JPS63502958A - Ｈｔｌｖ−３抗体の診断用ペプチド並びにそれらの製造法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＴＬＶ−ｍ抗体の診断用ペプチド並びにそれらの製造法及び用途 関連出願との相互関係 本出願は、１９８６年２月３日出願の米国出願第８２５．５９７号及び１９８６ 年９月２５日出願の米国出願第９１１．４５５号の一部継続出願であって、それ らの内容は参考のため本明細書中に完全に組込まれる。

発明の分野 本発明は、ヒトＴ細胞白血病（リンパ性）ウィルス（ＨＴＬＶ−ｍ）のある種の ペプチド断片が特にＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体に対して免疫反応性であるという発見 に関する。したがって、これらの断片はＨＴＬＶ−ｍに対する抗体検出のための 免疫診断試験に使用することがヒトＴ細胞白血病（リンパ性）ウィルス（ＨＴＬ Ｖ−■）は、ＲＮＡ上にその遺伝子コードを有するレトロウィルスである。レト ロウィルスが宿主細胞に感染した場合、そのゲノムのＤＮＡコピーはその宿主の 染色体中に組込まれる。数種のレトロウィルスの場合において、ＤＮＡはプロウ ィルス（Ｐｒｏｖｌｒｕｓ）として知られる配列の形で宿主細胞染色体中に組込 まれる。レトロウィルス遺伝子コードのＤＮＡコピーは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ リメラーゼ、即ち、逆転写酵素と呼ばれるウィルス酵素によって合成される。宿 主細胞はウィルス遺伝子のＤＮＡを転写し、かつウィルスによりコードされたタ ンパク質を合成するが、次いでこれらは新しいウィルス中に集合化される。

ＨＴＬＶ−ｍＲＮＡゲノムは他のレトロウィルスのものと類似しており、（１） 内部構造（ヌクレオカプシド又はコア）タンパク質についてコードするｇａｇ遺 伝子、（１１）逆転写酵素についてコードするｐｏｌ遺伝子、及び（１１１）ウ ィルスのエンベロープ糖タンパク質についてコードするｅｎｖ遺伝子を少なくと も有する。ＨＴＬＶ−■は、ｔａｔ％ｓｏｒ及び３’　−０ＲＦと呼ばれる遺伝 子を含めて更に遺伝子を有している。

ＨＴＬＶ−Ｈの完全ＤＮＡヌクレオチド配列は数人の研究者によって文献で報告 されているニラトナーら、ネーチャー、第３１３巻、第２７７−２８４頁、１９ ８５年（Ｒａｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　８１３　：２７７− ２８４　（１９８５）　）　；ムージング（Ｍｕｅｓｉｎｇ　）ら、ネーチャー 、第３１３巻。

第４５０−４８５頁、１９８５年；サンチェスーベスカドールら、サイエンス、 第２２７巻、第４４−４９２頁。

１９８５年［５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２２７　：４４−４９２　（１９８５）　）　；及びウニイン−ホブシ ンら、セルズ。

第４０巻、第９−１７頁、１９８５年（Ｖａｉｎ−Ｈｏｐｓｌｎ　ｅｔａｔ、、 　Ｃｅ１ｌｓ、　４０　：９−２７　（１９８５）　）。

他の者は、完全ＨＴＬＶ−ｍエンベロープタンパク質がＨＴＬＶ−ｍウィルス診 断用に使用されうろことを示した。アラン（Ａｌｌａｎ　）ら、サイエンス、第 ２２８巻。

第１０９１−１０９４頁、１９８５年；ベアリン（Ｂａｒｌｎ）ら、サイエンス 、第２２８巻、第１０９４−１０９６頁２１９８５年；及びベロニーズ（Ｖｅｒ ｏｎｅｓｅ）ら、サイエンス、第２２９巻、第１４０２−１４０５頁、１９８５ 年。

ウィルス配列の各部分の分子クローニングは、ラトナーら、同上；チャンら、バ イオ／テクノロジー、第３巻。

第９０５−９０９頁、１９８５年（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂ１ｏ／Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３　：　９０５−９０９　（１９８５））　；チャンら、 サイエンス、第２２８巻、第９３−９６頁、１９８５年；及びクロウルら、セル 、第４１巻、第９７９−９８６頁。

１９８５年（Ｃｒｏｖｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　４１：　９７９−９８ ６　（１９８５））に記載されたようにして達成された。これらのクローンはＨ ＴＬＶ−Ｉ［［ウィルス表面上の潜在的ポリベブチドエピトープの分析用物質を 提供し、免疫系はそれに対する抗体反応を生起しうる。これらエピトープの確認 は、エイズ診断のための感度がよくかつ迅速な方法の開発にとって重要である。

発明の要約 ウィルス表面上のエピトープが免疫学的診断において果たす役割を調べるために 、発明者らは診断領域を確認することによってヒトＴ細胞白血病ウィルス正型（ ＨＴＬＶ−ｍ）のプロウィルスを評価した。これらの努力は、特に抗ＨＴＬＶｍ 抗体と免疫反応する特異的ペプチド断片又はその構造物の確認に結びついた。更 に発明者らはこれらの診断用ペプチドを修正して、免疫反応性の程度を著しく増 大させた。

次いで発明者らは、遺伝子工学の手法によって、これら診断用ペプチドの高発現 レベルを達成することに成功した。

これらペプチドの使用を必要とする診断アッセイも、ＨＴＬＶ−ｍウィルスに対 する抗体を含有しているかもしれないサンプルにおいてＨＴＬＶ−Ｈに対する抗 体検出用として開発された。

図面の簡単な説明 第１図は、ｐＪＬＡ１６からプラスミドｐＪＬＢＯ１ｐＪＬＢ１及びｐＪＬＢ２ の製造法を示す。

第２図は、第１図のプラスミドへの翻訳ポリターミネータ−の付加方法、並びに 得られたプラスミドｐＪＬＢＯＴＳｐＪＬＢＩＴ及びｐＪＬＢ２Ｔを示す。

第３図は、第２図のプラスミドからのＤＮＡ合成のブライミング（ｐｒＩｍｌｎ ｇ　）に必要な転写リプレッサーの削除法、並びに得られたプラスミドｐＪＬＢ ＯＴＲ。

ｐＪＬＢＩＴＲ及びｐＪＬＢ２ＴＲを示す。

第４図は、ｐＢＲ３２２から中間プラスミドΔｐＢＲ２及びΔｐＢＲ４の製造法 を示す。

第５図は、プラスミドΔｐＢＲ４に組込んだλｐＬ断片のサブクローニング方法 を示す。

第６図は、ΔｐＢＲ４−ｐＬ−ｃＩＩと呼ばれるプラスミドが得られる、λｐＬ プロモーターの後に位置するλｃＩＩシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ ｌｇａｒｎｏ）配列のサブクローニング方法を示す。

第７図は、プラスミドΔｐＢＲ４−ｐＬ−ｃＩＩに組込んだＴａｑｌ断片の２工 程サブクローニング方法、並びに得られたプラスミドΔｐＢＲ４−ｐＬ−ｃｌＩ −ＴａｑＩと呼ばれるプラスミドを示す。

第８図は、プラスミドΔｐＢＲ４−ｐＬ−ｃＩ［−ＴａｑＩへの翻訳ポリターミ ネータ−の付加方法、並びに得られたプラスミドΔｐＢＲ４ＰＴ−ｐＬ−ｃＩＩ −Ｏ８Ｄを示す。

第９図は、第８図のプラスミドからのプラスミドΔｐＢＲ４ＰＴ−ｐＬ−ｃＩｒ −ＮＳＤの製造法を示す。

第１０図は、プラスミドΔｐＢＲ４ＰＴ−ｐＬ−ｃＩ［−ＮＳＤからのプラスミ ドｐＬＣＢＣＯ１ｐＬＣＢＣ１及びｐＬＣＢＣ２の製造法、並びにプラスミドΔ ｐＢＲ４ＰＴ−ｐＬ−ｃＩＩ−Ｏ３ＤからのプラスミドｐＬＣＢＣＯＯ１ｐＬＣ ＢＣ１０及びｐＬＣＢＣ２０の製造法を示す。

第１１図は、クローン発現のためのランダムクローニング法を示す。

第１２図は、クローン発現のための直接クローニング法を示す。

第１３図は、直接クローニング法により得られる制限断片を示す。

第１４図は、発現増加のためのクローンＧへの変換について示す。

第１５〜１９図は、ＨＴＬＶ−Ｈの各々５つの特別な免疫診断用領域を示す。ヌ クレオチド配列は、各々第１５図が６５３−１２１８　、第１６図が２６００− ３９１１、第１７図が２７４３−４２１１　、第１８図が６６１９−７１９８　 、及び第１９図が７１９９−８０５２である。注意：ＢＨｌｏ及びＢＨ５はクロ ーン名を表わす；配列の左側に付された数値はヌクレオチド残基を表わす。

第２０図は、コントロール及びヒト患者双方の血清における、ペプチド断片ΔＧ −７１Ａを用いたＥＬＩＳＡアッセイについて示す。

第２１図は、ＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ免疫反応性タンパク質についてコードするクロー ンΔＧ−７１Ａの一部のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す。

定義 以下の記載において、組換えＤＮＡ技術で使用されるいくつかの用語は頻繁に用 いられている。明細書及び請求の範囲のより明確かつ矛盾のない理解を得るため に、かかる用語で与えられる範囲を含めて、下記定義が与え子の５′領域と記載 されるＤＮＡ配列。プロモーター領域において、隣接遺伝子（群）の転写が開始 される。

遺伝子　ポリペプチド又はタンパク質の組立て情報を有し、かつ本明細書で用い られているように５′及び３′末端を含むＤＮＡ配列。

構造遺伝子　メツセンジャーＲＮＡに転写され、次いで特定ポリペプチドに特有 のアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列。典型的には、最初に翻訳されるコドン の第一ヌクレオチドは＋１と表示され、ヌクレオチドは構造遺伝子の翻訳領域か ら３′未翻訳領域にかけて正の整数で連続的に表示される。翻訳領域までのプロ モーター及び調節領域５′におけるヌクレオチドの番号は、最初に翻訳されるヌ クレオチドに隣接する５′ヌクレオチドが−１と表示されて、負の整数で連続的 に続けられる。

作動可能に結合される　本明細書で用いられているように、プロモーターが構造 遺伝子でコードされたポリペプチドの発現開始をコントロールしていることを意 味する。

るプロセスのことである。これには、遺伝子からメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲ ＮＡ）への転写及びかかるｍＲＮＡからポリペプチド（群）への翻訳が含まれる 。

クローニングビヒクル　宿主細胞中で複製しうるプラスミドもしくはファージＤ ＮＡ又は他のＤＮＡ配列のことであって、１つ又は一定数のエンドヌクレアーゼ 認識部位により特徴づけられ、この部位においてかかるＤＮＡ配列はＤＮＡの必 須生物学的機能の損失を伴うことなく決定可能な形で切断され、形質転換された 細胞の同定用に適した表現型選択マーカーを有している。マーカーは例えばテト ラサイタリン耐性又はアンピシリン耐性である。“ベクター″という語は時々ク ローニングビヒクルの意味で用いられることがある。

