PT77866B - Method of purification and reactivation of precipitated heterologous proteins - Google Patents

Description

Descrição detalhada do invento

(A) Definições:

Proteínas "heterélogas" são proteí. nas que normalmente não são produzidas pela célula hospedeira ou então são produzidos apenas em quantidades limitadas. 0 aparecimento da tecnologia de DNA recombinante e outros processos "Standard" de manipulação genética tais como mutagénese pontual, tem permitido a produção de proteínas heterélogas em quantidades substanciais a partir de culturas de células hospedeiras transfectadas. Na prática, estas proteínas heterólogas são frequentemente produzidas por expressão genética em quantidades que envolvem a sua precipitação em condições que mantêm a solubilidade das proteínas das células hospedeiras.

Nalguns casos, a insolubilidade da proteína expressa é de tal ordem que estas proteínas estão presentes na célula hospedeira na forma dos chamados "corpos refractáveis", i.e., corpos que refractam a luz e aparecem como pontos brilhantes quando vistos através de um microscópio de contraste de fase. Portanto, as proteínas são muitas vezes referidas como "proteínas refractáveis" ou "proteínas de corpos refractáveis".

0 invento aqui apresentado é dirigido a processos que são úteis no isolamento, purificação e, se necessário, reactivação de proteínas que surgem nas células hospedeiras na forma de "corpos refractáveis". Parte do invento diz respeito a métodos que induzem a formação de tais corpos refractáveis; no entanto, os processos para recuperai

ção e activação de proteína aqui divulgados pretendem ser especificamente aplicáveis a tais proteínas refractáveis.

Nesta especificação "refractável" desejada e "heteróloga" são usadas indiscriminadamente para significar uma proteína expressa num hospedeiro estranho que é, nalguma fase de expressão ou purificação, visível por microscopia de contraste de fase como um precipitado, independentemente do estado físico da proteína quando é referenciada p. ex., proteína "refractável" será ainda usado nalguns casos para designar a citada proteína mesmo após ter sido convertida da forma refractável para a forma solúvel pelo processo do invento.

Várias proteínas heterólogas expes. sas em células hospedeiras bacterianas, por exemplo, pGH, hGH e proteínas do envólucro virai tais como a proteína de fusão com proteínado vírus FMD e KBsAg, formam corpos refractáveis em maior ou menor grau nas condições de cultura normais. Certas outras proteínas tais como o interferão imune (ΙΙΪ¹) e interferão de leucócitos (LeIF) são mais solúveis no citoplasma. (0 interferão de fibroblasto (FIF) é, no entanto, refractá vel na cultura do hospedeiro).

"Células hospedeiras" inclui, quando usado no contexto de um material de partida numa descrição do processo para isolamento de proteína heteróloga, quaisquer das formas em que as células possam estar· a ser usadas. Inclui, por exemplo, além da pasta de células colhidas, a cultura celular na totalidade, uma amostra congelada da pasta, ou uma amostra da pasta congelada e descongelada. Assim a frase" trata mento das células hospedeiras numa solução tamponada" pode-se referir, por exemplo, a manipulação do caldo de cultura total ou a uma preparação usando células sedimentadas.

"Reactivação", como aqui é usado, é

práticamente sinónimo de "reenrolamento"---i.e., refere-se ao

assegurar da actividade biológica de uma preparação de proteína

por colocação desta numa forma conformacionalmente activa. "Reactivação", como aqui ê. descrito, não envolve qualquer alteração na sequência de aminoácidos e não inclui, por exemplo, "activação¹¹ do tipo em que os precursores peptídicos são cortados para dar aí suas formas activas, tal como conversão do tripsinogéneo em tripsina ou pro-renina em renina.

"Actividade biológica" refere-se à actividade da proteína in vivo, à sua actividade em testes biológicos convencionais in vitro e in vivo destinados a testar a sua funcionalidade, à sua capacidade para estimular uma resposta imune ou à capacidade da proteína para reagir com an ticorpos contra a proteína nativa. Deve-se notar, que nalguns casos, por exemplo, as proteínas são "biológicamente activas" quando testadas em relação à sua reactividade com anticorpos apropriados, mas não em testes de funcionalidade. No entanto, como reactividade com anticorpos ê gralmente o método de teste mais directo e fácil de efectuar ê algumas vezes usado como uma medida conveniente de "actividade".

"Força iónica" refere-se à medida convencional da concentração iónica em solução aquosa. E defi nida como 1/2 do somatório (todos os iões em solução) do produto da concentração de cada ião, vezes o quadrado da sua carga.

"Solução desnaturante" refere-se a uma solução que contem um "desnaturante". "Desnaturante", como aqui é usado, refere-se aos compostos caotrópicos ou materiais que, em solução aquosa e em concentrações adequadas são capazes de modificar a configuração ou conformação espacial das proteínas através de alterações da sua superfície, quer através da alteração, por exemplo, do estado de hidratação, do solvente ambiente ou da interacção solvente-superfície de interacção. Exemplos de tais desnaturantes incluem a ureia, hidrocloreto de guanidina, tiocianato de sódio e detergentes, tais como SLS e Triton. Não inclui processos desnaturantes drásticos e irreversíveis como sejam temperatura éL evada e acidez elevada.

Verificar-se-à que alguns dos reagentes enumerados são desnaturantes fortes, enquanto que outros são mais fracos, e que, concerteza, a concentração de qualquer destes afectará directamente a sua força e eficácia. Não pode haver uma linha divisória específicamente exacta entre "forte" e "fraco", no entanto, condições desnaturantes fortes "desen rolam" mais completamente a proteína a partir de qualquer con formação espontâneamente preferida devido à sua sequência de aminoácidos tendo áreas que conferem hidrofilia e hidrofolia ao longo da cadeia nas condições fisiológicas. 0 ambiente desnaturante forte mais vulgarmente usado útil na dissolução de proteína refráctil é uma concentração elevada (4-9M) do desnaturante iónico, hidrocloreto de guanidina. A ureia é o exemplo mais frequentemente usado de um desnaturante fraco, mesmo quando em concentrações altas (e.g. 7M) permite a retenção de algumas estruturas secundárias das proteínas e constitui uma via para o reenrolamento para a conformação "nativa". Acon tece também não ter caracter iónico, o que ê significante no que respeita à sua utilização naqueles aspectos do invento que incluem a utilização de, por exemplo, técnicas de troca iónica.

Assim, uma solução "fortemente desnaturante" refere-se a uma solução que "desenrolará" eficazmente uma proteína também dissolvida na solução. 0 desenrolamento será relativamente extensivo, mas reversível. Os solu tos que são eficazes na efectuação do desenrolamento até este grau são exemplificados pelo hidrocloreto de guanidina e tiocianato de sódio, geralmente em concentrações relativamente altas na gama de aproximadamente 4-9M e detergentes geralmente em concentrações da ordem dos 0,1-2 por cento.

"Soluções fracamente desnaturantes" refere-se àquelas soluções que permitem um enrolamento, pelo menos parcial, de uma proteína para a conformação espacial em que se encontra quando operando na sua forma activa em condições fisiológicas endógenas ou homólogas e também solubilização de quaisquer formas intermédias entre a forma "desnatura><

da" como se encontraria na solução fortemente desnaturante e a conformação enrolada correcta. Exemplos de tais soluções fracamente desnaturantes são soluções de concentrações elevadas de ureia, normalmente na gama de 4~9M e concentrações baixas de desnaturantes referidos acima que, em concentrações altas, são fortemente desnaturantes. Estas últimas concentrações "baixas" são geralmente na gama de 0,5 a cerca de 2M. Ocasionalmente, no entanto, o "status" funcional da "solução fracamente desnaturante" pode também ser observado simplesmente nas condições de testes enzimúticos "Standard" tais como, por exemplo, concentrações de tampões baixas da ordem de O,1M e mesmo inferiores e pH fisiológico. Tal como é usado neste invento, "solução fracamente desnaturante" refere-se à definição funcional— i.e., aquelas soluções que permitem reenrolamento a partir de seja qual for a conformação contorcida que a proteína tenha, por qualquer razão, adquirido, através de intermediários solúveis nesta solução, para uma conformação que ê capaz de apresentar actividade biológica.

Há abreviaturas e descrições convencionalmente usadas em relação a técnicas particulares que são utilizadas neste invento e por conveniência estas serão aqui descritas brevemente:

Oromatografia de permeação em gel ou filtração em gel é uma técnica de purificação vulgarmente usada que descrimina as moléculas de acordo com o seu tamanho. Isto é também frequentemente referido como "filtro molecular". Por selecção adequada do gel, pode-se seleccionar quase todas as gamas de tamanhos. As moléculas que são suficientemente grandes para serem excluídas dos poros do gel possam sem serem retidas através de uma coluna contendo o gel; as moléculas mais pequenas são fraccionadas pela coluna.

SDS-PAGE(Electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio- poliacrilamida é uma técnica convencio nalmente empregue que permite detèrminação aproximada do peso molecular e pureza. Nesta técnica, a preparação de proteína

é sujeita a electroforese em condições redutoras na presença de detergentes. 0 grau de migração para uma molécula particular está dependente apenas do seu peso molecular determinado na ausência de ligações dissulfureto (devido às condições redutoras). Assim, a quantidade de uma proteína particular presente na preparação pode ser calculada por medições de densitometria numa banda corada que surge na posição correspondente ao peso molecular da proteína. Uma descrição detalhada desta técnica encontra-se em Laemmli, U.K., et al.Nature, 227:680 (1970) aqui incluída como referência.

"Western Blot" ("transferência de Western") refere-se a uma técnica de ligação específica,de um anticorpo em que uma solução ou suspensão contendo a protêina a ser medida é exposta a um filtro de nitrocelulose, filtro esse que é depois enxaguado num anti-soro marcado contra a proteína desejada. Uma descrição detalhada é dada por Towbin,

H. , et al. , Proc. Nat.Acad. Sei. (USA), 76:4-350 (1979) aqui incorporada como referência.

"Técnicas de purificação da proteína por cromatografia de permuta iónica" refere-se a uma série de processos em que o material ê sujeito a separação por cromatografia numa interacção com uma coluna de permuta iónica. As colunas frequentemente usadas são, por exemplo, DEAE-celulose, frequentemente designado apenas por DEAE ou, por exemplo DE-52 ou DE-53 como nome comercial comum, ou carboxi metilcelulose (CMC). A valores de pH apropriados uma coluna contendo DEAE comporta-se como um permutador aniónico e as partículas carregadas negativamente ligam-se à coluna. A eluição pode ser conseguida nestas colunas alterando os componentes dos solventes de eluição, por exemplo, por alteração do pH, força iónica ou constante dieléctrica da solução ou mesmo através de regulação da temperatura.

"Permuta de tampão" refere-se a técnicas pelas quais 0 "solvente" efectivo, i.e., o ambiente líquido de uma molécula, é alterado. Assim, neste sentido,

"solvente inclui na realidade solutos micromoleculares (p.ex. sais) do meio em que a macromolécula desejada se encontre, pois, de facto, a sua solubilidade pode ser .atribuída aqueles. Por exemplo, num processo do presente invento, a proteína desejada pode ser preparada por cromatografia de troca iénica dando-lhe um solvente compreendendo ureia 8M num tampão adequado substituindo, por exemplo, hidrocloreto de guanidina 7M, que numa execução preferida é usada como desnaturante. Para fazer esta "permuta de tampão", uma técnica adequada é a diálise da solução de hidrocloreto de guanidina 7M contendo a proteína contra grandes quantidades do tampão de ueria. No entanto, outras técnicas de permuta de tampão, tais como, por exemplo permeação em gel e diafiltração podem igualmente ser usadas.

