JPH09119930A - 組換えタンパク質の精製方法及びその製品 - Google Patents

組換えタンパク質の精製方法及びその製品

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Abstract

(57)【要約】 微生物の屈折封入体から組換えタンパク質を回収する方
法であって、細胞を崩壊させ、組換えタンパク質を含む
屈折体を回収し、該屈折体を変性剤で可溶化し、組換え
タンパク質のスルフヒドリル基を保護し、組換えタンパ
ク質のカチオン性アミノ基を、有機環状酸無水物での誘
導化によりアニオン性カルボン酸に転換し、組換えタン
パク質誘導体を回収することからなる上記方法が開示さ
れている。本発明は、また、上記本発明の方法で回収し
た組換えタンパク質で被覆した固体支持体の製法に関
し、また、体液中の組換えタンパク質に対する抗体の検
出並びに定量のための上記デバイスの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 発明の分野 本発明は、微生物屈折封入体（microbial refractile i
nclusion bodies ）から従来公知の技術によっては可溶
化及び分離することが困難である、組換えタンパク質及
びポリペプチド類を単離する方法に向けられたものであ
る。この方法は微生物バイオマスの崩壊、屈折体の採
集、及び屈折体タンパク質の可溶化を含むものである。
可溶化は組換えタンパク質の遊離スルフヒドリル基を可
逆的或いは不可逆的保護剤（blocking ageuts)を用いて
保護して物理的、化学的、及び酵素的手段の組合わせに
より行なわれる。タンパク質の遊離アミノ基を次いで、
環状酸無水物とモレキュラーシーブ及びイオン交換クロ
マトグラフィを用いて分離された個々のタンパク質誘導
体との反応により誘導化する。分離されたタンパク質の
スルフヒドリル基及びアミノ基を次いで脱保護する。本
発明には、分離された組換えタンパク質抗原で被覆され
た固体支持体を含んでなる診断装置の製造、及びその診
断装置の体液内の抗体のアッセイのための使用が含まれ
る。
【０００２】背景情報についての簡単な説明 組換えＤＮＡ技術は微生物及びその他の宿主細胞におけ
る外来（異種）タンパク質の発現を可能にした。多くの
例において、組換えタンパク質の高度の発現はしばしば
「（細胞）封入体」或いは「屈折体（refractile bodie
s)」と称される高分子量集合体の形成に導く〔オールド
・アンド・プリムロース（Old and Primrose）、「遺伝
子操作の原理（Princeples of Gene Manipulation)」、
第三版、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブ
リッシャーズ（Blackwell Scientific Publishers)、オ
ックスフォード、１９８５年、２８９〜２９０頁〕。こ
れらの封入体は次の二つの範疇に分けられる。即ち、第
一のものは必ずしも生来的なものではないが、タンパク
質がおそらく安定な立体配座にあるパラ結晶配列であ
り、及び第二のものは部分的及び完全に変性タンパク質
並びに不正確な翻訳の結果として合成された異常型タン
パク質を含有する無定形の集合体である。その様な異種
タンパク質の集合体は全細胞タンパク質の相当な部分を
構成する。
【０００３】封入体はおそらく内在プロテアーゼに対す
るタンパク質への保護を与えるものであるが、それらは
実際水性緩衝液に極めて難溶性であるので抽出及び精製
の問題を提起する。殆んどの場合において、変性剤及び
洗剤（例、グアニジン塩酸塩、尿素、ナトリウムドデシ
ルサルフェート（ＳＤＳ）、 Triton Ｘ−１００）を用
いてタンパク質を抽出しなければならない。医薬的興味
のある、特に非経口投与用のタンパク質に対しては洗剤
及び変性剤の使用は、特にタンパク質が広範な疎水性領
域を有する場合にはそれらを完全に単離タンパク質から
除去することが困難であるので、望ましくない。更に、
強変性剤であるグアニジン塩酸塩（グアニジン・ＨＣ
ｌ）を用いる場合には、単離タンパク質の再変性は不可
能でないにせよ、困難であり、従って、得られる異種タ
ンパク質は不正確な折りたたみ或いは立体配座により生
物学的に不活性である。加えて、比較的弱い変性剤であ
る尿素が抽出剤として用いられる場合には、幾つかのア
ミノ酸残基の修飾が生じ得る。
【０００４】屈折体の形態にある目的タンパク質の回収
におけるもう一つの問題は、屈折体タンパク質を他の宿
主細胞物質から分離することのみならず、又、引続いて
屈折体タンパク質汚染物質を目的屈折体異種タンパク質
から除去する必要性があることである。この第二の問題
は、おそらく多分イオン的吸引性或いは疎水性結合によ
る屈折体タンパク質が相互に有する強い吸引性によるも
のと思われる。
【０００５】一連の密接に関連した特許〔ビルダー等
（Builder,et al.) 米国特許４，５５１，５０２号明細
書、オルソン等（Olson,et al.）米国特許４，５１１，
５０３号明細書、ジョーンズ等（Jones et al.）米国特
許４，５１２，９２２号明細書、及びオルソン（Olson)
米国特許４，５１８，５２６号明細書〕において、発明
者等は大腸菌（E.coli）屈折体組換えタンパク質を天然
の或いは誘導された不溶性状態から可溶性形態に転換す
る方法を教示している。これらの技術は、タンパク質の
可溶化に関連する超音波処理或いは高圧下における均質
化などの膜崩壊方法を、グアニジン・ＨＣｌ及びＳＤＳ
などのイオン性洗剤中における強変性剤と組合わせて用
いるものである。その様な処理後、組換えタンパク質は
２‐メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下におい
て尿素などの比較的弱い変性剤中へ緩衝剤交換により再
生される（緩衝剤交換の前にタンパク質を亜硫酸塩及び
穏やかな酸化試薬に接触させることによる亜硫酸分解を
行なってよい）。組換えタンパク質を次いで、緩衝化尿
素の存在下において、イオン交換及びモレキュラーシー
ブクロマトグラフィを用いて単離する。この様に、これ
らの特許によれば、変性剤は全工程を通して及び屈折体
タンパク質の回収方法に引続いて存在しなければならな
い。
【０００６】キンセラ等（Kinsella et al.)からの二つ
の特許（米国特許４，１６８，２６２号及び米国特許
４，３４８，４７９号各明細書）及び同一グループから
の二つの技術レポート〔シェッティ等（Shetty et al.)
バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical Journal)、
１９１：２６９〜２７２（１９８０）；シェッティ等
（Shetty et al. ) 、ジャーナル・オブ・アグリカルチ
ュラル・アンド・フード・ケミストリー（Journal of A
gricultural and Food Chemistry)、３０：１１６６−
１１７２（１９８２）〕は核タンパク質複合体から微生
物タンパク質をバルクで分離する方法を教示している。
この方法は、洗剤或いは変性試薬の不存在下における物
理的手段によるバイオマスの崩壊を含んでなるものであ
る。この後、遠心分離を行ない、細胞破片を除去し、水
溶性タンパク質物質‐核酸混合物を無水シトラコン酸或
いは無水マレイン酸などの有機ジカルボン酸無水物を用
いて誘導化し、誘導化されたタンパク質（遠心分離によ
り不溶性細胞破片を除去）をｐＨ４．０〜４．５におけ
る等電沈澱に付する。次いで、保護Ｎ‐アシル基を酸性
ｐＨにおいて加水分解により除去し、タンパク質溶液を
透析して塩を除去し、及び核酸‐減少したバルクタンパ
ク質を凍結乾燥或いは等電沈澱により単離する。これら
の二つのキンセラ等（Kinsella et al.)の特許及びシェ
ッティ等（Shettyet al.)の技術レポートの目標は、バ
ルクの微生物タンパク質をヒト消費用に適した形態で単
離することである。Ｎ‐アシル化工程の目的は、目的バ
ルクタンパク質を微生物核酸汚染物質から分離すること
である。
【０００７】哺乳動物細胞からタンパク質を可溶化する
ためにシトラコニル化も又使用されている。エッシャー
等（Eshharet al.）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ
・イムノロジー（European Journal of Immunology）、
１：３２３−３２９（１９７１年）はラット胸腺細胞及
びリンパ球からの６０〜７０％の膜タンパク質がシトラ
コニル化により可溶化され、及びこれらのタンパク質誘
導体がｐＨ５において脱シトラコニル化されるまで抗原
的に不活性であることを報告した。元の抗原性の僅かに
１０〜２０％が脱アシル化により回収されたに過ぎなか
った。ルンダール等（Lundahl et al.）、バイオヒミカ
・バイオフィジク・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）、
３７９：３０４−３１６（１９７５年）は水‐不溶性ヒ
ト赤血球膜タンパク質の部分を可溶化するためにシトラ
コニル化の使用を開示した。シトラコニル化タンパク質
は更にＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）或いはヒドロキシアパタイトカラム上で
更に分離された。
【０００８】キンセラ等（Kinsella et al.)、インター
ナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プ
ロティン・リサーチ（International Journal of Pepti
de and Protein Research ）、１８：１８〜２５（１９
８１年）は、タンパク質のシトラコニル化はリジン残基
の一級アミノ基のＮ‐アシル化に限定されないことを開
示した。無水シトラコン酸は又幾つかの遊離スルフヒド
リル基をアルキル化して架橋に導き、依ってタンパク質
の凝集に導く。
【０００９】ライト（Light)、バイオテクニクス（Biot
echniques)、３：２９８〜３０８（１９８５年）は、ア
ミノ基が無水シトラコン酸を用いて誘導化された場合に
折りたたまれていないタンパク質の溶解度が増大し、凝
集が避けられることを開示した。
【００１０】スナイダー等（Snyder et al.)、カーボハ
イドレート・リサーチ（Carbohydrate Research)、１０
５：８７〜９３（１９８２年）は、ヒト唾液タンパク質
を可溶化するために、及びムチン糖タンパク質を外来タ
ンパク質から解離するために、シトラコニル化を用いて
いる。個々のシトラコニル化タンパク質を分離する試み
は何等なされていなかった。
【００１１】それらの各種面において、タンパク質を可
溶化し、汚染宿主細胞タンパク質を除去し、及び個々の
組換えタンパク質を生物学的及び免疫アッセイにおいて
活性であり及び適当であり、及び如何なる変性剤あるい
は界面活性剤の不存在下においても可溶且つ生物学的に
活性である形態で分離することに成功する方法を用い
て、微生物組換え異種タンパク質を可溶化及び分離する
ことにおける問題を解決する方法を提供することは有用
であろう。
【００１２】発明の概要 本発明は、微生物細胞内において産生され、それに対し
て異種であり、及び細胞内部の屈折封入体、即ち不溶性
タンパク質の塊内に少なくとも部分的に堆積されている
組換えポリペプチド或いはタンパク質を活性な形態で回
収する方法に向けられたものである。本発明は又、本発
明の方法により回収された個々の組換えタンパク質によ
り被覆された固体支持体の製造にも向けられたものであ
り、該被覆固体支持体は固体状態タイプの診断アッセイ
に適したものである。
【００１３】本発明は、バックグラウンド宿主細胞タン
パク質から、全細胞の溶解により、次いで任意の適当な
方法、例えば低速遠心分離などにより屈折体の回収によ
り組換え異種タンパク質を分離する方法に関する。この
屈折体タンパク質は界面活性剤／変性剤溶液に溶解さ
れ、スルフヒドリル基を可逆的或いは不可逆的に誘導化
して引続くタンパク質の操作に際してその様な基を保護
し、誘導体が次いで分画される。組換えタンパク質の解
凝集はこのタンパク質上に大きな陰性電荷を課すること
により、カチオン性アミノ基をアニオン性カルボン酸基
に転換することにより行なわれる。この二重に誘導化さ
れたタンパク質を次いでクロマトグラフ操作により分別
し、次いで精製組換えタンパク質を未保護、再変性され
た生物学的に活性形態に回復する。
【００１４】本発明の異なった実施態様は、脱保護後各
種の診断アッセイに適した組換えタンパク質で被覆され
た固体支持体の製造に関する。本発明のこれらの面は、
それらの遺伝源或いは生物学的性質の如何に拘らず、宿
主細胞培養液中の不溶性異種組換えタンパク質に適用可
能な多段方法を提供するものであり、従って任意の目的
生成物に対する化学薬品及び装置要件の均一性を提供す
る利点を有する。これらの操作は一般的に適用可能であ
り、特別のタンパク質に対して僅かに小さい修正或いは
調整が必要とされるに過ぎない。本発明の各種面はその
適当な組合わせ及び選択により屈折体タンパク質の回収
の問題に解決を与えるものである。
【００１５】好ましい実施態様の説明 屈折封入体が形成されている微生物及びその他の宿主細
胞からの異種組換えタンパク質の回収のための有効な方
法を提供する本発明の手法を、本明細書の図１及び図２
のような各種利用可能な代替形態を含む図解形態で示
す。
【００１６】簡単に説明すると、図１の図式は幾つかの
段階を有する。第一の段階において、不溶性組換えタン
パク質は、強い外部細胞壁膜を、宿主細胞タンパク質が
可溶化されるか或いは少なくとも組換えタンパク質‐含
有封入体を沈澱させるに十分な沈澱力において懸濁状態
に留どまるようなｐＨ及びイオン強度条件下で崩壊する
酵素及び／又は化学的手段を用いて、宿主細胞から放出
される。用いられる酵素及び化学薬品（洗剤及び弱い変
性剤）は宿主細胞壁及び膜及び核タンパク質体などの各
種高分子構造を攻撃して細胞溶解を促進することが知ら
れているものである。沈澱ペレットは主として目的タン
パク質を含有するものであるが、それは又この段階にお
いては除去を必要とする少量の可溶性宿主細胞タンパク
質で汚染されている。第二段階において、汚染宿主タン
パク質を洗剤及び弱い変性剤の両者を含む穏やかな溶液
で洗浄することにより組換えタンパク質凝集物から除去
する。組換えタンパク質が細胞質条件下にin vivo で沈
澱されるにつれて、通常の水性可溶化技術が失敗するの
は明らかである。依って、第三段階において、封入体を
溶液にするためにより強烈な手段が用いられる。これを
行なうのに強い変性剤溶液が有効であることが判明し
た。強い変性剤は又目的組換えタンパク質の三次元構造
の折りたたみを開いて遊離スルフヒドリル基を空気酸化
その他の望ましくない副作用に曝露する。この困難をな
くすために並びにスルフヒドリル基を以下に説明する本
発明の第四段階における環状酸無水物との反応から保護
するために、本発明はこの第三段階において各種試薬に
よる遊離スルフヒドリル基の誘導化を提供する。本発明
によるスルフヒドリル試薬は遊離スルフヒドリル基に可
逆的或いは不可逆的のいずれかにより結合するものであ
る。
【００１７】目的タンパク質の部分的精製は、目的タン
パク質が変性剤の濃度が透析により低下されるにつれて
溶液から沈澱する条件下において透析或いは他の任意の
方法によりスルフヒドリル誘導化反応混合液を脱塩する
ことにより達成される。この段階において、宿主細胞の
封入体をそれらの起源として有した組換え及びその他の
汚染タンパク質は高濃度の強い変性剤の存在下において
は尚凝集する傾向を有する。しかしながら、変性条件下
におけるタンパク質はそれらの正常な生物学的活性を示
