JPH04507099A - 改良型の塩基性線維芽細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 型の塩基性　維　残置−１ １亙立互 本発明は、蛋白組成物を安定化する技術に関わる。さらに詳細には、ジスルフィ ド１．あるいは、他のＳ−３共有結合を形成できる化合物により、塩基性線維芽 細胞増殖因子を処理し、安定化する技術に関するものである。

ＬＬ区歪 所望する蛋白をリコンビナントに製造することに伴う、解決の難しい問題の一つ は、リコンビナント産生物の適切なプロセッシング及び折り畳み構造を得ること にある。蛋白の一次構造をコードしている遺伝子は、一般に、それが正常（こ複 写及び翻訳される宿主とは異なる宿主系内で発現されるので、その結果得られる 産生蛋白は、正しいアミノ酸配列を有する一方で、本来の蛋白とは性質が異なっ ている。ある場合には、この違いの一部は、分子構造の変化によることもある一 正常には伴って起きるグリコジル化の欠如が最も一般的である。

しかし、蛋白の三次元構造は、細胞環境により異なり得ることも理解すべきであ る。特に、種々のりコンビナンド宿主（ま、通常は細胞成分に付随している酸化 又は還元のレベルに関して異なる環境を有しているために、本来の蛋白とは異な るジスルフィド結合組成を含有し、さらに、一般的には、三次元構造の異なった 、リコンビナント蛋白を産生ずる。これらの変異は、蛋白の挙動及び活性に有害 な影響を与えること力ｆある。

塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の場合、本来の分子がグリコジル化され ていないので、グリコジル化パターンには関連しない。しかしながら、リコンビ ナントに製造された物質は、脳下垂体から単離された物質とはクロマトグラフィ ーの挙動が異なり、そして、溶液中での多量体化を防止しするために手段を講じ ない場合には、安定性の問題が生じる。本発明者がここに示し、さらに５ｅｎｏ 、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｅｈｅｍ　Ｂｉ。

■１１匣」互駐（１９８８）是、１ニア０１．に開示されているように、位置第 ７８番及び第９６番のシスティンをセリンで置換すると、多量体化が阻止される 。天然の牛脳下垂体から単離したｂＦＧＦも場合もまた、多量体化しない。単離 された本来の牛脳下垂体のｂＦＧＦのアミノ酸組成分析により、遺伝子は４個の システィンしかコードしていないのに、６個のシスティンが存在していることが 示された。この付加的なシスティン残基は、蛋白にジスルフィドが結合したもの であると提言された。（Ｅｓｅｈ、　Ｆ、。

ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｅａｄ　Ｓｅｉ　ＵＳＡ　（１９１１ ５）　８２：６５０７．）。

自然現象として、蛋白が、シスチン又はグルタチオンジスルフィドとの反応によ り、システィンあるいはグルタチオンとの複合体を形成することは、昔から示唆 されまた教示されていた。１９６０年に、Ｅａｇｌｅ、　Ｈ，、ａｔ　ａｌ、、 　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９６０＞　２３５：１７１９−１７２６．は、 哺乳類細胞培養物は、例えば、システィン、５２０３−”、及びチオグリコール 酸塩を含むＳ−５共育結合を形成できる化合物を添加すると、保持されることを 示した。

この著者らは、培地中の蛋白は、Ｓづ結合によりこれらの試薬と結合したと推論 している。ヒト血清アルブミンは、恐らくジスルフィド結合により二型体型で、 また、システィンまたはグルタチオンにより安定化され単量体型で存在すること が、Ｋｉｎｇ、　Ｔ、Ｐ、、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｒａ（１９６１）　２３６ ：ＰＣ５，により、教示された。グルタチオンと結合することは、ヘモグロビン の不均一性を説明するために、Ｈｕｉｓｍａｎ、　Ｔ、Ｉｉ、、　ｅｔ、　ａｌ 、、　Ｊ　Ｌａｂ　＆　Ｃ１１Ｌ拐世（１９６２）赳：３０２−３１９．により 、提案された。

Ｆｒａｎａｐ、　Ｋ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ 　Ａｃｔａ　（１９７３）　３１０：ＬＯ４−１１０，は、グルタチオンと血清 アルブミンとの混合ジスルフィドの存在を示し、さらに、これらがグルタチオン 還元酵素により還元されることを見いだした。ｌ５ａａｃｓ、　Ｊ、、　ｅｔ　 ａｌ。

