JPH0660198B2 - タンパク質の採取方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は初めに不溶性凝集体して存在するタンパク質を
可溶性の形態で採取する方法に関する。
可溶性の形態で採取する方法に関する。
組換えDNA技術は大量のホルモン類、インターフエロ
ンおよび酵素のような所望される真核生物(通常、哺乳
動物)のタンパク質を合成する強力な極めて価値ある手
段を提供する。所望のタンパク質を生産するために、細
菌のような生物を操作することは比較的容易であること
は証明されているが、宿主生物は正常では、タンパク質
産生物を培地中に分泌しない。従つて、生物(たとえば
細菌)の細胞溶解、次いで所望のタンパク質の単離が通
常必要である。
ンおよび酵素のような所望される真核生物(通常、哺乳
動物)のタンパク質を合成する強力な極めて価値ある手
段を提供する。所望のタンパク質を生産するために、細
菌のような生物を操作することは比較的容易であること
は証明されているが、宿主生物は正常では、タンパク質
産生物を培地中に分泌しない。従つて、生物(たとえば
細菌)の細胞溶解、次いで所望のタンパク質の単離が通
常必要である。
2〜3の例外を除いて、Escherichia coli(E.coli)に
高レベルで現われる真核生物のタンパク質は宿主細胞内
に不溶性タンパク質凝集体の形で存在する(Marston,F.
A.O.,Lowe,P.A.Doel,M.T.,Schoemaker,J.M.,White,S.お
よびAngal,S.によるBio/Technology,2(9)、198
4年、729頁)。一例として、E.coliにより産生され
るヒト インシユリンは細菌細胞内に形態学的特徴を有
する封入体として存在する(Williams,D.C.,Van Frank,
R.M.,Muth,W.L.,およびBurnett,J.P.によるScience21
5、1982年、687頁)。これらの封入体(inclus
ions bodies)は細胞容積の大割合を占めることがで
き、細胞内での沈殿および凝集により生成される真核生
物タンパク質の局限的蓄積場所であるように見える(前
記文献)。
高レベルで現われる真核生物のタンパク質は宿主細胞内
に不溶性タンパク質凝集体の形で存在する(Marston,F.
A.O.,Lowe,P.A.Doel,M.T.,Schoemaker,J.M.,White,S.お
よびAngal,S.によるBio/Technology,2(9)、198
4年、729頁)。一例として、E.coliにより産生され
るヒト インシユリンは細菌細胞内に形態学的特徴を有
する封入体として存在する(Williams,D.C.,Van Frank,
R.M.,Muth,W.L.,およびBurnett,J.P.によるScience21
5、1982年、687頁)。これらの封入体(inclus
ions bodies)は細胞容積の大割合を占めることがで
き、細胞内での沈殿および凝集により生成される真核生
物タンパク質の局限的蓄積場所であるように見える(前
記文献)。
これらの不溶性凝集体は機械的手段、たとえば遠心分離
または濾過により高収率で効果的に採取できるが、通
常、これらのタンパク質はさらに精製する前に可溶性に
する必要がある。
または濾過により高収率で効果的に採取できるが、通
常、これらのタンパク質はさらに精製する前に可溶性に
する必要がある。
従来技術によれば、二つの基本的方法が使用されてお
り、その両方法がともに、タンパク質の変性を付随する
可溶化および変性剤の漸進的除法を包含する;タンパク
質は次いでゆつくりと正常の状態に戻すことができる。
これらの方法の一つにおいて、可溶化および変性は水中
で非常に高濃度(6〜9M)の尿素またはグアニジン塩
酸塩のような化合物を使用して行なわれており、もう一
つの方法では、タンパク質は高pHでアルカリにより可溶
化され、可逆的に変性され、次いでpHを非変性低pHに下
げてタンパク質を正常の状態に戻す。これら二つの方法
は組合せて、採取をさらに改善することができる(GB
8407570)。しかしながら、このような組合せ
技術によつても、採取率は依然として30%程度にすぎ
ない。
り、その両方法がともに、タンパク質の変性を付随する
可溶化および変性剤の漸進的除法を包含する;タンパク
質は次いでゆつくりと正常の状態に戻すことができる。
これらの方法の一つにおいて、可溶化および変性は水中
で非常に高濃度(6〜9M)の尿素またはグアニジン塩
酸塩のような化合物を使用して行なわれており、もう一
つの方法では、タンパク質は高pHでアルカリにより可溶
化され、可逆的に変性され、次いでpHを非変性低pHに下
げてタンパク質を正常の状態に戻す。これら二つの方法
は組合せて、採取をさらに改善することができる(GB
8407570)。しかしながら、このような組合せ
技術によつても、採取率は依然として30%程度にすぎ
ない。
これらの方法は重大な欠点を有する。尿素またはグアニ
ジン塩酸塩を使用する方法は非常に高価で、取扱いが困
難および危険であり、除去が困難であり、環境上で有害
であり、そして非常に大量が要求される試薬を使用する
方法である。これらの試薬の溶液はさらに経費をかけて
再循環または廃棄しなければならない。従つて、これら
の欠点はこれらの方法の将来の大規模適用の価値を減じ
る傾向がある(Emtage,J.S.によるNature,317、1
985年、185頁)。さらにまた、グアニジン塩酸塩
はタンパク質の免疫原性に有害に作用することがある。
ジン塩酸塩を使用する方法は非常に高価で、取扱いが困
難および危険であり、除去が困難であり、環境上で有害
であり、そして非常に大量が要求される試薬を使用する
方法である。これらの試薬の溶液はさらに経費をかけて
再循環または廃棄しなければならない。従つて、これら
の欠点はこれらの方法の将来の大規模適用の価値を減じ
る傾向がある(Emtage,J.S.によるNature,317、1
985年、185頁)。さらにまた、グアニジン塩酸塩
はタンパク質の免疫原性に有害に作用することがある。
たとえば水酸化ナトリウムまたはカリウムを使用するア
ルカリ可溶化は安価な別法であるが、便宜上で真の利益
