이 1mm인 원기둥 형상을 가지고 있고, 170 내지 180 μm의 직경을 갖는 복수의 기공을 보유하였다. 이러한 다공성의 상호연결된 네트워크 구조는 불규칙한 기공구조를 가지며, ImageJ를 통한 체적분석으로부터 구체적으로, 평균 약 175μm의 직경을 가지는 복수의 기공이 존재함을 확인할 수 있었다(도 1a). 도 1a의 선택된 구역의 고배율이미지에서 구별가능한 경계면 (G.B.)과 함께 치밀한 반구형의 다공성 구조를 확인하였다(도. 1b). 다공성 BCP 과립(MCG)의 고배율 종단면 내부에서 상호 연결된 다공성 구조를 확인하였다(도. 1c). 또한, X-Ray 회절 패턴을 통해 다공성 BCP 과립(MCG)에서 hydroxylapatite (HAP, ICDD No: 01-072-1243)와 tricalcium phosphate (TCP, ICDD No: 01-072-7587)이 공통적으로 확인되었다(도. 1d). 상기 다공성 BCP 과립(MCG)의 조성분석을 통해 Ca, C, P 및 O 원소의 존재를 확인하였다(도. 1e).

실험예 2: 코팅된 C- MCG , H- MCG 및 PD- MCG 표면의 비교 분석

도 2는 표면개질된 다공성 BCP 과립(MCG)인, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 형태학적 및 화학적 조성을 분석한 것이다. 구체적으로, 도 2는 (a) C-MCG, (b) H-MCG, (c) PD-MCG의 SEM 및 EDX 이미지를 나타낸다.

도 2a에서 다공성 BCP 과립(MCG)의 상단부분에 상호연결된 콜라겐 섬유가 확인되었다. 또한 EDX 분석을 통해 콜라겐 코팅된 다공성 BCP 과립(MCG) 표면에서 Ca, N, P, C 및 O 원소가 확인되었다. 헤파린 (도. 2b) 및 폴리도파민 (도. 2c)의 첨가로 인한 다공성 BCP 과립(MCG) 표면의 특별한 변화를 확인할 수 없었으나, 표면개질 이후 표면 윤곽선이 다소 희미해졌으며, 희미해진 표면 윤곽선은 헤파린 및 폴리도파민 코팅에 의한 것으로 보인다. 그러나 몇몇 섬유형태의 침전물이 헤파린(도. 2b)과 폴리도파민 (도. 2c) 코팅된 표면에서 발견되었다. 정량분석 결과 H-MCG에서 Ca, C, P, O와 함께 S 및 N 원소가 나타남에 따라 헤파린이 성공적으로 코팅된 것을 알 수 있었다(도. 2b). PD-MCG에서도 Ca, C, P, O와 함께 N 원소가 나타남에 따라 폴리도파민이 성공적으로 코팅된 것을 알 수 있었다(도. 2c). 표면 개질된 다공성 BCP 과립(MCG)인 C-MCG, H-MCG 및 PD-MCG 모두 균일하고 균열없는 표면형태를 보여주었다. 이처럼 콜라겐, 헤파린 및 폴리도파민의 코팅은 다공성 BCP 과립(MCG)의 다공성 구조에 별다른 영향을 주지 않았다. 각 유형별 코팅 이후에 결정립 경계면이 사라짐에 따라 표면 전체에 코팅제가 균일하게 코팅됨을 확인하였다(도. 2a-c).

도 3은 MCG와 표면개질된 C-MCG, H-MCG 및 PD-MCG 표면의 화학구조 분석을 위해 FTIR 분광학 분석을 수행한 것이다. 도 3은 MCG; C-MCG; H-MCG; PD-MCG의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다.

개질화되지 않은 MCG는 960-1035 cm^- ¹범위에서의 PO₄ ^3-결합기와 1106 cm^-1에서의P-O결합기를 나타내었다. MCG의 FTIR 분석결과 도 1d의 XRD에서 확인된 hydroxyapatite (HAP), tricalcium phosphate (TCP)와 일치하는 패턴을 보였다. 콜라겐 결합기의 특징인 1644 cm^-1 (amide I, C=O), 1538 cm^-1 (amide II, N-H stretching 및 C-N deformation) 및 1456 cm^-1 (C-N deformation)에서의 흡광도 발현을 통해 콜라겐이 MCG에 성공적으로 코팅되었음을 확인하였다. H-MCG의 FTIR 스펙트럼을 통해 1240-1260 cm^-1에서 흡수 피크를 보이는 사카라이드 그룹의 S=O 결합기와 3400 cm^-1에서의 -OH 결합기를 확인하였다. 또한 1626 cm^- ¹와 1410 cm^-1범위 사이에서 일부 C=O와 N-H 결합기를 통해 MCG상에 추가된 헤파린의 코팅을 확인하였다. PD-MCG 역시 FTIR 스펙트럼을 통해 명확하게 폴리도파민의 코팅을 확인하였다. 3379 cm^-1주변에서의 높은 흡광도를 통해 폴리도파민의 -OH 및 N-H 결합기를 확인할 수 있었으며, 1500-1600 cm^- ¹범위에서 다양한 N-H 결합기가 확인되었다. 게다가, 1627 cm^-1 및 1296 cm^-1의 피크가 각각 C=O 및 C-O 결합기에서 기인되었음을 확인하였다.

