CN208395180U - 预装微载体的一次性摇瓶 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种预装微载体的一次性摇瓶。所述的预装微载体的一次性摇瓶包括摇瓶本体，所述摇瓶本体的开口部盖合有瓶盖，所述摇瓶本体内预装有微载体，以及，在所述瓶盖内还设置有一层以上的滤膜，当所述瓶盖盖合于所述摇瓶本体的开口部时，所述一层以上的滤膜位于所述瓶盖与摇瓶本体的开口部之间。本实用新型提供的一种预装微载体的一次性摇瓶，避免了传统玻璃摇瓶需在使用前的清洗清洁和灭菌工作，提高生产产品的安全性，避免多种产品之间的交叉污染；其可以避免微载体称量、水合、洗涤、灭菌、排缓冲液等步骤，节约了这些步骤相关的时间和成本。

Description

预装微载体的一次性摇瓶

技术领域

本实用新型特别涉及一种预装微载体的一次性摇瓶，属于生物技术领域。

背景技术

生物制药行业得到迅猛发展，微载体细胞培养成为重组蛋白、疫苗、单克隆抗体、干扰素、核酸等的主流生产技术。使用微载体来培养贴壁细胞，可以在有限的体积内实现更大的表面积，并因此获得高细胞浓度。例如，在5L摇瓶(装液量为2L)中使用3g/L的微载体相当于4个细胞工厂。目前，无论科学院校、制药公司、研发机构等使用摇瓶进行微载体细胞培养的前处理过程，一般采用以下四种方案：

第一种方案，称量普通微载体添加至洁净的普通摇瓶中，经水合、洗涤、湿热灭菌、排缓冲液等步骤后完成前处理过程。

第二种方案，称量普通微载体添加至洁净的容器中，经水合、洗涤、湿热灭菌、排缓冲液等步骤后，转移至一次性摇瓶中，完成前处理过程。

第三种方案，洁净的普通玻璃摇瓶湿热灭菌后，一次性微载体添加至普通玻璃摇瓶中，完成前处理过程。

第四种方案，一次性微载体添加至一次性摇瓶，完成前处理过程。

第一种方案和第三种方案，对普通玻璃摇瓶进行清洗清洁以及高压灭菌等操作都需要占据操作人员额外的时间和精力，使他们陷于日常的维护，而无法执行其它更有价值的工作。此外，使用普通玻璃摇瓶进行微载体培养时，需将少量的硅化液(SigmacoteTM、二甲基二氯硅烷、SilicladTM)加入到干净的普通玻璃摇瓶中，润湿所有可能接触到微载体的摇瓶内表面，将多余的硅化液从容器中倒出，然后把摇瓶晾干；容器用蒸馏水或纯化水彻底地冲洗(至少2次)并用高压蒸汽灭菌。

第一种方案和第二种方案，普通微载体重复使用时，需使用强酸和强碱洗涤细胞，去除残留的细胞碎片，因强酸改变微载体基质的性质和取代程度。使用过的微载体可以在收获步骤后用无菌的PBS直接洗涤，然后用于下一级培养，但是对细胞的粘附力较弱而且产量不到新微载体得到的产量的70％。对于所有测试的细胞类型而言，重复使用微载体三次都是不可行的。对于一些细胞株来说，基本上是不能重复使用微载体的。重复使用微载体的清洗过程的成本比使用新微载体的成本还高。

第一种方案、第二种方案和第四种方案，一次性摇瓶和一次性载体使用寿命一般长达2年，大多数品牌没有独立密封包装，使用者开封完一个包装后，剩余的一次性载体和一次性摇瓶不能立马使用，给一次性摇瓶和一次性载体的无菌环境带来一定的风险。

实用新型内容

本实用新型的主要目的在于提供一种预装微载体的一次性摇瓶，以克服现有技术的不足。

为实现前述实用新型目的，本实用新型采用的技术方案包括：

本实用新型实施例提供了一种预装微载体的一次性摇瓶，包括摇瓶本体，所述摇瓶本体的开口部盖合有瓶盖，所述摇瓶本体内预装有微载体，以及，在所述瓶盖内还设置有一层以上的滤膜，当所述瓶盖盖合于所述摇瓶本体的开口部时，所述一层以上的滤膜位于所述瓶盖与摇瓶本体的开口部之间。