はほとんど提供しない;さらにまた、高pHにおいて、ア
ルカリ水溶液は反応性であり、溶解したタンパク質分子
に修復不能の損傷を与える。両方法において、所望のタ
ンパク質を正常な状態に戻すことは不完全になり、貧弱
な採取率をもたらし、そしてまたこれらの方法は緩慢で
あつて、冗長である。
ルカリ可溶化は安価な別法であるが、便宜上で真の利益
はほとんど提供しない;さらにまた、高pHにおいて、ア
ルカリ水溶液は反応性であり、溶解したタンパク質分子
に修復不能の損傷を与える。両方法において、所望のタ
ンパク質を正常な状態に戻すことは不完全になり、貧弱
な採取率をもたらし、そしてまたこれらの方法は緩慢で
あつて、冗長である。
従つて、本発明の目的は従来技術に関連する難点の一つ
または二つ以上を解消するか、または少なくとも軽減す
ることにある。
または二つ以上を解消するか、または少なくとも軽減す
ることにある。
従つて、第1の態様において、本発明は不溶性の形のタ
ンパク質源、少なくとも一種のカチオン性界面活性剤源
を用意し、不溶性タンパク質を、このタンパク質の構造
幹鎖に実質的な修飾を生じさせることなく可溶化させる
に充分な量の少なくとも一種のカチオン性界面活性剤で
処理することを包含する、タンパク質の採取方法を提供
する。
ンパク質源、少なくとも一種のカチオン性界面活性剤源
を用意し、不溶性タンパク質を、このタンパク質の構造
幹鎖に実質的な修飾を生じさせることなく可溶化させる
に充分な量の少なくとも一種のカチオン性界面活性剤で
処理することを包含する、タンパク質の採取方法を提供
する。
望ましくは、この少なくとも一種のカチオン性界面活性
剤の量は臨界ミセル濃度を超える量である。
剤の量は臨界ミセル濃度を超える量である。
本発明は特に、組換えDNA技術により修飾されている
真核生物および微生物細胞により合成される生物学的に
活性なタンパク質の可溶化および採取に使用できる。タ
ンパク質凝集体はタンパク質をコードする遺伝子を含む
ベクターで形質転換またはトランスフエクシヨンされて
いてもよい宿主細胞の崩壊または溶解により単離された
封入体を含むことができる。しかしながら、本発明はこ
れらに制限されるものではない。さらに、本発明は多大
の生物学的系に共通する天然産生凝集タンパク質複合体
にも適用できる。
真核生物および微生物細胞により合成される生物学的に
活性なタンパク質の可溶化および採取に使用できる。タ
ンパク質凝集体はタンパク質をコードする遺伝子を含む
ベクターで形質転換またはトランスフエクシヨンされて
いてもよい宿主細胞の崩壊または溶解により単離された
封入体を含むことができる。しかしながら、本発明はこ
れらに制限されるものではない。さらに、本発明は多大
の生物学的系に共通する天然産生凝集タンパク質複合体
にも適用できる。
本発明により採取できるタンパク質凝集体は封入体およ
び細胞質凝集体から選択できる。封入体は生長ホルモ
ン、インターフエロン、免疫原およびリンホカインを含
む生物学的に活性なポリペプチドおよびペプチドから選
択できる。本明細書で使用するかぎり、「構造幹鎖」の
用語はタンパク質の第1次および第2次構造を意味す
る。
び細胞質凝集体から選択できる。封入体は生長ホルモ
ン、インターフエロン、免疫原およびリンホカインを含
む生物学的に活性なポリペプチドおよびペプチドから選
択できる。本明細書で使用するかぎり、「構造幹鎖」の
用語はタンパク質の第1次および第2次構造を意味す
る。
好ましくは、少なくとも一種のカチオン性界面活性剤は
ほぼ2.5〜50%(重量/容量)、さらに特に2.5
〜20%(重量/容量)の量で存在させる。この界面活
性剤含有量の上限は選択された界面活性剤の溶解度限界
によつて変えることができる。
ほぼ2.5〜50%(重量/容量)、さらに特に2.5
〜20%(重量/容量)の量で存在させる。この界面活
性剤含有量の上限は選択された界面活性剤の溶解度限界
によつて変えることができる。
本発明により、ここに封入体を包含する所望のタンパク
質の凝集体を、その不溶性形態物を水中において、極性
溶剤の存在または不存在下にカチオン性界面活性剤であ
るいは極性溶剤単独で処理することにより可溶化できる
ことが見い出された。本発明の方法は迅速であり(5〜
60分)、そして可溶化されたタンパク質の採取は非常
に容易に最適に実施できる。容易に入手でき、また再循
環できる少量の安価な試薬が必要なだけである。たとえ
ば、可溶化剤の大部分は水であることができる。
質の凝集体を、その不溶性形態物を水中において、極性
溶剤の存在または不存在下にカチオン性界面活性剤であ
るいは極性溶剤単独で処理することにより可溶化できる
ことが見い出された。本発明の方法は迅速であり(5〜
60分)、そして可溶化されたタンパク質の採取は非常
に容易に最適に実施できる。容易に入手でき、また再循
環できる少量の安価な試薬が必要なだけである。たとえ
ば、可溶化剤の大部分は水であることができる。
本発明の好適態様に従う場合に、不溶性の形態のタンパ
ク質源、少なくとも一種のカチオン性界面活性剤源およ
び少なくとも一種の極性有機溶剤を用意し、不溶性タン
パク質を少なくとも一種の極性有機溶剤ほぼ5〜70%
(容量/容量)とタンパク質の構造幹鎖を実質的に修飾
することなく可溶化を生じさせるに充分な量の少なくと
も一種のカチオン性界面活性剤との混合物で処理し、次
いで生成する溶液から可溶化したタンパク質を分離する
ことを包含するタンパク質の採取方法が提供される。
ク質源、少なくとも一種のカチオン性界面活性剤源およ
び少なくとも一種の極性有機溶剤を用意し、不溶性タン
パク質を少なくとも一種の極性有機溶剤ほぼ5〜70%
(容量/容量)とタンパク質の構造幹鎖を実質的に修飾
することなく可溶化を生じさせるに充分な量の少なくと
も一種のカチオン性界面活性剤との混合物で処理し、次
いで生成する溶液から可溶化したタンパク質を分離する
ことを包含するタンパク質の採取方法が提供される。
タンパク質は極性有機溶剤および適当な緩衝性塩を含む
水溶液中に保持できる。アセトニトリルのような極性有
機溶剤の、好ましくは5〜70%濃度での存在は不溶性
タンパク質と水性溶剤との間の相互反応を変え、これに