、肛匹肚り肛並■Ｌ紋凰（１９７７）　４９ユニ１９２−２０４．は、蛋白とグ ルタチオンとの混合ジスルフィドの形成は、Ｓ−Ｓ／ＳＨ比を調節するための手 段であると提案した。逆に、Ｍａｎｎｅｒｖｆｔｃ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｂｉｏｅｈｉｍ　Ｊ　（１９８０）　封印５：１２５−１３０．は、蛋白とのジ スルフィドの形成は、蛋白活性の調節のための機構であると、仮定した。その例 としてピルビン酸キナーゼが挙げられた。

多くの哺乳類に於てｂＦＧＦをコードし、ている遺伝子中の３４及び１０１位に システィン残基が保存されていることから、これら二つの残基の間に分子内ジス ルフィドが形成されていると仮定され、そして、７８及び９６位の位置でシステ ィンがセリンに置き替わった変異型のりコンビナンドｂＦＧＦに於てこのジスル フィドの形成が報告された（Ｆａｘ、　Ｇ、Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｂｉ ｏｌ　Ｃｂｅ匹（１９８８）凝旦：１８４５２＞。

リコンビナント的に製造されたｂＦＧＦに、グルタチオンの様な有機ジスルフィ ド含有化合物を添加すると、安定性の増大と、本来の蛋白により近い挙動が得ら れることが、発見された。この安定化型のｂＦＧＦを精製すると、薬理学的に適 用される処方に適した調製物が得られる。

＆豆立肌丞 本発明は、安定で、使い易すく、活性が本来の蛋白と同等な、そして、薬理学的 製剤に適用可能な形態の、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を、提供する 。この形態は、影響され易い型の塩基性線維芽細胞増殖因子、あるいは、その類 似体を、例えば、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）の様な有機ジスルフィ ドでｂＦＧＦとＳ−３共有結合形成可能な保護試薬と処理することにより得られ る。この様にして安定化したｂＦＧＦを、次に、薬理学的あるいは他の組成物と して用いるために、標準的なりロマトグラフィー技術によりさらに精製する。

この様に、一つの見地からは、本発明は、塩基性線維芽細胞増殖因子蛋白を安定 化する方法に関するものでありこの方法は以下の工程を包含する。即ち、ｂＦＧ Ｆのアミノ酸配列を有する影響を受けやすいペプチドを、ｂＦＧＦとＳ−３共有 結合を形成できる、好適にはＲが有機置換基であって構造式Ｒ５５Ｒの化合物で ある、保護試薬の、多１体化を防止するのに有効な量を用いて、ｐＨ６あるいは それ以上であって前記ｂＦＧＦが変質しないｐＨの緩衝液存在下で、該安定化操 作が効果を発揮するのに十分な時間、処理する工程を包含する。

他の見地からは、本発明は、本発明の方法にしたがって調製されたｂＦＧＦ、及 び、本発明の方法に有用な組成物に関する。

図面の簡単な説明 図１は、リコンビナント体ｂＦＧＦ、及び、そのリコンビナント体Ｃ７８／９６ ３類似体を、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）　テ処理した場合、及び、 処理しない場合の逆相）ＩＰＬＣ分析の結果を示している。

図２は、Ｇ５５Ｇで処理したりコンビナンド体ｂＦＧＦ、及び、牛脳下垂体ｂＦ ＧＦ、の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示している。

図３１Ｌ　Ｇ５５Ｇで処理していないリコンビナント体ｂｐａｐ、　及び、Ｇ５ ５Ｇで処理したｂＦＧＦ、の活性曲線を示す。

図４は、銅イオン（Ｃｕ４２）で前処理した場合としない場合の、Ｇ５５Ｇで処 理し、または、処理しない、リコンビナント体ｂＦＧＦ。

および、銅イオン（Ｃｕ”’）で前処理した場合としない場合の、Ｇ５５Ｇで処 理した牛脳下垂体ｂＦＧＦ、のヘパリン−ＴＳＫ　）ＩＰＬＣ分析の結果を比較 したものである。

図５は、ｂＦＧＦを、Ｇ５５Ｇで処理した場合、及び、処理しない場合の、ヘパ リン−ＴＳＫ　ＨＰＬＣ分析の結果を、三日間にわたり、比較したものである。

図６は、システィンで処理したりコンビナンド体ｂＦＧＦ、及び、天然の牛脳下 垂体ｂＦＧＦ、の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を比較したものである。

図７は、Ｇ５５Ｇでの前処理をした場合及びしない場合の、リコンビナント体ｂ ＦＧＦ類似体の、逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示したものである。