B. Descrição Geral

0 esquema 1 apresentado abaixo mostra os processos gerais envolvidos na resolução do problema de isolamento de uma proteína desejada activa a partir de células hospedeiras em que esta proteína foi produzida e depositada na forma de corpos refractáveis.

Células contendo corpos refractáveis

Sobrenadante contendo a proteína desejada

Sedimento

(rejeitado)

cnvagem ou

centrifugação a alta veloci de.

agente

ox. ,

S0,=

2

l)desnaturante

fraco

Alto pH (rejeitado)

Sobrenadante

2)cromatografia

Proteína S- Proteína sulfonato

•4/

?ro

purificada

l)desnaturan te fraco .

2)cromatogra

fia

1) desnaturar te fraco

2) cromatogra fia

GSH/

GSSG

reenrolamento

Forma reduzida purificada

S-sulfonado purificado

diálise

ar

reenrolamento GSH/GSSG

Proteína

desejada

Esquema 1

C. Recuperação de corpos refractáveis

Gomo se mostra no esquema 1, devido aos corpos refractáveis estarem dentro das células, é neces, sário primeiro romper as células de modo a haver libertação dos corpos refractáveis e torná-los disponíveis para recuperação por, por exemplo, centrifugação. Num aspecto do invento, a purificação de proteínas refractáveis, obtem-se simplesmente assegurando que os detritos celulares estejam suficientemente destruídos de modo a não aparecerem no sedimento quando da centrifugação a baixa velocidade. Neste aspecto do invento, as células são suspensas num tampão de pH 5 a 9, de preferência 6 a 8, usando uma força iónica da ordem de 0,01M a 2M de preferência O,1M'- 0,2M. Qualquer sal adequado, incluindo NaCl pode ser usado para manter um nível de força iónica adequado. Esta gama de força iónica sabe-se ser adequada para o invento, no entanto os limites exactos das forças iónicas permissivas não estão bem compreendidos ou conhecidos. No entanto é aparentemente indesejável usar força iónica zero. As células enquanto suspensas no tampão referido são lisadas pelas técnicas vulgarmente usadas tais como, por exemplo, métodos mecâ, nicos tais como a utilização de uma prensa Manton-Gaulin, uma prensa Francesa, ou um oscilador sónico, ou por métodos químicos ou enzimáticos tais como tratamento com lisozima.

Quando se pensa que as células estão suficientemente destruídas de modo a haver um mínimo ou mesmo a não haver fragmentos celulares de tamanho suficiente para não serem sedimentadas, a suspensão é centrifugada a baixa velocidade, à volta de 500 a 5000 vezes a gravidade, de preferência à volta de 1000 vezes a gravidade numa centrífuga "Standard" durante um período de tempo adequado dependendo do volume, geralmente cerca de 10 minutos a 1/2 horas. 0 sedimento resultante contem práticamente toda as proteínas refra£ táveis, mas se o processo de destruição das células não for completo, pode também conter fragmentos de células. A destrui ção pode ser testada por ressuspensão do sedimento numa quantidade pequena da mesma solução tampão e examinação da suspen

são com um microscópio de contraste de fase. A presença de fragmentos de células indica que é necessário mais sonicação ou oturos métodos de disrupção para remover as proteínas associadas a estes fragmentos. Após esta disrupção ulterior, se necessário, a suspensão é centrifugada de novo e o sedimento recuperado, ressuspenso e reexaminado. Este processo é repetido até a observação visual mostrar a ausência não refractáveis no material do sedimento. Com preparações adequadas, as condições para uma proteína particular podem ser definidas de um modo claro de modo a que ao efectuar-se o processo do invento apenas seja necessário uma suspensão, uma disrupção e uma centrifugação. Ro entanto mesmo neste caso é preferível efectuar o processo nos vários passos acima, de preferência num total de três pois isto permite uma redução desejável nos volumes de tampão aquoso (i.e. a quantidade usada para ressuspender o sedimento é substancialmente menor do que o volu me usado na preparação original) e a qualidade da preparação é consistentemente assegurada por controle visual.

As proteínas do sedimento assim pre. parado contêm cerca de 40 por cento a cerca de 90 por cento da proteína heteróloga desejada, comparado com a quantidade de proteína total nele contida, dependendo da proteína específica produzida pela célula hospedeira.

Por exemplo, quando preparado pelos processos particulares utilizados nos Exemplos 1 a 8, para a hormona de crescimento humana, mais de 9θ por cento da proteína refractável era de facto a proteína desejada (medida pelos métodos ali indicados) , enquanto que apenas cerca de 50 por cento era a proteína desejada nos casos dos interferões humanos e proteínas antigénicas virais. Quantidades intermédias foram obtidas com o activador do plasminogênio de tecidos e renina de vitela. Estas purezas são, nesta fase, adequadas a algumas utilizações da proteína desejada.

0 sedimento consegue-se dissolver numa solução de desnaturante, mas a solução resultante pode conter ou não uma forma activa da proteína. Os resultados da utilização deste método sozinho para isolamento de proteínas refractéveis é exemplificado nos Exemplos 1 a 8 da especificação acima mencionados. E mais vantajoso quando aplicado a proteínas heterôlogas produzidas em culturas bacterianas, de preferência E.coli e para o isolamento de proteínas seleccionadas do grupo consistindo em hGH, bGH, pGH, interferao de fibroblasto humano (EIE), interferão imune humano (IIE) , activador do plasminogénio de tecido humano (tPA), pro-renina de vitela e proteínas do envólucro de EMD. A técni ca de dissolução das proteínas sedimentadas num desnaturante e recuperação de actividade é dada nos outros aspectos do invento, aspectos esses tratados nos parágrafos que se sucedem.

D. Aumento da produção de corpo refractáveis

Num segundo aspecto, o invento está relacionado com um processo para aumentar a quantidade de proteína, expressa numa célula hospedeira estranha e que está insolubilizada na forma refractável, antes da sua purificação.

No caso de muitas proteínas, quando o crescimento e expressão são obtidos como se estabelece nos exemplos aqui apresentados, o aumento não é de qualquer modo necessáriamente devido a toda a proteína desejada, aparecer na forma de corpos refractáveis. Um exemplo de tais proteínas são os hormonas de crescimento animal e interferão de fibroblasto. No entanto, no caso da hormona de crescimento humano, aparentemente apenas à volta de 5θ por cento da proteína expressa por E. coli aparece na forma de corpos refractáveis e ter-se-à uma perda correspondeu te no rendimento se não se seguirem estes processos. De um modo semelhante, 0 interferão imune é largamente produzido numa forma não-refractável e se se empregar para 0 seu isolamento os processos dirigidos para corpos refractáveis, 0 aumento deve ser assegurado pelos métodos estabelecidos neste aspecto do invento.

Neste processo, tira-se vantagem do desejo da utilização de um passo de "morte" pelo qual as células recombinantes ficam nas condições regulamentadas pelo governo dirigidas no sentido da segurança no crescimento e cu/ tura de tais células. Podem ser utilizadas uma série de técni cas de morte que têm sido usadas simplesmente para fins de segurança e que além disso tem 0 efeito desejado adicional de nos casos mencionados aumentarem a quantidade de proteína refractável. No processo deste aspecto do invento, as células hospedeiras podem ser mortas quer no meio em que são cultivadas e crescidas quer numa suspensão preparada através de uma centrifugação inicial ou de outros métodos para concentração de células a partir do meio original, recuperação de uma pasta de células e ressuspensão numa solução aquosa. Processos de morte adequados são a administração de concentrações baixas

de ácido tratamento com calor e de preferência tratamento com solventes orgânicos não polares em pequena percentagem.

Num processo particularmente prefe rido, o meio de cultura é tomado 0,25 P°^r cento de fenol e 0,25 por cento de tolueno e deixado em incubação desde a temperatura ambiente até 45°, de preferência a cerca de 37°» durante 15 minutos a várias horas, de preferência 0,5 horas.

Como alternativa, se houver hipóteses de "containment" as célu las são primeiro colhidas sob "containment", ressuspensas em por exemplo tampão de força iónica 0,01M-2M, de preferência de força iónica 0,l-0,2M, pH5-9, de preferência 6-8. A suspensão é tratada então com concentrações baixas de solventes orgânicos-p.ex. fenol e tolueno 0,25 por cento de cada.

Noutras execuções, 0 meio ou suspensão de células como descrito acima pode também ser aquecido até cerca de 60°-80°C durante cerca de 15 min. -45 mia. para matar as células; ou então levados p. ex. a um pH de cerca de 0,5-1,5.

Estes processos resultam numa preci. pitação adicional considerável da proteína heteróloga expressa caso não esteja já tão precipitada. 0 Exemplo 9 descreve um caso particular em que este método é vantajoso.

0 processo deste aspecto do invento pode então ser combinado com outras técnicas, aqui divulgadas, para a recuperação de proteína heteróloga activa.

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E. Solução de proteiua heteróloga em solução fortemente desnaturante

Num terceiro aspecto, o invento refere-se a um processo para dissolução de proteínas refractáveis a partir da sua forma insolúvel ou sedimentada através da utilização de uma solução desnaturante forte. Enquanto que as proteínas nos corpos refractáveis são geralmente insolúveis nas condições que prevalecem no citoplasma (e portanto em tampões de força iónica relativamente fraca) parecem, no entanto, ser solúveis em concentrações elevadas, tipicamente concentrações de 4 a 9 M, de certos desnaturantes. No processo do invento os desnaturantes fortes, por vezes iónicos, são aparentemente os mais práticos. Um desnatutante particularmen te preferido é um sal de guanidina, apesar de terem também sido usados com sucesso detergentes como sejam Triton e SLS e sais de ião tiocianato. Uma gama de concentrações de 4 a 9 M é operacionável para os sais de guanidina ou tiocianato de sódio, sendo particularmente preferido 6-8M . Os detergentes são usados na gama de 0,01-2 por cento da solução. 0 pH da solução deve ser compatível com as caracteristicas da proteína particular cie modo a que se não dê desnaturação irreversível ou hidrólise da proteína; a concentração óptima de desnaturar, té está dependente da proteína a ser solubilizada e do pH usado .

Enquanto que a solubilidade uma vez adquirida é muitas vezes mantida quando a proteína heteróloga solubilizada é passada para um meio desnaturante mais fraco, a solubilização inicial neste mesmo meio fracamente desnaturan te não é praticável. Seja por razões termodinâmicas ou cinéti cas, a proteína não se dissolve dentro de um tempo razoável nes. tas condições menos drásticas.

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Pode-se juntar à solução componentes adicionais para manter o nível desejado de pH, tal como outros componentes desejáveis em casos paticulares tais como sejam, por exemplo, quelatores tais como EDTA. Gomo se mostra pelo comportamento das proteínas nos corpos refractáveis, nos Elxemplos 1-8, 10 e 11, as soluções que não são fortemente desnaturantes falham tipicamente a dissolução destas proteínas refractáveis (se hem que as proteínas celulares sejam dissolvi das), enquanto que soluções desnaturantes fortes as dissolvem. Deste modo, tais tampões fracamente desnaturantes podem também ser usados para solubilizar e remover proteínas de célula hospedeira.

No processo deste aspecto do invento, as células hospedeiras são primeiro suspensas num meio de força iónica correcta para solubilizar muitas das proteínas da célula hospedeira - i.e. força iónica 0,01 - 2M, de preferência cerca de 0,4-0,6 M de força iónica, a um pH de cerca de 5-9» de preferência à volta de 6-8. Os limites precisos de pH e força iónica não podem, concerteza, ser determinados sendo porém dadas gamas operacionais.

As células são destruídas na presen ça da referida solução e a suspensão é centrifugada para formar um rendimento. 0 sedimento contem principalmente a proteína de sejada na forma refractável e resta empregar o meio fortemente desnaturante descrito acima a solubilizar, À proteína solubili. zada pode então ser recuperada usando meios que permitam a sua renaturação.