よりタンパク質の疎水性領域の溶解度が増大される。さ
らに好ましくは、有機溶剤の濃度は10〜20%であ
る。
水溶液中に保持できる。アセトニトリルのような極性有
機溶剤の、好ましくは5〜70%濃度での存在は不溶性
タンパク質と水性溶剤との間の相互反応を変え、これに
よりタンパク質の疎水性領域の溶解度が増大される。さ
らに好ましくは、有機溶剤の濃度は10〜20%であ
る。
さらにまた、4級アンモニウム化合物のようなカチオン
性界面活性剤を臨界ミセル濃度を超えるレベルで、しか
も凝集体内の会合力に打ち勝つに充分に配合すると極め
て有利であり、封入体成分の隔離、崩壊および可溶化を
促進する。
性界面活性剤を臨界ミセル濃度を超えるレベルで、しか
も凝集体内の会合力に打ち勝つに充分に配合すると極め
て有利であり、封入体成分の隔離、崩壊および可溶化を
促進する。
本発明のもう一つの態様において、タンパク質凝集体の
乾燥粉末または水性スラリーに、適当な界面活性剤の水
溶液を添加すると、また極めて好ましく、特に完全封入
体の可溶化の効果的手段になる。少なくとも一種のカチ
オン性界面活性剤の添加は臨界ミセル濃度以上のレベル
であつて、その溶解度および経済性の限界内である。こ
の方法はその単純性の点で極めて望ましい方法である;
さらにまた、いくつかの従来技術に比較して、タンパク
質を温和な天然に近い環境で可溶化できる。可溶化剤の
性質によつて、従来技術の苛酷な可溶化とは異なり、本
発明の採取方法は後続の処理工程と適合できる。本発明
の可溶化剤はタンパク質凝集体の受ける処理に使用され
るその他の成分と適合することが見い出された;たとえ
ばジチオスレイトール、メルカプトエタノール、還元さ
れたグルタチオン、ジメチルスルホン、尿素、水酸化ナ
トリウムおよび水酸化カリウム。
乾燥粉末または水性スラリーに、適当な界面活性剤の水
溶液を添加すると、また極めて好ましく、特に完全封入
体の可溶化の効果的手段になる。少なくとも一種のカチ
オン性界面活性剤の添加は臨界ミセル濃度以上のレベル
であつて、その溶解度および経済性の限界内である。こ
の方法はその単純性の点で極めて望ましい方法である;
さらにまた、いくつかの従来技術に比較して、タンパク
質を温和な天然に近い環境で可溶化できる。可溶化剤の
性質によつて、従来技術の苛酷な可溶化とは異なり、本
発明の採取方法は後続の処理工程と適合できる。本発明
の可溶化剤はタンパク質凝集体の受ける処理に使用され
るその他の成分と適合することが見い出された;たとえ
ばジチオスレイトール、メルカプトエタノール、還元さ
れたグルタチオン、ジメチルスルホン、尿素、水酸化ナ
トリウムおよび水酸化カリウム。
本発明の範囲は種々の先端基、相対イオンおよび分枝状
または誘導体状炭素鎖を有する適当な単鎖状および多鎖
状4級窒素またはリン化合物の全部の使用を包含する。
または誘導体状炭素鎖を有する適当な単鎖状および多鎖
状4級窒素またはリン化合物の全部の使用を包含する。
好ましくは、少なくとも一種のカチオン性界面活性剤は
次の化合物から選択される: セチル トリメチルアンモニウム ハライド、たとえば
ブロミド、 セチル ピリジニウム ハライド、たとえばクロリド、 テトラデシル トリメチルアンモニウム ハライド、た
とえばブロミド、 ドデシル トリメチルアンモニウム ハライド、たとえ
ばブロミド、 混合n−アルキル ジメチル ベンジル アンモニウム
ハライド、たとえばクロリド(50%C−14、40
%C−12、10%C−16)、 N,N−ジメチル−N−[2−[2−[4−(1,1,
3,3−テトラメチル ブチル)フエノキシ]エトキ
シ]エチル]ベンゼンメタンアミニウム ハライド、た
とえばクロリド。
次の化合物から選択される: セチル トリメチルアンモニウム ハライド、たとえば
ブロミド、 セチル ピリジニウム ハライド、たとえばクロリド、 テトラデシル トリメチルアンモニウム ハライド、た
とえばブロミド、 ドデシル トリメチルアンモニウム ハライド、たとえ
ばブロミド、 混合n−アルキル ジメチル ベンジル アンモニウム
ハライド、たとえばクロリド(50%C−14、40
%C−12、10%C−16)、 N,N−ジメチル−N−[2−[2−[4−(1,1,
3,3−テトラメチル ブチル)フエノキシ]エトキ
シ]エチル]ベンゼンメタンアミニウム ハライド、た
とえばクロリド。
しかしながら、ハライド イオンの選択は例示のためだ
けのものであると理解されるべきである。アニオンの同
定は重要ではない。たとえば、ハライドの代りに、その
他のアニオン、たとえばp−トルエンスルホネートのよ
うなスルホンも使用できる。
けのものであると理解されるべきである。アニオンの同
定は重要ではない。たとえば、ハライドの代りに、その
他のアニオン、たとえばp−トルエンスルホネートのよ
うなスルホンも使用できる。
さらに好ましくは、カチオン性界面活性剤はセチル ト
リメチルアンモニウム ブロミドまたはセチル ビリジ
ニウム クロリドである。
リメチルアンモニウム ブロミドまたはセチル ビリジ
ニウム クロリドである。
ポリペプチド吸収が最大である紫外線スペクトルの領域
に吸収を示さないカチオン性界面活性剤、たとえばセチ
ル トリメチルアンモニウム ブロミドを選択すると好
ましい。
に吸収を示さないカチオン性界面活性剤、たとえばセチ
ル トリメチルアンモニウム ブロミドを選択すると好
ましい。
本発明は大規模精製系において重要な経済的利点を与え
る。カチオン性界面活性剤は細菌、カビおよびウイルス
に対して活性であると考えられているので(Goodman,L.
S.およびGilman,S.,によるThe Pharmacological Basis
of Therapeutics,第5版、Macmillan Publishing社、
N.Y.1975年、1001頁)、汚染の危険、試料
劣化および複雑で高価な無菌封じ入め装置の必要性が全
て減じられる。さらにまた、低濃度の可溶化剤が要求さ
れるだけであり、またこれらはクロマトグラフイ、透
析、Kraff点結晶化により、あるいはさらに有機溶剤の
場合には、蒸留により溶液から容易に除去できる。
る。カチオン性界面活性剤は細菌、カビおよびウイルス
に対して活性であると考えられているので(Goodman,L.