さない。この様に、強い変性剤の不存在下において、組
換えタンパク質を溶液中に維持するための代替的手段が
探索された。本発明の第四段階によるこの代替法は、組
換えタンパク質の遊離アミノ基を選ばれた環状ジカルボ
ン酸無水物化合物と反応させることよりなるものであ
る。この反応は、そのカチオン性アミノ基がアニオン性
カルボン酸基に転換されるにつれて、組換えタンパク質
の総合電荷に変化をもたらすものである。高度に陰性に
荷電したタンパク質が互いに反発し合って、封入体組換
えタンパク質が水性媒体内において凝集する傾向を減少
させて、高度に望ましい水溶性タンパク質単量体を生成
するものと仮定されるが、しかし、本発明者等はこの仮
説に拘束される意図を有するものではない。弱い変性剤
の存在下における単離に引続き、及び透析或いはゲル瀘
過のいずれかにより脱塩し、本発明のこの段階はこの様
に誘導化された組換えタンパク質のモレキュラーシーブ
或いはイオン交換クロマトグラフィによる分別を提供す
るものである。
【００１８】個々の回収されたタンパク質は少なくとも
三つの様式で利用することができる。第一の様式におい
て、可逆的に保護されたスルフヒドリル基は適当な手段
により脱保護することができ、及び今だＮ‐アシル化さ
れている純粋な組換えタンパク質を凍結乾燥により回収
するか或いは溶液中に凍結して保存することができる。
この段階はまだ完全に誘導化されているか、或いは部分
的に誘導化されているか、或いは非誘導化形態にある組
換えタンパク質を回収することを含む幾つかの代替様式
を含むものである。
【００１９】本発明のもう一つの面は、純粋組換えタン
パク質の回収方法の幾つかの段階におけるその柔軟性で
ある。図２に示す如く、第一段階において酵素消化及び
機械的崩壊の組合わせにより洗剤及び変性剤の不存在下
において細胞溶解を達成することができる。更に、第三
段階において、スルフヒドリル基の保護に引続いて組換
えタンパク質の予備的精製を図１に示したような強い変
性剤の濃度の減少に引続く凝集によらないでモレキュラ
ーシーブ上におけるタンパク質分別により達成すること
ができる。
【００２０】本発明のもう一つの実施態様は、回収精製
組換えタンパク質の診断及びその他のアッセイへの利用
に向けられたものである。本発明はこの様に又マイクロ
タイタープレート、ラテックスビーズなどの固体支持体
をＮ‐アシル化組換えタンパク質で被覆し、アミノ基を
その場で（in situ)で脱保護してタンパク質に抗原性を
回復させ、及び脱保護された組換え抗原を、酵素‐結合
イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びラテックスビーズ凝
集アッセイ（ＬＢＡ）を含む固体状態アッセイに用いる
方法も含んでなるものである。これらの用途は本明細書
中の図３に素描されている。
【００２１】Ａ．被精製タンパク質源の一般的説明 本明細書において説明される発明は、微生物内における
発現に引続いて該細胞内に「屈折体」或いは「封入
体」、即ち光を屈折し且つ位相差顕微鏡を通して見た場
合に明るいスポットとして表われる小体、として現われ
る異種組換えタンパク質を単離、精製、再活性化及び使
用するのに有用な操作に向けられたものである。本発明
の目的のためには、これらのタンパク質は「屈折タンパ
ク質」或いは「屈折体タンパク質」或いは「封入体タン
パク質」と称される。組換えＤＮＡ技術を用いて宿主微
生物に複製量の外来タンパク質を産生することを誘発す
る場合には、その様なタンパク質はしばしば「異種タン
パク質」或いは「組換えタンパク質」或いは「目的タン
パク質」と称される。本発明において、「タンパク質」
という用語は、全てのポリペプチド類及びタンパク質を
含んで意味する。本発明において、「屈折」、「異
種」、及び「組換え」は言及時点、例えばそれが本発明
の方法により屈折形態から可溶性形態に転換された後に
おいて、タンパク質の実際の物理的状態の如何に拘ら
ず、発現或いは精製のある段階において位相差顕微鏡に
より沈澱として見ることのできる宿主微生物内に発現さ
れたタンパク質を示すものとして互換可能に用いられ
る。
【００２２】微生物宿主細胞内に発現される各種異種タ
ンパク質、例えばＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶウィルス抗
原、ＨＴＬＶ−IIウィルス抗原、ＨＴＬＶ−Ｉウィルス
抗原、及びネコ白血病ウィルス抗原は通常見られる溶媒
条件下においては屈折体として現われる。その他のその
様な例としては、ヒト及びブタ成長ホルモン類、口蹄疫
ウィルスキャプシドタンパク質、繊維芽球インターフェ
ロン、ヒトインシュリン、ソマトスタチン、アルファ、
ベータ、及びガンマインターフェロン、及びＢ型肝炎抗
原などが挙げられる〔ビルダー等（Builder et al.）上
掲、及びオールド及びプリムロース（Old and Primros
e）上掲、１６０−１６４頁〕。要するに、本発明の方
法には該タンパク質が宿主細胞内に不溶性屈折体として
蓄積する宿主微生物内にＤＮＡ技術により発現される任
意のタンパク質が包含される。
【００２３】本発明において、「宿主細胞」としては組
換えＤＮＡ技術において用いられている任意の微生物、
例えばグラム陰性細菌〔Ｅ．コリ（E.coli）、シュード
モナス種（Pseudomonas spp.）、プロテウス種（Proteu
s spp.）、ナイセリア種（Neisseriae spp.)の菌株から
選ばれるが、好ましくはＥ．コリの菌株である〕、グラ
ム陽性細菌〔バチルス・ズブチリス（Bacillus subtili
s)、コリネホルミス種（Coryneformis spp.)、アクチノ
マイセート種（Actinomycetes spp.）、ストレプトミセ
ス種（Streptomyces spp.）、メチロフィルス種 （Meth
ylophilus spp.）、シアノバクテリウム種（Cyanobacte
rium spp.)の菌株から選ばれるが、好ましくはＢ．ズブ
チリスの菌株である〕、サッカロミセス・セレビジアエ
（Saccharomyces cerevisiae)などの酵母、真菌〔ノイ
ロスポラ（Neurospora ）、アスペルギルス（Aspergill
us)及びポドスペラ（Podospera)から選ばれる〕、及び
クラミドモナス（Chlamydomonas)などの藻類〔オールド
及びプリムロース （Old andPrimrose） 、上掲、３
章、４章、８章及び１０章〕などの任意のものが包含さ
れるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】本文脈内において、「宿主細胞」は、又、
異種タンパク質の発現が上方温度シフトその他の手段に
より誘発された任意の形態の微生物を指し、その生育培
地内における全細胞培養液、収穫された細胞ペースト、
ペーストの凍結試料、或いはペーストの凍結及び解凍試
料、典型的には標準条件、例えば６０００ｘｇで６０分
まで、最も好ましくは４０００ｘｇで３０分間の標準的
条件下に遠心分離により集められた細胞を含むものとさ
れる。
【００２５】Ｂ．屈折体組換えタンパク質の回収 １．屈折体の回収 図１は、活性目的タンパク質をこのタンパク質が発現ベ
クターに応答して産生され、その後屈折体の形態で堆積
されている宿主細胞から単離する問題を解決するに際し
て含まれる一般的操作を示すフローシートである。
【００２６】図１に示されるように、屈折体は宿主細胞
内に封入されているので屈折体を放出してそれらを例え
ば遠心分離により回収し利用可能とするために先ず細胞
を崩壊することが好ましい。本発明の一面において、屈
折体の部分的精製は宿主細胞破片が低速遠心分離に際し
て上澄液相内において残存するのに十分に崩壊すること
を確実にすることによって単純に得られる。本発明のこ
の面において、細胞は０．０１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは
０．１〜 ０．２Ｍのイオン強度を用いてｐＨ５〜９．
５、好ましくは８〜９の緩衝液内において洗浄及び再懸
濁される。任意の適当な塩、好ましくは塩化ナトリウム
を用いて、適当なイオン強度レベルを維持することがで
きる。通常のイオン濃度の目安であるイオン強度は、存
在する各イオン濃度Ｘその上の電荷の２乗の積の合計の
１／２と定義される。任意の適当な緩衝液を用いてｐＨ
を正しい範囲に維持してよいが、Ｔｒｉｓ塩酸塩（Ｔｒ
ｉｓ・ＨＣｌ）緩衝液がこの範囲におけるその緩衝化能
力及びその生化学的不活性によりｐＨを８〜９に維持す
るのに好ましい緩衝液である。
【００２７】細胞は前記緩衝液中に懸濁されながら、次
いでこの目的のために通常用いられる技術により溶解さ
れる。細胞溶解は酵素的及び／又は化学的手段の組合わ
せにより達成される。この目的のために通常用いられる
酵素としてはRhiz.solani からの「溶解酵素混合物」、
Arth.luteusからの「リチカーゼ」、Strep.globisporus
からの「ムタノリシン」、Staph.staphlolyticus から
の「リゾスタフィン」、ウシ膵臓及び／又は脾臓からの
デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）及びリゾチー