発現ビヒクル　クローニングビヒクルと似ているが、但し通常ある調節配列のコ ントロール下で宿主中において所定の構造遺伝子を発現することができるビヒク ル。

かかるビヒクルは挿入遺伝子の発現を促進するように作られている。典型的には 、遺伝子の調節配列を有する制限断片は、調節配列を欠く遺伝子をもった制限断 片を有するプラスミドにインビトロで結合せしめられる。この新しいＤＮＡ配列 の組合せをもつプラスミドは、次いで調節配列のコントロール下で遺伝子の発現 を促進するような環境のもとで複製される。

る生物。

好ましい態様の説明 Ｈ９／ＨＴＬＶ−ｍ細胞系由来（７）ＨＴＬＶ　−ＩＩＩプロウィルスに関する 完全ＤＮＡヌクレオチド配列及びそれ゛から予想されるアミノ酸配列は、テトナ ーら、ネーチャー。

第３１３巻、第２７７−２８４頁、１９８５年に記載さ　′れているが、これは 参考のため本明細書に組込まれる。

Ｈ９細胞系から単離されたクローンＢＨ５及びＢＨ８が、本発明の出発物質とし て使用された。Ｈ９／ＨＴＬＶ−■細胞系は、ＡＴＣＣＮαＣＲＬ８５４３とし て米国基準培養寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔ１ｏｎ）に寄託されており、米国特許第４，５２０，１１３号明細書 で総括的に記載されている。ＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスは、永久増殖性ヒトＴ細 胞クローンのリゼイトを用いて増殖させることもできる。

ＢＨ５及びＢＨ８クローンのペプチド断片についてコードする様々なヌクレオチ ド配列が、免疫診断用領域を調べるために評価された。特に免疫反応性であるが ゆえにエイズ抗体に関する免疫診断に利用できることが発明者らによって発見さ れたＨＴＬＶ−ｍプロウィルスの特定のペプチド断片は、配列が前記ラトナーら の第１図において番号付けされたヌクレオチド配列６５３−１２１８．２６００ −３９１１．２７４Ｂ−４２１１，６６１９−７１９８及び７１９９−８０５２ によってコードされている（又はその中に存在している）。これら５つの領域は 、本出願の第１５〜１９図に示されている。

本明細書で用いられているようにかつ適切な位置となるように、ヌクレオチド配 列の番号は制限エンドヌクレアーゼクリップ（ｃｌｉｐ）部位の３′側から始ま る第一ヌクレオチドを基礎としている。

好ましいペプチド断片は、ヌクレオチド配列２６００−３９１１．２７４３−４ ２１１及び７１９９−８０５２によってコードされる（又はその中に存在する） 断片である。最も好ましいペプチド断片は７１９９−８０５２である（又はその 一部である）。

更に、発明者らは、断片中の疎水性部分についてコードするＤＮＡ配列を削除す ることが断片の発現量増加とＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体に対する高度の免疫反応性と に繋がることを発見した。疎水性領域は、ＨＴＬＶ−ＩＩ［ウィルスの様々なヌ クレオチド部分によってコードされた疎水性アミノ酸からなる領域である。好ま しい態様においては、ヌクレオチド配列７１９９−８０５２によってコードされ た免疫原性ペプチド断片の２つの疎水性領域が削除されていた。これら２つの疎 水性領域は、およそヌクレオチド７３５０−７４１８及びおよそヌクレオチド７ ８５１−７９１６においてコードされている。

更に、本発明者らは、疎水性領域が削除されたペプチド断片のアミノ末端を延長 させることが断片の発現量増加とＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体に対する高度の免疫反応 性とに繋がることも発見した。このように、他の好ましい態様においては、ヌク レオチド配列７１９９−８０５２によってコードされた疎水性二重削除ペプチド 断片のアミノ末端が延長されている。最も好ましい態様においては、ヌクレオチ ド配列７１９９−８０５２によってコードされた疎水性二重削除ペプチド断片の アミノ末端は、およそヌクレオチド６８２７におけるＡｈａｍ部位まで延長され ている。ＨＴＬＶ−Ｈのこの部分、即ちヌクレオチド６８２７−８０５２は、今 まテニ知られていたＨＴＬｖ−■単離物中に存在するエンベロープ配列のほとん どすべてを含んでいる。この特定のペプチド断片はΔＧ−７１Ａと命名され、こ のペプチドを発現するプラスミドを含有した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　 ｃｏｌｌ）培養物（ＭＺＩ）はｐΔＧ７１ＡＣと命名された。この培養物は１９ ８６年１月３０日にＡＴＣＣＮｏ、５３４５５として米国基準培養寄託機関、１ ２３０１　バークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌｏｖｎ　Ｄｒｉｖｅ）　、　０ 　ツクビル（Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ　）　、メリーランド州２０８５２に寄託され た。この寄託機関は永久寄託と一般人による簡易な入手性とを保証している。

当業者であれば理解されるであろうが、発現ビヒクルにおいてクローン化された ヌクレオチド配列の適当な配列調整によって、ペプチド断片の最初の１又は２個 のアミノ酸に関して様々な変換が可能となる。

更に、ペプチド断片は、変換が抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体に対するペプチドの免疫 反応性を高めるのであれば、挿入、削除及び置換（保存的もしくは非保存的であ れ）のような様々な変換に付すことができる。保存的置換とは、ｇｌｙ、ａｌａ ；ｖａｌ、１ｌｅｘ　ｌｅｕＨａｓｐｓｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｉｎ；５ｅｒＳｔｈ ｒ；ｌｙｓｓａｒｇ；及びｐｈｅ、ｔｙｒのような組合せを意味する。

ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、コドンと呼ばれる３個のヌクレオチド群で翻訳 される。各コドンは、合成されたペプチド断片中の１個のアミノ酸に相当する。

読取り枠は、どの３個１組のヌクレオチドがコドンとして読取られるかを規制し ており、開始コドンＡＵＧによって決定される。

特に重要なものは、下記式のペプチドである：〔上記式中、Ｒ１はＣｙｓ−Ｃｏ −Ｒ２、ＯＨ５０Ｍ又は−ＮＲ３Ｒ４である； Ｍは薬学上許容される陽イオン又は低級（Ｃ１−Ｃ６）分岐鎖もしくは非分岐鎖 状アルキル基である；Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同一か又は異なっており、水素及び 低級（Ｃニー０６）分岐鎖もしくは非分岐鎖状フルキル基からなる群より選択さ れる； Ｘは前記のようなアミノ酸配列又はペプチド断片である〕　； ２）　それらの酸付加塩；及び ３）　それらの保護された又は一部保護された誘導体。

当業者公知の如く、アミノ酸残基は適当なアミノもしくはカルボキシル保護基を 用いてそれらが保護された形で又は未保護の形で存在する。

有用な陽イオンＭは、アルカリもしくはアルカリ土類金属の陽イオン（即ち、Ｎ ａ５ＫａＳＬｉｓ　ｌ／２Ｃａ。

１／２Ｂａ等）又はアミノ陽イオン（即ち、テトラアルキルアンモニウム、トリ アルキルアンモニウム、但しアルキルはＣ１−０１２である）である。

様々な鎖長のペプチドは、遊離アミン（Ｎ末端）でも又はその酸付加塩の形であ ってもよい。通常の酸付加塩はハロゲン化水素酸塩、即ちＨＢｒ、ＨＩ、又は更 に好ましくはＭＣＩの塩である。

ＨＴＬＶ−ｍウィルスのペプチド断片は、宿主細胞中においてプロウィルスから 得ることができる。その際に、ペプチド断片は適当な酵素又は化学的方法を用い て天然ウィルスを断片化することにより得られるであろう。しかしながら、合成 により、例えばメリフィールド、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ サエティ。

第８５巻、第２１４９頁、１９６２年（ＭｅｒｒｉＮｅｌｄ。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔ ｙ、　８５　：２１４９（１９Ｂ２））並びにスチュワード及びヤング、固相ペ プチド合成（フリーマン、サンフランシスコ、１９６９年）。

第２７−６２頁（Ｓｔｅｖａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ　ｉｎ　５ｏｌｉｄ　Ｐ ｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｓａｎ　 Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　１９６９　）ａｔ　２７−６２）に記載された周知の固相 ペプチド合成によりペプチド断片を得ることもできる。

ペプチド断片を得る好ましい方法は、遺伝子工学技術を利用して所望のポリペプ チド断片をクローニングすることである。遺伝子工学及び組換えクローンを用い る利点は２つある。第一の利点は、単離技術又は合成によりウィルスゲノムを大 量に得ることが困難かつ時間の浪費となることであり、第二の利点は、組換えペ プチドが診断試験の信頼度を低下させうるヒト抗原をもっていないことである。

ここで、“ペプチド断片″という語は、天然アミノ酸配列、合成配列、及びＨＴ ＬＶ−ｍウィルスゲノムのセグメントであるクローン化配列から発現された断片 を含んでいることを意味する。

上記のように診断用ペプチド断片にはいくつかのバリエーションがあると当業者 には理解されるであろうが、但しこれらのペプチドではＨＴＬＶ−Ｉ［ｒの抗体 に対する免疫反応性を保持していなければならない。したがって、ペプチド断片 の鎖長範囲は明確に規定される必要はない。

ペプチド断片のアミノ酸は、免疫反応性の損失を伴わずに削除又は付加される。

しかも、アミノ酸は交換することができ、例えばバリン等の中性アミノ酸はロイ シン等の他の中性アミノ酸と交換することができる。単離物毎にもゲノムのバリ エーションがある〔例えば、ウォングースタール（Ｗｏｎｇ−９ｔａａｌ）ら、 サイエンス、第２２９巻。

第７５９−７６２頁、１９８５年参照〕。このようなバリエーションも本発明の ペプチド断片に含まれる、と理解されたい。

遺伝子構造体及びそれらの使用方法は、原核細胞及び真核細胞の宿主を含めた宿 主においてのペプチド断片の発現用に利用することができる。原核細胞宿主とし ては、大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ　ｔｙ−ｐ ｈｌｇｕｒｌｕｍ　）　、セラチア−フルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａａａｒ ｃｅｓｃｅｎｓ）又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　５ｕ−ｂｔｌ ｌｌｓ）のような細菌がある。発現用の好ましい細菌宿主は、ラウテンベルガー ら、ジーン・アナライティカル・テクノロジー、第１巻、第６３−６６頁、１９ ８４年（Ｌａｕｔｅｎｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　ａｎａｌｙｔ ｌｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

１　：　６３−６［ｉ　（１９８４））に記載されているＭＺＩのような、温度 感受性バクテリオファージスＣｌ８５フ遺伝子をもつ大腸菌株である。真核細胞 宿主としては、酵母菌、繊維状真菌及び哺乳動物細胞がある。ペプチド断片のＤ ＮＡ配列は、ワクシニアウィルスのゲノムに挿入することができる〔マケット・ エムら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス ＵＳＡ、第７９巻、第７４１５頁、１９８２年（Ｍａｃｋｅｔｔ。

Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ’　Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ａｃａ ｄｅｍｙ　ｏｆ’　５ｃｉ−ｅｎｃｅ　ＵＳＡ、　７９　：　７４１５　（１９ ８２））　；バニカリ・デー（Ｐａｎｉｃａｌｉ、　Ｄ、）ら、プロシーディン グ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ拳すイエンスＵＳＡ、第７９巻。

第４９２７頁、１９８２年；バニカリ・デーら、プロシーディング・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第５３６４頁、１９ ８３年；及びスミス・ジー・エル（Ｓｗｉｔｈ、　Ｇ、Ｌ、　）ら、ネーチャー 、第３０２巻、第４９０頁、１９８３年〕。その際に組換えヴアクシニアウイル スはいずれかの哺乳動物細胞中で複製を行ない、対象とする断片はエンベロープ 又は内部ウィルスタンパク質中に出現してくる。昆虫細胞も断片の複製用に使用 しうる〔例えば、スミスら、モレキュラーψアンド・セル・バイオロジー、第３ 巻、第２１５６−２１６５頁、１９８３年（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　３　：　２１５Ｂ −２１６５（１９８３））参照〕。

一般に、挿入された遺伝子断片の効果的な転写を促進し、宿主細胞に親和性の種 から得られるプロモーター配列含有発現ベクターは、これら宿主と合わせて使用 される。発現ベクターは、典型的には、複製源、プロモーター、ターミネータ− １及び形質転換細胞での表現型選択を可能にする特定遺伝子を有している。

形質転換された宿主細胞は、最適の細胞増殖を行ない、しかもクローン化された ＨＴＬＶ−ｍペプチド断片の最適の発現を行なわせるために、当業者に公知の手 段によって発酵かつ培養させることができる。後述の例５で記載されているよう に、ペプチド断片についてコードする゛クローンＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルス配列 の高レベル発現は、本発明の好ましい操作法に従って行なうことができる。

クローンＨＴＬＶ−ｍペプチド断片の発現後、断片は典型的には当業者に公知の 手段によって回収精製される。

細菌が宿主として用いられる場合には、クローンの高レベルの発現の結果として 、不溶性封入体又は凝集物が通常形成される。発現タンパク質を精製するために は、不溶性封入体は可溶化されねばならない。本発明の好ましい態様において、 発現されたペプチド断片はアミノ基のシトラコニル化誘導プロセスによって精製 されるが、このプロセスは例８で更に詳細に記載されている。

本発明の精製された免疫原性でかつ診断用のペプチド断片は、ＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ に応答して産生された抗体によって特異的に認識される。血液又は組織サンプル 中のＨＴＬＶ−ｍ抗体はイムノアッセイにおいてペプチド断片を用いて検出する ことができるが、その際にペプチドは液相中で用いられるか又は固相担体に結合 せしめられる。しかも、ペプチド断片はウィルスのイムノアッセイ向けに様々な 方法で検出可能となるよう標識をつけることができる。本発明のペプチド断片を 用いてＨＴＬＶ−■抗体を検出するための好ましいイムノアッセイとしては、ラ ジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当 業者に公知の他のアッセイ、例えばイムノフルオレセントアッセイ、ケミルミネ セントアッセイもしくはバイオミネセントアッセイがある。

アッセイで特に使用される放射性同位体としては、３Ｈ，１２５，１３１１，３ ２Ｐ、　３５ｓ、　１４ｃ、　５１ｃｒ。

３６ｃ１．５７ｃ０．５８ｃｏ、５９Ｆｅ、７５ｓｅ及び１５２Ｅｕがある。

放射線標識をすることは１つの選択であるが、別法として、ペプチド配列又はそ れに対する抗体が、当業者に公知の技術により螢光標識、酵素標識、遊離ラジカ ル標識、アビジン−ビオチン標識又はバクテリオファージ標識を用いて標識され る〔チャード、生物学の実験技術。

“ラジオイムノアッセイ及び関連技術の入門′、ノース・ホランド・パブリッシ ング社、１９７８年（Ｃｈａｒｄ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　”Ａ ｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎ ｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｔｑｕｅｓ−、ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ　Ｐ ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（１９７８）　）　）。

代表的な螢光標識としては、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、フ ィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−フタルアルデヒド 及びフルオレサミンがある。

代表的な化学ルミネセンス化合物としては、ルミノール、イソルミノール、芳香 族アクリジニウムエステル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩類及びシュウ 酸エステル類がある。代表的な生物ルミネセンス化合物としては、ルシフェリン 、ルシフェラーゼ及びエクオリンがある。

代表的な酵素としては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グル コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコー スオキシダーゼ及びペルオキシダーゼである。

酵素アッセイにおける２つの主なタイプは、酵素結合イムノソルベントアッセイ （ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　、及び酵素多重化イムノアッセイ（ＥＭＩＴ）（サイバ社 （５ｙｖａＣｏｒｐ、　）　）としても知られる均一酵素イムノアッセイである 。ＥＭＩＴ系はトレーサー抗体複合体による酵素の不活性化に依存しており、し たがって活性は分離工程を必要とせずに測定することができる。

本発明の範囲内に属するイムノアッセイとしては、イムノメトリックアッセイ（ ｉＩＩＩＩＩｌｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ）及び競合アッセイがある。

イムノメトリックアッセイとしては、フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ　）サンドイ ッチ、逆サンドイッチイムノアッセイ及び同時アッセイがある。これら各々の用 語は当業者に十分理解されている。イムノメトリックアッセイは、ＨＴＬＶ−Ｉ ＩＩに対する抗体の検出用として記載されることになるであろう。これらのアッ セイでは、ペプチド断片は固相担体に結合せしめられ、抗ＩｇＧ抗体は検出可能 なように認識される。

フォワードサンドイッチイムノアッセイでは、ＨＴＬＶ−Ｈに対する抗体を含有 している可能性があるサンプルは、最初にペプチド断片を有する固相免疫吸着剤 と一緒にインキュベートされる。インキュベートは、サンプル中の抗体を固定ペ プチド断片に結合させるために十分な時間にわたって続けられる。最初のインキ ュベート後、固相免疫吸着剤はインキュベート混合物から分離され、かつサンプ ル中に存在している可能性のある阻害物質を除去するために洗浄される。次いで 、固定ペプチド断片に結合した固相免疫吸着剤含有抗体は、被検抗体上の別のド メインを交差反応する可溶性標識抗体と一緒にわずかな時間インキュベートされ る。第二のインキュベート後、もう１度洗浄が行なわれ、それによって固相免疫 吸着剤から未結合標識抗体を除去し、かつ非特異的結合標識抗体を除去する。次 いで固相免疫吸着剤に結合した標識抗体が検出され、検出された標識抗体量は原 サンプル中に存在する抗体量の直接的測定値とみなされる。又は、免疫吸着剤複 合体を結合しない標識抗体も検出することができるが、その場合において測定値 はサンプル中に存在する抗原量と反比例する。フォワードサンドイッチアッセイ は、例えば米国特許第３，８６７．５１７号、第４．０１２．２９４号及び第４ ．３７６．１１０号明細書に記載されている。

逆サンドイッチアッセイでは、ＨＴＬＶ−ＩＩＩに対する被検抗体を含有してい る可能性があるサンプルは最初に標識含有抗体と一緒にインキュベートされ、次 いで被検体上の別のドメインと交差反応する固定ペプチド断片を含有した固相免 疫吸着剤がそれに加えられ、わずかな時間インキュベートが行なわれる。フォワ ードサンドイッチアッセイに必要な最初の洗浄工程は不要であるが、第二のイン キュベート後には洗浄が行なわれる。逆サンドイッチアッセイは、例えば米国特 許第 ４．０９８，８７６号及び第４．３７６．１１０号明細書に記載されている。

同時サンドイッチアッセイでは、サンプル、ペプチド断片を固定した免疫吸着剤 及び被検抗体の別のドメインに対して特異的な可溶性標識抗体が、１回のインキ ュベート工程で同時にインキュベートされる。同時アッセイではたった１回のイ ンキュベートのみを要し、洗浄工程を要しない。同時アッセイの適用は非常に有 効な技術であって、簡易操作性、均一性、再現性、アッセイの直線性及び高精度 という利点を与える。参考のため本明細書に組込まれるデビット（Ｄａｖｉｄ　 ）らの米国特許第４．３７６．１１０号明細書参照。

所謂、遅延型イムノメトリックアッセイも、例えばチュー（Ｃｈｕ）、米国特許 第４，２８９，７４７号明細書及びウォルターズ（Ｗｏｌｔｅｒｓ　）　、米国 特許第　４．３４３，８９６号明細書に記載されているように、利用することが できる。

上記アッセイの各々において、抗体含有サンプル、固定ペプチド断片含有の固相 免疫吸着剤及び可溶性標識抗体は、被検抗体を固定ペプチド断片及び可溶性抗体 と結合させるために十分な条件下でかつ十分な時間にわたってインキュベートさ れる。一般に、できるだけ抗体を多く結合させるために十分なインキュベート条 件を整えることが望ましいが、その理由はこれによって固相への標識抗体の結合 量を最大にし、もってシグナルを増加させることになるからである。勿論、標識 抗体及び固定断片の具体的濃度、インキュベートの温度及び時間、並びに他のこ のようなアッセイ条件は、サンプル中の抗体濃度、サンプルの性質等をはじめと する各種ファクターに応じて変更させることができる。当業者であれば、日常的 実験法によって、各々の決定事項に関して実施可能かつ最適のアッセイ条件を定 めることができるであろう。

今までに使用されておりかつ本発明でも使用可能な固相免疫吸着剤としては多数 のものがある。周知の免疫吸着剤としては、ガラス、ポリスチレン、紙、ポリプ ロピレン、デキストラン、ナイロン及び他の物質から形成されたビーズ類；かか る物質から形成されるか又はそれでコーティングされたチューブ類、等がある。

固定されるペプチド断片は、アミドもしくはエステル結合を介する共有結合等の 技術により又は吸着によって、固相免疫吸着剤に共有結合せしめられるか又は物 理的に結合せしめられる。当業者であれば、ペプチド断片を結合させるために適 した他の多数の担体を知っており、そうでないとしても日常的実験法によってそ のことを確認することができるであろう。

ホルモン、タンパク質、抗体等のような微量有機物分子の検出用に使用される一 般的な競合的結合アッセイ技術は、当業者に周知である。チャード、同上参照。

これらいずれの競合的結合アッセイ技術も、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体の検出目的の ために利用することができる。競合的結合アッセイ、典型的にはラジオイムノア ッセイ（ＲＩ　Ａ）を実施するためには、ペプチド断片に応答して産生された標 識含有抗体と、試験されるべき１（ＴＬＶ−ｍ抗体とに対して親和性を有する結 合用分子を加えることが必要である。未知量のＨＴＬＶ−ｍ抗体を含有した少量 の液体又は組織サンプルは、産生標識抗体及び既知量の抗体特異性ペプチド断片 の存在下でインキュベートされる。