进一步的，所述摇瓶本体包括依次连接设置的瓶口、瓶颈、侧壁和瓶底，所述侧壁设置有刻度线，所述侧壁包括沿轴线方向依次连接设置的上侧壁和下侧壁，所述上侧壁的顶部与瓶颈连接，所述下侧壁的底部和瓶底连接；其中所述瓶口的外径大小与瓶颈的高度大小之比为0.5-2:1。

更进一步的，所述瓶颈外侧设置有第一螺纹部，所述第一螺纹部包括一条以上第一螺纹。

进一步的，所述第一螺纹为连续螺纹或间断式螺纹。

更进一步的，在所述瓶颈与侧壁的连接处还凸设有瓶颈唇部。

进一步的，所述上侧壁与摇瓶本体的轴线方向平行。

进一步的，所述下侧壁与摇瓶本体轴线方向呈1-80°的夹角；优选为5-45°角。

进一步的，所述摇瓶本体底部的直径大于上部的直径。

更进一步的，所述下侧壁与瓶底的连接处为连续弧面。

进一步的，所述瓶底的内表面和/或外表面为平面或者由外向内凸出的凸面；优选的，所述瓶底为由外向内凸出设置的内凹式瓶底。

进一步的，所述摇瓶本体由注塑或吹塑的方式一体成型。

进一步的，所述瓶盖与摇瓶本体螺纹连接；所述瓶盖为透气性瓶盖，所述瓶盖包括盖体和设置于盖体一端开口部的瓶盖固定环，所述瓶盖固定环的外环部与盖体连接，所述瓶盖固定环的内环部分别经两条以上的第一支撑条与位于瓶盖固定环开口部中心处的瓶盖固定中心体连接；所述盖体的内侧具有与所述第一螺纹部相匹配的第二螺纹部，所述盖体的外侧设置有防滑螺纹。

进一步的，所述瓶盖固定环的直径与盖体的直径之比为0.1-0.9:1；优选为0.5-0.7:1。

进一步的，所述瓶盖内设置有1-4层滤膜；优选为1-2层。

更进一步的，所述滤膜为疏水透气性滤膜，所述滤膜的孔径为0.1-0.45μm，优选为0.22μm。

进一步的，在所述瓶盖内还设置有至少用于压紧固定所述滤膜的箍体，沿所述箍体的边缘部设置有环状凹槽，所述环状凹槽内设置有密封圈，所述密封圈的厚度略大于环状凹槽的深度。

进一步的，所述箍体包括依次连接设置的固定外环和固定内环，在所述固定内环和固定外环之间形成所述环状凹槽。

更进一步的，在所述固定内环内还设置有两条以上的第二支撑条，所述第二支撑条的一端与固定内环连接，另一端与固定内环中心的箍体固定中心体连接。

进一步的，所述的预装微载体的一次性摇瓶还包括：无菌密封袋，所述预装微载体的一次性摇瓶无菌密封于所述无菌密封袋中。

与现有技术相比，本实用新型的优点包括：

1)本实用新型实施例提供的一种预装微载体的一次性摇瓶，避免了传统玻璃摇瓶需在使用前的清洗清洁和灭菌工作，提高生产产品的安全性，避免多种产品之间的交叉污染；

2)本实用新型实施例提供的一种预装微载体的一次性摇瓶，可以避免微载体称量、水合、洗涤、灭菌、排缓冲液等步骤，节约了这些步骤相关的时间和成本；

3)采用湿热灭菌和伽马射线辐射灭菌，能完全达到无菌效果，避免由于载体和摇瓶灭菌不充分导致染菌；

4)本实用新型实施例提供的一种预装微载体的一次性摇瓶，摇瓶本体内无通气、搅拌装置，大大避免了高剪切力产生，有效保证了平行使用性；

5)本实用新型实施例提供的一种预装微载体的一次性摇瓶适用于所有的标准摇瓶夹具，可直接安装在普通摇床上摇动，使培养基、载体、细胞充分悬浮混合，提供充分的氧气传递；一次性摇瓶的混合方式，避免了高剪切力对细胞的损伤，且无需鼓泡通气，避免了消泡剂的使用；此外，流体运动性良好，具有很高的平行性，该摇瓶特别适用于细胞株的筛选、培养条件优化、细胞的扩培；