ム（ムラミダーゼ）などが挙げられる。リゾチーム＋Ｄ
ＮＡｓｅを用いるのが好ましい。又、目的タンパク質を
宿主細胞自身のプロテアーゼによる攻撃から保護するこ
とも望ましい。これは、溶解混合物を肺タンパク質アポ
プロチニン、大豆トリプシン阻害剤或いはフェニルメチ
ルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）などのプロテア
ーゼ阻害剤、好ましくはアポプロチニン及びＰＭＳＦを
接触させることにより達成することができる。
【００２８】又、細胞壁／膜内の疎水性構造を洗剤、例
えば界面活性剤を用いて崩壊することも好ましい。細胞
溶解はポリオキシエチレンエーテルタイプ、例えば Tri
tonＸ−１５乃至 Triton Ｘ−４０５、 Triton Ｎ−１
０１、 Triton ＷＲ−１３３９、Lubrol−ＰＸ、好まし
くは Triton Ｘ−１００を細胞溶解段階において屈折体
を崩壊しない程度に十分に低い濃度で含む非イオン性洗
剤により助けられる。洗剤濃度は０．００５〜１％、好
ましくは０．１〜０．２％のオーダである。細胞が十分
に崩壊されて沈澱するように十分に大きい径の細胞断片
が全くないか或いは最少量であると判断された時点にお
いて溶解懸濁液を約５００〜６００ｘｇ、好ましくは５
０００〜６０００ｘｇの低速で標準的遠心分離器内で容
量に応じて異なる適当な時間、通常２０〜３０分間遠心
分離にかける。得られたペレットは通常（位相差顕微鏡
により決定して）まだ吸着宿主細胞タンパク質及び膜断
片により汚染されている屈折体を含有する。
【００２９】汚染物質は適当な緩衝液中において屈折体
ペレットを繰返し懸濁することより除去することがで
き、好ましくはＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８〜９中で
０．１０．２％ Triton Ｘ−１００で２回、Ｔｒｉｓ・
ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８〜９中で０．１５〜２Ｍ ＮａＣｌ
で１回、１〜１０ｍＭエチレンジアミンテトラアセテー
ト（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤及び市販の（Pierce
Chemical社）ＳＤＳ、ＬＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰ
ＳＯ及びZwittergent 、好ましくはZwittergent３〜１
４（０．０５〜０．３％、好ましくは０．１〜０．２
％）の中から選ばれたイオン性洗剤を含有するＴｒｉｓ
・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８〜９）で１回、及びＴｒｉｓ・
ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８〜９中の例えば２〜１０Ｍ、好まし
くは５〜６Ｍ尿素などの弱い変性剤溶液で１回行なわれ
る。
【００３０】「変性溶液」とは「変性剤」を含有する溶
液を指し、「変性剤」とは茲に水溶液中においてタンパ
ク質の立体配座を水和状態、溶媒環境或いは溶媒‐表面
相互作用を変更することにより変化することのできるカ
オトロピック化合物を指す。変性剤の具体例としては、
尿素、グアニジン・ＨＣｌ、及びナトリウムチオシアネ
ートが挙げられるが、又洗剤、即ち上記界面活性剤など
も含まれる。掲げられた試薬のあるものは強い変性剤で
あるのに対し、他のものはより弱いものである。これら
の任意のものの濃度は勿論その強度及び有効性に直接に
影響を及ぼす。
【００３１】「強い」及び「弱い」の間に正確な分割線
は存在しないが、一般的に強い変性剤はタンパク質をそ
れらの生来の立体配座からより完全に変性するものであ
る。屈折タンパク質を溶解するのに有用な最も普通に用
いられる強変性環境はイオン性変性剤、グアニジン・Ｈ
Ｃｌの十分に高い（４〜９Ｍ）濃度である。尿素は十分
に高い、例えば７Ｍの濃度であっても幾らかのタンパク
質二次構造の保持を許容するので、比較的弱い変性剤の
最も頻繁に用いられる例である。従って、図１に示す如
く、屈折体の弱い変性剤、例えば尿素の溶液による洗浄
は屈折体自身を溶解することなく、汚染宿主タンパク質
を除去する。
【００３２】２．スルフヒドリル基の誘導化 屈折体タンパク質の遊離スルフヒドリル基をスルホン酸
への空気酸化及びタンパク質のジスルフィド架橋などの
望ましくない副反応に対して、並びに下記段階３におけ
る環状酸無水物との反応に対して保護することが望まし
い。
【００３３】従って、上記の如く調製された屈折体はス
ルフヒドリル基をそれらの還元状態に維持するように計
画された還元剤の存在下において強い変性溶液、好まし
くはグアニジン・ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液、ｐ
Ｈ８〜９中６〜７Ｍ）内に溶解される。典型的な還元剤
としては２‐メルカプトエタノール、ジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）システィン、或いはナトリウムホスホロチ
オレートなどが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。又、ミーンズ・アンド・フィーニィ（Means
& Feeney）、「タンパク質の化学的修飾（Chemical Mod
ification of Proteins）」、Holden-Day 社、サンフラ
ンシスコ, １９７１年、第８章参照。２‐メルカプトエ
タノール（０．１〜１．０Ｍ）が好ましい。その後、遊
離スルフヒドリル基は可逆的に或いは不可逆的に誘導化
されるが、その選択は個々の回収される組換えタンパク
質が生物学的或いは免疫学的活性のために、そのスルフ
ヒドリル基が遊離状態にあることを必要とするか否かに
基づくものである。その様な遊離性が必要でなければ、
保護基の化学的付加の容易性及び完全性の理由により、
又、不可逆性誘導体の化学的安定性の理由により不可逆
的誘導化が選ばれる。
【００３４】組換えタンパク質スルフヒドリル基の不可
逆的アルキル化は標準的操作により典型的には該タンパ
ク質を過剰（好ましくは５〜１０倍モル過剰）のヨード
酢酸、ヨード酢酸アミド、Ｎ‐エチルマレイミド、３‐
ブロモプロピオン酸、アクリロニトリル、好ましくはヨ
ード酢酸から選ばれたアルキル化剤と室温において０．
５〜２時間、好ましくは１時間、アルカリ性ｐＨ（ｐＨ
８〜９）を反応に際して強アルカリ好ましくはＮａＯＨ
を添加することにより維持して、接触させることにより
達成される。ミーンズ及びフィーニィ（Means & Feene
y）、上記第６章及び第８章参照。
【００３５】後に組換えタンパク質のスルフヒドリル基
から保護部分を除去することが望ましい場合には、組換
えタンパク質スルフヒドリル基の可逆的誘導化は、該ス
ルフヒドリル基をモル過剰の、それとスルフヒドリル基
がジスルフィド結合を形成するグルタチオン、システィ
ン、５， ５′‐ジチオビス（２‐ニトロベンゾエー
ト）、或いはｏ‐ヨードソベンゾエートの中から選ばれ
た試剤と接触させることにより達成することができる。
或いは又、遊離スルフヒドリル基は亜硫酸ナトリウムと
の反応によりＳ‐スルホネート誘導体に或いはナトリウ
ムテトラチオネートとの反応によりＳ‐スルフェニルス
ルホネート誘導体に転換することができる。ワーク等
（Work et al.)（編者）「生化学及び分子生物学におけ
る実験技術（Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology） 」中のグレーザー等（Glazer
et al.)、「タンパク質の化学的修飾（Chemical Modif
ication of Proteins）」、Elsevier 、アムステルダ
ム、（１９７６年）、１０８〜１１０頁。適当な時点に
おいて、ジスルフィド、Ｓ‐スルフェニルスルホネート
及びＳ‐スルホネート誘導体は該誘導体を高還元ポテン
シャルを有する還元剤、好ましくは２‐メルカプトエタ
ノール及びＤＴＴと接触させることにより遊離スルフヒ
ドリル状態に回復することができる。スルフヒドリル基
の可逆的保護は制御された組換えタンパク質の再生及び
分子内ジスルフィド結合の形成を可能にしてそれにより
正しい生来の立体配座を達成する機会を増大する。
【００３６】図１に示した実施態様に従えばアルカリ性
媒体中における強い変性剤の濃度を減少することによる
選択的沈澱によるスルフヒドリル基の誘導化に続いて組
換えタンパク質の部分的精製を達成することが可能であ
る。これは誘導化反応混合物をホウ酸ナトリウム緩衝液
に対して透析することにより行なうのが最も好ましい。
緩衝液濃度は０．０１〜１Ｍ、好ましくは０．０５〜
０．１０Ｍであり、ｐＨは８〜１０、好ましくは８．５
〜９．５である。沈澱タンパク質は上記の如く低速遠心
分離によりペレットとして回収される。
【００３７】３．アミノ基の環状ジカルボン酸無水物に
よる誘導化 一度達成された屈折体組換えタンパク質の溶解度は可溶
化タンパク質がより弱い変性溶液、例えば高濃度の緩衝
化尿素中に交換される場合にしばしば維持されるが、こ
の同一の弱い変性媒体中の初期の溶解度は非実用的であ