凝集アッセイは、ＨＴＬＶ−ｍ抗体を検出するためにも利用可能である。例えば 、所望の断片は、適当な粒子、例えばラテックスビーズ、ゼラチン、赤血球、ナ イロン、リポソーム、金粒子等の上に固定される。サンプル中に抗体が存在して いる場合は、沈降反応に類似した凝集を引き起こし、しかる後比濁法、濁度、赤 外線分光測定法、目視検査、比色法等の方法で検出することができる。

産生抗体は本発明の抗原性ペプチド断片から製造されることが好ましい。試験サ ンプルと断片及びトレーサー含有抗体とのインキュベートが終了した後には、遊 離及び結合（免疫複合化）型間でのトレーサー含有分子の分布を調べることが必 要である。通常、但しいつも必ずというわけではないが、そのためには結合画分 が遊離画分から物理的に分離されることを必要とする。例えば、特異的ペプチド 断片はプレートに結合させることができる。

他の様々な技術もかかる目的のために利用することができ、各々においてその遊 離及び結合型のトレーサー含有分子間の物理化学的差異を活用している。通常利 用される方法論は、ヤロー、ファーマコロジカル・レビュー。

第２８巻、第１６１頁、１９７３年（Ｙａｌｏｖ、ｉｎ　Ｐｈａｒｓａ−ｃｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｌｅｖ、　２８　：　１６１　（１９７３）　）に記載さ れている。これらの技術としては、吸着、沈降、塩析技術、有機溶媒、電気泳動 分離等がある。チャード、同上、第４０５−４２２頁参照。

前記イムノメトリックアッセイの場合のように、可溶性抗体は放射線標識、螢光 標識、酵素標識、遊離ラジカル標識又はバクテリオファージ標識のようないずれ かの検出可能な標識で標識することができる。最も普通には、標識は放射線標識 又は酵素標識である。

本発明の免疫原性のペプチド断片は、抗体産生を促進させるために用いてもよい 。抗体産生を促進させるためには、ペプチド断片は、当業界で周知でかつ一般的 に利用されている技術を用いて、牛血清アルブミン又はキーホールアオガイ（Ｋ ｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）のような担体タンパ ク質に結合させてもよい。

好ましくは、担体タンパク質はＫＬＨであって、システィン残基を介してペプチ ド断片に結合せしめられる。

しかも、ペプチド断片は免疫学的に不活性又は活性な担体と混合させることがで きる。免疫応答を促進又は誘導するフロイント完全アジュバントのような担体が 使用可能である。

動物による抗血清生産は周知の技術である（例えばチャード、同上、第３８５− ３９６頁参照）。動物の選択は、入手し品さと、得られた抗血清量に関するおよ その必要量との間におけるバランスによって通常決定される。

ヤギ、ロバ及びウマのような大型種が好ましいが、その理由は大量の血清が容品 に得られるからである。しかしながら、通常高力価の抗血清を産生ずるウサギ又 はモルモットのような小型種を用いることも可能である。通常、抗原物質（ペプ チド断片ハブテン−担体タンパク質複合体）の皮下注射が動物の免疫系に導入さ れ、そこで抗体が産生される。適切な抗体の検出は、適切な標識トレーサー含有 分子で抗血清を試験することによって行なわれる。トレーサー含有分子と結合す る画分が次いで単離され、必要であれば更に精製される。

このようにして得られた抗体は次いで、ＨＴＬＶ−ｍウィルス又はその断片を同 定かつ定量するための様々なイムノアッセイにおいて利用することができる。コ ーラ−（ｋｏｈｌｅｒ）及びミルシュタイン（Ｍｌｌｓｔｅｉｎ）　、ネーチャ ー、第２５６巻、第４９６頁、１９７５年に記載されているような周知の技術に よって製造され、本発明のペプチド断片に応答して生成するポリクローナル抗体 及びモノクローナル抗体は、いずれもイムノアッセイに利用することができる。

ＨＴＬＶ−ｍウィルス又はその一部を検出するためにイムノメトリックアッセイ を利用する場合には、２種の異なる別個の抗体が要求される。これら抗体のうち １つは固相担体に結合せしめられ、他は検出可能に標識される。本質的には、Ｈ ＴＬＶ−ＩＩＩウィルスに対して特異的な２種の異なる抗体は、ウィルスタンパ ク賃上の別々のドメインと交差反応する。１つの態様において、２種の異なる抗 体は本発明の２種の異なるペプチド断片を用いて製造することができる。、１つ が担体に結合し、他が検出可能に標識された、異なるペプチド断片に対する抗体 は、様々なサンドイッチアッセイで使用される。

あるいは、同一のペプチド断片を用い、ウサギ及びマウスのような２Ｖｉの異な る種で抗血清を産生させることによって、ＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスに対し特異 的であるものの別々のドメインと交差反応する抗体を製造することも可能である 。

更に、本発明のアッセイで使用される物質は、キットの製造用として申し分なく 適している。このようなキットは、バイアル、試験管等のような１以上の容器手 段を密な状態で収納できるように仕切られた運搬手段からなる。各々の上記容器 手段は、アッセイに使用される別々の要素のうちの１つを含有している。

例えば、上記容器手段の１つは免疫吸着剤結合ペプチド断片を含有している。か かる断片は、分離用固相免疫吸着剤に又は直接容器の内壁に結合せしめられる。

第二の容器は、凍結乾燥形又は溶液として検出可能に標識された抗−抗体を含有 する。

運搬手段は、複数の容器を更に収納することもでき、その容器の各々は別個の既 知量の抗体を含有している。

この場合において、これら後者の容器は標準曲線を作製するために利用すること ができ、未知量の抗体含有のサンプルから得られる結果をこの標準曲線にあては めることができる。

本発明の実施により、ＨＴＬＶ−ｍ抗体又はウィルス自体もしくはその一部の存 在が生物学的液体及び組織中で検出される。未知量のＨＴＬＶ−Ｉ［［抗体又は ＨＴＬＶ・■を含有したいかなるサンプルも使用可能である。通常、サンプルは 、液体、例えば尿、唾液、涙液、髄液、血液、血清等、又は固体もしくは半固体 、例えば組織、糞等である。当業者で公知のように、ＨＴＬＶ−ｍウィルス及び ウィルスに対する抗体は、Ｔ細胞異常、後天性免疫不全症候群（エイズ、ＡＩＤ Ｓ）及び前エイズ症状、例えばエイズ関連合併症（ＡＲＣ）に関与している。更 に、ＨＴＬＶ−Ｈに対する抗体がヒト又は動物の生物学的液体又は組織の中に存 在しているかもしれないことも当業者に知られているが、但しこの場合のヒト又 は動物とはエイズ又はＡＲＣにかかっていないものをいう。

本発明のペプチド断片は、ＨＴＬＶ−ｍウィルスに対するワクチンとしても使用 可能である。ペプチド断片は、抗体産生を促進させるために、当業者に一般的に 知られているようにして、製造されかつ動物に投与される。好ましくはヴアクシ ニアウイルスがＨＴＬＶ−ｍワクチンの製造のために公知の方法に従い使用する ことができる。

下記例は、本発明の実施例に際して使用される物質及び方法を更に詳しく説明す るものである。例はいかなる態様においても発明を制限するものではない。

因 下記例において、下記のヒト血清は、組換えペプチド断片の免疫反応性を評価す るために使用された。血清は、エイズもしくはエイズ関連合併症と臨床診断され た患者又はコントロールから得た。各々の血清は、ＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ／ＬＡＶｇ ｐ１６０／１２０抗体に関する基準に基づき試験した〔エル・ダブル・キッチン （Ｌ、ν、　Ｋｉｔｃｈｅｎ）ら、ネーチャー、第３１２巻、第３６７−３６９ 頁。

１９８４年〕。ｇｐ１６０／１２０抗体はいずれのエイズ患者の血清からも検出 されたが、コントロールのいずれかの血清からも検出されなかった。コントロー ルは、エイズの臨床的徴候のない、はとんどが危険度の低い個体であった。彼ら は、南部、東部、西部の米国都市及びハイチ出身の男性及び女性の個体；リウマ チ因子陽性人；核抗体（ＡＮＡ）陽性人、経産婦；及び様々な癌患者であった。

エイズ患者は主に同性愛者であったが、数人の婦人及び子供並びに数例の輸血関 連ケースも含まれる。

エイズ患者はコントロールと同様の地理的分布を有していた。

ｐＪＬＡ１６からのプラスミドｐＪＬＢｏ、ｐＪＬＢ１及びｐＪＬＢ２の製造 第１図は、プラスミドｐＪＬＡ１６からのプラスミドｐＪＬＢＯ１ｐＪＬＢ１及 びｐＪＬＢ２の製造法を示す。

プラスミドｐ　Ｊ　ＬＡＩ　６の組立て方は、ローテンベルガーら、ジーン・ア ナリティカル壷テクノロジー、第１巻。

第６３−６６頁、１９８４年に記載されている。プラスミドｐＪＬＡ１６は、バ クテリオフォージλＰＬプロモーター（ＰＬ）、並びにバクテリオファージλＣ ■遺伝子由来のシャインーダルガルノ配列及びリーダーペプチドを有している。

３つの発現プラスミドベクター、ｐＪＬＢＯ５ｐＪＬＢ１及びｐＪＬＢ２を、制 限エントンカーを切断プラスミドに結合させた。このプロセスでは、各々の翻訳 読取り枠におけるＣｎ細菌性リーダーの第２図において、合成オリゴヌクレオチ ドを、これは３種すべての読取り枠中に翻訳ターミネータ−を有しているが、ま ずプラスミドｐＢＲ３２２に組込んでクローニングし、次いでＢａｍＨ１クロー ニング部位の後で３種の発現ベクターに組込んでシャトル化した。得られたプラ スミドをｐＪＬＢＯＴ、ｐＪＬＢＩＴ及びｐＪＬＢ２Ｔと命名した。

転写リプレッサーを除去したプラスミドの製造第３図は、ＤＮＡ合成のブライミ ング（ＰｒｉＩＩｌｒｌｇ　）に必要な転写リプレッサーについてコードするプ ラスミドベクタ一部分の削除法を示す。プラスミドｐＪＬＢＯＴ。

ｐＪＬＢＩＴ及びｐＪＬＢ２Ｔを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕｌＩ及び且」」 工Ｉで消化した。プラント末端を結合し、得られたプラスミドをｐＪ　ＬＢＯＴ Ｒ，ｐ　Ｊ　ＬＢＩＴＲ及びｐＪＬＢ２ＴＲと命名した。