S.およびGilman,S.,によるThe Pharmacological Basis
of Therapeutics,第5版、Macmillan Publishing社、
N.Y.1975年、1001頁)、汚染の危険、試料
劣化および複雑で高価な無菌封じ入め装置の必要性が全
て減じられる。さらにまた、低濃度の可溶化剤が要求さ
れるだけであり、またこれらはクロマトグラフイ、透
析、Kraff点結晶化により、あるいはさらに有機溶剤の
場合には、蒸留により溶液から容易に除去できる。
本発明による方法は可溶化されたタンパク質を生成する
溶液から分離するもう一つの工程を包含できる。
溶液から分離するもう一つの工程を包含できる。
この分離工程は可溶化されたタンパク質のクロマトグラ
フイ カラムに通す分別溶出、透析、限外濾過、分別沈
殿またはリガンド特異性単離を包含できる。クロマトグ
ラフイ カラムは高速液体クロマトグラフイ(HPL
C)カラム、場合により逆転相高速液体クロマトグラフ
イ(RP−HPLC)カラムであることができる。TS
K−GEL(LC)の商品名で販売されているToyo Sod
a Manufacturing社(日本国)から入手できるカラム、
またはUltrapore RPSCの商品名でBeckman Instruments
社(California、米国)から入手できるカラムが適当で
あることが見い出された。可溶化剤の性質によつて、分
離工程は分子篩型のクロマトグラフイ、たとえばゲル濾
過クロマトグラフイ、アニオン交換クロマトグラフイ、
疎水性相互反応クロマトグラフイおよびリガンド特異性
クロマトグラフイを含むその他の既知の形式のクロマト
グラフイを使用して実施することもできる。好ましく
は、クロマトグラフイ溶出液はカチオン性界面活性剤の
水溶液である。稀溶液が使用できる。カチオン性界面活
性剤はほぼ0.25重量/容量%〜ほぼ2.0重量/容
量%、さらに好ましくは0.4重量/容量%の量で存在
させることができる。
フイ カラムに通す分別溶出、透析、限外濾過、分別沈
殿またはリガンド特異性単離を包含できる。クロマトグ
ラフイ カラムは高速液体クロマトグラフイ(HPL
C)カラム、場合により逆転相高速液体クロマトグラフ
イ(RP−HPLC)カラムであることができる。TS
K−GEL(LC)の商品名で販売されているToyo Sod
a Manufacturing社(日本国)から入手できるカラム、
またはUltrapore RPSCの商品名でBeckman Instruments
社(California、米国)から入手できるカラムが適当で
あることが見い出された。可溶化剤の性質によつて、分
離工程は分子篩型のクロマトグラフイ、たとえばゲル濾
過クロマトグラフイ、アニオン交換クロマトグラフイ、
疎水性相互反応クロマトグラフイおよびリガンド特異性
クロマトグラフイを含むその他の既知の形式のクロマト
グラフイを使用して実施することもできる。好ましく
は、クロマトグラフイ溶出液はカチオン性界面活性剤の
水溶液である。稀溶液が使用できる。カチオン性界面活
性剤はほぼ0.25重量/容量%〜ほぼ2.0重量/容
量%、さらに好ましくは0.4重量/容量%の量で存在
させることができる。
クロマトグラフイ分離はタンパク質生成物を精製する役
目を果たすことが理解されるだろう。
目を果たすことが理解されるだろう。
本発明による方法はポリペプチド試料の分析方法におい
て、被験試料の採取方法として使用できることが理解さ
れるべきである。
て、被験試料の採取方法として使用できることが理解さ
れるべきである。
本発明の態様をここで非限定的例として引用する例およ
び添付図面により説明する。
び添付図面により説明する。
次例において、透過型電子顕微鏡図は次のとおりにして
得られたものである: 含水ペレツト状物の小部分をL.R.White樹脂(London Re
sin社製、英国)に固定し、埋め込みこのブロツクをPhi
lips EM−300透過型電子顕微鏡を用いる電子顕微
鏡による検査用に区分した。
得られたものである: 含水ペレツト状物の小部分をL.R.White樹脂(London Re
sin社製、英国)に固定し、埋め込みこのブロツクをPhi
lips EM−300透過型電子顕微鏡を用いる電子顕微
鏡による検査用に区分した。
例1 天然ブタ生長ホルモンの可溶化 従来技術で開示されている方法[Reichert,L.E.,JR,に
よるMethods in Engymology、XLIII、1975年、3
60頁:(i)]と同様の方法で単離された、水不溶性の
凍結乾燥させた天然のブタ生長ホルモン(50mg)をセ
チル トリメチルアンモニウム ブロミドの水溶液(1
0%の1.0m)およびB−メルカプトエタノール
(1%)とともに激しくかきまぜる(25°で30
分)。清明にした溶液を次いでBeckman MicrofugeTM1
1で遠心分離し(13000rpmで5分間)、清明な上
澄液を得る。この溶液の試料1.0mは72 の紫外線吸収値を有する。これは可溶化が生起している
ことを示している。
よるMethods in Engymology、XLIII、1975年、3
60頁:(i)]と同様の方法で単離された、水不溶性の
凍結乾燥させた天然のブタ生長ホルモン(50mg)をセ
チル トリメチルアンモニウム ブロミドの水溶液(1
0%の1.0m)およびB−メルカプトエタノール
(1%)とともに激しくかきまぜる(25°で30
分)。清明にした溶液を次いでBeckman MicrofugeTM1
1で遠心分離し(13000rpmで5分間)、清明な上
澄液を得る。この溶液の試料1.0mは72 の紫外線吸収値を有する。これは可溶化が生起している
ことを示している。
例2A 合成ブタ生長ホルモンの可溶化 実験は形質転換E.coli細胞から得られた封入体を用いて
行なつた。1−190AAメチオニン−ブタ生長ホルモ
ンを含有し、プラスミドpMG935から得られた封入
体は細胞崩壊後に遠心分離により単離する。この不溶性
タンパク質ペレツトをトリトン(Triton)X−100
(0.5%)およびEDTA(10mM)の水溶液で2
回、次いで水性EDTA(5mM)で2回洗浄し、最終の
ペレツトは次いで貯蔵用に凍結乾燥させる。
行なつた。1−190AAメチオニン−ブタ生長ホルモ