실험예 3: 세포 생존능 분석

도 4는 MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 (a) 1일, 3일 그리고 7일 이후의 세포 생존능; (b) 7일 이후의 공 초점 현미경 이미지를 나타낸다. 그 결과, MCG에 비해 C-MCG, H-MCG, PD-MCG에서 세포생존능이 증가하였으며, 1일에 비해, 3일, 7일로 기간이 경과할수록 세포 생존능은 더욱 증가하였다.

실험예 4: 대퇴골 결손부의 골 재생능 측정

도 5는 3주 그리고 6주 후 결손부 (대조군) 및 MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG가 이식된 대퇴골 결손부의 절단된 Micro-CT 2D 이미지를 나타낸다. 구체적으로, 이식 3주 그리고 6주 후 대조군 (결손부위), MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 2차원 micro-CT 이미지이다(빨간색 원은 경계선을 나타내며, 화살표는 새로 생성된 골을 나타냄).

도 6은 도 5의 Micro-CT 영상으로부터 계산된 이식 3주 그리고 6주 후에 형성된 신생 골의 부피 (BV/SV) 퍼센트를 나타낸 것이다.

그 결과, 이식 3주 후 MCG와 모든 샘플에서 현저히 향상된 골 형성은 관찰되지 않았다(도. 5). 그러나 6주 후 MCG 사이의 공간과 내부에 생성된 신생 골이 Micro-CT 이미지를 통해 명확히 관찰되었다 (도. 5의 7)-10)). PD-MCG 주변과 내부 공간에 더 크게 채워진 신생 골로부터, PD-MCG의 골 재생능이 C-MCG와 H-MCG보다 우수함을 확인하였다. 반면 H-MCG는 가장 낮은 골 재생능을 보였다.

실험예 5: 골 내부의 성장 평가

도 7은 대조군 및 MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 5가지 유형의 샘플에 대한 조직학적 염색을 통한 골 내부의 성장정도를 관찰한 것이다. 구체적으로, 이식 3주 그리고 6주 후 hematoxylin and eosin과 Masson's Tricrome 염색법을 통한 대조군, MCG, C-MCG, H-MCG, PDMCG의 조직학적 저배율 이미지를 나타낸 것이다. 도 8은 이식 6주 후 hematoxylin and eosin과 Masson's Tricrome 염색법을 통한 MCG, C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 조직학적 고배율 이미지를 나타낸 것이다.

도 7에서는 3주 그리고 6주간 이식된 각 샘플에 대한 성능비교를 낮은 배율로 나타내었다. 결손부위 전체는 직사각형의 경계선으로 표시했다. 낮은 배율에서 관찰된 표면 개질된 샘플 사이에는 유의미한 차이를 확인할 수 없었으나 대조군에 비해 매우 우수한 골 재생력이 확인되었다. MCG와 표면개질된 C-MCG, H-MCG, PD-MCG를 비교 분석하기 위해 중심 구역(적색 경계구역)을 선정하여 결손부로의 세포 이동과 과립 사이의 골 전도성(osteoconduction)을 관찰하였으며, 이러한 결과들을 도 8을 통해 확인하였다.

도 8에서 보여지는 것과 같이 골 전도성은 선택된 영역(고배율 이미지)에서의 성숙된 골에 의해 평가되었다. 모든 결과에서 표면개질된 C-MCG, H-MCG, PD-MCG의 골 치유능은 MCG보다 높았다. 3주 후 결손부위 중심으로의 1차적 골형성은 MCG, C-MCG, H-MCG보다 PD-MCG에서 더욱 빠르게 진행되었다(도. 7). 6주 후 치유 부위의 성숙된 골 조직이 도 8에서 더 높은 배율로 명확하게 보여지며, 염색된 샘플의 고배율 이미지 중 PD-MCG에서 가장 높은 골 유동성을 보이는 것을 확인하였다(도. 8). 이러한 PD-MCG의 우수한 골 형성은 골 유도 신호의 효과적인 전달에서 기인하는 것이다. 따라서, 항생제인 폴리도파민으로 코팅된 MCG는 전체 샘플 중 가장 높은 잠재력을 보였으며, 이는 골 이식재에 가장 알맞은 후보가 될 수 있다고 판단된다. Micro-CT 와 조직학적 염색에 의해 분석된 in-vivo 연구 결과를 종합하여 PD-MCG> C-MCG> H-MCG> MCG 순서의 골 재생 효능을 확인하였다.