図８及び図９は、それぞれ牛およびヒトの、塩基性ＦＧＦをコードするＤＮＡ配 列およびそれらから推定されるアミノ酸配列である。

汀を　るための≦態 本発明で用いられている塩基性線維芽細胞増殖因子という用語は、ｐＨ７におい てカチオン性であり、そして、牛の脳及び副腎皮質由来毛細管内皮細胞（ａｄｒ ｅｎａｌ　ｃｏｒｔｅｘ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｎｄｏｔｈ ｅｌｉａｌ　（ＡＣＥ）　ｃｅｌｌ）、ヒト腰帯静脈内皮細胞、牛の副腎皮質細 胞、胞状卵胞顆粒層細胞、あるいは、血管の平滑筋細胞、等の培養細胞にｉｎ　 ＶｔｔｒＯ試験で使用した際にマイトジェン活性を示すことが可能な、蛋白とし て定義される。

これらの培養細胞を用いたｆｎ　ｖｉｔｒｏ試験については、　Ｇｏｓｐｏｄａ ｒｏｖｉｃｚ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　（ １９８５）　１２２：３２３−３３２、、　Ｇａｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ 、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｆｏｌ　（１９１１３）　９７：１６ ７７−１６８５．、Ｅｓｃｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａ ｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８５）　８２：６５０７−６５１１．、及び、Ｇｏ ｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｚ、Ｄ、、ａｔ　ａｌ、、Ｊ　Ｃｅ旦」■■虹（１９８６ ）庄：１２１−１３６．、に記載されている。さらに、鶏の奥尿膜を用いたｉｎ 　ｖｉｖｏ試験についても、Ｇｏｓｐｏｄａｒ。

ｖｆｃｚ、　Ｄ、、　ｉｎ　”Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｐ ｅｐｔｉｄｅｓ−Ｘｌｌ：２０５−２３０　（Ａｃａｄｅｍｆｃ　ｐｒｅｓｓ） 、に記載されている。ｐ）ｌ　７においてカチオン性であり、そして、上記の試 論の少なくとも一つに活性を持つ蛋白が、塩基性ＦＧＦと定義される。

この定義を満足するアミノ酸配列には、様々な実施様態がある。好適な実施様態 は、それぞれ牛及びヒトのライブラリーから単離された遺伝子にコードされた、 塩基性ＦＧＦのアミノ酸配列を示した、図８及び図９に示したものである。これ らの遺伝子は、図中の配列の下に”ｌ“と番号付られたプロリンから始まる１４ ６個のアミノ酸を持つ、例えば脳下垂体などから一般に単離された、蛋白をコー ドしている。この示されたヒト及び牛の１４６個のアミノ酸配列は、本発明の方 法が応用可能な塩基性ＦＧＦの二つの好適な例である。図８及び図９に示した蛋 白の活性型で、図に示したように、１４６個のアミノ酸の配列のＮ−末端に伸張 部分を有するもの、および、１４６個のアミノ酸の配列のＮ−末端から１５個以 上のアミノ酸の配列を失ったもの、等も好適である。特に好適なのは、Ｎ−末端 のメチオニン（これは、バクテリア中でリフンビナントｂＦＧＦを産生する間に 取り除かれる）を除く７個または８個のアミノ酸を上流にすべて持つアミノ酸配 列の、全体で１５３個か１５４個のアミノ酸を含有する型であり、また、基本配 列から最初の１５個のアミノ酸を欠き、１３１個のアミノ酸を含む、短縮型であ る。リコンビナント的に蛋白を製造すると、完全な１５５個のアミノ酸配列の発 現したものから、翻訳後のプロセッシングによりＭｅｔが取り除かれ、１５４個 のアミノ酸型が得られる。配列の上部に番号付された２あるいは３の位置に示さ れたＡｌａから始まる、１５３個または１５４個のアミノ酸型若しくは、その混 合物が最も好適である。