ンを含有し、プラスミドpMG935から得られた封入
体は細胞崩壊後に遠心分離により単離する。この不溶性
タンパク質ペレツトをトリトン(Triton)X−100
(0.5%)およびEDTA(10mM)の水溶液で2
回、次いで水性EDTA(5mM)で2回洗浄し、最終の
ペレツトは次いで貯蔵用に凍結乾燥させる。
結果は第1図に示す。
第1図はメチオニン−ブタン生長ホルモン封入体の透過
型電子顕微鏡写真を示している。直径0.2〜0.5ミ
クロンの数個の明白に目に見える封入体はその大部分が
細胞破片であるかなりの繊維状汚染物とともに存在して
いる。倍率×6,000。
型電子顕微鏡写真を示している。直径0.2〜0.5ミ
クロンの数個の明白に目に見える封入体はその大部分が
細胞破片であるかなりの繊維状汚染物とともに存在して
いる。倍率×6,000。
この凍結乾燥封入体の一部分(50mg)を次いで試験管
内で水性セチル トリメチルアンモニウム ブロミド
(10%の1.0m)で処理し、混合物を室温で1時
間かきまぜる。混合物をBeckman Microfuge IIで遠心分
離し(2,000rpmで10分間)、清明な上澄液と不
溶性の小さいペレツト状物を得る。このペレツトの小部
分をL.R.White樹脂に固定し、埋め込み、このブロツク
の一区分を電子顕微鏡により未処理材料と比較用に区分
する。
内で水性セチル トリメチルアンモニウム ブロミド
(10%の1.0m)で処理し、混合物を室温で1時
間かきまぜる。混合物をBeckman Microfuge IIで遠心分
離し(2,000rpmで10分間)、清明な上澄液と不
溶性の小さいペレツト状物を得る。このペレツトの小部
分をL.R.White樹脂に固定し、埋め込み、このブロツク
の一区分を電子顕微鏡により未処理材料と比較用に区分
する。
結果を第2図に示す。第2図は可溶化処理後に残存する
不溶性残留物の透過型電子顕微鏡写真を示している。倍
率は×4,000である。未処理材料とは全く対照的
に、可溶化処理後には封入体は見られない。
不溶性残留物の透過型電子顕微鏡写真を示している。倍
率は×4,000である。未処理材料とは全く対照的
に、可溶化処理後には封入体は見られない。
例2B 前記例1Aに記載の実験と同様の実験を行ない、プラス
ミドpMG936から得た変種4−190AAブタ成長
ホルモンを含有する凍結乾燥細胞封入体(50mg)をセ
チル トリメチルアンモニウム ブロミド(10%の
1.0m)で処理する。混合物をかきまぜ(室温で1
時間)、次いで遠心分離して清明な上澄液と不溶性の小
さいペレツト状物を得る。上澄液の1.0m試料は6
0 の推定紫外線吸収を示し、これは可溶化が生起したこと
を示している。
ミドpMG936から得た変種4−190AAブタ成長
ホルモンを含有する凍結乾燥細胞封入体(50mg)をセ
チル トリメチルアンモニウム ブロミド(10%の
1.0m)で処理する。混合物をかきまぜ(室温で1
時間)、次いで遠心分離して清明な上澄液と不溶性の小
さいペレツト状物を得る。上澄液の1.0m試料は6
0 の推定紫外線吸収を示し、これは可溶化が生起したこと
を示している。
例3 もう一つの実験において、1−190AAメチオニンま
たは変種4−190AAブタ生長ホルモンのどちらかを
含有する凍結乾燥封入体(50mg)をアセトニトリル
(0.2m)、水性緩衝液(0.1Mグリシン、pH
8.5;0.8m)および水性セチル トリメチルア
ンモニウム ブロミド(10%の0.5m)で試験管
中において25℃で処理する。混合物を1時間かきまぜ
る。前記実験と同様に、また封入体の実質的な可溶化が
見られる。
たは変種4−190AAブタ生長ホルモンのどちらかを
含有する凍結乾燥封入体(50mg)をアセトニトリル
(0.2m)、水性緩衝液(0.1Mグリシン、pH
8.5;0.8m)および水性セチル トリメチルア
ンモニウム ブロミド(10%の0.5m)で試験管
中において25℃で処理する。混合物を1時間かきまぜ
る。前記実験と同様に、また封入体の実質的な可溶化が
見られる。
例4 1−190AAメチオニン−ブタ生長ホルモンを含有す
る凍結乾燥封入体(50mg)を試験管中において25℃
で、下記にあげるカチオン性界面活性剤の一種の水溶液
(0.1M TRIZMA中20%の1.0m、pH1
0.0)と激しくかきまぜる。混合物を30分間かきま
ぜ、次いでBeckman Microfuge IIで30分間遠心分離し
て、全ての場合に、無視できるペレツト状物を含む清明
な淡黄色上澄液が得られる。前記実験とまた同様に、各
場合において封入体の実質的な可溶化が達成される。
る凍結乾燥封入体(50mg)を試験管中において25℃
で、下記にあげるカチオン性界面活性剤の一種の水溶液
(0.1M TRIZMA中20%の1.0m、pH1
0.0)と激しくかきまぜる。混合物を30分間かきま
ぜ、次いでBeckman Microfuge IIで30分間遠心分離し
て、全ての場合に、無視できるペレツト状物を含む清明
な淡黄色上澄液が得られる。前記実験とまた同様に、各
場合において封入体の実質的な可溶化が達成される。
(a)セチル ピリジニウム クロリド、 (b)テトラデシル トリメチルアンモニウム ブロミ
ド、 (c)ドデシル トリメチルアンモニウム ブロミド、 (d)混合n−アルキル ジメチル ベンジル アンモニ
ウム クロリド(50%C−14、40%C−12、1
0%C−16)、 (e)N,N−ジメチル−N−[2−[2−[4−(1,
1,3,3−テトラメチルブチル)フエノキシ]エトキ
シ]エチル]ベンゼンメタンアミニウム クロリド。
ド、 (c)ドデシル トリメチルアンモニウム ブロミド、 (d)混合n−アルキル ジメチル ベンジル アンモニ
ウム クロリド(50%C−14、40%C−12、1
0%C−16)、 (e)N,N−ジメチル−N−[2−[2−[4−(1,
1,3,3−テトラメチルブチル)フエノキシ]エトキ
シ]エチル]ベンゼンメタンアミニウム クロリド。
例5 ヒト マラリア病原体抗原融合タンパク質の可溶化 ヒト マラリア病原体Plasmodium falciparumからの表
面抗原を含有するB−ガラクトシダーゼ融合タンパク質
(Ag13)を異常にほとんど透明な封入体としてE.co
liに発現させ(第3図)、R.F.Anders博士からの贈呈物