6)本实用新型实施例提供的一种预装微载体的一次性摇瓶采用独立的一次性包装袋，易于快速方便开展无菌培养，方便处理和储存。

附图说明

图1是本实用新型实施例1中一种预装微载体的一次性摇瓶的结构示意图；

图2是本实用新型实施例1中一种预装微载体的一次性摇瓶的摇瓶本体的结构示意图；

图3a和图3b分别是本实用新型实施例1中一种预装微载体的一次性摇瓶的瓶盖的俯视图和结构图；

图4a和图4b分别是本实用新型实施例1中一种预装微载体的一次性摇瓶中环形密封圈和滤膜的结构示意图；

图5是本实用新型实施例1中一种预装微载体的一次性摇瓶的箍体的结构示意图；

附图标记说明：1-瓶盖，2-摇瓶本体，3-微载体，4-瓶颈，5-外螺纹，6-连接处，7-瓶口，8-瓶颈唇部，9-上侧壁，10-下侧壁，11-刻度，12-瓶底，13-瓶盖固定环，14-瓶盖固定中心体，15-瓶盖固定架，16-瓶盖防滑螺纹，17-瓶盖内螺纹，18-环形密封圈，19-滤膜，20-固定内环，21-箍体固定架，22-箍体固定中心体，23-凹槽，24-固定外环。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本实用新型的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本实用新型实施例提供了一种预装微载体的一次性摇瓶，包括摇瓶本体，所述摇瓶本体的开口部盖合有瓶盖，所述摇瓶本体内预装有微载体，以及，在所述瓶盖内还设置有一层以上的滤膜，当所述瓶盖盖合于所述摇瓶本体的开口部时，所述一层以上的滤膜位于所述瓶盖与摇瓶本体的开口部之间。

进一步的，所述摇瓶本体包括依次连接设置的瓶口、瓶颈、侧壁和瓶底，所述侧壁设置有刻度线，所述侧壁包括沿轴线方向依次连接设置的上侧壁和下侧壁，所述上侧壁的顶部与瓶颈连接，所述下侧壁的底部和瓶底连接；其中所述瓶口的外径大小与瓶颈的高度大小之比为1:1。

更进一步的，所述瓶颈外侧设置有第一螺纹部，所述第一螺纹部包括一条以上第一螺纹。

进一步的，所述第一螺纹为连续螺纹或间断式螺纹。

更进一步的，在所述瓶颈与侧壁的连接处还凸设有瓶颈唇部。

进一步的，所述上侧壁与摇瓶本体的轴线方向平行。

进一步的，所述下侧壁与摇瓶本体轴线方向呈1-80°的夹角；优选为5-45°角；其中，所述摇瓶本体底部的直径大于上部的直径。

更进一步的，所述下侧壁与瓶底的连接处为连续弧面。

进一步的，所述瓶底的内表面和/或外表面为平面或者由外向内凸出的凸面；优选的，所述瓶底为由外向内凸出设置的内凹式瓶底。

进一步的，所述摇瓶本体由注塑或吹塑的方式一体成型。

进一步的，所述摇瓶本体内无通气、搅拌装置。

进一步的，所述瓶盖与摇瓶本体螺纹连接；所述瓶盖为透气性瓶盖，所述瓶盖包括盖体和设置于盖体一端开口部的瓶盖固定环，所述瓶盖固定环的外环部与盖体连接，所述瓶盖固定环的内环部分别经两条以上的第一支撑条与位于瓶盖固定环开口部中心处的瓶盖固定中心体连接；所述盖体的内侧具有与所述第一螺纹部相匹配的第二螺纹部，所述盖体的外侧设置有防滑螺纹。

进一步的，所述瓶盖固定环的直径与盖体的直径之比为0.1-0.9:1；优选为0.5-0.7:1。

进一步的，所述瓶盖内设置有1-4层滤膜；优选为1-2层。

更进一步的，所述滤膜为疏水透气性滤膜，所述滤膜的孔径为0.1-0.45μm，优选为0.22μm。

进一步的，在所述瓶盖内还设置有至少用于压紧固定所述滤膜的箍体，沿所述箍体的边缘部设置有环状凹槽，所述环状凹槽内设置有密封圈，所述密封圈的厚度略大于环状凹槽的深度。

