CN107636143A - 用于细胞培养的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于将无菌材料从存储容器转移至生物反应器的方法和系统。更确切地说,本发明涉及一种用于将用于细胞培养的干燥材料(诸如微载体)无菌地转移至生物反应器的方法和系统,其包括通过使容纳微载体的第一容器连接至用于细胞培养的生物反应器的转移管将所述微载体从所述第一容器转移至所述生物反应器,其中,用供应至容器的加压空气或气体完成转移。
Description
技术领域
本发明涉及用于将无菌材料从存储容器转移到生物反应器的方法和系统。更确切地说,本发明涉及用于将用于细胞培养的干燥材料(诸如微载体)无菌地转移至生物反应器的方法和系统,其包括通过使容纳干燥材料的第一容器连接至用于细胞培养的生物反应器的转移管将干燥材料从第一容器转移至生物反应器,其中用供应至容器的加压空气或气体完成转移。
背景技术
细胞培养技术对于研究动物细胞结构、功能和变异以及对于生产许多重要的生物学材料(诸如病毒疫苗、酶、激素、抗体、干扰素、核酸和用于基因治疗的病毒载体)已经变得至关重要。此外,细胞培养和细胞扩增在细胞治疗中是非常重要的步骤。对于许多细胞培养方法,期望的是将细胞培养从小的细胞群体扩增至大的细胞群体。
对于细胞培养,常规上在细胞粘附表面上生长细胞,因为大多数哺乳动物细胞和某些其它细胞就能够生长而言是锚定依赖性的。由于可用的表面区域小,在组织培养处理过的瓶子或其它小瓶中的常规的细胞培养给出锚定依赖性细胞的有限产量。
微载体培养引入新的可行性并第一次使锚定依赖性细胞的实际高产量成为可能。在微载体培养中,细胞以单层在小球体表面上生长,小球体通常通过温和的搅动悬浮在培养基中。通过在简单的悬浮培养系统中使用微载体,实现每毫升数百万个细胞的产量是可行的且系统是可轻易缩放规模的。
在微载体方法中,通常用自旋瓶中的珠或在柱(灌注培养)中装填的珠进行细胞培养。新近,已在一次性生物反应器(诸如柔性袋)中进行利用微载体的细胞培养。微载体例如是葡聚糖、纤维素或聚乙烯基产品。
为了进行细胞培养,需要具有灭过菌的细胞培养材料,诸如干培养基和微载体。传统的对微载体灭菌的方式是在生物反应器外部通过蒸汽灭菌或在生物反应器内部通过高压灭菌进行。随着单次使用的生物反应器的引入,在生物反应器中通过蒸汽进行灭菌不再可行。因此,必须提供在不损害无菌性的情况下可无菌地被引入生物反应器中的预先灭菌的微载体。
US2014/0196791描述了一种包括微载体容器和生物反应器器皿的单次使用的生物反应器,其中,微载体通过重力或用流体冲洗而被转移到器皿中。以重力的转移将是不完全的,即,一些微载体将粘着到容器壁上从而没有被转移至生物反应器器皿中。为了改善这一点,建议用例如细胞培养基冲洗容器。
尽管本领域中已知许多生物反应器,但是仍需要改进的用于将干燥材料(诸如微载体)无菌地转移至生物反应器的方法和系统。
发明内容
本发明提供一种用于将干燥材料(优选微载体)无菌地转移至生物反应器的方法和系统。系统适用于任何类型或大小的生物反应器且特别适用于大型的、单次使用的生物反应器。
因此,在第一方面,本发明涉及用于将用于细胞培养的干燥材料无菌地转移至生物反应器的方法,其包括通过使容纳干燥材料的第一容器连接至用于细胞培养的生物反应器的转移管将干燥材料从第一容器转移至生物反应器,其中,用通过包括插入到容器中的浸入管的通气管供应至容器的加压空气或气体完成转移。浸入管防止在引入空气或气体流期间干燥材料到处旋转。
在一个实施例中,方法包括通过将一部分的干燥材料从在第二容器中提供的干燥材料供应通过在容器之间的转移管转移至第一容器而从多个容器定量供给干燥材料。用通过包括插入到第二容器中的浸入管的通气管供应至第二容器的加压空气或气体进行转移。此后,现处于第一容器中的所述部分的干燥材料被用加压空气或气体转移至生物反应器。