る。熱力学的或いは動力学的理由を問わず、屈折体タン
パク質はこれらの強烈でない変性条件下では合理的時間
内に溶解しない。従って、初期可溶化に対してグアニジ
ン・ＨＣｌの強い変性溶液が必要とされ、弱い変性溶液
はその後溶解度を維持することができる（上記、オルソ
ン）。屈折体タンパク質の溶解度問題を克服するため
に、又必ずしも変性剤を使うことなくそうするために
は、組換えタンパク質に大きな陰性電荷が課され、陰性
電荷はタンパク質の水溶性、単量体状態への解凝集を促
進する。
【００３８】本発明のこの面は、目的タンパク質の遊離
アミノ基をアルカリ性条件下に特別の環状ジカルボン酸
無水物と接触することに向けられており、この接触はカ
ルボン酸基末端を形成するＮ‐アシル基の可逆的形成に
導き、それらの全てはイオン化され、従って数値的に弱
有機酸のイオン化定数よりも全てのｐＨ値、即ち約４の
ｐＨを越えるｐＨにおいて陰性に荷電される。アミノ基
の環状酸無水物によるアシル化の可逆性は加水分解反応
の分子内触媒としての粒子に対して特別に配向したプロ
トン化カルボキシル基の存在に依存する。この配向は炭
素・炭素二重結合の周りのカルボキシル基のシス‐立体
配置或いはヒドロフタル環上の隣接カルボキシル基の配
置の結果である。グレーザー等（Glazer et al.)、上
記、７９−８４頁。
【００３９】上記望ましい特性を有する環状酸無水物の
一般構造は次の如く表わすことができる：
【化１】 （式中、左側の図におけるＲ１及びＲ２は水素原子及び
アルキル基の任意の組合わせから選ぶことかできる。右
側に示された構造においては、４，５‐結合に単一或い
は二重結合のいずれでもよい）。
【００４０】これらの条件の結果、適当な環状酸無水物
の具体例としてはシトラコン酸無水物（モノメチルマレ
イン酸）、無水マレイン酸、無水ジメチルマレイン酸、
エキソ‐シス‐３，６‐エンドキソ‐Δ４‐ヘキサヒド
ロフタル酸無水物、及びエキソ‐シス‐３，６‐エンド
キソ‐Δ４‐テトラヒドロフタル酸無水物などが挙げら
れるが、これらに限定されるものではない。特別の組換
えタンパク質に最も適した特別の酸無水物は当業者の技
術内の試験により選ぶことができる。
【００４１】組換えタンパク質は高濃度（６〜９Ｍ、好
ましくは７〜８Ｍ）の弱い変性溶液、好ましくはホウ酸
ナトリウム緩衝液（１〜１００ｍＭ、好ましくは４０〜
６０ｍＭ）中の尿素中にｐＨ８〜１０、好ましくはｐＨ
８．５〜９．５において溶解される。溶解完結後、組換
えタンパク質を、過剰（５〜１００倍モル過剰、好まし
くは４０〜６０倍モル過剰）の添加される全無水物の１
／４０を表わすアリコートとして添加される環状ジカル
ボン酸無水物とｐＨを強アルカリ、好ましくは５Ｎ Ｎ
ａＯＨの添加により８〜１０、好ましくは８．５〜９．
０に維持しながら接触させる。
【００４２】４．誘導化に続くタンパク質分別 上記Ｎ‐アシル化反応の完結後、反応混合物を脱塩して
過剰の環状ジカルボン酸無水物及びその加水分解生成
物、即ちジカルボン酸自体を除去する。これは本発明に
従えば、アルカリ性緩衝液例えばホウ酸ナトリウム
（０．０１〜０．２０Ｍ、好ましくは０．０５〜０．１
０Ｍ；ｐＨ８〜１０、好ましくはｐＨ８．５〜９．０）
に対して透析することにより達成することができる。
【００４３】透析の代りに、或いは引続いて組換えタン
パク質二重‐誘導体をモレキュラーシーブ或いはイオン
交換タイプのいずれかのクロマトグラフィマトリックス
上の分別により回収することができる。適当なモレキュ
ラーシーブカラムとしてはUltragel（LKB Products）、
Fractogel （Pierce Chemical Company)およびSepharos
e 、Sephadex 及びSephacryl(Pharmacia Fine Chemical
s） などが挙げられるが、これらに限定されるものでは
ない。好ましい実施態様においては、組換えタンパク質
誘導体はホウ酸ナトリウム緩衝液（０．０１〜１．００
Ｍ、ｐＨ８．５〜９．５）で平衡化された Ultragel Ａ
ＣＡ３４ゲルカラム上で分別され、溶出プロフィールは
タンパク質の最大紫外線吸収領域である２８０ｎｍの波
長において追跡される。溶出組換えタンパク質の分子量
は通常用いられる標準的タンパク質の溶出容積を参照し
て推定される。
【００４４】適当なイオン交換カラムとしてはFractoge
l ＴＳＫ−ＤＥＡＥ（Pierce Chemical Company)或いは
ＤＥＡＥ−Sepharose 及びＤＥＡＥ−Sephacel（Pharma
ciaFine Chemicals)などが挙げられるが、これらに限
定されるものではない。好ましい実施態様において、組
換えタンパク質はホウ酸ナトリウム緩衝液（０．０１〜
０．１０Ｍ、ｐＨ８．５〜９．５）中で平衡化されたFr
actogel ＴＳＫ−ＤＥＡＥ−６５０のカラム上で分別さ
れ、タンパク質は上記ホウ酸ナトリウム緩衝液中の０．
３〜１Ｍ塩化ナトリウムの塩勾配により溶出される。Fr
actogel ＴＳＫ−ＤＥＡＥイオン交換体はそのより大き
な剛性及びより速い流速により好ましい。クロマトグラ
フィカラムから溶出される組換えタンパク質溶液は凍結
乾燥してタンパク質を粉末形態で回収するか或いは典型
的に−２０°〜−１８０℃において凍結貯蔵することが
できる。
【００４５】５．アミノ及びスルフヒドリル基の脱保護 本発明のもう一つの面において、上記純粋組換えタンパ
ク質をその生来の状態に脱保護、即ち保護基をスルフヒ
ドリル基から除去することにより（誘導化が可逆的であ
る場合）、及びアミノ基からアシルカルボン酸基を除去
することにより回復することができる。例えば、組換え
タンパク質のＮ‐アシルカルボン酸基を該タンパク質を
酸性緩衝液と３〜６、好ましくは４．０〜５．５の ｐ
Ｈ値において、適当な温度において適当な時間の長さ接
触させることにより加水分解することができる。タンパ
ク質のμｇ対酸性緩衝液のμｍｏｌの比率は約１：１５
である場合に、加水分解は約室温（２５℃）において約
２４時間以内に、約３７℃において約１６時間以内に完
結し；加水分解は３７℃において約１時間以内に及び約
２５℃において約２時間以内に約５０％完結する。組換
えタンパク質が完全に抗原的であるためにアミノ基の脱
保護が必要とされる。シトラコニル化ＨＴＬＶ−III ／
ＬＡＶ抗原は、例えば以下に説明するＥＬＩＳＡアッセ
イにより判定して脱保護タンパク質の僅かに約半分の抗
原性を有するに過ぎない。
【００４６】幾らかの屈折体組換えタンパク質が反発性
アシルカルボン酸基の除去後、特にタンパク質が濃溶液
中にある場合に凝集することは本発明の一面である。従
って、その様な単離タンパク質が、以下に示すように、
それらが固体担体上に吸着される準備が整うまで脱保護
されないことが本発明の重要な面である。その他の場合
には、ワクチン或いは治療目的のために用いられる組換
えタンパク質は生物学的に活性な立体配座への適当な再
生を可能にし、及びその溶解度特性を保つ条件下におい
て脱保護されるべきである。
【００４７】ある組換えタンパク質、例えばＨＴＬＶ抗
原については、完全な生物学的活性を達成するためにス
ルフヒドリル基を脱保護する必要がない場合がある。し
かし、組換えタンパク質抗原の性質に従って、スルフヒ
ドリル基を脱保護する必要がある場合には、本発明は又
スルフヒドリル基のそれらの生来の状態への回復に向け
られたものである。本発明に従えば、これは組換えタン
パク質上のＮ‐アシルカルボン酸部分の存在或いは不存
在の如何に拘らず達成することができる。標準的方法
（ミーンズ及びフィーニー、上記、第８章）に従えば、
Ｓ‐スルホン化及びＳ‐スルフェニルスルホン化組換え
タンパク質はそれらの遊離スルフヒドリル対応物に０．
０２〜１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ或いはリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７．０〜７．６中の１モルのタンパク質を
２‐メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ナト
リウムホスホロチオレート、ホウ水素化ナトリウム、亜
硫酸ナトリウムなどの還元剤、好ましくは０．１〜０．
７Ｍ ２‐メルカプトエタノールと３７℃において１５
分間或いは２５℃において６０分間接触することにより
還元することができる。その後、反応混合物は適当な緩
衝液に対して透析することにより脱塩される。同様の標
準的操作により、ジスルフィド結合をシスティン、グル
タチオン及び５，５′‐ジチオビス（２‐ニトロベンゾ
エート）などの部分に還元する。
【００４８】６．組換えタンパク質の代替的回収方法 本発明のもう一つの面は、純粋屈折体組換えタンパク質
の誘導化形態における回収方法の幾つかの工程に関する
その柔軟性である。図２に示された代替的手法において
は宿主細胞溶解は図１に用いられた酵素的‐化学的組合
わせの代りに酵素的及び機械的手段の組合わせにより行
なわれる。
【００４９】図２において、図１におけるような細胞の
Ｔｒｉｓ‐緩衝化塩水による洗浄後、細胞をＰＭＳＦ
（０．５〜２．０Ｍ）、ＤＴＴ（０．０１〜１．０
Ｍ）、 Triton Ｘ−１００（０．０５〜０．３％）、Ｅ