として入手した[Coppel,R.I.、Cowman,A.F.、Anders,
R.F.、Bianco,A.E.、Saint,R.B.、Lingelbach,K.R.、Ke
mp,D.J.およびBrown,G.V.によるNature、310、19
84年、789頁−(ii)]。
面抗原を含有するB−ガラクトシダーゼ融合タンパク質
(Ag13)を異常にほとんど透明な封入体としてE.co
liに発現させ(第3図)、R.F.Anders博士からの贈呈物
として入手した[Coppel,R.I.、Cowman,A.F.、Anders,
R.F.、Bianco,A.E.、Saint,R.B.、Lingelbach,K.R.、Ke
mp,D.J.およびBrown,G.V.によるNature、310、19
84年、789頁−(ii)]。
分子量156KDaのポリペプチドであるAg13を含
有する含水封入体ペースト(800mg)をセチル トリ
メチルアンモニウム ブロミド[50 mMジナトリウム
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)および0.15
Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIZ
MA)(pH10.0)中の19%の1.0m、セチル
ピリジニウム ブロミド(50mM EDTAおよび
0.15M TRIZMA(pH10.0)中の10%の
0.25mおよびジチオトレイトール(5%)の水溶
液と室温で激しくかきまぜる。
有する含水封入体ペースト(800mg)をセチル トリ
メチルアンモニウム ブロミド[50 mMジナトリウム
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)および0.15
Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIZ
MA)(pH10.0)中の19%の1.0m、セチル
ピリジニウム ブロミド(50mM EDTAおよび
0.15M TRIZMA(pH10.0)中の10%の
0.25mおよびジチオトレイトール(5%)の水溶
液と室温で激しくかきまぜる。
45分位の後に、初め不透明な混合物は透明になる。混
合物を次いでBeckman Microfuge IIで遠心分離して(1
3,00rpmで10分)、清明な淡黄色上澄液およびオ
フ白色の小さいペレツト状物を得る。このペレツト状物
は電子顕微鏡で検査して、目に見えない封入体残留物を
含有する。
合物を次いでBeckman Microfuge IIで遠心分離して(1
3,00rpmで10分)、清明な淡黄色上澄液およびオ
フ白色の小さいペレツト状物を得る。このペレツト状物
は電子顕微鏡で検査して、目に見えない封入体残留物を
含有する。
例6 感染性滑液のう病ウイルス抗原融合 タンパク質の可溶化 感染性滑液のう病ウイルスからの32DKD構成タンパ
ク質のD1フラグメントを含有する封入体(第4図)を
K.J.Fahey博士から入手した[Azad,A.A.、Fahey,K.J.、
Barrett,S,A,、Erny,K.M.、およびHudson,P.J.によるVi
rology、149、1986年、190頁−(iii)]。
この封入体は従来開示されている方法[Stanley,K.K.お
よびLuzio,J.P.によるThe EMBO Journal 3、198
4年、1429頁−(iv)]で形質転換したE.coliから
単離されたものである。
ク質のD1フラグメントを含有する封入体(第4図)を
K.J.Fahey博士から入手した[Azad,A.A.、Fahey,K.J.、
Barrett,S,A,、Erny,K.M.、およびHudson,P.J.によるVi
rology、149、1986年、190頁−(iii)]。
この封入体は従来開示されている方法[Stanley,K.K.お
よびLuzio,J.P.によるThe EMBO Journal 3、198
4年、1429頁−(iv)]で形質転換したE.coliから
単離されたものである。
発現ウイルス融合タンパク質を含有する含水封入体ペー
スト(100mg)をセチル トリメチルアンモニウム
ブロミド(50mM EDTAおよび0.15M TRI
ZMA中19%溶液0.75m)、セチル ピリジニ
ウム クロリド(50mM EDTAおよび0.15M
TRIZMA中の10%溶液0.5m)およびジチオ
トレイトール(5%)の水溶液と室温で激しくかきまぜ
る。30分位の後に、初めの不透明混合物は完全に透明
に見える。
スト(100mg)をセチル トリメチルアンモニウム
ブロミド(50mM EDTAおよび0.15M TRI
ZMA中19%溶液0.75m)、セチル ピリジニ
ウム クロリド(50mM EDTAおよび0.15M
TRIZMA中の10%溶液0.5m)およびジチオ
トレイトール(5%)の水溶液と室温で激しくかきまぜ
る。30分位の後に、初めの不透明混合物は完全に透明
に見える。
この混合物を次いでBeckman Microfuge IIで遠心分離し
(13,000rpm、10分)ほぼ完全な可溶化を示す
清明な黄色上澄液および無視できるペレツト状物を得
る。ニトロ−セルロース紙およびD1ポリペプチドに対
するモノクロナル抗体を使用する上澄液の免疫−斑点分
析法(immuno-dot blot analysis)により、融合ポリペ
プチド上の活性抗原性部位の保有を確認した。
(13,000rpm、10分)ほぼ完全な可溶化を示す
清明な黄色上澄液および無視できるペレツト状物を得
る。ニトロ−セルロース紙およびD1ポリペプチドに対
するモノクロナル抗体を使用する上澄液の免疫−斑点分
析法(immuno-dot blot analysis)により、融合ポリペ
プチド上の活性抗原性部位の保有を確認した。
例7 C3またはC1アルキル結合ラージ ポール シリカ
(Laege Pore Silica)上の逆転相H.P.L.C.。
第5図および第6図に示されているクロマトグラムは次
の概略に従つて得られたものである。
(Laege Pore Silica)上の逆転相H.P.L.C.。
第5図および第6図に示されているクロマトグラムは次
の概略に従つて得られたものである。