下記プラスミド系ｐＬｃＢｃｏ及びｐＬｃＢｃＯＯをｐＪＬＡ１６の場合と同様 の方法で製造した。これらの製造法は、シマタケ・エッチ（ＳｈＩＩＩａｔａｋ ｅ、　Ｈ，）ら、ネーチャー、第２９２巻、第１２８頁、１９８１年：オッペン ハイム・ニー・ビーら２　ジャーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジー、第 １５８巻、第３２７頁。

１９８２年（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、　Ａ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ 　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１５８　：　３２７　（ｌＨ２ ）　）　；　ｏ−テンベルガー・ジエイ・ニーら、ジーン、第２３巻、第７５頁 。

１９８３年（Ｌａｕｔｅｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｊ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎ ｅ、２３：　７５（１９８３））　；及び、ローテンベルトガ−争ジェイ・ニー ら。

ジーン・アナリティカル・テクノロジー、第１巻、第６３頁、１９８４年に記載 されている。

第４図は、ｐＢＲ３２２からのプラスミドΔｐ　ＢＨ３及びΔｐＢＲ４の製造法 を示す。プラスミドΔｐ　ＢＨ３において、ＤＮＡ合成開始のリプレッサーは、 制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩ及びＢａ１ＩＩでｐＢＲ３２２を消化し、次 いでプラスミドを再結合させることによって除去する。プラスミドΔｐＢＲ４は 、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅｌ及びＢａ１Ｉで切断してｐＢＲ３２２かフレ ノウ断片でプラント末端化した。プラント末端を結合し、得られたプラスミドを ΔｐＢＲ４と命名した。

第５図は、プラスミドΔｐＢＲ４に組込んだλｐＬ断片のサブクローニング方法 及び得られたプラスミド第６図は、λｃＩＩシャインーダルガルノ配列化及びコ ード化配列をｐＬプロモーターの後にサブクローニングしてプラスミドΔｐＢＲ ４−ｐＬ−ｃｌＩを得ることを示す。このプラスミドは、Ｔａｑｌ断片としての 発現系の本質的要素の２工程サブクローニングにおいて使用した。

この構造は第７図に示されている。次いで、得られたプラスミドΔｐＢＲ４−ｐ Ｌ−ｃＩＩ−ＴａｑＩを制限エンドヌクレアーゼＢａｍ及び５ａｌＩで切断した 。消化後、翻訳ポリターミネータ−を第８図に示されているように加えた。得ら れたプラスミドをΔｐＢＲ４ＰＴ−ｐＬ−ＣＩＩ−ＯＳＤと命名した。’Ｏ５Ｄ ”とは“旧シャインーダルガルノ（Ｏｌｄ　Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）　 ”配列を表わす。

’ＯＳ　Ｄ”プラスミドを次いでプラスミドΔｐＢＲＰＴ−ｐＬ−ｃＩＩ−ＮＳ Ｄと同時に修正したが、後者のブラスミドは第９図に示されたようにＯＳＤ”プ ラスミドから製造されたものであって、“新シャインーダルガルノ”配列を有し ている。

“ＯＳＤ”及び“Ｎ５Ｉ）”プラスミドの発現配列をそれぞれ第１０図で示され たようにプラスミドΔｐ　ＢＨ３に組込んでサブクローニングした。得られたプ ラスミド上のＣｌａｌ部位をＢａｍＨ１部位に変換したが、これは発現させるべ き遺伝子断片の挿入用として利用した。

ＢａｍＨ１部位は、製造された３種のベクターの各々において異なる読取り枠中 に存在する。プラスミドｐＬｃＢｃｏ、ｐＬｃＢｃ１、及びｐＩ、ＣＢＣ２は新 シャインーダルガルノ配列を有している。プラスミドｐＬｃＢｃＯＯ１ｐＬｃＢ ｃ１０及びｐＬｃＢｃ２０は上記プラスミドと同様であるが、元来のｃＩＩシャ インーダルガルノ配列を有している。

第１１図において、ＢＩ３又はＢＩ３　（ＨＴＬＶ−ＩＩＩサブクローニング； ラトナーら）をランダムクローニングに供する。この方法では、（１）クローン をΔ±ｕｌ又はＨａ　ｅｍで部分的に切断し、（２）Ｂａｌ工３１エキソヌクレ アーゼ（約１０ｂｐ）を用いる。１ランダム°は大きさのＤＮＡ断片は、読取り 枠に関してランダムに終結していた。

第１３図において、制限部位は、切断部位の３′側に位置する最初のヌクレオチ ドから番号が付されている。

第１８図及び第１９図における＊印は、ＨＴＬＶ−ｍ配列によって完全にコード されている最初のコドンのうち第一塩基を示す。ＨＴＬＶ−ＩＩＩ配列と発現ベ クターの配列との結合によって生じるコドンは、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ自体に存在す るコドンと同一であってもよいし、そうでなくともよい。

第１８図において、クローンＦの配列６ｃｆ８７−７００１は”ｎ“として示さ れている。これらのヌクレオチドは、ＢＨＩＯと比べてＢＩ３では削除されてい る。

この領域におけるＢＩ３の現実の配列はＴＴＧＧＡＣＴＡであり、即ちヌクレオ チド６９８８の次にヌクレオチド７００２が続いている。ｎは、ラトナーらによ り公表された配列と一致する番号付けを保持するために記入されている。

発現用クローンは、ランダムクローニング法及び直接クローニング法を利用して 製造した。

ランダムクローニング法 ランダムクローニング法の場合では、２種のＨＴＬＶ読取り枠に関してランダム 化させた。次いで、これらの断片をプラスミドｐＯＲＦ１　［ウニインストック （Ｗｅｌｎｓｔｏｃｋ　）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンス、第８０巻、第４４３２−４４３６頁、１９８３年〕のΣ エエ１部位に組込んでクローニングした。（ｐＯＲＦｌ及びｐＯＲＦ２は、米国 基準培養寄託機関にそれぞれＡＴＣＣＮ（Ｌ３９１４７及び３９１４５として寄 託されている。）ｐＯＲＦｌは、ＯＭＰプロモーター、リーダーペプチド、ポリ リンカー及びβ−ガラクトシダーゼについてコードするＤＮＡ配列を有している 。ランダムクローニング法に関しては第１１図に示されている。β−ガラクトシ ダーゼに関する読取り枠は、ＯＭＰ−リーダーペプチドのものとは異なっている 。機能的β−ｇａｌ（Ｘ−ｇａｌプレート上に青色コロニーとして示される）は 、開環された読取り枠を有しかつＯＭＰ＋β−ｇａｌ枠を新たに組込んだＤＮＡ 断片がクローニングされた場合にのみ、製造される。このクローンＤＮＡでコー ドされたタンパク質も、ＯＭＰ−β−ｇａｌ三部分融合タンパク質の一部として 発現されさねばならない。

Ｓｍａ１消化ｐＯＲＦ１に組込んでクローニングされるランダム化断片で形質転 換された大腸菌宿主ＭＨ３０００を、Ｘ−ｇａｌプレート上で増殖させた。青色 及び白色のコロニーが出現したが、青色コロニーを選択した。タンパク質抽出物 は、青色コロニーから得た。５つの陽性クローンは、エイズ患者血清のウェスタ ーンプロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）分析によるタンパク質抽出物の評価 後に得られた。ＢａｍＨＩ断片をこれら５つのクローンの各々から単離し、該断 片をｐＪＬＢＯに組込んでクローニングした。このクローンから産生されるタン パク質をエイズ患者血清を用いるウェスターンイムノプロット法により分析した 。

直接クローニング法 直接クローニング法の場合では、更に２種のサブクローンがＢＨ８ヌクレオチド ５９２４−８５９２の五且旦１断片をＰＵＣ１９に組込んでサブクローニングす ることにより製造された〔ヤニツシューペロン（Ｙａｎｌｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ） ら、ジーン、第２６巻、第１０１−１０６頁。

１９８３年（ＰＵＣ１９は米国基準培養寄託機関にＡＴＣＣｋ３７２５４として 寄託されている〕。得られたサブクローンの１つであるＨ３ｅｎｖｌは、ＢＨ８ 第１２図に示されている。

いくつかの制限断片を、ＢａｍＨｌ及び／又はＢａ±■によるＨ３ｅｎｖｌ、） （３ｅｎｖ２及びＢＩ３の消化後に単離した。これらの制限断片は第１３図に示 されている。これらの断片を、適切な読取り枠配列のために適切にｐＪＬＢＯＴ 、ｐＪＬＢＩＴ又はｐＪＬＢ２Ｔに組込んでクローニングした。翻訳は、クロー ンＣ及びＤの場合がＨＴＬＶ終結コドンにより終結し、他のすべてのクローンの 場合はポリターミネータ−の位置で終結した。

タンパク質発現性及び免疫反応性は、ゲル電気泳動及びウェスターンプロット法 によって分析された。

第１表は、ｐＪＬプラスミド系の適切なベクターでＨＴＬＶ−ｍペプチドを発現 させるためにクローニングされたＨＴＬＶ−ＩＩＩヌクレオチド断片を掲載して いる。

発現用クローンから製造されたペプチドを、ヒト患者血清からのＨＴＬＶ−ＩＩ Ｉウィルスの抗体に対する免疫反応性に関してスクリーニングした。エンベロー プ（ｅ　ｎ　ｖ）クローンＡ及びＥから発現したタンパク質との免疫反応性は最 も強い試験血清においてほとんど検出できなかったため、これらのクローンをそ れ以上試験しなかった。

クローンＢ、、Ｃ及びＤは、宿主細胞たる大腸菌に対して極めて高毒性であった 。これらのクローンから発現したＨＴＬＶ−ｍタンパク質は最も強い血清におい てほとんど検出しえなかったため、それらをそれ以上試験しなかった。

第１表は、ヒト患者血清中のＨＴＬＶ〜■ウィルスの抗体に対する免疫反応性に 関する各種クローンから発現されたタンパク質のスクリーニング結果を示す。第 １欄はクローン名を表わし、第２欄は発現されたペプチド断片についてコードす るヌクレオチド配列を表わす。第３欄は、クローン製造のためのクローニング法 及び出発物質を示す。第４欄において、（＋）の記号は発現タンパク質がＨＴＬ Ｖ−ｍ陽性血清パネルに対する免疫反応性に関してスクリーニングされたことを 示し、一方（−）記号の発現タンパク質は、高力価エイズ血清に対する低免疫反 応性のために又は宿主細菌に対する極度の毒性のためにスクリーニングされなか った。最後の欄は、クローンが形質転換宿主細胞に対して毒性があったことを示 し、ここでも、（＋）の記号は宿主細胞に対する毒性があったことを示し、一方 （−）の記号はクローンが宿主細胞に対して毒性がなかったことを示す。

５つの発現用クローン（ｌ土工、ｐｏｌｌ、ｐｏ±２、ヒト血清中におけるＨＴ ＬＶ−ＩＩＩウィルスの抗体に対するそれらの検出能に関して試験した。これら のクローンは第１表に示されており、実験結果は第２表に掲載されている。被験 血清には、エイズＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスに対して陽性の血清（＋）及びエイ ズＨＴＬＶ−Ｉ［［ウィルスに対して陰性の血清（−）の双方があった。すべて の血清をラジオイムノ沈降に基づき特徴付けた。クローンはウェスターンプロッ ト法により分析した。エイズＨＴＬＶ−ｍ抗体を含まない血清はいずれもクロー ンと反応しなかった。しかしながら、エイズＨＴＬＶ−ｍ抗体に対して陽性のす べての血清はエンベロープ（ｅ　ｎ　ｖ）Ｇクローンと反応した。