ＤＴＡ（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（０．０１〜０．１０
Ｍ、ｐＨ８〜９）中１〜２０ｍＭ）中に懸濁し、次いで
図１と同様な溶解酵素との接触と共に超音波振動、均質
化、ミル内の磨砕或いは圧力セルへの曝露などと共に溶
解され、変性剤は用いられない。
【００５０】図２の方法のもう一つの面において、組換
えタンパク質のスルフヒドリル基の誘導化に続いて、目
的タンパク質の部分的精製が図１の方法の沈澱方法によ
らず、弱い変性剤、好ましくは８Ｍ尿素の存在下におい
て操作されるSepharose ６Ｂ−ＣＬ（Pharmacia Fine C
hemic-als)の存在下においてモレキュラーシーブ上の分
別により達成される。このマトリックスは通常の水性緩
衝液系において不溶性であり凝集されるタンパク質の回
収に特に適したものである。
【００５１】Ｃ．精製組換えタンパク質の診断装置にお
ける使用 純粋な組換えタンパク質抗原が結合された固体支持体を
含んでなる診断装置を製造することができることは極め
て有用である。この装置はヒト及び動物の血清及びその
他の体液に存在する様な抗原に対する抗体のための固体
状態イムノアッセイ及び凝集アッセイを行なうのに適当
なものである。本発明によるその様な診断装置の製造は
図３のフローシートに要約されている。
【００５２】図３に説明される本発明の一面において、
精製組換えタンパク質はマイクロタイタープレートのウ
エルに吸着される。典型的には、その様なプレートとし
てはポリスチレン及びポリプロピレンが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。アルカリ性緩衝液、
好ましくはホウ酸ナトリウム（０．０１〜０．１０Ｍ、
ｐＨ８．５〜９．５）中に溶解されたＮ‐アシル化組換
えタンパク質、好ましくはＮ‐シトラコニル化組換えタ
ンパク質のアリコートをマイクロタイタープレートの各
ウエルに添加する。各ウエルに投入される組換えタンパ
ク質の量は、このタンパク質の生物学的活性に従って及
び引続き用いられるアッセイの感度に従って調整され
る。典型的には、ＨＴＬＶ抗体に対するＥＬＩＳＡアッ
セイに対しては、ウエル当り０．０１〜０．１０ｍｌの
溶液中の０．１〜１．０μｇのタンパク質で十分であ
る。
【００５３】抗原の添加後、本発明に従えば組換えタン
パク質からのアミノ基からの酸アシル基を加水分解する
ために１０〜２０倍モル過剰の弱酸緩衝液がウエルに添
加される。加水分解緩衝液のｐＨは酢酸ナトリウム緩衝
液に対して３．５〜６．０の範囲であり、好ましくはｐ
Ｈ４であり、及びクエン酸ナトリウム緩衝液に対しては
ｐＨ５．５〜５．６である。プレートは遊離アミノ基に
対して標準的トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢ
Ｓ、ミーンズ及びフィーニー、上記、２１７頁）試験に
より決定されるＮ‐酸アシル基を完全に加水分解するの
に必要な時間インキュベートされる。これは３７℃で約
１６時間以内或いは２５℃において２４時間以内に生ず
るが、より短い時間が好ましい。脱アシル化組換えタン
パク質のウエルへの吸着が完了後、ウエル内の溶液を吸
引して廃棄する。
【００５４】標準的操作に従えば、組換えタンパク質及
びウエルのプラスチック表面の両者の上の非特異的結合
部位は、例えば純粋ウシ血清アルブミンの稀釈溶液（典
型的には、標準リン酸緩衝塩水、ｐＨ７．６中等容量の
０．１〜２％溶液）で保護される。アルブミン溶液を次
いで吸引廃棄し、ウエルを風乾させる。
【００５５】本発明のもう一つの面において、それに組
換えタンパク質が吸着されるラテックスビーズを含んで
なる診断装置が製造される。この装置はラテックスビー
ズ凝集アッセイに特に適したものである。本発明に従え
ば、Ｎ‐アシル化組換えタンパク質抗原、好ましくはシ
トラコニル化組換えタンパク質が３０μｇ／ｍｌの濃度
でアルカリ性緩衝液、典型的には炭酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ８．５〜９．５中の１〜４％懸濁液としてのラ
テックスビーズ（好ましくは０．１〜１．０μ直径のポ
リスチレンビーズ）に物理的に吸着される。ビーズへの
タンパク質の吸着に引続き、即ち撹拌しながら２５℃で
１６時間の間、酢酸ナトリウム緩衝液（０．０５〜１．
０Ｍ、ｐＨ３．５〜４．５）などの弱い酸緩衝液を添加
して組換えタンパク質のＮ‐酸アシル基を加水分解す
る。抗原‐被覆ラテックスビーズを低速遠心分離により
単離し、上澄流体を吸引廃棄し、及びビーズを次いでラ
テックスビーズ表面の非‐特異的結合部位に吸着するよ
うにしたタンパク質の溶液内に再懸濁する。本発明に従
えば、これはビーズを０．０１〜０．１０％の非イオン
性ポリエトキシエーテル洗剤、好ましくはTween ２０を
も含有する標準的リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．
６）内の０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブ
ミンの溶液内にビースを懸濁することにより達成され
る。ビーズの懸濁液の最終濃度は０．１〜１．０重量
％、好ましくは０．５〜０．６％である。ビーズは４０
℃において、冷蔵庫内に貯蔵されるべきである。
【００５６】Ｄ．診断装置を用いるアッセイ 本発明により製造される診断装置は各種アッセイにおい
て利用することができる。本発明の一面において、その
ウエルが本発明に従って得られた組換えタンパク質抗原
で被覆されているマイクロタイタープレートは、ヒト及
び動物の体液及び組織内の該抗原に対する抗体のための
ＥＬＩＳＡアッセイに特に有用である。ＥＬＩＳＡ試験
はＥ．エングバル（E. Engvall)、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー（Methods in Enzymology） １７０：４
１９〜４３８（１９８０）に従って行なわれ、これは本
明細書中において準用する。
【００５７】本発明のこの面において、適当な稀釈率の
被分析流体のアリコートを吸着組換えタンパク質抗原を
含有するウエルに添加する。抗原‐抗体反応が完結後、
典型的には２５°〜４０℃で３０〜１２０分インキュベ
ーション後、ウエル内の流体を吸引廃棄し、ウエルをＰ
ＢＳ ｐＨ７．６で洗浄する。その後、各ウエルに第二
の抗体、例えばそれに共有的にアッセイの要件に従って
選ばれる、好ましくはワサビダイコンペルオキシダーゼ
或いはアルカリホスファターゼなどのレポーター分子を
共有的に結合した抗‐ヒトＩｇＧの溶液を添加する。第
一抗体及び第二抗体の反応が完結（２５°〜４０℃にお
いて０．５〜２４時間インキュベーション）後、ウエル
をＰＢＳで洗浄し、レポーター分子を典型的には適当な
クロマゲン溶液、好ましくはアルカリホスファターゼに
対してはｐ‐ニトロフェニルホスフェート、及びペルオ
キシダーゼレポーターに対しては過酸化水素＋ジアミノ
ベンジジン及び硝酸銅を用いてレポーター分子が検出さ
れる。次いで、マイクロタイタープレート分光光度計内
で吸光度を読取る。本発明のこの面を実施するために
は、公知の任意のレポーター分子が使用される。
【００５８】本発明のもう一つの面において、上記方法
に従って得られた組換えタンパク質抗原で被覆されたラ
テックスビーズを用いてヒト及び動物の体液内に存在す
る該タンパク質に対する抗体のアッセイを行なう。ラテ
ックスビーズ凝集試験は、ウィリアムス及びチェア（Wi
lliams and Chare) 、メソッズ・イン・イムノロジー・
アンド・イムノケミストリー （Methods in Immunology
and Immunochemistry）、（１９７７年）、１１５〜１
２５頁に従って行なわれ、これは本明細書において準用
する。本発明に従えば、血清或いはその他の体液の小ア
リコート（５〜５０μｌ）を抗原‐被覆ラテックスビー
ズの懸濁液の小アリコート（３〜３０μｌ）とガラスス
ライド上で混合する。本発明に従えば、抗原と抗体の反
応を完結するために必要な時間典型的には５〜１０分
間、２５℃においてゆっくりスライドを回転するのが好
ましい。本発明に従う陽性の終了点は、肉眼或いは顕微
鏡的に見えるラテックスビーズのマクロ凝集である。
【００５９】以上、一般的に本発明を説明したが、これ
は以下の実施例を参照することにより、より明確に理解
され、特に断りのない限りこれらのいずれも本発明を限
定する趣旨のものではない。例１及び２は屈折体組換え
タンパク質の可溶化及び精製誘導化形態のその様なタン
パク質の回収よりなる本発明の面に関する。例３及び４
は精製組換えタンパク質抗原の固体支持体への被覆及び
その様な被覆固体支持体の幾つかの各種アッセイにおけ
る利用よりなる本発明の側面に関する。全てのこれらの
例は、本発明の方法により精製された特定の異種組換え
タンパク質に関する。精製の詳細は勿論用いられた特定
のタンパク質により異なる。本発明の操作は、全ての場
合において同様であるが、ある種の詳細例えば変性剤の
選択及び目的タンパク質の可溶化、適当なサイジングゲ
ル或いはイオン交換樹脂の選択、並びに各工程において
適当なイオン強度及びｐＨ条件はタンパク質の性質に応
じて異なる。しかしながら、組換えタンパク質は十分に