下記のとおりの操作パラメーターを用いる: 溶出は0.8m/分の流速で室温において変性剤とし
て0.1容量/容量%トリフルオル酢酸を含有する水/
アセトニトリル混合物を用いて行なう。水100%
(0.1分)から5分間で75%水/アセトニトリル
に、15分間で45%水/アセトニトリルに、5分間に
100%アセトニトリルにする段階的線状勾配を用い
る。100%アセトニトリル溶出をさらに10分間続
け、その後次の注入の前に再平衡化する。溶剤の組成お
よび流速は所望の分割を達成するために僅かに変えても
よい。
て0.1容量/容量%トリフルオル酢酸を含有する水/
アセトニトリル混合物を用いて行なう。水100%
(0.1分)から5分間で75%水/アセトニトリル
に、15分間で45%水/アセトニトリルに、5分間に
100%アセトニトリルにする段階的線状勾配を用い
る。100%アセトニトリル溶出をさらに10分間続
け、その後次の注入の前に再平衡化する。溶剤の組成お
よび流速は所望の分割を達成するために僅かに変えても
よい。
溶液は全て脱気し、濾過する(0.45μm);第5図
および第6図に示されているクロマトグラムについて、
3μの注入量を用いた。しかしながら、この注入量は
検出限界および利用できるタンパク質濃度に従い、適当
に変えることができる。
および第6図に示されているクロマトグラムについて、
3μの注入量を用いた。しかしながら、この注入量は
検出限界および利用できるタンパク質濃度に従い、適当
に変えることができる。
H.P.L.C.は20μループ状注入器およびBeck
man421コントローラーと組合せた2個のBeckman11
4M System Delivery Modulesを含む系で行なつた。
検出はBeckman165Variable Wavelength Detectorで
270nmの固定波長における紫外線により行なつた。
man421コントローラーと組合せた2個のBeckman11
4M System Delivery Modulesを含む系で行なつた。
検出はBeckman165Variable Wavelength Detectorで
270nmの固定波長における紫外線により行なつた。
前記で使用した次の用語は登録商品名である:TRITON;
L.R.White。
L.R.White。
本発明はその一般的観点において、前記した特定の詳細
な説明に制限されるものでないことは理解されるべきで
ある。
な説明に制限されるものでないことは理解されるべきで
ある。
第1図は生物の形態を示す写真であつて、メチオニン−
ブタ成長ホルモン細胞封入体の透過型電子顕微鏡写真で
ある(6,000倍率);第2図はメチオニン−ブタ生
長ホルモン封入体を本発明に従い可溶化処理した後の透
過型電子顕微鏡写真である(4,460倍率);第3図
は生物の形態を示す写真であつて、ヒト マラリア病原
体抗原融合タンパク質Eg13を発現するE.coliの完全
細胞の透過型電子顕微鏡写真である(23,000倍
率;ポリペプチドを含む封入体が直径0.5μまでの範
囲のほとんど透明な小球体として、微生物内に位置して
いることが判る);第4図は生物の形態を示す写真であ
つて、感染性滑液のう病ウイルス抗原融合タンパク質を
含有する完全封入体の透過型電子顕微鏡写真である(1
2800倍率;封入体はその他の細胞断片に対して暗色
の円形粒子として明白に見られる);第5図はB−メル
カプトエタノール1%含有0.05M TRIS(pH1
0.0)中の18重量/容量%セチル トリメチルアン
モニウム ブロミド中の組換えブタ生長ホルモン含有封
入体の2種の異なる標本のC1アルキル結合シリカ上に
おける逆転相H.P.L.C.パターンを示す[試料
(1)および(2)はそれぞれブタ生長ホルモン39%および
27%(この%はクロマトグラムから測定された総面積
の%として(b)の部分に相当し、±5%の推定実験区域
内で見積もられる)を含有する。(a)は溶剤フロントの
溶出に相当するピークであり、そして(b)は共注入およ
び免疫斑点により確認されるブタ生長ホルモンの溶出に
相当するピークである;カラム:TSK−GEL(L
C)TMS250(5g詰め)(Toyo Soda Manufactur
ing社製];そして第6図は(1)0.05M NaHCO
3/0.05M Na2CO3、pH10.0中の50%
天然ブタ生長ホルモンの、(2)0.05M NaHCO
3/0.05M Na2CO3、pH10.0中の79%組換
えブタ生長ホルモンの、(3)1%ジチオトレイトール含
有0.05M TRIS、pH10.0中18%セチル
トリメチルアンモニウム ブロミド中の20%組換えブ
タ生長ホルモン含有可溶化封入体の、C3アルキル結合
シリカ上における逆転相H.P.L.C.パターンを示
す[これらの%は第6図と同じ意味を有する;(a)は溶
剤フロントの溶出に相当するピークであり、そして(b)
は共注入および免疫斑点分析法により確認されたブタ生
長ホルモンの溶出に相当するピークである;溶出時間:
約21分;カラム:UltraporeTM RPSC 5μm
(4.6mm×7.5cm)(Beckman Instruments社
製]。
ブタ成長ホルモン細胞封入体の透過型電子顕微鏡写真で
ある(6,000倍率);第2図はメチオニン−ブタ生
長ホルモン封入体を本発明に従い可溶化処理した後の透
過型電子顕微鏡写真である(4,460倍率);第3図
は生物の形態を示す写真であつて、ヒト マラリア病原
体抗原融合タンパク質Eg13を発現するE.coliの完全
細胞の透過型電子顕微鏡写真である(23,000倍
率;ポリペプチドを含む封入体が直径0.5μまでの範
囲のほとんど透明な小球体として、微生物内に位置して
いることが判る);第4図は生物の形態を示す写真であ
つて、感染性滑液のう病ウイルス抗原融合タンパク質を
含有する完全封入体の透過型電子顕微鏡写真である(1
2800倍率;封入体はその他の細胞断片に対して暗色
の円形粒子として明白に見られる);第5図はB−メル
カプトエタノール1%含有0.05M TRIS(pH1
0.0)中の18重量/容量%セチル トリメチルアン
モニウム ブロミド中の組換えブタ生長ホルモン含有封
入体の2種の異なる標本のC1アルキル結合シリカ上に
おける逆転相H.P.L.C.パターンを示す[試料
(1)および(2)はそれぞれブタ生長ホルモン39%および