F. Remoção de contaminantes de alto peso molecular

Num quarto aspecto, o invento é dirigido a um processo para separar a proteína, desejada anterior mente refractável e agora solubilizada de componentes de peso molecular superior directamente a partir da solução fortemente desnaturante, mesmo que o desnaturante seja iónico, usando um

filtro molecular ou centrifugação a alta velocidade. O processo segue a série de setas mais à esquerda a partir de "sobrenadante contendo a proteína desejada" no Esquema 1, em que o sobrenadante de sedimento que foi extraído com um desnaturante forte é passado através de uma coluna com um crivo molecular de permeação em gel discriminatório de tamanho, como seja "sephacryl", ou é centrifugado a alta velocidade para sedimentar componentes de peso molecular superior. Nenhum destes processos de separação requer a remoção de iões da solução e portanto pode ser efectuado directamente no extracto do sedimento, mesmo que este extracto seja iónico.

(Ver Exemplos 10 e ll).

Ao efectuar-se a remoção das impurezas de alto peso molecular através da filtração em gel, uma coluna contendo um filtro molecular, tal como por exemplo Sephacryl S-300, é equilibrada com um tampão adequado (conten do de preferência um agente redutor) e a solução contendo a proteína heteróloga é passada através da coluna. 0 volume de escoamento contendo os componentes de alto peso molecular é rejeitado e a proteína heteróloga é então eluída com mais quan tidade de tampão. A proteína eluida pode ser controlada por exemplo por medição de densidade óptica a 280 nm e a presença da proteína desejada verificada por diálise contra um solvente não iónico, seguido de SDS-PAGE para confirmar a proteína de peso molecular correcto.

Na abordagem alternativa, a centrifugação a alta velocidade é efectuada centrifugando a proteína a 25.000-40.000 kg, de preferência 35·θΟΟ xg durante 10 min. - 3 hrs. e recuperação do sobrenadante para ulterior purificação .

E invulgar a utilização de cromatografia de permeação um gel como um primeiro passo cromatográfico num processo de purificação comercial de proteina, i.e.

efectuar permeação em gel antes de, por exemplo, oromatografia de permuta iónica. No entanto, no processo do presente invento a proteína tem um elevado nível de pureza (virtualmente sempre 50 por cento ou mais) logo após os passos de lise e/ou extracção com desnaturantes. Assim, quando comparado com os processos convencionais para isolamento de proteínas, a proteína desejada está num estado de pureza relativamente elevado antes de ser submetida ao passo de filtração em gel. Portanto a habitual desvantagem - i.e., a baixa capacidade da filtração em gel quando comparado com permutas iónicas não é pertinente neste caso. Uma vez que a quantidade de impurezas é pequena não é necessária uma capacidade total elevada como seria para isolar uma pequena quantidade de uma proteína particular a partir de uma larga gama de impurezas.

Purificação ulterior pode ser facultativamente efectuada, de acordo com este aspecto. Se o desnatu rante solvente era iónico, é necessário retirar o sal da solução por permuta num desnaturante não iónico caso esses tais outros passos envolvam permuta iónica. Em termos práticos é preferível utilizar uma solução desnaturante fraca tal como a ureia. Enquanto que em principio o desnaturante deve ser simplesmente removido por, por exemplo diálise contra tampão de tipos "Standard" isto resulta muitas vezes em repreoipitação da proteína. A manutenção da proteína numa solução que ainda contem uma concentração razoável de desnaturante evita uma precipitação prematura da proteína. Uma vez que os iões tenham sido removidos e substituídos por uma substância não iónica podem ser utilizadas em ulterior purificação uma varie dade de técnicas de oromatografia que envolvam permuta iónica ou suportes de adsorção neutros. Uma escolha acertada entre estes é oromatografia em DEAE celulose a um pH tal que a proteína desejada não adsorva à coluna e apareça no volume vazio. Deste modo a coluna, captura os contaminantes proteicos aniónicos e remove-se da proteína desejada. Esta abordagem em lu gar da contrária, em que a proteína desejada é adsorvida e elui da, tem a clara vantagem da simplicidade e de necessidades de

resina mais limitadas. Uma vez que a proteína desejada predo mina em quantidade, só é necessária resina para adsorver os contaminantes. No entanto, o processo referido neste aspecto do invento não é limitado por qualquer exemplo especifico , mas antes permite a utilização de uma variedade de técnicas de separação como métodos de purificação ulterior.

G. Manutenção da solubilidade sem desnaturante forte

Ainda um outro aspecto do presente invento compreende a manutenção da solubilidade durante a purificação por substituição da solução fortemente desnaturan te da proteina em questão por uma solução fracamente desnaturante antes de subsequente purificação ou teste biológico. Nalguns casos, por exemplo o da hGH expressa em E. coli, isto por si só pode ser suficiente para efectuar o reenrolamento, mas isto nem sempre é o caso. Ainda, nalgumas circunstâncias e para algumas aplicações (p.ex. em que não esteja envolvida subsequente permuta iónica) a diluição limitada da solução fortemente desnaturante será suficiente para manter a solubilidade de algumas proteínas. No entanto um processo de troca de tampão através do qual uma solução fortemente desnaturante é substituída por uma mais fraca, é útil para manter a solubilidade enquanto permite posterior purificação, e nalguns ca sos, restauração da actividade biológica. Isto é desejável, em particular, no caso de desnaturantes fortes iónicos, porque por exemplo, é muitas vezes necessário usar técnicas de permuta iónica para purificar mais proteínas refractáveis par cialmente purificadas. Não é possível utilizar a solução resultante directamente da solubilidade das proteínas refractáveis devido ao desnaturante iónico interferir com a permuta iónica. No entanto, a remoção deste desnaturante resulta muitas vezes em precipitação da proteína desejada. Estes pro. blemas podem ser evitados por troca de tampão substituindo um desnaturante forte iónico, como seja a guanidina, por um desnaturante menos poderoso não iónico como seja a ureia. Em particular, a ureia parece, em concentrações razoáveis - i.e.

1 - 9 M aproximadamente, permitir ο reenrolamento das proteínas até algo aproximado, do seu estado nativo se fornecidas na for ma extraída, ou na forma S-sulfonada como estabelecido noutro aspecto deste invento e também (talvez devido a isto) mantém a solubilização.

À "permuta de tampão" pode ser feita na presença de ρ-mercaptoetanol ou outro agente redutor adequado de modo a manter a redução de qualquer ligação dissulfu reto incorreta que se possa ter formado antes do processo de renaturação por troca de tampão ou, como alternativa, com a proteína na forma de um S-sulfonato.

Deste modo no processo deste aspecto do invento, a solução fortemente desnaturante contendo a proteína de interesse ou o seu S-sulfonato e, por exemplo, guani dina HCl 4-9M, é submetida a "permuta de tampão" usando diáli se ou diafiltração contra uma solução de ureia ou outro desna turante fraco que facultativamente contem uma concentração adequada de agente redutor, antes de ter lugar qualquer purificação subsequente. (Como estabelecido num outro aspecto do invento, a solução fortemente desnaturante original pode ser primeiro tratado com sulfito e um agente oxidante suave para causar sulfitólise antes da permuta de tampão contra um meio fracamente desnaturante. Este processo de sulfitólise não é inconsistente com o objectivo do presente aspecto do invento). Em qualquer dos casos, a solução fracamente desnaturante contém proteína que toma a conformação mais aproximada da da pro teína biologicamente activa, (quer seja S. sulfonada ou não) e a solução resultante pode ser sujeita à panóplia completa de técnicas de purificação, tais como permuta iónica numa colu na de aniões tal como DEÁE celulose ou numa coluna de catiões tal como CMC. Em qualquer dos casos os métodos de purificação subsequentes são conduzidos de modo convencional a pH e concen tração salina apropriados dependendo da proteína particular a ser isolada e da estratégia especifica a see empregue. Tais métodos de purificação subsequente são bem conhecidos na espe-31-

cialidade e a sua aplicação é familiar para os seus executantes.

Ξ. Reenrolamento

Os três aspectos restantes do invento representam processos alternativos dirigidos para a reactivação de uma forma inactiva (presumivelmente porque está enrolada de um modo incorreto) da proteína desejada.

No primeiro desses aspectos, as proteínas refractáveis que foram solubilizadas num desnaturante forte tal como hidrocloreto de guanidina são renaturadas atra vés de sulfitólise preliminar na solução fortemente desnaturante seguido de reenrolamento, deleção de sulfonato e formação de dissulfureto, num meio fracamente desnaturante na presença de um composto sulfidrilo contendo uma pequena percenta gem da sua forma dissulfureto correspondente. A forma dissul fureto pode ser dada directamente ou o composto sulfidrilo usado só zinho na ausência de precauções para exclusão de ar. Isto cria uma atmosfera oxidante adequada suficiente para assegurar a presença de algum dissulfureto.

Tipicamente, para efectuar sulfitólise, a proteína refractável solubilizada num meio fortemente desnaturante é tornado 3- 200 mg por ml aproximadamente, de preferência à volta 15 - 30 mg por ml em sulfito de sódio ou nas quantidades molares correspondentes de outros sais de sulfito , na presença de um agente oxidante suave suficiente para regenerar dissulfureto a partir de quaisquer grupos sulfidrilo que resultam da reacção. Agentes oxidantes adequados são, por exemplo, oxigénio molecular com catalisadores tais como catiões metálicos ou tetrationato de sódio, de preferência tetrationato de sódio. 0 tetrationato de sódio é adicionado na quantida de de aproximadamente 1-20 mg/ml de preferência cerca de 10 mg/ml, podendo ser usadas quantidades molares correspondentes de outros agentes. A solução é então deixada em repouso 4-24

horas, de preferência durante a noite, entre 15°C a 35°C de preferência à volta da temperatura ambiente. Se bem que tenham sido dadas gamas de concentrações e temperaturas, ate., as condições precisas que são mais adequadas dependem, concerteza, da natureza da proteína a ser sufitolisada.

Além do mais, por vezes apenas é útil sulfitólise "parcial”. Nesse caso, podem ser usadas quantida des muito menores de sulfito e oxidante. Ver, p.ex. Exemplo 13. As quantidades referidas são meramente linhas gerais de orientação e os limites são definidos por vários parâmetros incluindo a quantidade de proteína em solução e 0 grau de sul fitólise desejado.

Na reacção de sulfitólise acima, as pontes dissulfureto são quebradas e um sulfonato substituído por um dos sulfuretos associados. Crê-se que o mecanismo desta reacção envolve um ataque nucleofílico pelo ião sulfito para quebrar a ponte dissulfureto. Em qualquer dos casos a ligação resultante é proteína-S-SO^ , i.e. uma proteína-S-sulf onato.

A solução resultante de proteína-S-sulfonato é então colocada numa solução fracamente desnaturante quer por diluição quer por troca de tampão, p.ex. por diálise contra uma solução contendo um desnaturante fraco tal como a ureia.

Deve-se notar que purificação ulterior usando cromatografia de troca iónica ou outras técnicas "Standard" de purificação de proteínas podem ser usadas enquanto a proteína está ainda na forma S-sulfonada.