共通の性質を有するのでこれらの小さな変更は問題とな
る特別のタンパク質に操作を適用させるのに十分であ
る。これらの例において引用された全ての文献は本出願
に準用する。
【００６０】例 １誘導化された屈折体組換えタンパク質抗原の水溶性形態
における単離のための操作−図１の方法 Ｅ．コリ（E.coli）細胞を４０００ｘｇで３０分間遠心
分離により集め、０．１５Ｍ ＮａＣｌ−５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５で１回洗浄し、及び
４容の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５
中に懸濁した。細胞を次いで２ｍｇ／ｇペレット化細菌
のリゾチームで３０μｇ／ｇペレット化細菌のaprotini
n （アプロチニン）の存在下において溶解した。細胞を
更に０．２％ Triton Ｘ−１００及び７０ｍｇ／ｇペレ
ット化細菌のＤＮＡｓｅを添加して崩壊した。６０分間
撹拌して最大溶解をさせた後、不溶性凝集物、即ち屈折
体の形態の組換えタンパク質を６０００ｘｇで３０分間
遠心分離させることにより集めた。これらの凝集物を５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．９中の０．
２％ Triton Ｘ−１００で２回、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・
ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．９中１Ｍ ＮａＣｌで１回、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．９中０．２％
Zwittergent３〜１４及び５ｍＭ ＥＤＴＡで１回、及
び５０ｍＭＴｒｉｓ・ ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．９中６Ｍ
尿素で１回洗浄した。
【００６１】これらの封入体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ９．０中の６Ｍグアニジン・ＨＣｌ及
び０．５％２‐メルカプトエタノールに溶解した。遊離
スルフヒドリル基は２‐メルカプトエタノールに対して
５倍モル過剰のヨード酢酸で２５℃において１時間アル
キル化した。反応に際して、５Ｎ ＮａＯＨを添加する
ことにより８．５のｐＨを維持した。アルキル化タンパ
ク質の部分精製は５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ９に対する透析に際してその様なタンパク質の選択的
沈澱により達成され、グアニジン・ＨＣｌを除去した。
このタンパク質を低速遠心分離によりペレットとして回
収した。
【００６２】５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．
０中の１００ｍｌの８Ｍ尿素に溶解した１００〜１５０
ｍｇの組換えタンパク質に２５℃において一定に撹拌し
ながら１００μｌアリコートの４ｍｌの無水シトラコン
酸を添加し、ｐＨをＮａＯＨを添加することにより、
９．０に保った。反応の完結を確実にするために更に３
０分の反応時間後、反応混合物を５０ｍＭホウ酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ８．５〜９．０に対する透析により或い
はTrisacryl ＧＦ ０５（LKB Products）上のゲル瀘過
のいずれかにより脱塩した。
【００６３】１ｍｌの溶液中５ｍｇのシトラコニル化タ
ンパク質を５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０
で平衡化した Ultragel ＡＣＡ ３４のモレキュラーシ
ーブカラム（０．７５ｃｍＩ．Ｄ．×９０ｃｍ）を通し
て瀘過することにより精製した。溶出プロフィールは２
８０ｎｍにおける吸光度に従うことにより追跡し、標準
タンパク質の溶出プロフィールと対比した。図４に示す
如く、組換えＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶ抗原は約３５．０
００のＭｒ単量体に対応する位置に溶出した。質量基準
でタンパク質を分離するＳＤＳ−ＰＡＧＥによるピーク
ゲル瀘過画分の分析は約３５，０００のＭｒの１個の主
たるバンドプラス数個の汚染高分子量種の存在を示した
（図５）。
【００６４】シトラコニル化タンパク質は又イオン交換
カラム上で分別した。一例において、１００ｍｌの５０
ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０中の１００ｍ
ｇのシトラコニル化タンパク質を、Fractogel ＤＥＡＥ
−ＴＳＫ ６５０の２．５×１７ｃｍカラムに２ｍｌ／
分の流速でかけ、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
９．０中の５００ｍｌの０．３〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配に
より溶出した。ＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶ抗原（３０ｍ
ｇ）は０．４〜０．５Ｍ ＮａＣｌの間に溶出した（図
６のピークII）。小量の汚染タンパク質（ピークＩ）も
又存在した。図６のピークIIにおける組換えタンパク質
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図７）。その結
果、主たるバンドは脱シトラコニル化時に約３５，００
０のＭｒのタンパク質に対応した。
【００６５】図７はトランスフェクションされたＥ．コ
リ及び精製されたＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶ（Delta G71
A）ポリペプチド類のクーマシーブルー‐染色１０％ポ
リアクリルアミドゲルの写真である。レーン１は Lambd
a ＰＬ及びＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶポリペプチドをコー
ドする遺伝子によりトランスフェクションされた８０μ
ｇのＥ．コリのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。レー
ン２は誘発に引続き、 Lambda ＰＬ及びＨＴＬＶ−III
／ＬＡＶポリペプチドをコードする遺伝子によりトラン
スフェクションされた８０μｇのＥ．コリのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析結果である。３５，０００Ｍｒタンパク質の
発現における増大に注意。レーン３はシトラコニル化後
の、しかし脱保護なしのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を
示す。レーン４においては、レーン４のタンパク質は酸
性条件下に脱シトラコニル化された。
【００６６】例 ２誘導化された屈折体タンパク質の水溶性形態での単離操
作ー図２の方法 ３２°においてＬＢブロス内で０．５のＡ550 まで生育
されたＥ．コリの培養液を誘発してＨＴＬＶ−III 抗原
を４２°までの温度シフトにより１．５時間発現させ
た。細胞を４０００ｘｇでの３０分間の遠心分離により
集め、Ｔｒｉｓ‐緩衝化塩水で１度洗浄し、次いで１ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
及び０．２％ Triton Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５中に再懸濁させ
た。細胞を次いでリポチーム（Lipozyme）による消化及
び短時間繰返された超音波処理により溶解した。不溶性
凝集体として発現されたタンパク質を５０００ｘｇにて
３０分間の遠心分離により集めた。Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ‐
緩衝化０．２％ Triton Ｘ−１００及び６Ｍ尿素で数回
逐次洗浄後、タンパク質凝集体を８Ｍ尿素及び５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５中の１％２‐メ
ルカプトエタノール中で可溶化させた。組換えタンパク
質の遊離スルフヒドリル基を１０倍モル過剰のヨード酢
酸を２５℃において添加することによりアルキル化し
た。アルキル化タンパク質抗原の部分精製は、Ｔｒｉｓ
・ＨＣｌ‐緩衝化８Ｍ尿素の存在下におけるSepharose
６Ｂ−ＣＬカラムを通したゲル瀘過により達成された。
アルキル化組換えタンパク質を含有するカラム画分を次
いでホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５中の８Ｍ尿素
の溶液中において５０‐倍モル過剰の無水シトラコン酸
で２５℃において１．５時間処理した。この反応混合物
を０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５に対して
十分透析した後、抗原を更に同一緩衝液中で平衡化した