一般的に、本明細書に用いている番号付体系は、配列の上部の番号を指している 。

塩基性ＦＧＦの定義の中に入っており、前述の試験の少なくとも一つ以上でＦＧ Ｆ活性を示し、中性ｐＨにおいてカチオン性であるうえに、さらに、ヘパリンと 結合し、また、アミノ末端配列の合成類似体を用いて調製した抗体あるいは、牛 またはヒトの塩基性ＦＧＦに、あるいは、それら合成のまたは天然のペプチド断 片に対する他の抗体、と免疫学的に反応する、はとんどの、しかし全てではない 、蛋白が適切である。一般的に、これらの蛋白は、図８あるいは図９のｂＦＧＦ に対して少なくとも８０％の類似性があり、９０％以上の類似性があることが望 ましい。好適な例の一つに、１９８７年７月７日付の米国特許出願第０７０，７ ９７号に記載されているような、前記試験でＦＧＦ活性を保持したｂＦＧＦ類似 体がある。これはここに参考文献として採用される。本発明の方法の適切な基質 となるように、ｂＦＧＦは、−５−Ｓ−共有結合を形成可能なシスティンを、た とえば、一つ、好適には二つのシスティン残基を、３４および１０１番の位置（ 分子内ジスルフィド結合部位とされている）に含まれている以外の位置に含有し ている必要がある。

一般的に、本発明の方法は、いかなる”影響され易い”、抗酸化剤が存在しない ときにジスルフィド結合した多量体を形成する、ｂＦＧＦ蛋白にも応用できる。

蛋白が、多量体を形成しやすいというこの傾向は、例えば、種々の異なる時間空 気に曝された蛋白の溶液を、標準的な高性能クロマトグラフィー法に懸け、高分 子量型の存在を検出することにより、藺単に評価できる。又、還元的及び非還元 的条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥに、これらの試料を懸けることにより、多量体化が 検出できる。

還元的条件下での結果は、標準的な多量体化していない分子量を与え、還元され ていない物質は、多量体の存在を示す。

このような規則の下で多量体化する蛋白について、本発明の方法を用いて、非多 量体化形態による安定化をおこなうことが出来る。

通常、多量体化する蛋白は、分子内ジスルフィド結合部位に含まれていないシス ティン残基を、少なくとも一つ以上含有している。もちろん、配列を調べること は、分子内ジスルフィド結合が形成される範囲を予測することではないので、単 純にアミノ酸配列中のシスティン数を評価することにより、どの蛋白が、本方法 による安定化に影響され易いかを識別することは不可能である。しかしながら、 本発明者により、例えば、塩基性ＦＧＦといくらかの相同性を有する酸性ＦＧＦ は、類似の活性があり、中性ｐＨではアニオンであるが、多量体化しないし、Ｇ ５５Ｇとも反応しないことが本明細書で示された。このことは、′影響の受け易 さ”は、アミノ酸配列からは明白とはならず、実験的に決定しなければならない ことを示してイル。酸性ＦＧＦは、奇数個のシスティンを持っているので、分子 内ジスルフィドの形成は一つの自由なシスティンを残し、そのために、この蛋白 は、二型体化が可能である。

従って、”影響を受け易い″ｂＦＧＦ蛋白を、次の様に定義することは、妥当で ある一前に記述した試験により示される様に、本発明の方法により安定化され得 るｂＦＧＦである。塩基性ＦＧＦの場合には、′影響を受け易い”ためには、図 ８及び図９に上部に示した番号で示される７８及び／若しくは９６番の位置（ま たは、例えば類似体中の同様の位置に対応するシスティン）にシスティンが少な くとも一つ以上存在することが要求される。両方のシスティンが存在すると、な お好適である。”影響の受け易さ”を維持するためには、本来の配列の中のどの 位置であるのかを正確に特定する必要はなく、さらに、一般的には、”影響を受 け易い”型の塩基性ＦＧＦ蛋白は、多量体化ノタメに使える、即ち、当該の条件 下では、分子内ジスルフィド結合が形成される範囲に含まれない、少なくとも一 つ、好適には二つのシスティン残基を有している。

哺乳類動物組繊から単離された”天然の”塩基性ＦＧＦは、最も一般的な単離用 プロトコールに従うと、恐らく既に存在していたグルタチオンジスルフィドがｉ ｎ　５ｉｔｕで用いられ得ることにより、既に安定化されている。塩基性ＦＧＦ は、この天然に起こる安定化が起こらない環境下で製造された場合にのみ、多量 体化を阻止する処理に対して影響を受け易い。これは、還元試薬による蛋白の処 理が、単離プロトコールに含まれている場合、あるいは、塩基性ＦＧＦのりコン ビナンド製造の場合には、最も普遍的であるが、特に、原核細胞系の場合に、あ るいは、既に存在している安定化についての正しい環境が使えない真核細胞系の 場合、に起こる。