第２表 ＨＴＬＶ−ＩＩＩクローンの評価 ｑａｑ　５８＋　３３＋、２５− ｐｏｌｌ　１７＋　１４＋、　３− ｅｎｖＦ　５８＋　３７＋、３１− ヒト血清中におけるＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスの抗体に対するそれらの検出能に 関して試験した。評価された発現用クローンは第１欄に示されているが、これは 第１表の第１欄及び第２欄で既に記載されたものである。

第２欄において、（＋）の記号が後に付された第一の数値は、ＨＴＬＶ−Ｈの抗 体に関して陽性であることが既知の被検患者血清数である。（−）の記号が後に 付された第二の数値は、陰性であることが既知の、即ちＨＴＬＶ−ｍに対する抗 体を含有していなかった被験血清数である。

第３欄は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩの抗体を検出する場合におけるペプチドの特異性及 び感受性の双方を示す。最良の結果は、クローンｅｎｖＧの場合に示され、この 場合において９１例すべての被験陽性血清は真に陽性の結果を示し、８７例すべ ての被験陰性血清は真に陰性の結果を示１７例の被験陽性血清の中で、真の陽性 結果は１４の試験例で得られ、一方偽陰性結果は３つの試験例で得られた。陰性 血清はいずれも真の陰性結果を与えた。第１のクローンのｇａｇにおいて、５８ 例の被験陽性血清中で真の陽性結果は３３の試験例で得られ、一方偽陰性結果は ２５の試験例で得られた。陰性血清はいずれも真の陰性結果を与えた。第４のク ローンのｅｎｖＦも同様の結果を与えた。

例６ クローンＧの発現レベルを高めるために、以下の２つの異なるアプローチを採択 した：ｉ）クローンＧタンパク質の２つの疎水性領域についてコードするＤＮＡ を削除する；Ｎ）高レベルで発現させる別のＨＴＬＶ−ＩＩＩ配列にクローンＧ 配列を融合させる。

’；ｙｏ−ンＧはＨＴＬＶ−ｍヌクレオチド７１９９−８０５２を有する。２つ の疎水性領域は、はぼ７３５０−７４１８　（５’　）及び７８５１−７９１６ 　（３”）でアーゼでヌクレオチド約２００個を除去することによって削除した 。ＢａｍＨ１リンカ−を加え、プラスミドをＤＮＡリガーゼで再環化させた。ク ローンを選択し、Ｇ−８、Ｇ−１２、Ｇ−２９、Ｇ−４４、Ｇ−４２、Ｇ−４６ 、Ｇ−５６、Ｇ−７１、Ｇ−７９、Ｇ−８２及びＧ−８４と命名した。新しい３ ′末端部位は地図化されたが、７５００−７９００の間に位置していた。これら のクローン由来のＨＴＬＶ−ｍ配列を発現ベクターｐＪＬＢ２Ｔに組込んでサブ クローニングし、発現レベルを測定した。

５′疎水性領域は、オリゴヌクレオチド５’　−ＴＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＣ ＣＴＡＴＴＣＣＣＡＣ−３’を用いたＭ−１３部位の突然変異誘発によって削除 した。

このオリゴはヌクレオチド７３Ｂ’８−７３４９及び７４１９−７４３０と相捕 的であって、コドン２３個の削除に繋がる。削除されたＤＮＡ配列はｂｌ）７３ ５０−７４１８である。適切に組立てられたクローン（ΔＧ）であるか否かはハ イブリッド形成及びＤＮＡ配列決定によって確認し、発現レベルを測定した。

二重削除体はＧ−８及びＧ−７１の間からも製造した。

Ｇ−８及びＧ−７１は、３′末端部位（７８４０±２０及び７８１０±２０）が ３′疎水性ドメインの開始部の近くに位置していることから選択された。これら の二重削除体をΔＧ−８及びΔＧ−７１と命名し、それらの発現レベルを測定し た。

Ａｈａ延長体の二重削除体を製造し、発現性を分析した（ΔＧ−７１Ａ及びΔＧ −８Ａ）。クローンΔＧ−７１Ａでコードされたアミノ酸配列が決定され、第２ １図に示されている。クローンΔＧ−７１Ａでコードされた現実のアミノ酸配列 は、約ｂｐ６８２７−６９３６．６９５２−７３４９．７４１９−７８０２であ って、ｂｐ６９３７−６９５１及び７３５０−７４１８の領域が除かれている。

アミノ酸ペプチド配列は下記のとおりである： ＾＾Ａ　ＣＡＧ　＾ＴＡ Ｌｙｓ　（ｉｎｎ　！ｌｅ Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　 Ｌ鐙ｕＴｒｐ　６ｒｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｔｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｌ″ｌ 　Ｊｌ曾　ＴｒｐＴＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＣＡＴ　＾ＡＡ　ＴＧＧ　ＧＣＡＬ ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　ＡｌａΔＧ−７１Ａ及びΔＧ −８Ａをｅｎｖ−ｐｏｌ及び５７−２と融合させた。全構造体からのＨＴＬＶ− ｍＤＮＡ断片をｐＪＬ発現ベクター系のプラスミドに組込んでサブクローニング した。大腸菌宿主ＭＺＩを用いてペプチド断片を発現させた。次いでΔＧ−７１ ＡのＨＴＬＶ−ＩＩＩ配列をクローニングし、３種の発現ベクターｐＪＬＢＯＴ 、ｐＬｃＢｃＯ及びｐＬｃＢｃＯＯにおいて発現させた。これらのクローンをｐ −ΔＧ７１Ａ８、ｐ−ΔＧ７１ＡＣＮ及びｐ−ΔＧ７１ＡＣと命名した。

３種すべてのクローンは、ΔＧ−７１Ａに関して第３表に示された発現量と同レ ベルで同一のタンパク質を製造した。ｐ−ΔＧ７１ＡＣは、細菌宿主ＭＺＩに組 込んでＡＴＣＣに寄託されている。

製造されかつ分析されたすべての構造体は第１４図に示されている。相対的発現 量は第３表に示されている。

最大の発現量は、クローンΔＧ−８、ΔＧ−７１、ΔＧ−８Ａ及びΔＧ−７１Ａ で確認された。

要約すると、１個の削除又はＡｈａ延長ではいずれも発現レベルを有意に高める ことはなかった。しかしながら、二重削除体（ΔＧ−７１及びΔＧ−８）及びこ れらしつるほどタンパク質レベルを高めたにすぎなかった。

第３表 評価された発現量 （総細菌タンパク ク　ロ　−　ン　質中の％） Ｇ、Ｇ−８、Ｇ−１２、Ｇ−２９＜０．０２％Ｇ−４４、Ｇ−４２、Ｇ−４６、 Ｇ−５６、Ｇ−７１、Ｇ−７９、 Ｇ−８２、Ｇ−８４、ΔＧ、ＧＡ、ΔＧ−ＡΔＧ−８、ΔＧ−７１　’５−１０ ％ ΔＧ−ＢＡ、ΔＧ−７１Ａ ΔＧ−７１Ａ：ｐｏｌ　＜Ｑ、００５９６ｐｏｌ：ΔＧ−７１Ａ すべてのクローンの免疫反応性を下記のように試験した。

細菌培養物をＡ３５ｏ−０，４となるまでＬブロス中３２℃で増殖させた。次い で培養物を４２℃で１時間増殖させた。Ａ３５０の値を読み、細菌を遠心分離に より回収した。ＳＤＳゲル含有緩衝液を加え（Ａ５５ｏ−０，５の時点で１．５ ｍｌにつき０．１ｍ１）、サンプルを沸騰水浴中に５分間おいた。タンパク質を ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース上にプ ロットし、エイズ患者の高力価血清、または、スクリーニング目的のためにラジ オイムノ沈降法によってＨＴＬＶ−ｍ抗体に関してそれぞれ別個に分析した血清 と反応させることにより分析した。

細菌中で所望のタンパク質を高レベル発現させた場合、不溶性封入体又は凝集物 が形成されることが典型的である。発現された組換えタンパク質を精製するため には、これらタンパク質の溶解度が高められねばならない。

ＨＴＬＶ−ＩＩＩ発現発現用クローンへＧ７１Ａ８又はｐ−ΔＧ７１ＡＣからの 組換えタンパク質ΔＧ−７１Ａを溶解させ、下記のように精製した。

大腸菌ΔＧ７１Ａの培養物をＡ５．。−０，５となるまでＬＢブロス中３２℃増 殖させた。ＨＴＬＶ−ｍ抗原の発現は培養温度を４２℃に富めて誘導し、４２℃ で９０分間インキュベートした。細胞を４０００ｘｇで３０分間の遠心分離によ り回収し、ＴＢＳで一度洗浄し、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５０ｍＭ　ＤＴＴ、０．２ ％トリトンＸ−１００及び１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するｐＨ８，５の５０ｍＭ トリスＨＣＩに再懸濁した。次いで細胞をリゾチームでの酵素的消化及び簡単な 超音波処理によって溶解させた。発現した抗原は不溶性凝集物とじて存在し、５ ０００Ｘｇで３０分間の遠心分離によって回収することができた。これらの凝集 物を弱い洗剤及び６Ｍ尿素で数回洗浄した。タンパク質凝集物を１％β−メルカ プトエタノールを含有する１：＋Ｈ８，５の５０ｍＭ）リスＨＣＩ中に８Ｍ尿素 で溶解させた。遊離スルフヒドリル基を室温において１０倍過剰のヨード酢酸で アルキル化した。アルキル化抗原の部分的精製は、８Ｍ尿素の存在下で操作され るセファロース６Ｂ−ＣＬカラムでのゲル濾過によって実施した。

次いで、部分的精製抗原を８Ｍ尿素を含有するｐＨ８，５のホウ酸緩衝液中にお いてシトラコニル化させた。

これは、室温で９０分間５０倍モル過剰のシトラコン酸無水物で抗原調製物を処 理することによって実施した。

シトラコニル化サンプルをｐＨ８，５のＯ，ＩＭ；ｈつ酸緩液液に対して大量に 透析し、抗原を同一の緩衝液で平衡化しかつ溶離したフラクトゲル（Ｐｒａｃｔ ｏｇｅｌ　）カラムでのゲル濾過によって更に精製した。

シトラコニル化抗原は、分子量３５，０００のタンパク質標準の溶出位置に相当 する位置でカラムから溶出したが、このことは抗原が可溶性−量体分子としてこ の緩衝液系中に存在していることを示していた。他のタンパク質汚染物質を含有 しない画分をプールし、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ用に使用した。