0 meio fracamente desnaturante proporciona uma via para reenrolamento correeto, não se encontrando mais a proteina com ligações dissulfureto incorrectas. Se se usar ureia como solução desnaturante fraca, as concentrações

adequadas andam entre 1-9M, de preferência 6-8M. 0 pH é

mantido a aproximadamente 5-9, d.e preferência à volta de 6 -8, com tampão adequado e facultativamente com adição de EDTA ou outro agente quelatante. Se se usar, diluição as concentrações apropriadas são cerca de 0,5M-2Mpara o desnaturante forte original. Ao meio desnaturante fraco adiciona -se um sistema contendo um composto sulfidrilo (RSH) e o seu correspondente dissulfureto (RSSR), por exemplo, p-mercaptoetanol, glutationa reduzida, cisteamina ou cisteína e as suas formas oxidadas correspondentes, de preferência glutationa nas suas formas reduzidas (GSH) e oxidada (GSSG). O pH é ajus tado para um valor tal que o composto sulfidrilo (RSH) está pelo menos parcialmente na forma ionizada (RS^-) de forma a ser incrementado o deslocamento nucleofílico do sulfonato. Como alternativa pode-se usar a forma reduzida por si só na presença de ar pois originar-se-à dissulfureto suficiente neste ambiente. Tipicamente a relação molar de RSH para RSSR é aproximadamente entre 20:1 e 5:1, de preferência cerca de 10:1 e a concentração de glutationa total ou de outro reagente sendo na gama de 0,05 a 5mM· A mistura é incubada entre cerca de 0°C e 37°C, dependendo da proteína, 4-24 horas, de preferência durante a noite.

Enquanto que o composto sulfidrilo por si só seria suficiente para efectuar a conversão da proteína-S-sulfonato no dissulfureto correspondente, ou pelo menos para formar ligações dissulfureto com o próprio composto sulfidrilo, a presença de uma forma oxidada é necessária para assegurar que as ligações dissulfureto adequadas se mantenham intactas. Se se adicionar composto sulfidrilo não adulterado nas condições em que a oxidação não é permitida, a proteína acabará na forma sulfidrilo e não na forma dissulfureto . Para evitar que isto aconteça, o potencial de oxidação do tampão circundante é mantido através da adição de uma pequena quantidade de dissulfureto directamente ou permitindo oxidação de sulfidrilo reduzido pelo ar.

A solução resultante contendo agora a proteína de interesse correctamente reenrolada, que presumivelmente está protegida pelas ligações dissulfureto correç. tas, pode então ser facultativamente liberta do desnaturante por diálise contra solução tampão adequada de pH 5 -9 θ poden do conter ou não pequenas quantidades de glutationa reduzida ou outro composto sulfidrilo numa concentração da ordem de aproximadamente lmM. Se as utilizações subsequentes da proteína suportam a presença do desnaturante então não é necessá rio este passo.

No processo precedente, a concentração proteica é mantida num nível baixo, de preferência menos de mg por ml porque nalguns casos (mas não em todos) concentrações elevadas são prejudiciais à progressão da reacção.

Ainda a reacção de sulfitólise pode ser efectuada facultativamente em ureia ou outro desnaturante fraco assim como na solução fortemente desnaturante, podendo mesmo ser vantajoso fazê-lo, particularmente nos casos em que a concentração de desnaturante usada para efectuar a solução fôr particularmente alta. Nesses casos a troca de tampão para um desnaturante mais fraco ou diluição será efectuada antes e não depois da reacção de sulfitólise.

Num aspecto alternativo do invento destinado a "reenrolar" a proteína heteróloga, o desenrolamen to e reenrolamento são feitos de modo a ocorrerem na mesma so. lução colocando a proteína ou peptídeo de interese num tampão contendo sulfidrilo/dissulfureto, tampão esse que tem poder desnaturante suficiente para que todas as comparações intermédias se mantenham solúveis no decorrer do desenrolamento e reenrolamento. Um meio adequado é por exemplo ureia 1-9M, de preferência aproximadamente ureia 7Mque parece ser um agen te desnaturante suficientemente fraco que permite uma grande aproximação da conformação correcta e suficientemente forte tornando possível a mobilidade da cadeia em reenrolamento

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e solubilidade dos intermediários. Esta execução pode ser caracterizada como "reenrolamento em tampão redox". Ambas as formas reduzida (BSH) e oxidada (BSSB) dos compostos sul fidrilo, por exemplo B-mercaptoetanol, glutationa, cisteami na ou cisteína, de preferência glutationa, estão presentes no meio de troca apropriado.

Neste reenrolamento em tampão redox, a relação molar de RSH para RSSE. é aproximadamente entre 20:1 e 5íl» de preferência cerca de 10:1 e a concentração de reagente total está na gama de 0,05 a 5mT2. 0 pH, de novo, deve

ser suficientemente alto para assegurar pelo menos uma ionização parcial de RSM de bem que não tão alto que desnature a proteína. A mistura ê incubada entre 0°C e 37°C, de preferên cia a 5°C durante 4-24 horas, de preferência durante a noite. Aqui, como atras, a presença de ambas as formas reduzidas e oxidada do composto sulfidrilo pode ser conseguida quer direch tamente quer através da oxidação pelo ar do sulfidrilo. Ambas as formas necessitam de estar presentes para manter o potencial oxidante adequado de modo a impedir a redução completa da proteína em causa.

Como acontece com outros processos de reenrolamento do invento, a proteína pode, enquanto em solução , ser sujeita a técnicas "standard" para purificação da proteína como sejam filtração em gel ou permuta iónica. Ê particularmente preferível empregar uma técnica de troca iónica tal como DEAE celulose.

Ainda num outro aspecto deste invento, o reenrolamento e restauração da forma nativa no contexto do processo de purificação é feito retendo a protêina numa forma reduzida através de quaisquer que sejam os passos de purifica ção usados e reoxidação na presença de ar para formar as liga ções dissulfureto apropriadas quando da remoção final do desnaturante. Neste processo, um agente redutor está presente na solução inicial de proteína refractável num desnaturante

forte e durante todos os passos de purificação subsequentes. Agentes redutores adequados são por exemplo j^-mercaptoetanol, ditiotreitol e glutationa reduzida, de preferência p-mercapto etanol. Quando da remoção da maior parte ou de todo o desnaturante no fim do processo, o agente redutor não é incluído na mistura de reacção havendo a presença de ar suficiente para reoxidar os grupos sulfidrilo da proteína agora correcta mente enrolada para ligações dissulfureto de modo a assegurar a forma nativa correcta. 0 emprego deste processo está exemplificado no Exemplo 10 e 11.

H. Um processo "Standard" de passos múltiplos

No Esquema 2 abaixo é apresentada uma versão abreviada mostrando os múltiplos passos necessários num processo geral de passos múltiplos para purificação e que constitui um outro aspecto do invento, assim como dois passos facultativos seleccionados entre aqueles agora convencionalmente empregues.

Pasta de células

Passo 1

Sedimento

dispersa e homogeneizada em tampão

sohrenadante (proteína hospedeira)

Passo 2

solução desnaturante

Sedimento Sohrenadante

(detritos do hospedeiro)

Passo 3 (facultativo)

filtração em gel

proteina hospe- proteína heteróloga de ira

Passo 4 troca de tampão ,

(facultativo) troca iónica

proteina não desejada proteina

heteróloga

passo 5

troca de tampão

4/

proteina desejada (renaturada)

ESQUEMA 2

Como se mostra no Esquema 2, o proces. so no seu aspecto básico compreende a dispersão de uma pasta celular num tampão tendo uma força iónica de aproximadamente 0,05-2,0 M, de preferência 0,4-0,6 M, para completar ou manter a precipitação da proteína heteróloga e para dissolver ou man ter a solubilidade da maioria das proteínas do hospedeiro. Àpós separação da proteína hospedeira, a proteína heteróloga é dissolvida numa solução fortemente desnaturante contendo um agente redutor. 0 processo está completo quando da recuperação da proteína heteróloga na forma biologicamente activa através de permuta de tampão. Os passos de filtração em gel ou troca iónica (Passos 3 e 4) são execuções preferidas facul tativas de passos de purificação adicionais que podem ser ade quados em casos individuais.

0 material celular usado como material de partida pode ser a cultural total ou uma sua forma reduzida como seja a paste celular. Como células hospedeiras são preferidas as culturas bacterianas, em particular E.coli. Correntemente, é preferival usar uma pasta de células feita após um passo de morte celular que é usado para cumprir os regulamentos correntes promolugados como precauções de segurança. (0 invento é aplicável à recuperação de proteína a partir de células hospedeiras quer seja empregue ou não preliminarmente um passo de morte celular). Num processo preferido ao caldo de cultura, que é cultivada até aproximadamente 30-50 unidades de DO a 55° são adicionados fenol e tolueno aproximadamente 0,25% de cada, e deixado em repouso durante aproximadamente V2 hora. Com isto consegue-se notar as células sem desnaturação indevida da proteína celular. 0 calor e 0 ácido são eficazes na morte de células mas são menos preferidos; no entanto estes e outros métodos de morte podem ser usados em-concordância com 0 processo subsequente do invento. Os materiais mortos que são então sujeitos ao process so do invento podem ser quer 0 caldo total quer as células centrifugadas; no entanto, é preferível dum ponto de vista prático (de minimização de volumes) usar a pasta de células

-Ήcentrifugadas. Esta cultura ou pasta pode também ser congelada para se guardar antes do processo de purificação puramen te por conveniência.

Ao efectuar-se a extracção inicial (Passo 1 do Esquema 2) as células são bem dispersas numa solução que é tamponada a aproximadamente pH4-10, de preferência a cerca de pH6-9 e contem espécies iónicas num nível de aproximadamente 0,05-2,0 M de força iónica, de preferência 0,4-0,6M . Pode ser usado qualquer sistema tampão apropriado. A força iónica é dada por qualquer sal inclinado as espécies usadas na tamponaçêo, mas por razões de economia, de preferência ela é dada por cloreto de sódio. Em adição é desejável que o tampão contenha um agente quelante, tal como, por exemplo , EDTA e um agente redutor, por exemplo, 2-mercaptoetanol (BME).

Ao efectuar-se o paso precedente é altamente desejável obter uma suspensão uniforme; se se usar pasta celular é preferível a dispersão mecânica. Há no merca do máquinas dispersoras para este fim e uma escolha preferível é Dispax (Tekmar Inc.) Modelo SD 45· No entanto, se se usar o caldo de cultura não é necessária a dispersão mecânica.

Uma vez que a proteína heteróloga pre cipitada (refractável) está geralmente dentro das células, é também necessário homogeneizar a suspensão de células resultante do Passo 1 usando um homogeneizador ou prensa de um tipo que destrua eficazmente a integridade das células. Podem ser usados uma série de dispositivos ou técnicas, tais como prensa Francesa, ou um moinho de contas, ou sonicação; é no entanto preferido um homogenizador Manton-Gaulin tipo 15M . Quando as células estão dispersas e homogeneizadas no tampão como descrito o material insolúvel é separado das proteínas solúveis de preferência por centrifugação e o sobrenadante é removido.

0 sobrenadante contem basicamente as proteínas hospedeiras e é rejeitado.

j£gO$0ifei| lyftfcQfôãll -40-

Num processo preferido, o sedimento é lavado por redispersão do sedimento num tampão semelhante de modo a remover ainda mais material hospedeiro das proteínas insolúveis do sedimento. A lavagem é efectuada de modo "Standard" por tratamento do sedimento com uma amostra fresca do mesmo tampão redispersão e centrifugação do sedimento lava do.

0 sedimento é então extraído como se mostra no passo 2 para recuperar as proteínas heterólogas desejadas. 0 sedimento é disperso numa solução fortemente desnaturante actuando de um modo semelhante ao descrito no Passo 1. De preferência a solução usada neste passo será 1-9 molar, sendo mais preferível 6-8 molar num desnaturante forte tal como um sal de guanidina, juntamente com fosfato suficiente ou outros agentes tamponantes adequados para dar um pH de aproximadamente 4-10, de preferência cerca de 6-9, e ainda melhor cerca de 7 e de preferência com pequenas quanti dades de agente quelante tal como por exemplo EDTA. E necessário que estaja presente um agente redutor, tal como jp-mercapfco etanol para assegurar a conversão de quaisquer pontes dissulfureto em grupos sulfidrilos. Podem ser usados, concerteza, outros desnaturantes. 0 sedimento quando disperso é agitado com a solução desnaturante até durante 24 horas, de preferência durante a noite.