呆１区盈 一般的に保護試薬は、目的蛋白中のシスティン残基とＳ−３共有結合を形成可能 な試薬である。最も一般的には、形成される結合はジスルフィド結合であり、保 護試薬は、各Ｒが独立して、該保護試薬に水溶性を賦与するのに十分な親水性を もつ有機置換基である、構造式Ｒ５５Ｒの化合物である。ｌ？ｓｓＲの最も好適 な具体例は、両Ｒ置換基が同じものである場合で、この化合物は入手が非常に簡 単で、及び／若しくは、成分とするスルフフィドリル化合物から容易に調製でき る。例えば、シスチン、ホモシスチン、シスタミン、及び、グルタチオンジスル フィド（ＧＳＳＧ）は、普通に入手できる試薬である。混合ジスルフィドを用い ることによる特別の利点はないが、これらの成分が混合したジスルフィドも用い ることが出来る。同様に蘭単に調製できる、しかし非常に高価なものに、補酵素 Ａ（ｃｏｅｎｚｙ＋ｍｅΔ）のジスルフィドがある。

これら例示した構造式Ｒ５５Ｒの化合物かられかるように、Ｒは一般には、水溶 性となるように十分な極性基で置換されたヒトカルビルである。そのため、Ｇ５ ５Ｇあるいはシスチンの様ニ、硫黄原子を含む残基がアミノ酸またはペプチドの 一部分であるものが、好適なｌ？ｓｓＲの例である。

構造式Ｒ３５Ｒの保護試薬に加えて、Ｓ−３共有結合を形成可能な無機化合物を 使用することもできる。好適な無機試薬としては、テトラチオネートイオン、即 ち、５ａ０６−”が挙げられる。

この場合、目的ペプチドの安定化された形態は、構造−５−ＳＯ３−を有する置 換基を持ったシスティン誘導体を含有することになる。さらに、保護試薬として 用いれるものに、構造式Ｒ５−５Ｏ３−の混合試薬がある。

総括すると、保護試薬は、安定化される基質蛋白のフＩＪ−のシスティンのチオ ール基とＳ−３共有結合を形成するならば、いかなる化合物でも使用できる。薬 理学的使用を意図した蛋白の安定化に好適なのは、薬理学的に許容できる誘導体 を生成する試薬である；従って、グルタチオンあるいはシスティンの様な、生体 適合性の物質により、基質のシスティンを誘導体に換える化合物の使用が好適で ある。

二に肛方迭 影響され易い目的蛋白の安定化は、緩衝化水性溶液中で行う。ｐＨは、６から、 上限は、変性により蛋白の安定性が保証される任意の範囲まで、が使用できる。

フリーのチオール基、あるいは、チオール反応性の基を含まないものならば、例 えば、リン酸、トリス、あるいはその他の緩衝液を含む、普通に用いられる緩衝 溶液系が何でも使用できる。副反応を防ぐために、約１　ｍＭの、低濃度のＥＤ ＴＡを加えることが望ましい〇蛋白の溶解度に依存した好適な濃度に、蛋白を緩 衝液に溶解する。典型的な濃度の範囲は、０．ｆ−１０Ｂ／ｍｌである。保護試 薬は、使用する目的蛋白の濃度により決定される、好適な任意の濃度で用いてら れる。反応を最後まで進行させ完了させることが望ましいために、蛋白の１０か ら１００倍過剰のモル比となるような試薬濃度が望ましい。種々の蛋白濃度の溶 液条件に対して、適切な量は、０．１　ｄ−１００ｍＭであり、さらに一般的に は、０．５−５ｍＭが、試薬の溶解性に応じて用いられる。この反応混合物は、 安定性を賦与するのに十分な時間、代表的には数時間から一晩の間、約４°Ｃか ら約室温の間の温度で、インキュベートする。得られる安定化蛋白は、標準的な 技術を用いて精製する。保護試薬の選定に依存するが、通常は蛋白が溶液中の唯 一の巨大分子であり、そのためにゲル濾過により容易に回収できる；この蛋白を さらに精製するためには、他の標準的な技術を使用し得る。例えば、塩基性ＦＧ Ｆが目的蛋白の場合、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ　（１９８４）　８１：６９３ ６．に記述されている、ヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィ ーを用いることが出来る。

以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、制限するものではない。

肌ｙ遁ニュ リコンビナントｂＦＧＦの　１ ヒト塩基性ＦＧＦは、同時１９８６年８月３０日付で出願された、係属中の米国 特許出願第８６９．３６２号に記載されているのと同様の方法により、Ｅ、ｃｏ ｌｔ中でリコンビナント的に製造した。このｂＦＧＦを細胞溶解液から回収し精 製した。