Fractogel カラム上のゲル瀘過により精製した。シトラ
コニル化ＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶタンパク質は３０，０
００ダルトン分子量標準に対比した際に約３５，０００
のＭｒに対応する位置に溶出した。
【００６７】例 ３マイクロタイタープレートのシトラコニル化組換えタン
パク質による被覆及びＥＬＩＳＡにおける使用 Ｓ‐アルキル化或いは遊離スルフヒドリルシトラコニル
化組換えタンパク質抗原（２５〜５０ｍＭホウ酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ９．０中１０μｇタンパク質／ｍｌ溶
液の５０μｌ）をポリスチレンマイクロタイタープレー
トの各ウエルに添加した後、等容量の０．１５Ｍクエン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５−５．６を添加した。
プレートはシトラコニル基をアミノ基から完全に加水分
解するのに十分長い時間インキュベートした（遊離アミ
ノ基に対する標準ＴＮＢＳ試験により求めたところ、３
７℃で１６時間或いは２５℃で２４時間、図８参照）。
反応混合物を吸引廃棄した後吸着組換えタンパク質上及
びポリスチレン表面自体の上の非‐特異的結合部位を各
ウエルに、０．０６％Tween ２０洗剤を含有するＰＢＳ
ｐＨ７．６中の１％（ｗ／ｖ）純粋ウシ血清アルブミン
をインキュベートすることにより保護した。溶液を吸引
廃棄し、ウエルを風乾した。適当にＰＢＳ緩衝液ｐＨ
７．６で稀釈された血液血清のアリコートをウエルに添
加し、３７℃で１時間インキュベートした。過剰の流体
を吸引廃棄し、細胞をＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．６で１度洗
浄した。その後、ペルオキシダーゼ‐結合抗‐ヒトＩｇ
Ｇを添加した（上記、Ｅ．エングバル）。プレートをイ
ンキュベートし、洗浄し、及びペルオキシダーゼクロマ
ゲンを添加した。５５０ｎｍにおける吸光度をマイクロ
タイタープレート分光光度計（Dynatech MR600）内で求
めた。これらの結果（表Ｉ）は全てのＨＴＬＶ−III ／
ＬＡＶ陽性試料〔Ｌ．Ｗ．キッチン等（L.W.Kitchen et
al.）、ネイチャー（Nature）３１２：１６６（１９８
４年）によるイムノブロット及びラジオイムノ沈澱アッ
セイにより確認〕は０．４１より大きいＥＬＩＳＡ吸光
度を有し、６個の試料以外の全ては１．００より大であ
った。全てのＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶ‐陰性試料、即ち
バックグラウンド吸光度は０．２４未満の読みを有し
た。従って、分画ＥＬＩＳＡ読取りを０．３０に設定す
ると脱シトラコニル化組換えＨＴＬＶIII ／ＬＡＶ抗原
についてのＥＬＩＳＡ試験は１００％正確であった。
【００６８】組換えタンパク質抗原の脱シトラコニル化
がそれらのイムノアッセイにおける使用前に先行しなけ
ればならないという要請が図９に示される。シトラコニ
ル化組換えＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶタンパク質抗原の脱
保護はその完全な免疫反応性の発現のために必要であっ
たが、シトラコニル化タンパク質さえもＥＬＩＳＡ試験
において幾らかの活性を保持することが明らかである。
【表１】
【表２】
【００６９】例 ４ＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶエイズウィルスタンパク質に対
する抗体に対するラテックス凝集試験 シトラコニル化組換えＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶタンパク
質抗原を一定速度で静かに２５℃で撹拌しながら１６時
間のインキュベーションに際して重炭酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ９．０中においてラテックスビーズ（２．５％の
０．６μ直径ビーズの懸濁液）に物理的に吸着させた。
シトラコニル基を次いで吸着タンパク質を０．１Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０で２５℃において１６時
間処理することにより除去した。抗原‐被覆ラテックス
ビーズを低速における短時間の遠心分離により集め、次
いで非‐特異的結合部位を保護するためにＰＢＳ緩衝液
ｐＨ７．６中の１％ウシ血清アルブミン‐０．０６％Tw
een ２０中に再懸濁させた。再懸濁ビーズの最終濃度は
０．６％であった。被覆ビーズを４℃において貯蔵し
た。抗体に対する試験を２５μｌの患者の血清を１５μ
ｌの被覆ラテックスビーズとガラススライド上で混合
し、次いでスライドを１００ＲＰＭで２５℃において８
分間回転することによって行なった。
【００７０】この抗原に対する抗体の陽性の結果は、被
覆ラテックスビーズの凝集により表わされ、該凝集は肉
眼に可視であった。或いは又、低倍率の顕微鏡が用いら
れた。
【００７１】５０個のその様な試験の結果を表IIに示
す。ＥＬＩＳＡ試験により陽性であった２４個の血清中
２２個は又、ラテックスビーズ凝集（ＬＢＡ）試験によ
っても陽性であった。二つの食い違った試料の再試験
は、血清を未稀釈形態で用いた場合に陽性であった。Ｅ
ＬＩＳＡ試験により陰性であった全ての２４の血清は
又、ＬＢＡ試験によっても陰性であった。これらの結果
は、血清の１：１０稀釈率においてＬＢＡ試験は９２％
感受性及び１００％特異性であるのに対し、未稀釈血清
を用いると感度及び特異性はレーザー試験に対して共に
１００％であることを示す。
【００７２】以上、本発明を十分に説明したが、茲に示
した本発明の趣旨或いは範囲から離れることなく多くの
変更及び修正がなされることは当業者には明らかであろ
う。
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、活性目的組換えタンパク質をこのタン
パク質が産生された屈折体の形態で堆積されている宿主
細胞から単離するための一般的操作のフローシートであ
る。
【図２】図２は、組換えタンパク質を単離するための異
なった操作のフローシートである。
【図３】図３は、図１及び図２の方法により回収された
組換えタンパク質を含む固体状態及び凝集アッセイに適
した装置の製造操作を示すフローシートである。
【図４】図４は、 Ultragel ＡＣＡ ３４カラムからの
Ｓ‐アルキル化、Ｎ‐シトラコニル化ＨＴＬＶ−III ／
ＬＡＶ組換えタンパク質の溶出プロフィールを示す。
【図５】図５は、図４において回収された組換えタンパ
ク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（電気泳動）による分析結果を
示す写真である。
【図６】図６は、アニオン交換Fractogel ＤＥＡＥ−Ｔ
ＳＫカラムからのＳ‐アルキル化、Ｎ‐シトラコニル化
ＨＴＬＶ−III ／ＬＡＶ組換えタンパク質の溶出プロフ
ィールを示す。
【図７】図７は、図６において回収された組換えタンパ
ク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（電気泳動）による分析結果を
示す写真である。
【図８】図８は、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５
中における３７℃及び２５℃における組換えＨＴＬＶ−
III ／ＬＡＶタンパク質の脱シトラコニル化の動力学を
示す。
【図９】図９は、シトラコニル化ＨＴＬＶ−III ／ＬＡ
Ｖタンパク質抗原の免疫反応性をタンパク質の脱シトラ
コニル化形態と対比するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ソーン、リチャード エム. アメリカ合衆国マサチューセッツ州、ミル フォード、タングルウッド ドライブ ４ (72)発明者 リギン、チャールズ アメリカ合衆国マサチューセッツ州、ホプ デイル、ローレルウッド ドライブ 54 (72)発明者 マルチアーニ、ダンテ ジュアン アメリカ合衆国マサチューセッツ州、ホプ キントン、スクール ストリート 48

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ある与えられた組換えタンパク質に特異的
    に結合する、ある試料中の抗体を検出するための方法で
    あって、 1) 実質上すべてのアミノ基が酸アシル化されており、
    かつ固体支持体に結合されているＮ‐酸アシル化組換え
    タンパク質を約６．０未満のｐＨの酸性媒体と接触さ
    せ、 2) 過剰溶液を除去し、 3) 工程 1) の固体支持体に結合された該組換えタンパ
    ク質を該試料と抗体‐抗原複合体を形成させるのに十分
    な時間及び条件下に接触させ、 4) 該抗原‐抗体複合体をレポーター分子が共有結合的
    に結合されている第二の抗体に接触させ、及び 5) 該レポーター分子を検出する、ことを特徴とする方
    法。
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