A suspensão é então centrifugadá e o sedimento que contem proteína hospedeira não dissolvida e precipitada e detritos celulares é rejeitado.

A purificação até este ponto é por vezes suficiente para que a proteina resultante possa ser usada após enfraquecimento do efeito do desnaturante através de diluição ou troca de tampão. Se assim fêr, os passos 3 ^e 4 podem ser omitidos e o passo 3 efectuado directamente como descrito abaixo.

No passo 5, a proteína desejada é então recuperada na forma biologicamente activa por substituição do agente desnaturante por um meio solvente adequado.

Para algumas proteínas, a diluição para uma concentração mais baixa do desnaturante original será suficiente. Para outras é necessária a troca de tampão para um desnaturante diferente que seja menos caotrópico, tal como a ureia. 0 passo final da recuperação é feito na ausência de agente redutor para permitir uma certa segurança das pontes dissulfureto quando a proteína é deixada desenrolar num desnaturante mais fraco.

No entanto, se se desejar purificação ulterior, os passos facultativos subsequentes podem ser efectuados na presença de um agente redutor para aumentar a pureza antes da renaturação. Pode-se escolher um certo número desses passos. Como exemplo e como preferidos entre estes são os que se seguem:

Num primeiro desses passos preferidos, (passo 3) a solução contendo ainda o agente redutor de_s naturante e a proteína desejada é sujeita a oromatografia por um processo de filtração em gel para separação por tamanhos. A escolha do tamanho adequado de poro do gel, devido a esta dependência de tamanho, depende da natureza da proteína a ser purificada. Para as proteínas da febre aftosa (PMD) a escolha adequada ê por exemplo Sephacryl S-300 (Pharmacia).

0 passo de filtração em gel pode ser efectuado na presença de altas concentrações de um agente de_s naturante iónico que possa ter sido usado para solubilizar a proteína desejada. No entanto, é claro que um passo de cromatografia de permuta iónica como o exemplificado no passo 4, já não poderá. Assim se se desejar uma maior purificação baseada em permuta iónica, a própria solução desnaturante, caso contenha iões, p.ex. guanidina ou mesmo o eluente da cro matografia de permeacção em gel se ainda contem estes deve

ser primeiro sujeito a remoção de iões. Isto pode fazer-se por diálise contra tampão alcalino de preferência, contendo de novo agente redutor com uma alta concentração de um agen te desnaturante neutro tal como, por exemplo, ureia cerca de 8M, para manter a solubilização da proteína heteróloga.

Após feita a remoção de sal do material que está no saco de diálise é sujeito a cromatografia numa coluna de permuta iónica apropriada, tal como por exemplo DEAE celulose. As condições são de preferência seleecio nadas de modo a permitir que a proteína desejada passe pela coluna no volume vazio. Isto é vantajoso pois é necessária menos resina de troca iónica áe forem as impurezas, que estão presentes em pequena quantidade, absorvidas à resina e não o grosso da proteína que nesta fase da purificação é o produto desejado.

0 volume vazio contendo proteína puri ficada e desnaturante neutro pode ser usado como tal em casos apropriados ou liberta do agente desnaturante por diálise con tra uma solução mais diluída. Verificou-se que nalguns casos é necessária uma permuta de tampão preliminar para uma concentração de ureia mais baixa precedendo uma permuta de tampão final para água ou tampão para evitar a precipitação da proteína. Durante todos os passos até ao último deve estar presente o agente redutor. Os agentes redutores adequados são estabelecidos e dadas as indicações para a sua utilização em correcção oom o aspecto do invento previamente descrito .

A solução resultante é geralmente da ordem de 95—99 por cento pura em relação à proteina desejada. A recuperação é tipicamente da ordem de pelo menos 5θ por cen to e até 98 por cento da proteina heteróloga.

0 processo referido pode ser aplicado especialmente com vanatgem a bGH, pGH, bGH, interf erão bovino, tPA e proteínas do envólucro virai do EMD.

I. Exemplos

Os exemplos seguintes pretendem ilustrar o invento mas não limitar o seu âmbito.

Os exemplos 1-8 relacionam-se com o aspecto do invento que compreende a solubilização das proteínas da célula hospedeira e recuperação dos corpos refractáveis como tal através de centrifugação a baixa velocidade.

0 exemplo 9 ilustra o aumento de recuperação de corpos refractáveis através da utilização de um passo de "morte " celular.

Os exemplos 10 e 11 relacionam-se com o aspecto do invento que se caracteriza por um processo de passos múltiplos combinando uma lise preliminar e remoção das proteínas bacterianas, com solubilização das proteínas refractáveis resultantes e inevitavelmente, certos contaminantes, num desnaturante forte, seguido de uma purificação subsequente facultativa que tem como primeiro passo filtração em gel ou centrifugação a alta velocidade e recuperação da proteína activa.

Estes Exemplos também ilustram os aspectos do invento que usam o ar como reagente formador de dissulfuretos após a proteína ter sido deixada reenrolar na presença de um agente redutor, a capacidade dos solventes que são soluções fortemente desnaturantes para dissolver corpos refractáveis e a manutanção da solubilidade por troca para desnaturante mais fraco.

Os Exemplos 12, 13 e 15 dizem respeito ao reenrolamento de proteína pelo menos parcialmente inactiva por sulfitólise seguido de tratamento com tampão redox; 0 Exemplo 14 estabelece o processo do "reenrolamento com tampão redox".

0 Exemplo 16 ilustra especificamente a eficácia da solubilização em solução fortemente desnaturante seguido de permuta de tampão para um desnaturante mais fraco.

_Ji h .

Todas as referências citadas nestes exemplos são englobadas como referência neste pedido.

Todos os exemplos estão relacionados com proteínas heterólogas específicas que foram purificadas pelo processo do invento. Os detalhes da purificação variarão, con certeza, com as proteínas especificas usadas. Apesar do processo do invento ser semelhante em todos os casos, certos detalhes, tais como, por exemplo, a selecção do agente desnaturante para a solubilização.da proteína desejada, a selecção dos géis de poro adequado ou das resinas de troca iónica, assim como as condições de força iónica e pH adequados a cada passo estarão dependentes da natureza da proteína. No entanto, as proteínas refractáveis têm em comum caracteristicas suficientes para que estas alterações menores bastem para adaptar o processo a uma proteína particular em questão.

Exemplo 1

Método para produção e isolamento de proteínas heterólogas

A. Crescimento das células;

As células E. coli E12 transformadas com o plasmídeo recombinante pBR 522 transportando os genes heterólogos sob o controle do promotor-operador do trp de E. coli. foram cultivadas em caldo contendo 10 g/1 de extractos de levedura e 5 g/1 de triptona até uma densidade de cerca de 2-4 x 10 células/ml. 5-5 P^or cento do volume desta cultura foi inoculado em meio M9 (J.H. Miller, Experiments in Molecular Geneties, p. 451, Oold Spring Harbor Labor atory, 1972) ou em meio semelhante de sais minerais contendo 40-120 mg/1 de triptofano. As culturas foram cultivadas num fermentador de bancada com agitação suficiente e arejamento de modo a conseguir-se uma taxa de crescimento de 60-90 minutos por divisão celular, deu-se glucose às culturas para manter o crescimento não tendo excedido 50 g/1 durante a fermentação e o pH das culturas foi controlado a 6,8-7,2 com NaOH ou ΝΞ^ΟΗ. A uma

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! densidade celular de 5-10 g peso seco/1 adicionou-se às cultu ras ácido indoloacrílico (IAA) ou ácido indolopropiónico (IPA) para uma concentração de 25-50 mg/1. Duas a cinco horas após a adição de IPA, as células de E. coli tornaram-se alongadas podendo-se ver um ou mais corpos refractáveis por célula num microscópio de contraste de fase com uma aplicação de 1000 vezes.

B. Isolamento da proteina heteróloga:

As culturas foram colhidas por centri fugação contínua e as pastas de células foram congeladas entre -10 e -20°C.(As células podem facultativarnente ser mortas antes da colheita através da adição ao meio de 0,25 por cento de fenol e 0,25 por cento de tolueno e incubação durante 0,5 hrs a 37°C (Ver Exemplo 9)). As pastas de células recentemente colhidas ou congeladas foram ressuspensas num tampão contendo Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 numa relação de 1 g de pasta de células para 10-40 ml de tampão e as células destruídas por sonicação ou ho mogeneízação a pressão-elevada.

Com microscópio de contraste de fase observaram-se partículas refractáveis entre os detritos célula res. A Pigura 1 mostra a suspensão de E. coli E12 estirpe 3110 (ATCC 27325) transformada com 0 plasmídeo pUK 33trp LEg, descri to no pedido dos E_OU.A. N2 de Série 368.775 (PE 92182) deposita do em 15 de Abril, 1982, expressando uma proteína de fusão con tendo uroquinase (UK). Os corpos refractáveis surgem como pontos brilhantes dentro do envelope celular. A suspensão foi sujeita a centrifugação a 1000 x g (Sorvall 55-54 a 3000 rpm) durante

3-10 minutos. Após centrifugação 0 sobrenadante foi rejeitado e 0 sedimento foi ressuspenso no mesmo tampão em 1/5 do volume original. A suspensão foi examinada em microscopia de contraste de fase e se estivessem presentes células intactas residuais ou fragmentos visíveis de células, 0 processo acima seria repetido até uma observação óptica do sedimento ressuspenso apresentar apenas partículas refractáveis.

A Figura 2 mostra o sedimento ressuspenso para a proteína UK da Figura 1. Parece que a preparação é na sua maioria refractável com algumas células e fragmentos celulares incluídos.

Se células ou fragmentos celulares estiverem presentes a suspensão será sujeita a nova disrupção. 0 isolamento de partículas refractáveis dá-se tipicamente após 3-4 ciclos. A preparação de partículas refractáveis pode então ser guardada congelada como sedimento ou em suspensão e constitui cerca de 95 por cento da proteina refractável.

Para verificar a identidade as preparações de partículas refractáveis são sujeitas a SDS-PAGE, transferência Western e/ou teste radioimune (RIA). A Figura 3 sumariza os resultados de purificação obtidos para pGH, raiva e uroquinase Raiva e pGH parecem resultar em bandas únicas de proteína no sedimento, a uroquinase é mais complexa devido às suas várias formas alotrópicas.

Exemplo 2

Hormona de Crescimento humana

Células E. coli K12 transformadas com DNA recombinante tendo o gene da hormona de crsecimento humana (estirpe W311O/plO7) como descrito na Patente US N2 4.342.832 foram crescidas num fermentador, e colhidas e as partículas refractáveis isoladas de acordo com o processo descrito no Exemplo 1.

As partículas apresentavam uma banda proteica correspondendo a um padrão de peso molecular de 22000 daltons em SDS-PAGE com 2-mercaptoetanol. Uma análise densitomêtrica do gel mostrou que a quantidade desta proteina era cerca de 90 por cento da proteina total na preparação de partículas refractáveis e a identidade desta proteina como hormona de crescimento humana foi verificada por transferência Western. 0 rendimento de partículas refractáveis foi de cerca de 10-20 mg por grama de pasta Celular molhada.

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! A Figura 4A mostra os corpos refractá

veis contendo hGH numa suspensão do sedimento da primeira centri. fugação.