进一步的，所述箍体包括依次连接设置的固定外环和固定内环，在所述固定内环和固定外环之间形成所述环状凹槽。

更进一步的，在所述固定内环内还设置有两条以上的第二支撑条，所述第二支撑条的一端与固定内环连接，另一端与固定内环中心的箍体固定中心体连接。

进一步的，所述的预装微载体的一次性摇瓶还包括：无菌密封袋，所述预装微载体的一次性摇瓶无菌密封于所述无菌密封袋中。

进一步的，所述的微载体包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、甲壳质微载体、PHEMA微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体及磁性微载体中的任意一种，但不限于此。

作为较佳优选实施方案之一，所述的预装微载体的一次性摇瓶采用湿热蒸汽灭菌或照射灭菌。

进一步的，照射剂量为25-40kGy，避免更高的剂量使得摇瓶和载体的降解最小化，也避免更低的剂量导致消毒灭菌不充分。

进一步的，照射灭菌的方式可以是伽马照射、电子束照射、贝塔照射中的任意一种，但不限于此；伽马照射、电子束照射、贝塔照射分别可采用Co-60源、电子束加速器、贝塔照射源进行，优选的为伽马照射。一般而言，使用Co-60源时，辐照剂量达到25kGy需6h，辐照剂量达到25kGy需18h，具体的照射时间根据照射所达到的照射剂量酌情调整。

进一步的，照射灭菌的过程应避免氧气的存在，避免氧衍生物如氧自由基或双氧水使摇瓶和载体降解，照射过程通常在溶液中进行，其中溶液已脱气去除氧气，即使在干燥条件下进行，也要使用惰性气、除氧剂等去除氧气。现有的照射方法利于细胞粘附在载体上，减少细胞对瓶内壁的粘附，在照射灭菌过程中遵循照射灭菌规程，额外使用乙醇作为干燥步骤，乙醇在伽马射线照射期间，猝灭为自由基。

更进一步的，为避免乙醇在培养基中残留影响细胞生长，在细胞接种前，预装微载体的一次性摇瓶加入温和培养基至少保留2h，以蒸发大部分乙醇。

进一步的，灭菌后，预装微载体的一次性摇瓶采用无菌密封袋密封，保证其无菌性能；灭菌后，可以在4-25℃环境下，至少保存2年。

作为较佳优选实施方案之一，所述的摇瓶本体由轻质且完全透明的塑料材质制成，并标有刻度。

进一步的，摇瓶可直接线性放大，包括125ml、250ml、1.6L、5L和定制规格，不同液体体积之间具有相似的流体动力学性能。

进一步的，预装微载体的一次摇瓶安装在摇床上摇动，液体中心形成漩涡，震荡液体在瓶壁形成液体薄膜，薄膜被外界的氧气或二氧化碳所饱和，液体薄膜与瓶内液体主体迅速混合，提供了较强的供氧能量。

作为较佳优选实施方案之一，所述的微载体材质包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、聚酯、聚丙烯、玻璃、纤维素、丙烯酰胺、硅、橡胶、葡聚糖、明胶、糖胺聚糖。

进一步的，所述的微载体形状包括但不限于球形、纤维状、纸片状、管状、波浪盘管。

进一步的，所述的微载体浓度为1-25g/L，可根据工艺情况定制载体浓度。

作为较佳优选实施方案之一，所述的预装微载体的一次摇瓶适用于昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、爬行类细胞、两栖类细胞、人体细胞、节肢动物细胞、海绵动物细胞、环节动物细胞、昆虫细胞、线虫细胞、植物细胞、微藻细胞、真菌细胞、酵母细胞、原核细胞。

作为较佳优选实施方案之一，所述的预装微载体的一次摇瓶采用广口大瓶底和透气膜设计，其剪切力微乎其微，供氧水平高，特别适用于以上剪切力敏感的细胞。预装微载体的一次性摇瓶中微环境可控，也可用于同样环境参数条件下的平行性培养。