27%(この%はクロマトグラムから測定された総面積
の%として(b)の部分に相当し、±5%の推定実験区域
内で見積もられる)を含有する。(a)は溶剤フロントの
溶出に相当するピークであり、そして(b)は共注入およ
び免疫斑点により確認されるブタ生長ホルモンの溶出に
相当するピークである;カラム:TSK−GEL(L
C)TMS250(5g詰め)(Toyo Soda Manufactur
ing社製];そして第6図は(1)0.05M NaHCO
3/0.05M Na2CO3、pH10.0中の50%
天然ブタ生長ホルモンの、(2)0.05M NaHCO
3/0.05M Na2CO3、pH10.0中の79%組換
えブタ生長ホルモンの、(3)1%ジチオトレイトール含
有0.05M TRIS、pH10.0中18%セチル
トリメチルアンモニウム ブロミド中の20%組換えブ
タ生長ホルモン含有可溶化封入体の、C3アルキル結合
シリカ上における逆転相H.P.L.C.パターンを示
す[これらの%は第6図と同じ意味を有する;(a)は溶
剤フロントの溶出に相当するピークであり、そして(b)
は共注入および免疫斑点分析法により確認されたブタ生
長ホルモンの溶出に相当するピークである;溶出時間:
約21分;カラム:UltraporeTM RPSC 5μm
(4.6mm×7.5cm)(Beckman Instruments社
製]。
Claims (20)
- 【請求項1】不溶性形態のタンパク質源および少なくと
も一種のカチオン性界面活性剤源を用意し、この不溶性
タンパク質を変性性グアニジン塩酸塩および尿素変性剤
の不存在下に、このタンパク質の構造幹鎖に実質的な修
飾を生じさせることなく可溶化させるに充分な量のカチ
オン性界面活性剤の少なくとも一種で処理することを包
含するタンパク質の採取方法。 - 【請求項2】可溶化を水溶液中で行なう、特許請求の範
囲第1項に記載の方法。 - 【請求項3】少なくとも一種のカチオン性界面活性剤を
臨界ミセル濃度を超える量で存在させる、特許請求の範
囲第2項に記載の方法。 - 【請求項4】少なくとも一種のカチオン性界面活性剤を
ほぼ2.5%〜50%(重量/容量)の量で存在させ
る、特許請求の範囲第3項に記載の方法。 - 【請求項5】カチオン性界面活性剤が4級アンモニウム
化合物であり、そして不溶性タンパク質がタンパク質凝
集体である特許請求の範囲第4項に記載の方法。 - 【請求項6】カチオン性界面活性剤が セチル トリメチルアンモニウム カチオン、 セチル ピリジニウム カチオン、 テトラデシル トリメチルアンモニウム カチオン、 ドデシル トリメチルアンモニウム カチオン、 混合n−アルキル ジメチル ベンジル アンモニウム
カチオン、 N,N−ジメチル−N−〔2−〔2−〔4−(1,1,
3,3−テトラメメチル ブチル)フェノキシ〕エトキ
シ〕エチル〕ベンゼンメタンアミニウム カチオン から選ばれるカチオンを含む界面活性剤から選択され
る、特許請求の範囲第5項に記載の方法。 - 【請求項7】カチオン性界面活性剤がセチル トリメチ
ルアンモニウム ブロミドである特許請求の範囲第6項
に記載の方法。 - 【請求項8】不溶性形態のタンパク質源、少なくとも一
種のカチオン性界面活性剤源および少なくとも一種の極
性有機溶剤源を用意し、この不溶性タンパク質を、変性
性グアニジン塩酸塩および尿素変性剤の不存在下に、ほ
ぼ5〜70%(容量/容量)の量の少なくとも一種の極
性有機溶剤とこのタンパク質の構造幹鎖に実質的な修飾
を生じさせることなく可溶化させるに充分な量の少なく
とも一種のカチオン性界面活性剤との混合物で処理し、
次いで生成する溶液から可溶化されたタンパク質を分離
することを包含するタンパク質の採取方法。 - 【請求項9】少なくとも一種のカチオン性界面活性剤を
臨界ミセル濃度を超える量で存在させる、特許請求の範
囲第8項に記載の方法。 - 【請求項10】少なくとも一種のカチオン性界面活性剤
をほぼ2.5〜50%(重量/容量)の量で存在させ
る、特許請求の範囲第9項に記載の方法。 - 【請求項11】カチオン性界面活性剤が4級アンモニウ
ム化合物であり、そして不溶性タンパク質がタンパク質
凝集体である、特許請求の範囲第10項に記載の方法。 - 【請求項12】カチオン性界面活性剤が セチル トリメチルアンモニウム カチオン、 セチル ピリジニウム カチオン、 テトラデシル トリメチルアンモニウム カチオン、 ドデシル トリメチルアンモニウム カチオン、 混合n−アルキル ジメチル ベンジル アンモニウム
カチオン、 N,N−ジメチル−N−〔2−〔2−〔4−(1,1,
3,3−テトラメチル ブチル)フェノキシ〕エトキ
シ〕エチル〕ベンゼンメタンアミニウム カチオン から選ばれるカチオンを含む界面活性剤から選択され
る、特許請求の範囲第11項に記載の方法。 - 【請求項13】カチオン性界面活性剤がセチル トリメ
チルアンモニウム ブロミドである特許請求の範囲第1
2項に記載の方法。 - 【請求項14】分離工程がクロマトグラフィ カラムを
通す可溶化されたタンパク質の分別溶出を包含する、特
許請求の範囲第11項に記載の方法。 - 【請求項15】溶出剤のカチオン性界面活性剤の稀水溶
液である、特許請求の範囲第14項に記載の方法。 - 【請求項16】分離工程が分別沈殿、透析、限外濾過ま
たはリガンド特異性単離を含む、特許請求の範囲第11
項に記載の方法。 - 【請求項17】少なくとも一種のカチオン性界面活性剤
がセチル トリメチルアンモニウム ブロミドであり、
そして少なくとも一種の極性有機溶剤がアセトニトリル
である、特許請求の範囲第16項に記載の方法。 - 【請求項18】タンパク質凝集体が宿主細胞の溶解によ
り単離される封入体である、特許請求の範囲第17項に
記載の方法。 - 【請求項19】宿主細胞がタンパク質をコードする遺伝
子を含むベクターにより形質転換または翻訳されてい
る、特許請求の範囲第18項に記載の方法。 - 【請求項20】封入体が成長ホルモン、インターフェロ
ン、免疫原およびリンホカインを含む生物学的に活性な
ポリペプチド類およびペプチド類から選択される、特許
請求の範囲第18項に記載の方法。
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