干燥材料的许多部分但优选其至少两个部分可被单独地从第二容器转移至第一容器,并然后各部分被单独地转移至生物反应器。这样,当需要更多的干燥材料用于细胞培养时,不必将新的容器连接至生物反应器。这将进一步最大程度地减少细胞培养的污染的风险。
在另一实施例中,被转移至第一容器的所述部分的干燥材料在被转移至生物反应器之前在第一容器中被称重。这将保证准确量的干燥材料被转移至生物反应器。取决于生物反应器和容器的大小,各个部分可包括例如1g至10Kg的干燥材料,从而给出非常灵活的剂量范围。
优选地,将容器倒置,然后用加压空气或气体转移干燥材料,其中干燥材料在容器的底部处且浸入管到达干燥材料的高度之上。
干燥材料可例如为微载体、干培养基(诸如干燥过的或粉末化的细胞培养基)或任何其它粉末或盐。
在第二方面,本发明涉及一种转移系统,其包括:一个或多个容纳干燥材料的刚性容器;一个或多个用于将任何干燥材料(诸如微载体)从容器转移至生物反应器或从第二容器转移至第一容器的柔性转移管;一个或多个包括插在容器中的浸入管并连接至加压空气或气体源的柔性通气管。优选地,管设置有阀和将管连接至生物反应器和/或另外的容器的连接器。优选地,通气管设置有无菌的通气过滤器。备选地,使用无菌气体或空气。优选地,容器为瓶形的且设置有上端口盖,管在上端口盖中附连至容器。取决于生物反应器大小和细胞培养的需求,容器或瓶子及其干燥材料容量可具有任何合适的大小。容器大小的示例为100 mL至5 L且生物反应器大小的示例为1 L至10000 L。当在转移系统中使用不止一个容器时,它们可具有相同或不同的大小。
优选地,通过任何类型的灭菌、最优选通过γ射线辐照对转移系统灭菌。
在一个实施例中,连接到生物反应器的容器可被放置在秤上以对被转移至生物反应器的干燥材料的量称重,这将在下面的详细部分中更详细地被描述。
在第三方面,本发明涉及上述转移系统在细胞培养过程中的用途,其中,在该过程中的任何期望的时间将微载体提供给生物反应器。微载体在过程的开始时被提供并之后在过程结束前随时以任何数量被提供。在一个实施例中,转移系统优选在整个过程期间被连接至生物反应器,特别是当在该过程期间需要添加更多的微载体时。
附图说明
图1为本发明的处于准备使用位置的转移系统(即,容器已被倒置以将干燥材料从第一容器转移至生物反应器中)的示意图;
图2为本发明的处于将干燥材料的总量的一部分从第一容器转移至第二容器的位置的转移系统的示意图,其中第二容器被放置于秤上且继续转移直到在第二容器中获得期望重量的干燥材料;并且
图3示出转移系统的一部分,其中图2的第二容器已被倒置且转移系统准备用来将干燥材料从第二容器通过加压空气或气体转移至生物反应器。
具体实施方式
现将结合附图更详细地描述本发明的转移系统和及其使用方法。尽管方法和转移系统适合于转移任何类型的干燥材料,但是下面将结合作为干燥材料的用于细胞培养的微载体描述该详细描述。
本发明涉及用于将干燥材料(诸如微载体)无菌地转移至生物反应器的方法和转移系统。转移系统是与生物反应器分开的单元并可用于任何规模的任何类型的生物反应器。在本发明中使用的微载体在专门设计的容器中保持无菌,使得能够以无菌的方式将微载体珠直接转移到生物反应器中。这将大大改进现行工序,因为其避免了在制药工业中实施的繁琐且耗时的预备性灭菌,其中微载体珠被溶胀、用缓冲液洗涤并高压灭菌,之后被添加到细胞培养器皿(生物反应器)中,并然后用细胞培养基对其洗涤。
参照图1,转移系统包括容纳在容器2中的干的微载体1,容器2优选地成形为具有端口盖7的瓶子,转移管3和通气管4通过该端口盖被连接至容器2。在图1中,容器或瓶子2被示出处于倒置的位置,其中微载体1将定位在最接近盖7的容器的底部处且浸入管5将到达微载体的高度之上以使得加压空气或气体能够流入容器的该空间中,这将有效地通过转移管路3将微载体转移至生物反应器(未示出)或如在图2中示出的那样从另外的容器2A转移至容器2。