实施例1

(a)提供一次性摇瓶

请参阅图1，一种一次性摇瓶包括摇瓶本体2、瓶盖1和微载体3。其中摇瓶本体2为细胞微载体培养的场所，摇瓶瓶盖1保障整个培养过程的透气性无菌密封，为细胞生长提供充足的氧气；微载体3用于细胞贴壁，在有限的体积内实现更大的表面。

请参阅图2，摇瓶本体2由聚丙烯、聚碳酸酯、尼龙、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚酯或聚氯乙烯等聚合物材质注塑或吹塑一体成型，其包括瓶口7、瓶颈4、侧壁(侧壁包括依次连接设置的上侧壁9和下侧壁10)、瓶底12、刻度11等结构；瓶颈4设有外螺纹(即第一螺纹)5，外螺纹5结构可以为单条线、多条线，也可以为连续线或中断线，优选的是多条中断线；瓶颈4靠近上侧壁9的位置为瓶颈唇部8，瓶颈唇部延伸至瓶颈4外，这种法兰连接方式可防止瓶内液体飞溅以及保证无菌性能；为避免传统摇瓶大底小口的限制，瓶颈4的上端形成大瓶口7，充分保证外界气体透过瓶口进入瓶内；此外，大瓶口7结构方便操作者进行培养基补加、接种、培养液转移、接毒等操作；瓶颈4高度与瓶口7的外径相近，例如1.6L摇瓶的瓶颈4高和瓶口7外径均为100mm；一次性摇瓶上侧壁9与摇瓶中心线平行，下侧壁10与中心线呈1～80°夹角，优选为5-45°夹角；下侧壁10与瓶底连接处(或称拐角)6以平滑的圆弧过渡，避免设计死角，瓶内流体可沿着瓶底12、连接处6和侧壁流动；瓶体下侧壁10标有刻度线11，指明对应的瓶内液体体积；瓶底12可采用平底或内凹的形式，优选的为内凹形式(即瓶底由外向内凸出)；一方面，这使得吹塑工艺更加简单，加强瓶底强度和韧度，减少瓶体形变所带来的损害；另一方面，平底需要承受内部压强需要加厚，从而导致材料浪费，内凹形式分担了液体压强，可以使底部做得更薄，反而节省了材料。

请参阅图3a和图3b，瓶盖1的大小与瓶口7的尺寸相匹配，采用了中心开环形孔设计，根据瓶体的体积选择环形孔的设计大小，一般的瓶盖固定环13直径为瓶盖1直径的0.1-0.9倍，优选为0.5-0.7倍；瓶盖1的固定环13由圆形的瓶盖固定中心14和多条瓶盖固定架(即第一支撑条)15支撑，瓶盖固定架15的数目由瓶盖的大小决定，一般为2-10条，优选为3-5条。瓶盖1内侧设置有与瓶颈外螺纹(第一螺纹)5完全吻合的内螺纹(即第二螺纹)17，瓶盖外侧设置有防滑螺纹16，方便操作者快速拧紧或松开瓶盖。

请参阅图4a、图4b和图5，瓶盖1内还设有与瓶盖1相同大小的疏水性透气性滤膜19，滤膜19孔径为0.1-0.45μm，优选为0.22μm；滤膜19的层数为1-4层，优选为1-2层，且滤膜19可手动更换；滤膜的材质为聚四氟乙烯或聚偏氟乙烯，以避免培养基溅出瓶外，同时增大培养液与外界气体的交换面积，透气性面积的增大有效提高内培养液的溶氧，从而增大了瓶内装液量。箍体用于压紧滤膜，箍体固定中心22连同箍体固定架(即第二支撑条)21支撑整个固定外环24和固定内环20，防止其变形；环形密封圈18位于固定外环24和固定内环20之间的凹槽23(凹槽为环形凹槽)内，密封圈18的厚度略大于凹槽23的深度。

(b)微载体预装

摇瓶加工完成后，称量微载体于摇瓶中，所述的微载体3浓度为1-25g/L，可根据工艺情况和客户要求定制载体3浓度。

(c)灭菌

将预装微载体3的摇瓶包装好后，采用蒸汽湿热灭菌或照射灭菌。

湿热灭菌：灭菌温度为115-130℃，灭菌时间5min-300min。

照射灭菌：使用10-50kGy的伽马或贝塔射线或电子束对其进行辐照，在一些实施方案之中，所述的预装微载体的一次性摇瓶的照射剂量为25-40kGy，避免更高的剂量使得摇瓶和载体的降解最小化，也避免更低的剂量导致消毒灭菌不充分。