簡単に、かつ、特定的に述べると、使用したｂＦＧＦ遺伝子は、Ｎ−末端配列が ＭｅｔＡｌａＧｌｙＳｅｒｌｌｅで始まる、１５４個のアミノ酸型の蛋白をコー ドしている。このｂＦＧＦ遺伝子は、位置２のａｌａが欠失していること以外は 、図９に示したのと同じ配列を有する。この様にバクテリア中で、上記出願に従 い、リコンビナント的に製造した場合、Ｎ−末端のメチオニンが切り取られ、均 一な１５３個のアミノ酸型の蛋白が得られる。

この遺伝子は、標準的な原核細胞の発現ベクターの［ｌ１ｎｄ　ＩＩＩ制限部位 とＥｃｏＲＩ制限部位の間へ、クローニングされ、ムｏ１ｉ　Ｂへ、形質転換さ れた。培養物は、グリセリン保存溶液に保存するか、あるいは、Ｌ＋アンピシリ ンを含む培養皿上に置かれた。

単一のコロニーを、５Ｇルｇ／ｎ＋１のアンピシリンを含む５０１１のＬ−培地 に接種し、−晩、３０°Ｃで培養した。この培養物の１０　ｍｌを、ｌｘカザミ ノ酸及び、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、ＩＬのＭ９培地に接種した。

この培養物は、Ａｓ５ｓに於けるＯＤ値が０．５になるまで成長させ、ベクター はｔｒｐプロモーターの支配領域に遺伝子を有するので５０μｇ／ｍｌのインド ールアクリル酸を用いて誘導した。培養物は、−晩、３０°Ｃで成長させた。次 の朝、培養物を遠心し、ベレットを必要になるまで一７８°Ｃに凍結した。

このペレットを、２０Ｉｌ１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７、ｌＩＩＭ）ＥＤＴ Ａ、　１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライド、及び、０．５　ｍｇ ／ｍｌのリゾチームから成る溶液の２５０１１に再懸濁した。

水上に１５分間装いた後、細胞を破壊するために、懸濁液を超音波処理した。各 １１００７ｚのＲＮＡ５ｅ及びＤＮＡ５ｅを添加した。氷上に１０分間装いた後 、混合物を遠心処理し、上清を精製用に採取した。

上清を、２０　ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，１ｍＭのＥＤＴＡ、の溶液で 平衡化した５Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（２，５ｃｍ　Ｘ　２　ｃｍ）カラムに懸け た。このカラムは、２８０　ｎｍの吸光度がベースラインに復帰するまで同じ緩 衝液で洗浄した。蛋白は、２０　ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐｉ（７，１ｍＭ（ ７）ＥＤＴＡ、　４００　ｍＭ　ＮａＣ１の溶液で溶出した。

この５Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムからの４００　ｒｎＭ　ＮａＣ１分画を、２ ０　ｍＭのトリス、ｐＨ７，５，１ｍＭのＥＤＴＡ、６００　ｍＭ　ＮａＣ１の 溶液で平衡化したｈｅｐａｒｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ（２，５ｅｌｌ　Ｘ　２ 　ａｍ）カラムに懸けたロ　このカラムは、２８０　ｎｍの吸光度がベースライ ンに復帰するまで同じ緩衝液で洗浄した。蛋白は、２０　ＩＩＩＭのリン酸ナト リウム、ｐＨ７，５、Ｉ　ｍＭのＥＤＴＡ、　３　Ｍ　ＮａＣ１の溶液で溶出し た。

ｈｅｐａｒｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムから得た蛋白溶液は、ＤＴＴで１０ 　ｙ。

Ｍの溶液とし、氷上で３０分間インキコベートし、２０１１１Ｍのリン酸ナトリ ウム、ｐＨ７，１ｍＭのＥＤＴＡ、の溶液で４０倍に希釈し、第一段階と同様に ５Ｐ−３ｈｐｈａｄｅｘで、再精製した。

あるいは、最初の５Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムの後に、蛋白をＤＴＴで処理し 、次に、最終段階として、ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのクロマトグラ フィーに懸けた。この工程を用いると、二番目の５Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム の必要がなくなるが、蛋白は、高塩濃度の緩衝液中に置かれたままになる。