シトラコニル化抗原は微量滴定プレート上に吸着させることができたが、固定さ れた抗原はアミノ基の脱保護化後においてＨＴＬＶ−ｍ抗体に対する免疫反応性 を保持していた。

固定された抗原のシトラコニル化アミノ基は、各ウェル中への０．ＩＮ酢酸の添 加によって加水分解することができた。酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ） では、同一のアッセイ条件下で脱保護化タンパク質に関して得られるより高い吸 光度から判断すると、脱保護化分子の免疫反応性が保護化（シトラコニル化）分 子の場合よりも著しく高いことを示した。

組換えタンパク質以外にＥＬＩ　ＳＡ法の開発で用いられたすべての物質は、オ ルト・ダイアグノスティクス・システムズ社（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、　）から入手した。精製されたΔＧ−７１Ａ をｐＨ８，５の０．０５ＭトリスＨＣＩ中２Ｍグアニジン塩酸の存在下で最終タ ンパク質濃度３．０μｇ　／　ｍｌに調整した。この抗原溶液の一部（０，１ｍ １）を４℃で１６時間かけてイムロンＩＩ　（Ｉｍｍｕｌｏｎ　ＩＩ）微量滴定 ウェルに結合させた。

残ったタンパク質溶液をすて、ウェルを２Ｍグアニジン塩酸で洗浄し、非特異的 結合部位を３７℃で２時間１０９６　Ｂ　Ｓ　Ａ　０　、　１　ｍｌに接触させ てブロックした。血清を除去し、ウェルを０．０５％ツイーン２０　（Ｔｖｅｅ ｎ　２０）含有ＰＢＳで５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ） と結合したマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧを加え、３７℃で１時間かけて結 合させた。二次抗体を除去し、ウェルを洗浄し、０−フ二二レンジアミン塩酸（ ＯＰ　Ｄ）含有基質溶液を加え、結合ＨＲＰと１５〜３０分間反応させた。反応 を４Ｎ　Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させ、Ａ４゜０の値をダイナチック（Ｄｙ ｎａ−１ｅｃｈ）微量滴定プレートリーダー（ｒｅａｄｅｒ）で読取った。

第４表は、上記方法により得られたＥＬＩＳＡ結果をまとめたものである。そこ では、エイズ及びコントロールのＥＬＩ　ＳＡ吸光度値が重複せずかつ試験再現 性が許容されうるちのであることを示している。カットオフ値を０．３とした場 合、このサンプル群では偽陽性又は偽陰性がなかったであろう。

精製された組換えタンパク質ΔＧ−７１Ａ及び上記操作を利用して抗ＨＴＬＶ− ＩＩＩサンプルも同様に試験したが、米国病理学大学（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐａｔｈｏｌｏｇ−１ＳｔＳ）の基準（セットＷＭ−Ｂ）に 従った。非感染者の血清で希釈されたＨＴＬＶ−ＩＩＩ感染者のサンプルが３例 あった。これら３つのサンプルは、３回の別々のケースにおいて０．７０．０． ６０及び０．９４以上のＯＤ値を与えた。２例の陰性サンプルでは０．０４及び ０．０６であった。このように、組換えタンパク質ＥＬＩＳＡでは陽性サンプル を容易に確認することができた。

＊ヒト血清はコンサルタントから入手し、ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶｇｐ１６０／１ ２０抗体に関する基準に基づき〔エル・ダブりニー・キッチンら、ネーチャー、 第３１２巻、第３６７−３６９頁、１９８４年〕、及び例９で述べたＥＬＩＳＡ 試験によってΔＧ７１Ａとの反応性に関して試験した。アッセイ結果が得られた 後、その基準は破られた。

上記方法で更に血清を試験したところ、数例のコントロールサンプルでは非常に 高いＡ４゜。読取り値（例えば０．６０）を示した。これらのサンプルは、ラジ オイムノ沈降またはウィルスを用いたウェスターン・プロットによると１（ＴＬ Ｖ−１１１ＬＡＶ抗体を示さず、しかも低リスクの個体から得られたものであっ た。したがうて、改良法が開発された。

ｐＨ８，０の６Ｍグアニジン塩酸、５０　ｍ　Ｍ　）リス中の精製ΔＧ−７１Ａ をｐＨ８，０の２Ｍグアニジン塩酸、５０　ｍ　Ｍ　）リスで３μｇ／ｍｌに希 釈し、１００μＮをポリスチレンウェル〔例えば、イムロン■ウェル（グイナテ ック）〕に加えた。抗原を４〜３７℃で３０分間〜８週間（通常１８時間）かけ て吸着させた。抗原溶液をウェルから除去し、ｐＨ７，３の１０ｍＭリン酸緩衝 液（ＰＢＳ）及び４〜１０％正常ヤギ血清（ＮＲＧ）（好ましくはう９６）中の ０．１５Ｍ　ＮａＣ１１００ｕ（１／ウエルを加えた。次いでウェルを３０〜３ ９℃で３０分間〜５時間、好ましくは２時間インキュベートした。

ＰＢＳ及びＮＲＧ溶液を除去し、ｐＨ８，０の１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ） リス中の０．５〜１．５ＭＮａＣ１１００μｍ／ウェルを加えた。血清５μｇを 加え、１８〜３９℃（好ましくは３７℃）で１５分間〜３時間（好ましくは１時 間）インキュベートした。ウェルを吸引して液体除去し、脱イオン水中の０，０ ５％ツイーン２０で４〜５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（オルト） で複合化されたマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ　１００μｇを各ウェルに加 え、２０〜３９℃で１５分間〜１時間インキュベートした。ウェルを空にし、脱 イオン水中の０．０５％ツイーン２０で４〜５回洗浄した。クエン酸リン酸緩衝 液中の０−フェニレンジアミン・２ＨＣ１基質（オルト）（１００μｇ）を加え 、２０〜２２℃で３０分間反応させた。硫＊（４Ｎ溶液２５μｇ）を加え、Ａ４ ９０値をグイナテツク微量滴定プレートリーダーで読んだ。

コントロール２２３例及びエイズサンプル１２０例の結果は第２０図に示されて いる。最大のコントロール値は０．２５で、最低のエイズサンプル値は０．４９ であった。したがって、コントロール及びエイズサンプル間に重複はなかった。

例９で用いられたすべての血清はこのセットに含まれている。コントロール群の 平均標準偏差は０．０５±０，０５であった。コントロール群には、市販ウィル ス抗原ＥＬ　Ｉ　ＳＡで偽陽性のサンプルが含まれていた。更に重要なことには 、ウィルスとのラジオイムノ沈降及びウェスターン・プロットでＨＴＬＶ−ｍ／ ＬＡＶ抗体陽性であると確認された少なくとも１０例のエイズサンプルがあり、 これらはウィルスＥＬ　Ｉ　ＳＡによると陰性であったにもかかわらず（サンプ ル５例はＯＤが０．０５未満で、１０例すべてのサンプルは０．１５未満であっ た）、組換えＥＬ　Ｉ　ＳＡでは陽性であった（１０例すべてのサンプルは０． ４９以上の吸光度であった）。

皿１旦 シトラコニル仕組換えタンパク質による微量滴定プレートのコーティング及び脱 ブロッキング後におけるＥＬ　Ｉ　ＳＡでの利用 Ｓ−アルキル化又は遊離メルカブトシトラコニル仕組換えＨＴＬＶ−Ｉ［［抗原 （ｐＨ９，０の２５〜５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液中１０μｇタンパク質／ 　ｍｌで５０Ｍｇ）をポリスチレン微量滴定プレートの各ウェルに加え、次いで 等容量のｐＨ５，５〜５．６の０．１５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液を加えた。

プレートは、アミノ基からシトラコニル基を完全に加水分解させるために、十分 に長い時間をかけてインキュベートした（３７℃で１６時間又は２５℃で２４時 間、遊離アミノ基に関する標準ＴＮＢＳ試験によって決定される）。反応混合物 を吸引除去後、吸着された組換えタンパク質及びポリスチレン表面自体の非特異 的結合部位は、０．０６％ツイーン２０洗剤含有のｐＨ７，６のＰＢＳ中１％（ ｗ／ｖ）純粋牛血清アルブミン溶液で各ウェルをインキュベートすることにより ブロックした。溶液を吸引除去し、ウェルを風乾した。

ｐＨ７，６のＰＢＳ緩衝液で適当に希釈された患者血清の一部をウェルに加え、 ３７℃で１時間インキュベートした。過剰の液体を吸引除去し、菌体をｐＨ７， ６のＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化 抗ヒトＩｇＧを加えた。プレートをインキュベートシ、洗浄し、ペルオキシダー ゼ、発色原及び０−フェニレンジアミン塩酸を加えた。５５０ｎｍの吸光度を微 量滴定プレート分光測定器（グイナテックＭＲ６００）測定した。結果（第５表 ）は、すべてのＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ陽性サンプル（エル・ダブル・キッチンら。

ネーチャー、第３１２巻、第１６６頁、１９８４年に従いイムノプロット及びラ ジオイムノ沈降アッセイによって確認された）が０，４１以上のＥＬＩ　ＳＡ吸 光度であるが、６例を除くすべてのサンプルが１．００以上であることを示した 。すべてのＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉ陰性サンプル、即ちバックグランド吸光度は読取り 値が０．２４未満であった。したがって、カットオフＥＬ　Ｉ　ＳＡ読取り値を ０．３０と設定した場合には、脱シトラコニル仕組換えＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ抗 原によるＥＬＩＳＡ試験は１００％正確であった。

組換えＨＴＬＶ−ＩＩＩタンパク質抗原の脱シトラコニル化がイムノアッセイで それらを利用する前でなければならぬという必要性は、第２１図で証明される。

シトラコニル仕組換えＨＴＬＶ−ｍタンパク質抗原の脱ブロッキングは、その免 疫反応性の十分な発現のために必要であったが、しかしながら、シトラコニル化 タンパク質であってもＥＬＩ　ＳＡ試験において若干活性を有することは明らか である。