优选的，伽马照射、电子束照射、贝塔照射分别可采用Co-60源、电子束加速器、贝塔照射源进行，优选的为伽马照射。一般而言，使用Co-60源时，辐照剂量达到25kGy需6h，辐照剂量达到25kGy需18h，具体的照射时间根据照射所达到的照射剂量酌情调整。

优选的，所述的照射方法应避免氧气的存在，避免氧衍生物如氧自由基或双氧水使摇瓶和载体降解，照射过程通常在溶液中进行，其中溶液已脱气去除氧气，即使在干燥条件下进行，也要使用惰性气、除氧剂等去除氧气。现有的照射方法利于细胞粘附在载体3上，减少细胞对瓶内壁的粘附。在照射灭菌过程中遵循照射灭菌规程，额外使用乙醇作为干燥步骤。乙醇在伽马射线照射期间，猝灭为自由基。

优选的，灭菌后，预装微载体的一次性摇瓶采用无菌密封袋密封，保证其无菌性能。灭菌后，可以在4-25℃环境下，至少保存2年。

(d)培养

所述的预装微载体的一次摇瓶适用于昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、爬行类细胞、两栖类细胞、人体细胞、节肢动物细胞、海绵动物细胞、环节动物细胞、昆虫细胞、线虫细胞、植物细胞、微藻细胞、真菌细胞、酵母细胞、原核细胞。因预装微载体的一次摇瓶采用广口大瓶底和透气膜设计，其剪切力微乎其微，供氧水平高，特别适用于以上剪切力敏感的细胞。本发明的摇瓶中微环境可控，也可用于同样环境参数条件下的平行性培养。

为避免乙醇在培养基中残留影响细胞生长，在细胞接种前在培养过程中，预装微载体的一次摇瓶安装在摇床上摇动，摇瓶绕中心线旋转，中心线的流体速度最低，随着离中心轴线的距离增加，流体速度线性增加，液体中心形成漩涡，震荡液体在瓶壁形成液体薄膜，薄膜被外界的氧气或二氧化碳所饱和，液体薄膜与瓶内液体主体迅速混合，提供了较强的供氧能量。

实施例2

培养Vero细胞生产病毒，实施过程如下：

(a)种子细胞

Vero细胞解冻后接种到低血清培养基(购自苏州沃美生物技术有限公司)中，添加量为1％新生牛血清，于37℃、5％CO2环境下培养。当细胞密度达到2×106cells/ml时，加入0.2％普朗克宁制备细胞种子液；

(b)接种前处理

方案1，称量微载体于玻璃摇瓶(规格1.6L)中，加入PBS缓冲液洗涤，水合3h后，再次洗涤2次，121℃灭菌30min后，细胞培养基洗涤2次后排尽缓冲液，转移无菌培养基至玻璃摇瓶中；

方案2，称量微载体于洁净的容器中，加入PBS缓冲液洗涤，水合3h后，再次洗涤2次，121℃灭菌30min后，细胞培养基洗涤2次后排尽缓冲液，转移至装有无菌培养基的一次性摇瓶(规格1.6L)中，至少保留2h，以蒸发大部分乙醇；

方案3，玻璃摇瓶(规格1.6L)121℃灭菌30min后，一次性微载体添加至装有无菌培养基的玻璃摇瓶中，至少保留2h，以蒸发大部分乙醇；

方案4，一次性微载体添加至装有无菌培养基的一次性摇瓶(规格1.6L)中，至少保留2h，以蒸发大部分乙醇；

方案5，无菌培养基转移至预装微载体的一次性摇瓶(规格1.6L)中，至少保留2h，以蒸发大部分乙醇；

(c)接种和病毒培养

将种子细胞液按照初始细胞密度为0.2×106cells/ml接种，采用间歇换液的方式于37℃、5％CO2、100rpm的摇床中培养。待细胞密度达到1.5×106cells/ml时，按照0.05MOI病毒接种Vero细胞；