Ｋ１匠上 ｂＦＧＦのＧ５５Ｇル　の六 調製法　Ａで得られた、Ｎ−末端から＋ｇｅｔと一つのａ、ｌａがなくなってい る以外は、第９図と同じの、１５３個のアミノ酸のヒト配列の精製蛋白を、０． １　Ｂ／ｍｌとなるように、１　ｍＭのＥ　ＤＴＡを含む２０　ｄのリン酸ナト リウム、ｐＨ７，５の溶液に加えた。この溶液を、次に、グルタチオンジスルフ ィドでｌ　ｍＭの濃度にし、４°Ｃで、−晩、インキュベートした。修飾型への 変換を最大にするために、１２時間後に溶液を４　ｍＭのＧ５５Ｇ濃度とし、さ らに２４時間、４℃でインキュベートした。得られた修飾ｂＦＧＰは、調製法　 人（前述）の方法に従い、５Ｐ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製した。

図１ａは、上記のように処理する前の、アセトニトリル／ＴＦＡ濃度勾配を用い 、図に示した条件下での、Ｖｙｄａｃ　Ｃｐｓカラムを用いた逆相ＥＩＰＬＣの 結果を示している。主要ピークの溶出時間は、３５−４０分であった。

上記のように処理した後、主要ピークが大体３０分付近にあり、処理ｂＦＧＦが 形態を変えたことを示す、図１ｂの溶出パターンが得られた。

比較のために、図１０及び１ｄは、図８及び図９に上部の数字で示した第７８番 及び第９６番の位置のシスティンをセゾンに置き換えた、ｂＦＧＦ類似体の溶出 パターンを示しである。この類似体は、約３３分で単一ピークとして溶出し、上 記処理は溶出パターンに影響しない。従ってこの方法は明かに、工）これらの位 置にシスティンが含まれている、及び、２）これらの残基が存在しない類似体で は、明白な効果はない、ことを示している。

図２ａは、本実験例に基づいて処理したｂＦＧＦの逆相ＨＰＬＣ分析をさらに例 示したものであり、Ｇｏｓｐｏａａｒｏｖｉｅｚの方法に基づいた牛脳下垂体か らの物質の挙動を比較のために示している。

図２ａは、Ｇ５５Ｇ処理したりコンビナンドｂＦＧＦのＨＰＬＣを示し：図２ｂ は、脳下垂体から単離された物質の、対応するＨＰＬＣを示し一図２０は、単離 された物質及び、処理されたりコンビナンド物質の同時注入の結果を示している 。グルタチオンで処理されたりコンビナンドのｂＦＧＦの挙動は、天然の分離物 質と同じである。

最後に、図３は、ＡＣＥ細胞の増殖試験に於ける、実施例１のｂＦＧＦ及び、Ｇ ５５Ｇ処理されたｂＦＧＦの、活性プロフィールを示したものである。活性の差 は全く見られなかった。

爽立五主 Ｇ５５Ｇ処理したりコンビナンドｂＦＧＦの。

実施例１に記述したように処理したりコンビナンドのｂＦＧＦを、未処理のりコ ンビナンドｂＦＧＦでは通常時間経過と共に起こる多量体化反応を加速する実験 目的のために、ｌ　ｍＭのＣｕＣｌ２と１分間インキュベートした。得られたｂ ＦＧＦは、次に、ｈｅｐａｒｊｎ−ＴＳＫを用いた逆相ＨＰＬ　Ｃに懸けた。図 ４ａ及び４ｂは、牛脳下垂体から単離した天然のｂＦＧＦのクロマトグラフィー パターンには、Ｃｕ“２処理が全く影響しないことを示している。しかしながら 、図４０及び４ｄに示したように、Ｇ５５Ｇで安定化していないリコンビナント ｂＦＧＦをＣｕ＋２で処理すると、ピークの複数化、及び、保持時間の延長が起 こる。

図４ｅ及び４ｆは、Ｇ５５Ｇで安定化したりコンビナンドｂＦＧＦの挙動を示し ており、天然型と同様に、Ｃｕ″″処理の影響はみられない。

実施例１で調製された安定化ｂＦＧＦは、図５に示したように、少なくとも５日 間は安定である。図５ｄから５ｆは、安定化した物質を、ｈｅｐａｒｔｎ−ＴＳ Ｋのクロマトグラフィーに懸けた際の、一連のＨＰＬＣ分析の結果である。この 一連の図に示されているように、５日間の期間では変化はなかった。図５ａから ５ｅに示すように、同じ条件下で、未処理のｂＦＧＦは多量体を形成し、出発物 質の著しい減少を示している。