图2示出一个优选的实施例,其中干的微载体1A通过将加压空气或气体源连接至通气过滤器6A而从处于倒置的第二容器2A被转移至第一容器2。在该实施例中,并非所有微载体从第二容器2A被同时转移至容器2中。相反,根据细胞培养工序的需求,将微载体1A的单独部分或剂量通过容器2转移至生物反应器。为了确保将正确量的微载体从容器2A转移至容器2并然后转移至生物反应器,容器2被放置在秤8上。这避免了每当需要向生物反应器中的细胞培养添加新的微载体时需要将新的容器2连接到生物反应器。
本发明中使用的微载体1、1A优选为Cytodex TM(GE Healthcare Bio-SciencesAB)的微载体,但可使用任何类型的微载体。
图3示出了将微载体的期望部分从容器2A完全转移至容器2之后的容器2、2A的位置。在该位置中,容器2A已被恢复到其直立位置,而代之以将容器2倒置。当加压空气或气体被供应至容器2时,在容器2中称重的微载体将从容器2被转移到生物反应器(未示出)。该工序(即,根据图2将微载体从容器2A填充到容器2并然后根据图3使微载体转移至生物反应器)可重复任选的次数。
在本发明的方法中,无菌容器2、2A易于使用无菌连接器或焊接连接而通过管连接至生物反应器,以提供用以将微载体珠转移到生物反应器中的连接。在将容器倒置之后,通过使用经由专用端口而被引入容器中的略微过压的无菌空气或氮气来实现转移。
所有用于转移系统的直接与无菌微载体珠接触的材料将符合USP VI级要求(用于塑料的生物测试)。包括微载体珠的本发明的转移系统优选经得住至少40 KGy的最大γ射线辐照剂量。
在本发明中使用的微载体优选地被提供在刚性塑料容器(诸如PET容器)中。各个容器优选配备有适合的3端口盖7和与适合长度的管3、3A(诸如TPE(热塑性弹性体)管)相配的两个转移端口。在一个实施例中,一个转移管可在其剩余端配备有ReadyMateTM无菌连接器(用于ReadyMate无菌连接),而第二个转移管将被双重密封以用于随后的焊接连接。在另一实施例中,两条转移管路都被双重密封。第三端口将配备有与通气过滤器(诸如0.2µm的通气过滤器)相配的通气管4、4A(诸如硅通气管),用以引入用于将微载体转移到生物反应器中的略微压缩的空气或氮气(最大0.5 bar)。
如果在之前的运行之后容器不能完全排空,则两个转移端口3、3A将允许通过例如焊接而与其它生物反应器的同时的多个无菌连接或连续的无菌连接。3端口盖还配备有直接连接到外部通气端口的内部套管。该套管将与聚合物浸入管相配以使略微压缩的空气或氮气到微载体的高度之上(一旦容器倒置),并由此将材料压出容器而没有任何大的湍流(图2-3)。
本发明的容器系统可通过任何连接(诸如ReadyMate)或仅通过焊接无菌连接被容易地连接至生物反应器。将容器倒置后,打开连接并通过引入略微过压的空气或惰性气体来转移微载体(图2)。
如果需要,也可通过焊接实现无菌连接,从而使得容器和生物反应器具有直径匹配的同一种类的管。
如果在一个容器中的微载体的含量不足,那么按照下面描述的工序以无菌的方式将额外的材料转移至生物反应器将是可行的,见图2-3:
- 将排空的第一容器2放在天平上。
- 例如通过焊接,将由微载体供应填充的第二容器2A上的管3A连接到在空的容器2上可用的保留管3(图2)。
- 将第二容器2A倒置和对期望量的微载体进行转移/称重,其中,用通过在新的容器或包裹上的无菌通气管引入的略微过压的空气或氮气将期望量的微载体从容器2A转移至容器2。
- 一旦已对所需量的材料称重,关闭新的容器2A和连接生物反应器的容器2之间的连接,并将容器2倒置。然后使用通过直接连接到生物反应器的容器上的通气管引入的略微过压的空气或惰性气体而将新称重的材料转移到生物反应器中(图3)。
如果焊接是选择的以将微载体容器连接至生物反应器的方法,那么生物反应器应该设置有与微载体容器相同直径的同一种类的管。如果通过ReadyMateTM无菌连接器实现微载体容器和生物反应器之间的连接,那么在生物反应器管上应当存在可用的ReadyMateTM连接器。