실험예 6: SV - MCG와 SV -PD- MCG의 심바스타틴 방출 거동 분석

본 실험에서는 앞선 실험들에서 콜라겐, 헤파린 보다 골 재생 효과가 우수한 것으로 확인된 폴리도파민이 코팅된 PD-MCG를 이용하여 심바스타틴을 고정한 SV-PD-MCG의 방출 거동을 폴리도파민을 코팅하지 않은 MCG와 비교하였다.

도 9는 SV-MCG와 SV-PD-MCG의 30일간의 Simvastatin (SV) 방출 거동을 나타낸 것이다. SV-PD-MCG는 30일 동안 일정한 간격으로 simvastatin을 지속적으로 방출하였다. 이는 MCG에 코팅된 Polydopamine과 Simvastatin의 공유결합을 통해 Simvastatin을 지속적으로 방출하게 되는 것이다. SV-MCG에서 초기 방출양은 높았으나, 7일이후부터 simvastatin의 방출 양이 급격히 저하되었다. 반면, SV-PD-MCG에서는 MCG와 그 인접 주위에 골 형성을 자극할 수 있을 정도의 simvastatin의 방출 프로파일이 지속적으로 확인되었다(도. 9). 또한, 도 9의 심바스타틴 방출거동을 통해 SV-MCG에서는 7일 이전에 코팅된 심바스타틴 대부분이 방출됨에 반하여, SV-PD-MCG의 경우 측정된 30일간 비교적 일정한 양의 심바스타틴이 지속적으로 방출됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, SV-MCG에 비해 SV-PD-MCG가 지속적인 골세포 유도에 중요한 역할을 할 것을 알 수 있었다.

따라서, SV-MCG에 비해, 폴리도파민이 코팅된 SV-PD-MCG는 심바스타틴의 지속 가능한 방출 프로파일을 보여줌으로써 성장인자 방출의 좋은 매개체로서 적용 가능한 것을 알 수 있었다.

실험예 7: SV -PD- MCG와 G- SV -PD- MCG의 항균 효과 측정

젠타마이신(gentamicin)으로 코팅된 생체적합성 물질의 항균효과를 알아보기 위해 Gram (+) 및 Gram (-) 박테리아를 이용한 디스크 확산 분석을 수행하였다. 도 10은 P. aureginosa(녹농균) (A)와 S. aureus(황색 포도상구균)(B)와 다양한 농도의 MCG, SV-PD-MCG 및 G-SV-PD-MCG 디스크를 이용하여 얻어진 억제 영역(zones of inhibition)을 나타낸 것이다. 200mg/ml(w/v)의 MCG, SV-PD-MCG 및 G-SV-PD-MCG를 분쇄한 후 10배 희석하여 처리한 것이다. 사진은 Bio-Rad Chemidoc 및 ImageLab 2.0.1 소프트웨어 버전으로 촬영했다.

도 10에서 20 mg/ml의 G-SV-PD-MCG 생체재료로 처리된 디스크는 황색 포도상 구균과 녹농균 모두에서 20mm와 19mm의 명확한 억제 영역을 확인할 수 있었으나, 젠타마이신(gentamicin)을 포함하지 않은 MCG 및 SV-PD-MCG 생체재료에서는 억제 영역을 확인할 수 없었다. 이러한 결과로부터 gentamicin이 고정된 생체재료에서 항균 효과가 큰 것을 디스크 확산 분석을 통해 알 수 있었다. 따라서, 폴리도파민이 코팅된 MCG에 심바스타틴을 고정한 후, 젠타마이신을 코팅하여도 젠타마이신의 항생 효과가 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.

실험예 8: G- SV - MCG와 G- SV -PD- MCG의 항염 효과 측정

도 11에서는 폴리도파민-심바스타틴-젠타마이신이 차례로 코팅 또는 고정된 G-SV-PD-MCG가 TNFα와 같은 전염증성 유전자의 발현을 조절할 수 있는지를 확인하기 위해 qRT-PCR검사를 수행하였다. LPS는 전염증 유전자인 TNFα 유전자의 발현을 유도하기 위하여 전처리 하였다.