支里五ｌ Ｚ工二工２延皿 培養混合物中のｉ　ｍＭのグルタチオンを１　ｍＭのシスチンに置き換え、反応 をｐｉ（７，０で行った以外は、実施例１と同様の工程で行った。図６ａは、こ の様に処理された安定化ｂＦＧＦを、Ｖｙｄａｃ　Ｃｐｓカラムを用いた逆相Ｈ ＰＬＣに懸けた結果を示している。

図６ｂ及び６ｃは、システィン処理したｂＦＧＦは、脳下垂体から単離したｂＦ ＧＦ物質とは正確に共同転移しなかったことを示している。従って、このシステ ィン処理した物質は、牛脳下垂体からの天然のｂＦＧＦとは、挙動に於いて、明 かに異なっている。

叉」Ｉｔ先 匠立口ｌ駆本 実施例１の工程に従い、ｂＦＧＦ類似体に対してＧ５５Ｇ処理を行った。リコン ビナントのｂＦＧＦを、第７８番又は、第９６番の位置のシスティンの替わりに セリンを有する類似体に、置き換えた以外は同じ工程で行った。図７ａ及び７ｂ に示したように、この処理により、７８−５ｅｔ変異蛋白では、溶出ピークが速 くなり、従って、Ｇ５５Ｇ処理がこの類似体に影響することを示している。図７ ｃ及び７ｄは、５ｅｒ−９６変異蛋白を用いたときの（これらの条件下では、明 かに反応は完全ではないが）、同様の結果を示している。

牛の１！ｌ甚性緯維芽細胞増殖因子のアミノ１ｌｔＷＩ〜＋４６１１ヒトの塩基 性線維芽細胞増殖因子のアミノ酸第１−１４６番国際調査報告　−／＋ｔＱＱｎ １０７’Ｆｎ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の工程より成る、塩基性線維芽細胞増殖因子蛋白を安定化する方法： 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のアミノ酸配列を有する影響を受けやす いペプチドを、該影響を受けやすいペプチドに含まれている少なくとも一つ以上 のシステインとＳ−Ｓ共有結合を形成できる、該ｂＦＧＦの多量体化を防止する のに有効な量の保護試薬を用いて、ｐＨ６あるいはそれ以上であって前記ｂＦＧ Ｆが変質しないｐＨの緩衝液の存在下で、該安定化操作が効果を発揮するのに十 分な時間、処理する工程。
2. ２．前記保護試薬が、各Ｒが独立して、該保護試薬に水溶性を賦与するのに十分 な親水性をもつ有機置換基である、構造式ＲＳＳＲの化合物である、請求項１の 記載の方法。
3. ３．前記の構造式ＲＳＳＲの化合物が、グルタチオンジスルフィド及びシスチン から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記ｐＨが、ｐＨ６から８である、請求項１に記載の方法。
5. ５．さらに、処理したｂＦＧＦをクロマトグラフィーによる精製に共する工程を 包含する、請求項１に記載の方法。
6. ６．請求項１に記載の方法で調製される安定化した塩基性ＦＧＦであって、図８ あるいは図９に示した上部の番号の第２４〜１５５番の残基で示されるアミノ酸 配列を含む場合には、前記保護試薬がグルタチオンジスルフィドではない、ｂＦ ＧＦ。
7. ７．請求項５に記載の方法で調製される安定化した塩基性ＦＧＦであって、図８ あるいは図９に示した上部の番号の第２４〜１５５番の残基で示されるアミノ酸 配列を含む場合には、前記保護試薬がグルタチオンジスルフィドではない、ｂＦ ＧＦ。
8. ８．影響を受けやすい塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）蛋白、および、該 影響を受けやすいｂＦＧＦに含まれている少なくとも一つ以上のシステインとＳ −Ｓ共有結合を形成できる、該ｂＦＧＦを安定化するのに有効な量の保護試薬、 を含有する水性溶媒を含む組成物であって、該水性溶媒のｐＨが、少なくとも６ で該ｂＦＧＦが変性しないｐＨを有する、組成物。
9. ９．前記の保護試薬が、各Ｒが独立して、該保護試薬に水溶性を賦与するのに十 分な親水性をもつ有機置換基である、構造式ＲＳＳＲの化合物である、請求項８ に記載の組成物。
10. １０．前記の構造式ＲＳＳＲの化合物が、グルタチオンジスルフィド及びシスチ ンから成る群から選択される、請求項９に記載の組成物。