第５表 患者血清　コントロール血清 サンプル　ＥＬＩＳＡ　サンプル　ＥＬＩＳＡ読取り値　読取り値 ＣＤＣ−１２，１０ＣＤＣ−３００，１９ＣＤＣ−５２，１０ＷＭ−７０，１２ ＣＤＣ−６１，９２ＷＭ−９０，１１ ＣＤＣ−８２，１０Ｂ２Ｏ２０，１３ ＣＤＣ−９１，９８Ｂ２Ｏ２０，２２ ＣＤＣ−１１２，１０Ｆ７６８　０．２１ＣＤＣ−１３２，１０５Ｋ２−１３　 ０．０７ＣＤＣ−１８２，０１ＵＳＡ−１２０，０８ＣＤＣ−２０２，１０００ ８７０，２３ＷＭ−６１，００Ａ３４８　０．１８ ＷＭ−１００，６６５Ｋ４−ＮＲＰ　Ｏ，１９Ｐ−７２，１０７６０ＣＯ，２４ Ｐ−８２，１０ＮＩ　Ｏ，０４ Ｐ−９２，１０Ｎ３　０．１０ Ｐ−１０２，１０Ｎｌｌ　Ｏ，０７ ８に２−１５　１．８６　Ｎ１５　０．０２５に２−１１　２．１０　Ｎ７３　 ０．１６ＳＫ２−１２　２．１０　Ｎ７５　０．２９ＳＫ２−１７　０．６５　 Ｎ８２　０．０７ＳＫ３−２　０．７５　Ｎ８９　０．０２３に３−４　２．１ ０　Ｎ１２６　０．２４ＳＫ３−５　０．４１　ＰＬ−４０，００ＳＫ３−９　 １．２７　０ＲＮＥＧ　Ｏ，０１ＳＫ３−１０　２．１０　７５−４０８０−０ 　０．１３５に４−１４　２．１０　ＨＮ−１４４０，０４ＳＦ−６１，９７２ ７−０１１２−５０，０６ＵＳＡ−４２，１０２４−２１７０９０，０９ＵＳＡ −１１２，１０７５−１９０５−１０，０５８−０７０７−３２，０３５４−２ ３３３−００，０３１０１−５４５１６１，４６ＨＲ−２０１０，００１０７− ２１６０３１，５８５８−０８９１−００，０６０００２０，７３ＨＲ−４１６ ０，１０００５７０，８５ＨＲ−４７３０，０９０１８９２，１０１７−１１４ ８−００，２３ＲＣ１，７０２−１３６２−９０，０３ＤＲＰＯ３１，００ シトラコニル化組換えＨＴＬＶ−ｍペプチド抗原を、ｐＨ９，０の重炭酸ナトリ ウム緩衝液中のラテックスビーズ（直径０．６μのビーズの２，５％懸濁液）に 、２５℃で一定に静かに攪拌しながら１６時間インキュベートすることにより物 理的に吸着させた。次いでシトラ　−コニル基を、ｐＨ４，０の０．　１Ｍ酢酸 ナトリウム緩衝液による２５℃で１６時間の吸着タンパク質の処理によって除去 した。

抗原被覆ラテックスビーズを低速での簡単な遠心分離によって回収し、次いで非 特異的結合部位をブロックするためにｐＨ７，６のＰＢＳ緩衝液中の１％牛血清 アルブミン−０，０６％ツイーン２０に再懸濁した。再懸濁されたビーズの最終 濃度は０．６％であった。被覆ビーズを４℃で保存した。

抗体に関する試験は、ガラス製スライド上で患者血清２５μｇと被覆ラテックス ビーズ１５μｇとを混合し、しかる後２５℃１１００ｒｐで８分間スライドを回 転することによって実施した。

抗原に対する抗体について陽性の結果は被覆ラテックスビーズの凝集によって表 わされるが、この凝集は肉眼で見ることができた。又は、低倍率の顕微鏡が用い られた。

かかる５０例の試験結果は第６表に示されている。

ＥＬＩＳＡ試験で陽性であった２４例の血清のうち２２例は、ラテックスビーズ 凝集（ＬＢＡ）試験でも陽性であった。残り２例のサンプルの再試験は、血清が 未希釈の状態で用いられた場合に陽性であった。ＥＬＩ　ＳＡ試験で陰性の２４ 例すべての血清はＬＢＡ試験でも陰性であった。これらの結果は、血清の１：１ ０希釈時にはＬＢＡ試験が９２％の精度かつ１００％の特異性であり、一方血清 の未希釈時には精度及び特異性がいずれも１００％であってＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験 に匹敵することを示している。

本開示は本発明に関するすべての必須情報を含んでいるが、本明細書で引用され た多数の文献は発明の背景及び技術状況を理解する上で助けになるであろう。し たがって、引用されたすべての文献は参考のため発明の開示中に組込まれる。し かも前述の発明は、明確化及び理解の目的で図解及び例により更に詳細に記載さ れている。

ある種の変更及び修正が添付された請求の範囲のみによって制限されるけれども 発明の範囲内で行ないうることは、明らかであろう。

第６表 ヒト血清中のＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ抗体に関するラテックスビーズ凝集試験８ 患者血清　コントロール血清 Ａ２０８００４　２＋　２６　ＮＲ Ａ２０８０６　４＋　２７　ＮＲ ６２７２４１１４＋　２８　ＮＲ ６２７２１０３＋　２９　ＮＲ Ａ２０６１１０　３＋　３０　ＮＲ ６１０２００８３＋　３１　ＮＲ ６１６１０３３＋　３２　ＮＲ ００３４＋　３３　ＮＲ ０１４２＋　３４　ＮＲ ０１７１＋　３５　ＮＲ 陽性コントロール　３＋　３６　ＮＲ ＲＣ４＋　３７　ＮＲ Ｐ５　２＋　３８　ＮＲ Ｐ７　Ｂ＋　３９　ＮＲ Ｐ８　Ｂ＋　４０　ＮＲ Ｐ９　４＋　４１　ＮＲ ＰＩＯ４＋　４２　ＮＲ ６２７Ｂ　２＋　４３　ＮＲ ６３１６３＋　４４　ＮＲ ６２７２Ｂ＋　４５　ＮＲ ６３１０３＋　４６　ＮＲ ＳＫ２−１４　３＋　４８　ＮＲ ＳＫ２−１７　ＷＲ４８ＮＲ ＳＫ２−２１　ＷＲ４９ＮＲ ５０ＮＲ ＊１：１０希釈血清　ＮＲ：反応せず ＋肉眼による主観点評価　ＷＲ：未希釈時に弱い反応（抄　訳） 原明細書第９頁、第１６−１８行、 アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション１２３０１、パークローン、 ドライブ、ロックヴイル、メラリーンド、２０８５２、アメリカ合衆国、寄託臼 ：１９８６年１月３０日 受託番号：５３４５５ 微生物の表示：大腸菌　ｐΔＧ７１ＡＣ浄書（内容に変更なし） Ｅｃ。

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（Ｆ’Ｄ容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容瘉こ変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なＬ） 浄書（内容に変更なし） ７；７１ククー二二グｉ去 −−／：”ＩＧ、／／ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、／２ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ３８６０　ＴＡＡＴｒＧＧＡＧＡ　ＧＣＡＡ丁ＧＧＣＴＡ　ＧＴＧＡＴｒＴＴ＾ −２Ｄ−ンＰｏ＋−１ 、ＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴ　ＧＴＡＧＴＡＧＣＭ　ＡＡシ）書（ν祥・ ＢＨ５−ＰＯＬｔｒＪＪｅｓ ＦＩＧ、１ （−ニジ：更゛ヱし） 二列 ＣＡＧＡＣＭＴＧＧ　ＣＡＧＣＡＡｍＣＡＣＣＡＧＴＧＣＴＡ［７ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） ＡＴｒ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＴｒＡ　ＧＧＡ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＣＣＣＡＣＣＡＡ Ｇ　ＧＣＡ　ＡＡＧｌｌｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｏｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｌａ 　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＬｙｓＨＩＶ西て こ 手続補正書 昭和６３年９月３０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに対する抗体に対し免疫反応性であって、ヌクレ オチド６５３−１２１８、２６００−３９１１、２７４３−４２１１、６６１９ −７１９８及び７１９９−８０５２から選択されるＨＴＬＶ−ＩＩＩプロウイル スヌクレオチド配列によりコードされているペプチド断片。 ２．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに対する抗体に対し免疫反応性であってかつ少な くとも約７１９９−約７８１０に位置するＨＴＬＶ−ＩＩＩプロウイルスのヌク レオチド配列によりコードされており、疎水性領域７３５０−７４１８及び７８ ５１−７９１６を含まず、しかもアミノ末端より上流で約ヌクレオチド６８２７ までのセグメントを含むペプチド断片。 ３．ヌクレオチド配列が７１９９−８０５２である、請求の範囲第１項記載の断 片。 ４．疎水性領域７３５０−７４１８及び７８５１−７９１６が削除された、請求 の範囲第３項記載の断片。 ５．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに対する抗体に対し免疫反応性であって、６９３ ７−６９５１及び７３５０−７４１８を除く約６８２７−６９３６、６９５２− ７３４９、７４１９−７８０２からのＨＴＬＶ−ＩＩＩプロウイルスのヌクレオ チド配列によりコードされているべプチド断片。 ６．下記のペプチド配列： 【配列があります】７．免疫原として請求の範囲第１、２、３、４、５又は６項 のいずれかに記載のペプチド断片を用いることにより誘導可能な抗体。 ８．請求の範囲第１、２、３、４、５又は６項のいずれかに記載のペプチド断片 を、ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに対する抗体含有の可能性があるサンプルと接触 させ、かつ上記抗体の存在を検出することからなる、ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス に対する抗体の検出方法。 ９．ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス又はその一部を含有している可能性があるサンプ ルを請求の範囲第７項記載の抗体と接触させ、かつ上記ウイルスの存在を検出す ることからなる、ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス又はその一部の検出方法。 １０．請求の範囲第１、２、３、４、５又は６項のいずれかに記載のペプチド断 片についてコードするポリペプチド配列を含有した発現ビヒクル。 １１．請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載されたペプチド断片について コードするポリヌクレオチド配列を含有した、第２図に記載されたプラスミドｐ ＪＬＢＯＴ、ｐＪＬＢｌＴ及びｐＪＬＢ２Ｔ。 １２．請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載されたペプチド断片について コードするポリヌクレオチド配列を含有した、第３図に記載されたプラスミドｐ ＪＬＢＯＴＲ、ｐＪＬＢｌＴＲ及びｐＪＬＢ２ＴＲ。 １３．請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載されたペプチド断片について コードするポリヌクレオチド配列を含有した、第１０図に記載されたプラスミド ｐＬＣＢＣ０、ｐＬＣＢＣ１、ｐＬＣＢＣ２、ｐＬＣＢＣ００、ｐＬＣＢＣ１０ 、ｐＬＣＢＣ２０。 １４．請求の範囲第１０項記載の発現ビヒクルで形質転換された宿主細胞。 １５．ペプチド断片についてコードするポリヌクレオチド配列を含有した発現ビ ヒクルで宿主細胞を形質転換し、上記形質転換宿主を培養し、かつ上記ペプチド 断片を発現させることからなる、請求の範囲第１、２、３、４、５又は６項のい ずれかに記載されたペプチド断片の発現方法。 １６．請求の範囲第１、２、３、４、５又は６項のいずれかに記載されたペプチ ド断片の有効量を動物に投与することからなる、ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに対 するワクチン。 １７．１以上の容器手段（該容器手段のうち少なくとも１個は、請求の範囲第１ 、２、３、４、５又は６項のいずれかに記載された固定ペプチド断片を含有して いる）を収納するように仕切られた運搬手段からなる、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体検 出用キット。 １８．１以上の容器手段（該１以上の容器手段のうち少なくとも１個は請求の範 囲第７項の抗体を含有している）を収納するように仕切られた運搬手段からなる 、ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルス又はその一部検出用のキット。