A Figura 4B mostra os resultados de SDS-PAGE efectuado em células mortas (com ácido) e não mortas desta preparação. A 'banda correspondendo a hGH no sedimento é mais forte no caso das células mortas.

Exemplo 5

Hormona de crescimento bovina (bGH)

E. coli K12 transformada com DNA recom binante tendo o gene da hormona de crescimento hovina (estirpe W511O/pBGH-l) como descrito no pedido dos E.U.A. N2 de série 303-687 depositado em 18 de Setembro, 1981, (PE 75444 e GB 2106119, foi cultivada num fermentador e colhida como descrito no Exemplo 1. (As células foram tratadas com 0,25 por cento de fenol e 0,25 por cento de tolueno no fermentador antes de serem colhidas). As partículas refractáveis foram isoladas e verificou·· -se corresponderem a uma única banda proteica em SLS PAGE com um padrão de 22000 daltons de peso molecular. A análise deaeito métrica do gel mostrou que esta banda constitui cerca de 90 por cento da pròteína total nas partículas. Apés dissolução das paa? tículas em guanidina 7M e diálise em ureia 7^, a presença de bGH foi verificada por teste radioimune (RIA). 0 rendimento de partículas refractáveis foi de cerca de 20 mg por grama de pasta celular molhada.

Exemplo 4

Hormona de crescimento porcina (pGH)

E. coli K12 transformada com DNA recom binante transportando 0 gene da hormona de crescimento porcina (estirpe W3110/pGH-exl) como descrito no pedido dos E.U.A.

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Ν2 de Série 439.977 depositado em 8 de Novembro 1982 pedido de patente Europeia N2 83 306 750, foi crescida num fermentador e coibida como descrito no Exemplo 1. (As células foram tratadas com 0,25 por cento de fenol e 0,25 por cento de tolueno no fer mentador antes da colheita). As partículas refractáveis foram isoladas mostrando uma única banda proteica em SDS-PAGE corre£ pondendo a um peso molecular "Standard" de 22000 daltons. Uma análise densiométrica do gel mostrou que esta banda constitui cerca de 90 por cento da proteina total posta no gel. Após -dis solução das partículas em guanidina TM e diálise em ureia a presença de pGH foi verificada por teste radioimune (RIA). 0 rendimento de partículas refractáveis foi de cerca de 20 mg por grama de pasta celular molhada. A Figura 4A mostra a pureza e concentração dos corpos refractáveis contendo pGH na pasta celu lar suspensa em tampão, a Figura 4B mostra esta pasta após soni cação e a Figura 40 após centrifugação a baixa velocidade.

Exemplo 5

Interferão de fibroblasto humano (FIF)

E. coli K12 transformada com DNA recom binante tendo o gene do interferão de fibroblasto humano (estir pe W3H0/pFIF 34-7) como descrito em Shepard, M., et al., DNA, 1:125 (1982) foi crescida num fermentador colhida e as partículaíi refractáveis foram isoladas pelo processo descrito no Exemplo 1. SBS-PAGE com 2-mercaptoetanol da preparação de partículas refraç táveis resultantes mostrou uma banda principal correspondendo e um peso molecular de 17000 daltons, representando 5θ por cento da proteína total na preparação de partículas refractáveis. A transferência Western mostrou que a proteína refractável reage especificamente com anticorpos contra interferão de fibroblastos humano purificado. 0 rendimento de partículas refractáveis foi de cerca de 10-20 mg por grama de pasta celular molhada.

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Exemplo 6

Interferão imune humano (IIP)

E. coli K12 transformada com DNA recom binante transportando o gene do interferão imune humano (estir pe W311O/pIEN-Vtrp 48) como descrito no pedido dos E.U.A. ΪΓ2 de Série 312.489 de depositado em 19 de Outubro 1981 P.E.

77*670 e GB 2107718 foi cultivada num fermentador e colhida; as partículas refractáveis foram isoladas pelo processo descrito no Exemplo 1. SDS-PAGE com 2-mercaptoetanol da preparação de partículas refractáveis resultante mostrou uma banda principal correspondendo a um peso molecular de 17.000 daltons, represen taudo 50 por cento da proteína total da preparação de partículas refractáveis. A transferência Western mostrou que a proteína re fractável reage especificamente com anticorpos contra interferão imune humano puro. 0 rendimento de partículas refractáveis foi de cerca de 10-20 mg por grama de pasta celular molhada.

Exemplo 7

Activador do plasminogénio de tecido (TPA)

E. coli K12 transformada com DNA recom binante tendo 0 gene do activador do plasminogénio de tecido, (estirpe 3110, pEPAtrpl2) como descrito no pedido dos E.U.A.

N2 de Série 398.003 depositado em 14 de Julho de 1982 (P.E. 93619 e GB 2119804)", foi cultivada num fermentador, as células colhidas e as partículas refractáveis foram isoladas a partir

da pasta celular de acordo com 0 processo do Exemplo 1.

·<,

80-90 por cento da proteína presente na preparação de partículas refractáveis era TPA medido por densitometria de SDS-PAGE com 2-mercaptoetanol e transferência Western. 0 rendimento de partículas refractáveis contendo TPA foi de cerca de 10-20 mg por grama de pasta celular molhada.

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Exemplo 8

Proteína Ao envólucro do FMD

E. ooli K12 transformada com DNA recom binante tendo várias estirpes de antigénio do vírus da febre afetosa (W3110/pPMG /017, W311O/pEMB /1247, W311O/FMD /037, W311O/PMG /Ã277) como descrito no pedido dos E.U.A. N2 de Série 374.855 depositado em 4 de Maio, 1982 (P.E. 68.695 θ GB 2103622) foi cultivada, colhida e as partículas refractáveis isoladas segundo o processo descrito no Exemplo 1.

Cerca de 50 por cento da proteína pre. sente nas preparações de partículas refractáveis era produto do gene clonado da proteína do envólucro do PMD em cada caso medido por densitometria de SDS-PAGE com 2-mercaptoetanol e transferência Western.

Exemplo 9

Aumento de proteína refractável através de um passo de morte celular

A quantidade de hormona de crescimento humana (hGH) no citoplasma vs quantidade nos corpos refractáveis! foi determinada por um estudo comparativo em células mortas e não mortasí células de E. coli K12 capazes de expressar hGH (estirpe W311O/plO7) (ver Exemplo 2) foram cultivadas e colhi das por centrifugação como estabelecido no parágrafo A do Exem pio 1. Antes da centrifugação, o meio foi dividido e uma porção foi tratada com fenol a 0,25 por cento e tolueno a 0,25 por cento e incubado a 37°θ durante quatro horas. As células que foram mortas foram designadas por células "PT" e as que não foram mortas por células "NPT".

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A. Extractos de proteína celular total com SDS

Amostras iguais de células PT e de células NPT foram submetidas a tratamento idêntico por disrupção das amostras de células com sonicação numa solução compreendendo 5 ml de Tris 5θ mM contendo EDTA 10 mM mais 250 /ul de SDS a 20 por cento. As suspensões foram tratadas com vortex durante 0,5 minutos e depois centrifugadas. Os sobrenadantes foram testados relativamente à presença de bGH por teste radioimune (RIA) e por SDS PAGE. Ambas as células PT e NPT apresentaram actividades substancialmente idênticas por RIA, especificamente

8,5 x 10° e 8,7 x 10° unidades por ml, respectivamente. Presumivelmente o processo de extracção com SDS recupera a hormona de crescimento humana inicialmente solúvel e não solúvel. Os resultados de SDS-PAGE concordantes com isto estão apresentados na Eigura 6, assim como os resultados de SDS-PAGE efectuado com amostras tratadas como descrito no parágrafo seguinte.

B. Extractos experimentais

Mais duas amostras iguais de células PT e NPT foram tratadas idênticamente por extracção com 5 ml cada de Tris 50 mM contendo EDTA 10 mM, submetendo a vortex durante 0,5 minutos. As suspensões foram então centrifugadas a aproxi madamente 10.000 xg durante 10 min. i.e. um centrifugação a baixa velocidade (LSS) e o sobrenadante e o sedimento testados separadamente. Presumivelmente a proteína do sedimento será insolúvel na ausência de SDS. As células NPT mostraram actividade no sobrenadante num nível de 4,6χ10θ unidades/ml (cerca de 1/2 da do extracto de SDS), mas diminuindo grandemen te (0,42x1o⁴· unidades/ml) no sedimento. As células PT, por outro lado, apresentaram uma grande redução da actividade hGH no sobrenadante comparado com o extracto de SDS, medido por RIA 0,26χ10⁴ unidades por ml e também baixa actividade no sedimento tendo sido efectuada solubilização do sedimento. Resultados semelhantes foram obtidos quando as amostras foram tratadas de igual modo e sujeitas a uma centrifugação a velocidade mais elevada (HSS) i.e. 35.000 x Gdurante 30 minutos.

C. Comparação dos resultados

A figura 6 resume os resultados usando SDS PAGE. As células extraídas com SDS apresentaram intensida des equivalentes na banda correspondente a hGH. As células NPT apresentaram quantidades substanciais da banda correspondente a hGH no sobrenadante e no sedimento para separações quer a baixa quer a alta velocidade. Por outro lado as células PT mos. traram uma diminuição das quantidades de hGH no sobrenadante por tratamento com baixa e alta velocidade nas quantidades au mentadas no sedimento.

Exemplo 10

Proteína da cápside do vírus EMD

Um processo de passos múltiplos

E. coli K12 tendo o gene codificador do vírus PMD tipo A24 (W3110/pPMB /1247 como descrito no pedido dos E.U.A. N- de Série 374.855 depositado em 4 de Maio de 1982 (P.E. 68.695 © GB 2103622) foi cultivada até uma densidade ce lular correspondente a 3Ο-5θ unidades de D.O. a 550 nm; ou 40 g de pasta celular molhada por litro caldo total em M9 ou meio semelhante de sais mais triptofano a cerca de 40-120 mg/1 e glucose a não mais do que cerca de 5 por cento peso/vol de meio, Ver Experiments in Molecular Genetics. (J.H. Miller, Cold Spring Harbor laboratory, N.Y. (1972).) À cultura (10 litros) foi adi cionado fenol e tolueno para uma concentração de 0,25 por cento de cada e deixada assim durante pelo menos meia hora e depois centrifugada. A pasta de células foi congelada para guardar antes da purificação da proteína. A purificação tal como foi feita neste Exemplo está descrita no Esquema 3:

Pasta'celular

Passo 1

Descongelar,dispersar em Tampão A com dispersador Homogeneizar

Sedifnento 1

Sobrenadante ("rejeitar)

Passo 1'

Lavar o sedimento com Tampão A novo, dispersar

Sedimento 2 Sobrenadante (rejeitar)

Passo 2

Dissolver em Gu HCl 7ΓΊ (Tampão B)

Sedimento / Sobrenadante (rejeitar)

Passo 3

Cromatografia em Sephacryl S-300

Fracções sem proteína FMI} Reunião das fracções com proteína FMD (rejeitar)

Passo 3'

Dializado (rejeitar)

Passo 4

Material retido (rejeitar)

Dializar contra tampão C material retido

Cromatografia em DE-52

Proteína no volume vazio

Dializar contra

Passo 5

1) ureia

2) tampão

Dializato

(rejeitar)

>Material retido proteína FMD

Esquema 3

Imediatamente antes de usar, a pasta celular foi descongelada num frigorífico. 5θ0 g da pasta descongelada foi dispersa em 5 litros de Tampão A (fosfato 5° inM, EDTA 5 mM, NaCl 5°0 mM, /3-merc apto etanol (BME) 15 mM, pH 7)· Para se obter uma suspensão uniforme usou-se um Tekmar Dispax modelo SD-45 com. um gerador G-450 ( 3 min. na velocidade máxima).