转移管和通气管二者都配备有阀,诸如夹管阀,允许在转移操作下选择性地打开/关闭。阀优选由经得住γ射线辐照的材料制成。
本发明的容器系统将在具有受控的生物负载的环境中由微载体(优选CytodexTM微载体)填充。在填充并用端口盖闭合后,容器系统将封闭/密封在双层塑料薄膜保护(二级/三级包装)中并被包装在纸板箱中。纸板箱与其内含物然后被γ射线灭菌且在30℃下其保质期为2年。
Claims (15)
1.一种用于将用于细胞培养的干燥材料无菌地转移至生物反应器的方法,包括通过使容纳干燥材料的第一容器(2)连接至用于细胞培养的生物反应器的转移管(3)将所述干燥材料(1)从所述第一容器(2)转移至所述生物反应器,其中,用通过通气管(4)供应至所述容器(2)的加压空气或气体完成所述转移,所述通气管(4)包括插入到所述容器(2)中的浸入管(5)。
2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括通过在第一和第二容器(2, 2A)之间的转移管(3A),用通过包括插在所述容器(2A)中的浸入管(5A)的通气管(4A)供应至所述容器(2A)的加压空气或气体,使一部分的干燥材料(1)从在第二容器(2A)中提供的干燥材料供应(1A)转移至所述第一容器(2),并然后用加压空气或气体将所述部分的干燥材料从所述第一容器(2)转移至所述生物反应器。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,干燥材料(1)的至少两个部分被单独地从所述第二容器(2A)中的干燥材料供应(1A)转移至所述第一容器(2)并然后各个部分被单独地转移至所述生物反应器。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,被转移至所述第一容器(2)的所述部分的干燥材料在所述第一容器(2)中被称重,然后被转移至所述生物反应器。
5. 根据以上权利要求中的一个或多个所述的方法,其特征在于,包括在用加压空气或气体转移所述干燥材料之前将所述容器(2, 2A)倒置,其中所述干燥材料 在所述容器(2,2A)的底部处且所述浸入管(5, 5A)到达所述干燥材料的高度之上。
6.根据以上权利要求中的一个或多个所述的方法,其特征在于,所述干燥材料选自微载体、干培养基、粉末或盐。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述干燥材料为用于细胞培养的微载体。
8. 一种转移系统,其包括:一个或多个容纳干燥材料(1, 1A)的刚性容器(2, 2A);一个或多个用于将干燥材料从所述容器(2)转移至生物反应器或从第二容器(2A)转移至第一容器(2)的柔性转移管(3, 3A);一个或多个包括插在所述容器(2, 2A)中的浸入管(5, 5A)并被连接到加压空气或气体源的柔性通气管(4, 4A)。
9. 根据权利要求8所述的转移系统,其特征在于,所述容器(2, 2A)为瓶形的并设置有上端口盖(7),所述管(3, 3A, 4, 4A)在所述上端口盖(7)中附连至所述容器。
10.根据权利要求8或9的转移系统,其特征在于,连接至所述生物反应器的所述容器(2)被放置在秤上。
11. 根据权利要求8-10中的一个或多个所述的转移系统,其特征在于,所述管(3, 3A,4, 4A)设置有阀和连接器。
12.根据权利要求8-11中的一个或多个所述的转移系统,其特征在于,所述干燥材料选自微载体、干培养基、粉末或盐。
13.根据权利要求8-12中的一个或多个所述的转移系统,其特征在于,其优选通过γ射线辐照而灭菌。
14.根据权利要求13所述的转移系统,其特征在于,所述干燥材料为用于细胞培养的微载体。
15.根据权利要求14所述的转移系统在细胞培养过程中的用途,其特征在于,在所述过程中在任何期望的时间向所述生物反应器提供微载体。
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