도 11은 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 염증 억제 효과를 MCG, SV-PD-MCG 및 G-SV-PD-MCG 재료를 분쇄한 후 처리하여 qRT-PCR을 수행한 결과이다. 기 유전자의 발현은 하우스키핑 유전자 Gapdh로 정상화하였다. 데이터는 두 개의 개별 실험의 평균 SEM 값을 나타낸 것이다. #P < .05, 대조군과 유의한 차이가 있는 것을 의미하고, *P < .05, LPS 군과 유의한 차이가 있음을 의미한다.

상기 도 11에서 확인된 바와 같이, LPS에 의해 유발된 TNFα의 유전자의 발현을 G-SV-PD-MCG가 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 이를 통해, 폴리도파민-심바스타틴-젠타마이신이 차례로 코팅 또는 고정된 생체재료 G-SV-PD-MCG가 염증성 유전자의 발현을 억제시킴을 확인할 수 있었다.

실험예 9: G- SV -PD- MCG를 포함하는 주사형 골 이식재의 골 형성 효과

도 12는 상기 G-SV-PD-MCG를 식염수가 함유된 주사기에 넣어 주사용 골 이식재 형태로 제조한 것이다. 뿐만 아니라, 앞서 제조된 MCG, PD-MCG, SV-PD-MCG 역시 동일하게 주사형 골 이식재로 사용하기 위하여, 식염수가 함유된 주사기에 넣어 주사용 골 이식재 형태로 사용하였다.

본 실험에서는 흡입마취 (마취제:이소플로란)법을 이용하여 토끼(New Zealand white rabbit, 3 kg)를 마취시켰으며, 수술 시간은 10분 내외로 진행하였다. 구체적으로, 흡입마취 기기를 사용하여 수술용 산소통과 이소플로란 용기를 기기에 연결시켜 챔버 내에 토끼를 두고 마취시켰다. 마취된 후, 산소호흡기와 같은 흡입마취기를 호흡기에 씌워주어 마취를 연장시켰다.

다음으로, 토끼 대퇴부에 털을 제거한 뒤, 70% 에탄올로 소독 후 아이오다인으로 재소독하였다. 이 후, 오른쪽 대퇴부의 일부 조직을 절재한 후 직경 8mm, 깊이 5mm의 골 결손을 trephine drill을 이용하여 만들어 주었다. 이때 탈수방지를 위해 식염수로 세척해 주었다. 상기 골 결손 부위에 앞서 제조된 MCG, PD-MCG, SV-PD-MCG, G-SV-PD-MCG의 골 이식재를 이식하고 식염수로 세척하였다. 충진완료 후 내피를 봉합하고, 외피를 봉한 뒤 소독을 완료하였다. 도 13은 토끼를 이용한 주사형 골 이식재 이식과정을 나타낸다. 이식을 완료한 토끼는 동물실로 옮긴 후 상태를 관찰하며 사육하였다. 해열, 진통, 소염제인 도란찐주를 매 1일 1회 20mg/kg의 용량으로 복강주사하였다. 이식 1개월, 2개월 후 토끼를 희생시킨 후 대퇴부의 이식샘플을 적출하였으며, 적출된 조직 및 샘플은 포름알데하이드 용액에 고정된 후 Micro-CT 및 조직병리학적 검사에 이용하였으며, 골 재생능 및 조직형성 거동을 분석하였다.

그 결과, G-SV-PD-MCG 골 이식재를 이식한 경우, 다른 골 이식재에 비하여 골 재생 효과가 가장 우수하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

다공성 이상 인산 칼슘 과립(multichannel biphasic calcium phosphate granule, MCG)을 탈 이온수에 세척하여 표면을 처리하는 1단계; 및
표면 처리된 상기 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 폴리도파민으로 코팅하여 폴리도파민 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 형성하는 2단계
상기 폴리도파민 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립에 심바스타틴을 고정하여 심바스타틴 고정 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 형성하는 3단계;
상기 심바스타틴 고정 다공성 이상 인산 칼슘 과립에 젠타마이신을 코팅하여, 젠타마이신 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 형성하는 4단계; 및
상기 젠타마이신 코팅 다공성 이상 인산 칼슘 과립을 생리식염수에 혼합하여 골 이식용 주사제로 제조하는 5단계
를 포함하는, 서방성 주사용 골 이식재의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 다공성 이상 인산 칼슘 과립은 직경이 1mm인 원기둥 형상을 가지고 있고, 170 내지 180 μm의 직경을 갖는 복수의 기공을 보유하는 것인, 서방성 주사용 골 이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 서방성 주사용 골 이식재는 심바스타틴이 5일 후 10~20%, 15일 후 20~30%, 25일 후 30~40%가 용출되는 것인, 서방성 주사용골 이식재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 서방형 골 이식재는 골 재생, 항염 또는 항균 효과를 가지는 것인, 서방성 주사용 골 이식재의 제조방법.