A suspensão foi então homogeneizada com um homogeneizador Manton-Gaulin (Tipo 15 M) funcionando a 6000 psi durante 2 ciclos, com arrefecimento entre os ciclos e o homogenado foi centrifugado numa Beckman E03 a 5°°0 rpm durante 30 min a 4°0. SDS PAGE mostrou que o sobrenadante continha substancialmente a mesma mistura de proteínas que o homogenado do Manton-Gaulin não centrifugado mas grandemente diminuída a banda correspondente à proteina PMD.

0 sedimento continha aproximadamente metade da massa de células inicial. 0 sobrenadante foi decantado e rejeitado. 0 sedimento foi lavado por dispersão em novo tampão A (2 litros/200 g de sedimento) usando o Dispax SD-45 e a suspensão centrifugada de novo na EC3 a 5000 rpm durante 30 minutos a 4°0. 0 sobrenadante foi decantado e rejeitado, o sedimento (137 g) apresentou em SDS PAGE uma banda aumentada corres, pondendo à proteína EMD, representando cerca de 50 por cento da proteína no sedimento.

0 sedimento foi então extraído relativamente à proteína PMD por suspensão em 1 litro de Tampão B (fosfato 50 mM, EDTA 1 mM, BME 15 mM, hidrocloreto de guanidina (GuHOl) 7M, pH 7,0) usando 0 Dispax SD-45. A suspensão foi agitada durante a noite e clarificada por centrifugação num rotor Sorvall SS-34 a 19.000 rpm durante 3,0 horas a 4°0.

0 sedimento foi rejeitado e a solução de proteína FMD foi submetida a cromatografia em Sephacryl S-300 (Pharmacia). 0 gel foi primeiro equilibrado em tampão B e depois colocado numa coluna de 5 x 50 cm de acordo com as recomendações do fabricante. As fracçoes do volume vazio (começan do a 270 ml) eram turvas; apesar de que a solução que foi apli cada à coluna não 0 ser. As fracçoes contendo proteína FMD surgiram a 450-465 ml e eram claras. 0 conteúdo de proteína FMD foi verificado por diálise de pequenas quantidades das fracçoes contra ureia 8M e análise por SDS-PAGE (Guanidina precipita com SDS e deve ser removida).

As fracçoes contendo proteína EMD foram remidas e dializadas contra quatro mudas de tampão 0(Tris 14 mM, BME 15 mM, ureia 8M, pH 8,3) num excesso de 20 vezes, a 4°0.

(A ureia 8M substitui GuHCl na manutenção da proteína EMD em solução).

Uma pequena quantidade do material retido no tubo de diálise foi ajustada a pH 10 com NaOH e passada numa coluna de DE52 (l,0 cm x 19 cm) equilibrada com Tampão C ajustado a pH 10 com NaOH. A proteína EMD não foi retida pela resina enquanto que a maoria dos contaminantes de E. coli foram adsorvidos. A proteína presente no volume vazio constituía 96 por cento da proteína EMD encontrada por SDS PAGE e representa um rendimento de 30 g/kg de pasta celular usada ou cerca de 90 por cento. Este material pode ser usado como produto final se a presença de ureia fôr aceitável para a administração do material activo.

Na presente preparação a ureia foi removida sem precipitação da proteína PMD por diálise usando 4 mg/ml de proteína contra um volume em excesso de 250 vezes de ureia 1M, Tris 14 mM, 0,1 por cento de BME, pH 7 a 4°0, seguido de diálise do material retido contra água. Pormou-se tuna nuvem ligeira que foi removida por centrifugação. A precipitação da proteína PMD em água ou tampão foi aparentemente evitada pela diminuição gradual da concentração de ureia. A proteína

EMD obtida era biologicamente activa como se mostrou por reactividade com anti-soro EMD, transferência Western e por testes in vivo em gado no qual a resposta imune foi estimulada.

Exemplo 11

Purificação da hormona de crescimento porcina (pGH)

Um processo de passos múltiplos

E. coli K12 (W311O/pPGH-exl) (Exemplo 4) foi cultivada como no Exemplo 1 até 30-50 unidades de D.O. a 550 nm; 40 g de pasta celular molhada por litro. À cultura foi adicionado fenol e tolueno, 0,25 por cento de cada e deixou -se nestas condições durante 1/2 hora. 0 caldo foi então centrifugado e a pasta de células congelada para armazenamento.

Imediatamente antes de se usar descongelou-se 340 g de pasta celular num frigorífico, dispersou-se em 3,9 litros de tampão A (fosfato 50 mH, EDTA 5 mM, NaCl 500 mM, pH 7) frio. Para se obter uma suspensão uniforme usar-se um Tekmar Dispax modelo SD-45 com um gerador G45 e a suspensão foi homogeneizada com um homogenizador Manton-Gaulin (Tipo 15 M) funcionando a 6000 psi durante 2 ciclos com arrefecimento entre os ciclos.

0 homogenado (4,3 litros foi centrifugado numa Sorvall R03 a 5°00 ^P^m durante 35 minutos a 4°0. 0 sobrenadante foi decantado e verificou-se por SDS-PAGE conter substancialmente a mesma mistura de proteínas que 0 homogenado antes da centrifugação mas com uma banda grandemente diminuída correspondendo a pGH.

O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento disperso em Tampão A novo (1,5 litros/150 g de sedimento) usando 0 Dispax SD-45. A suspensão foi centrifugadá de novo na SC3 a 5000 rpm durante 35 minutos a 4°0. 0 sobrenadante

foi decantado e rejeitado.

0 sedimento (106 g) foi dissolvido em 0,750 1 de Tampão B (Tris 5θ EDTA 1 mM, BME 100 mM, hidrocloreto de guanidina 7 M, pH 8,8) usando o Dispax SD-45 e depois agitado durante a noite. A solução nublada foi clarificada por centrifugação num rotor Sorvall SS-J4 a 19.000 rpm durante 6,0 horas a 4°C e o sedimento foi rejeitado.

690 ml do sobrenadante (volume total 740 ml), foi sujeito a cromatografia à temperatura ambiente numa coluna de Sephacryl S-300 (Pharmacia) de 10 x 85 cm em duas amostras (350 ml e 345 ml). A coluna foi equilibrada e eluída com guanidina H01 7 M, Tris 50 mM, EDTA 1 mH, BME 50 mM, pH 8,9. Pequenas amostras das fracções da coluna foram dializadas contra ureia 8 M, 0,1 por cento de BME, Tris 25 mM, pH 7 e analisadas por SDS-PAGE para determinar a presença de pGH.

As fracções contendo pGH foram reunidas e dializadas contra 4 mudas de um excesso de aproximadamente 20 vezes de Tris HC1 15 mM, BME 50 mM, ureia 7 M, pH 9,0 a 4°C. 0 material retido (3900 ml) foi ajustado a pH 7,0 com HC1 e passa do numa coluna de DE52 (10 cm x 11,5 cm) equilibrada com Tris 15 mM, ureia 7,5 M, BME 50 mM, pH 7,0 à temperatura ambiente. A coluna foi lavada com 1 volume de coluna de tampão de equilíbrio para remover pGH retido.

0 total de DE52 (4000 ml) foi titulado para pH 10 com NaOH e dialisado num Spectrapor 1 contra três mudas de 100 litros de Tris 25 mM, 1 por cento de manitol, pH 10 a 4°C. 0 material retido foi reunido e diluído para 10,4 litros

com o líquido de diálise, esterilizado por filtração e liofilizado. Obteve-se dez gramas de proteína biologicamente activa (por transferência Western) com 98 por cento de pureza em pGH.

Exemplo 12

Reenrolamento da Pro-renina usando sulfitólise

432 gramas de pasta celular de E. coli K12 (estirpe W311O/pRIAX) que tem 0 gene codificador da pro-re nina como descrito no pedido copendente N2 de referência 100/ /130 (pedidos patente Europeia N2 83 3θ 7841.3 e 83307842.1) foi suspenso em 3 litros de tampão compreendendo Tris HC1 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7»5· A suspensão foi sujeita a disrupção ce lular por uma prensa Manton-Gaulin a 6.000 psi durante quatro ciclos. A suspensão assim tratada foi então centrifugada duran te 30 minutos a 4.000 xg e 0 sobrenadante removido e rejeitado. 0 sedimento foi ressuspenso em 2 litros do mesmo tampão usado na suspensão original e centrifugado de novo durante 30 minu tos a 4.000 xg. 0 sobrenadante foide novo rejeitado e 0 sedi. mento dissolvido em biârocloreto de guanidina 6 M contendo Tris 50 mM a pH 8. A proteína refractável solubilizada foi então sulfonada ajustando a solução de guanidina a 20 mg/ml de sulfi to de sódio e 10 mg/ml de tetrationato de sódio através da adi ção de uma pequena quantidade de uma solução "stock” clarifica da preparada recentemente de cada um destes componentes. A sul fonação foi deixada decorrer durante quatro horas à temperatura ambiente.

A solução foi então diafiltrada para ureia 5 M contendo Tris Ξ01 50 mM, pH 7»5 durante cinco horas.

A solução diafiltrada foi então colocada numa coluna de DE52 de 10 x 35 cm que tinha sido lavada com a mesma solução tampão de "ligação" (ureia 5 M, Tris HCl 50 mM, pH 7,5)· A solução foi vertida a 750 ml por hora e lavada durante a noite com 0 tampão de ligação.

A coluna de DE52 foi então eluída usando um gradiente de NaCl de 0 a 0,15 M com um fluxo de 1 litro por hora durante um período de 16 horas. A maioria da proteína foi eluida a aproximadamente 0,070 M de NaCl. As fracções contendo a pro-renina foram de novo diafiltradas contra ureia 5 M,

Tris Ξ01 50 mM pH 8,5 ® a solução ajustada a 1 mM de GSH

-59-

e 0,1 mH de GSSG e deixada em incubação à temperatura ambiente durante a noite. Efectuou-se uma diafiltração adicional contra Tris 50 mM, pH 8,0 contendo 0,1 mM de GSH para remover a ureia.

A solução resultante, sem desnaturante, continha 5,5 gramas de proteína ou aproximadamente 1 por cento de rendimento global.

A proteína apresentava actividade biológica por reacção contra anti-soro pro-renina e por actividade (após activação autocata lítica) num teste "Standard" de coagulação do leite.

Exemplo 15

Preparação de uroquinase activa através de sulfitólise

parcial

Os corpos refractáveis contendo uroqui nase foram isolados a partir de E. coli K12 (estirpe W3110/pUK ããtrpLE·^) como descrito no pedido dos E.U.A. NS de Série 368.773 depositado em 15 de Abril, 1982 (P.E. 92/82) pelo processo es. tabelecido no Exemplo 1. Os corpos refractáveis foram dissolvi dos em guanidina HC1 5 M contendo Tris 50 mM, pH 8,0. A solução foi ajustada a 0,2 mg por ml de sulfito de sódio e 0,1 mg por ml de tetrationato de sódio e incubada durante a noite à tempe. ratura ambiente.

A solução foi então diluida atê um nível de guanidina HG1 1,5 M com tampão Tris 50 ®M pH 9,0 e ajustada a 10 mM de GSH: 1 mH de GSSG. A solução de guanidina diluida contendo a proteína dissolvida foi então de novo incubada du rante a noite à temperatura ambiente e dializada contra solução aquosa. Enquanto que os corpos refractáveis apresentavam uma actividade num bioteste "Standard" para a uroquinase de 0,25 PU/mg, a uroquinase resultante do processo aqui descrito deu uma actividade de 150 PU/mg.

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Exemplo 14

Reactivação da uroquinase por reenrolamento em tampão redox

Os corpos refractáveis preparados como estabelecido no Exemplo 13 foram dissolvidos em hidrocloreto de guani dina 5 M em Tris 50 mM, pH 8,0 e depois a solução foi dializada contra ureia 2 M, Tris HC1 50 mM, pH 7. A solução foi então ajustada a 10 mM de GSH: 1 mM de GSSG e incubada durante a noite à temperatura ambiente. A solução resultante contendo a proteína reenrolada foi então dialisada contra maio aquoso. A solução resultante continha uroquinase que apresentou uma actividade de 30 PU/mg.

Exemplo 15

Reenrolamento da proteina Sare

Sare, uma proteína originalmente isolada a partir de tumores sarcoma foi obtida através da aplicação dos processos do Exemplo 1 a células transformadas preparadas de acordo com o processo estabelecido por Mc Gnath, J.P. e Levinson, A.D., Nature, 295^ 423 (1982). A 3 mg desta proteína que era insolúvel nas condições tamponantes nativas, foi adicionado 3 ml de guanidina 7 Μ, 300/ul de Tris 1 M, pH 8, 20/il de EDTA 0,5 M e 400 /il de uma solução contendo 200 mg por ml de sulfito de sódio e 100 mg por ml de tetrationato de sódio. A solução foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante a noite e tornou-se uma suspensão nublada.

A suspensão foi dialisada contra ureia 7 M contendo Tris 5 mM, pH 8. À metade de±a solução adicionou-se 300/il de glicina 0,1 M pH 9,5 e 90 /il de jB-merc apto etanol 10 mM; a solução foi deixada em repouso durante a noite. Após diálise contra Tris 50 mM, pH 8,5 a mesma proteína estava solúvel e com capacidade de induzir anticorpos precipitáveis contra a proteína sare autêntica quando injectada em ratos.

Exemplo 16

Solução em guanidina e extracção para ureia

E. coli E12 (W311O/pFMB/Ã247 (Exemplo 8) foi cultivada como descrito no Parágrafo A do Exemplo 1 e colhida por centrifugação. A pasta de células (281 g de peso seco) foi suspensa em 10 volumes de tampão de extracção fosfato (PEB: NaH₂P0₄ 50 mM, EDTA 5 mH, NaCl 0,5 M, 0,1 por cento de BME, pH 7,0) com um ultratorex. A suspensão resultante foi passada duas vezes através de um Manton-Gaulin pré-arrefecido a 600 psi e 1 litro/minuto. Após centrifugação a 5~°°° rpm (1/2 hora) numa centrífuga RC5B, o sedimento foi ressuspenso em 10 volumes de PEB com um ultratorex (10 min.). A suspensão foi centrifugada a 5-θΟΟ rpm numa centrífuga SC5B durante 1/2 hora e o sedimento resultante suspenso em 20 volumes de tampão Ureia-Tris (UTB: ureia 8 M (preparada recentemente e desio nizada) Tris 0,14 M, 0,1 por cento de BME, pH 8,3) e aquecido durante 1/2 hora num banho de água fervente. Após arrefecimentc até à temperatura ambiente, adicionou-se 4 volumes de acetona e a solução foi agitada a 6°C durante 1/2 hora. A suspensão foi então centrifugada a 5-000 rpm numa EC3B e o sedimento resultante diluído em 10 volumes de PEB. Após aquecimento da suspensão durante 1/2 hora num banho de água fervente o material foi recentrifugado em RC5B a 5*000 rpm e o sedimento resultante ressuspenso durante 48 horas em 2,2 litros de GuICl 7 M, 0,1 por cento de BME.

A amostra foi então dialisada versus 3 mudas de UTB a pH 8,0 e depois sujeita a cromatografia numa coluna de DE-52 celulose (5x8 cm) equilibrada com UTB, pH 8,0. 0

líquido de lavagem da coluna foi colhido em duas fracções, uma clara e outra turva. A fracção clara (/90 por cento de VP3) foi concentrada para ~ 1,3 mg/ml e testada relativamente à sua actividade biológica.

Uma preparação de antigénio testemunha foi preparada usando E. coli K12 (W3110/pFMB/Ã247) cultivada, colhida e tratada como acima mas em que UTB foi substituído por GuHCl quando da suspensão do sedimento.

As amostras foram testadas por injecção em porquinhos da Índia e obtenção de um anti-soro após 28 dias.

0 anti-soro foi então testado relativamente ao título de anticorpos através da capacidade para proteger ratos de aleitamento contra o vírus PMD. Os resultados são expressos como o log negativo da diluição do anti-soro capaz de conferir imu nidade em 50 por cento dos ratos (-log ΡΏ^θ).

Os anti-soros resultantes da injecção de 100 jug de proteína da preparação acima tinham valores de -log PD^q de 3,2- 3,4, enquanto que os anti-soros resultantes de injecções de 100 ^ig de proteína dos extractos feitos a partir das testemunhas tinham valores de -log ΡΏ^θ inferiores a 0,3·

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   IS. - Método para tratamento de um produto de expressão heterólogo a partir de uma cultura de células hospedeiras, caracterizado por se por em contacto um material refrangente que contém o referido produto com uma solução desnaturante.
2. 2ã. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o material refrangente ser dissolvido num desnaturante forte e por incluir ainda a separação do sobrenadante a partir do material nãõ dissolvido e recuperação do referido produto a partir da solução.
3. 3^â. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o material refrangente ser dissolvido num desnaturante forte, facultativamente na presença de um agente redutor e por a solução fortemente desnaturante ser posta em contacto com um crivo molecular descriminador de tamanho ou ser sujeita a centrifugação de alta velocidade, de modo a que os componentes de alto peso molecular sejam removidos da solução.

   44. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 3 caracterizado por o material refrangente ser dissolvido num desnaturante forte e por incluir ainda a subsequente redução da força da solução desnaturante mantendo simultaneamente o referido produto em solução.

   - Método de acordo com a reivindicação 4 caracterizada por a força da solução desnaturante ser reduzida por substituição do desnaturante forte por uma solução de um desnaturante fraco.

   64. - Método de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5 caracterizado por a solução fortemente desnaturante ser tratada, antes da redução da força da solução desnaturante, para quebrar ligações dissulfureto no referido produto.

   7-* - Método de acordo com a reivindicação
4. 4 ou reivindicação 5 caracterizado por a solução fracamente

   desnaturante ser tratada para quebrar as ligações dissulfureto

   no referido produto.
5. 8ã. - Método de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7 caracterizado por o referido tratamento compreender a sulfitólise com sulfito na presença de um agente oxidante suave.
6. 9^â. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8 caracterizado por a solução fracamente desnaturante ser tratada, apôs quebra das ligações dissulfureto, com um composto sulfidrilo contendo uma proporção menor do dissulfureto correspondente.
7. 10S. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4 e 5 caracterizado por. se fazer o tratamento do referido produto com uma solução desnaturante contendo um composto sulfidrilo e uma quantidade inferior da forma dissulfureto correspondente.

   llã. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 3 caracterizado por o produto ser dissolvido numa solução fortemente desnaturante e submetido a subsequente purificação na presença de um agente redutor que quebra as ligações dissulfureto do produto e subsequentemente qualquer desnaturante ser parcial ou totalmente removido e as ligações dissulfureto do produto serem restauradas por oxidação.
8. 12ã. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizado por as células hospedeiras contendo o referido produto serem dispersas numa solução tamponada para se obter uma fracção solúvel contendo proteína da célula hospedeira e uma fracção insolúvel contendo o referido produto na forma refrangente.
9. 13-. - Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por o material refrangente ser formado como um

   sedimento substancialmente livre de material não refrangente da célula hospedeira.

   142. - Método de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por 0 sedimento ser formado por: i) disrupção do material da célula hospedeira contendo 0 referido produto de modo a haver libertação do referido produto na forma refrangente; ii) centrifugação abaixa velocidade para formar um sedimento de material refrangente; e facultativamente repetição dos passos (i) e (ii) sobre 0 material sedimentado conforme necessário até deixar de aparecer no sedimento detritos celulares não refrangentes.
10. 15^&. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14 caracterizado por a cultura da célula hospedeira ser submetida a um processo para matar células, e as células serem então rompidas para extrair 0 referido produ to na forma refrangente.

    162. _ Método de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por 0 processo de morte celular ser efectuado através da administração de ácido, tratamento pelo calor ou tratamento com um solvente orgânico não-polar.
11. 17&. - Método de extracção de material refrangente incluindo proteína heteróloga a partir de material da célula hospedeira, caracterizado por se fazer:

    (i) a suspensão do material numa solução tamponada; (ii) a dis_ rupção do material celular de modo a haver libertação do material refrangente; e (iii) a centrifugação a baixa velocidade para formar um sedimento de material refrangente.

    182. _ Método de acordo com a reivindicação 17 caracterizado por compreender a repetição dos passos (i) a (iii) sobre 0 material sedimentado conforme necessário até deixar de haver detritos celulares não reagentes no sedimento.

    192. - Método de acordo com a reivindicação 17 ou. reivindicação 18 caracterizado por as células serem primeiro sujeitas a um processo para matar células.
12. 20â. - Método de acordo com a reivindicação 19 caracterizado por o processo de morte celular compreender o tratamento pelo calor, por ácido ou por um solvente orgânico não-polar.
13. 21ã. - Método para a reactivação de uma proteína formada como um produto de expressão heteróloga numa célula hospedeira, caracterizado por compreender 0 tratamento de uma solução fracamente desnaturante da proteína com um composto sulfidrilo na presença de uma quantidade inferior do seu dissulfureto correspondente.
14. 22^a. - Método de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por a proteína ser tratada para serem quebradas as ligações dissulfureto.
15. 23^a. - Método de acordo com a reivindicação 22 caracterizado por 0 referido tratamento compreender a sulfitólise de uma solução desnaturante da proteína com uma mistura de um sulfito e de um agente oxidante fraco.
16. 24ã. - Método de acordo com a reivindicação 22 ou reivindicação 23 caracterizado por a quebra das ligações dissulfureto ser efectuada numa solução desnaturante fraca.
17. 25^a. - Método de acordo com a reivindicação 22 ou reivindicação 23 caracterizado por a quebra das ligações dissulfureto ser efectuada numa solução fortemente desnaturante e a solução ser então convertida numa solução fracamente desnaturante enquanto se mantém a proteína em solução.
18. 26^a. - Método de acordo com a reivindicação 21 caracterizado por a proteína na forma refrangente ser posta em contacto com uma solução desnaturante contendo 0 composto sulfidrilo.
19. 27-. - Método para reactivação de uma proteína formada como um produto de expressão heterólogo numa célula hospedeira, caracterizado por se submeter uma solução ' desnaturante da proteína a purificação na presença de um agente redutor por se remover a maior parte ou todo o desnaturante e por se submeter, a proteína a oxidação.
20. 28ã. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, 11 e 25 caracterizado por a solução fortemente desnaturante ser 4-9 M de um sal de guanidina ou de um sal de um tiocianato, ou ser 0,01-2% por peso de um detergente .
21. 29-· - Método de acordo com a reivindicação 28 caracterizado por a solução do sal de guanidina ser 6-8 M.
22. 30&. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10 e 21 a 26, caracterizado por a solução fracamente desnaturante ser uma solução de ureia 1-9 M ou de um sal de guanidina 0,5-2 M.

    51-. - Método de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 23 caracterizado por a sulfitólise ser efectuada usando sulfito de sódio e o agente oxidante suave ser tetrationato de sódio.
23. 32ã. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10 e 21 a 26 caracterizado por o composto sulfidrilo ser glutationa reduzida.
24. 33a. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 .a 20 caracterizado por a solução tamponada ter um pH de 5 a 9.

    -6834ã. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20 e 33 caracterizado por a solução tamponada ter uma força iónica de 0,01 a 2 M.