(d)细胞计数和病毒滴度测定

每2d取样测定病毒的滴度，并采用结晶紫染色分别进行活细胞和死细胞计数，计算活细胞比例，取收获的病毒液经反复冻融离心后，用微量滴定法测定病毒的滴度(CCID50/ml)。

由表1可知，方案1-5中最终细胞数、活细胞比例、病毒的滴度差异不明显，表明预装微载体的一次性摇瓶对细胞生长和病毒表达无显著影响，但方案1～4的接种前处理过程步骤繁琐，增加了染菌几率、人力和时间成本，方案5可避免这些缺陷。

表1实施例2中方案1‐5中细胞生长和病毒滴度情况

本实用新型实施例提供的一种预装微载体的一次性摇瓶，避免了传统玻璃摇瓶需在使用前的清洗清洁和灭菌工作，提高生产产品的安全性，避免多种产品之间的交叉污染；其可以避免微载体称量、水合、洗涤、灭菌、排缓冲液等步骤，节约了这些步骤相关的时间和成本。

应当理解，上述实施例仅为说明本实用新型的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本实用新型的内容并据以实施，并不能以此限制本实用新型的保护范围。凡根据本实用新型精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种预装微载体的一次性摇瓶，包括摇瓶本体，所述摇瓶本体的开口部盖合有瓶盖，其特征在于：所述摇瓶本体内预装有微载体，以及，在所述瓶盖内还设置有一层以上的滤膜，当所述瓶盖盖合于所述摇瓶本体的开口部时，所述一层以上的滤膜位于所述瓶盖与摇瓶本体的开口部之间。

2.根据权利要求1所述的预装微载体的一次性摇瓶，其特征在于：所述摇瓶本体包括依次连接设置的瓶口、瓶颈、侧壁和瓶底，所述侧壁设置有刻度线，所述侧壁包括沿轴线方向依次连接设置的上侧壁和下侧壁，所述上侧壁的顶部与瓶颈连接，所述下侧壁的底部和瓶底连接；其中所述瓶口的外径大小与瓶颈的高度大小之比为0.5-2:1。

3.根据权利要求2所述的预装微载体的一次性摇瓶，其特征在于：所述瓶颈外侧设置有第一螺纹部，所述第一螺纹部包括一条以上第一螺纹，和/或，所述第一螺纹为连续螺纹或间断式螺纹；和/或，在所述瓶颈与侧壁的连接处还凸设有瓶颈唇部。

4.根据权利要求2所述的预装微载体的一次性摇瓶，其特征在于：所述上侧壁与摇瓶本体的轴线方向平行；和/或，所述下侧壁与摇瓶本体轴线方向呈1-80°的夹角；其中，所述摇瓶本体底部的直径大于上部的直径；和/或，所述下侧壁与瓶底的连接处为连续弧面。

5.根据权利要求2或4所述的预装微载体的一次性摇瓶，其特征在于：所述瓶底的内表面和/或外表面为平面或者由外向内凸出的凸面。

6.根据权利要求1或2所述的预装微载体的一次性摇瓶，其特征在于：所述摇瓶本体由注塑或吹塑的方式一体成型。

7.根据权利要求3所述的预装微载体的一次性摇瓶，其特征在于：所述瓶盖与摇瓶本体螺纹连接；所述瓶盖为透气性瓶盖，所述瓶盖包括盖体和设置于盖体一端开口部的瓶盖固定环，所述固定环的外环部与盖体连接，所述瓶盖固定环的内环部分别经两条以上的第一支撑条与位于瓶盖固定环开口部中心处的瓶盖固定中心体连接；所述盖体的内侧具有与所述第一螺纹部相匹配的第二螺纹部，所述盖体的外侧设置有防滑螺纹；和/或，所述瓶盖固定环的直径与盖体的直径之比为0.1-0.9:1。

8.根据权利要求1所述的预装微载体的一次性摇瓶，其特征在于：所述瓶盖内设置有1-4层滤膜；和/或，所述滤膜为疏水透气性滤膜，所述滤膜的孔径为0.1-0.45μm。

9.根据权利要求1所述的预装微载体的一次性摇瓶，其特征在于：在所述瓶盖内还设置有至少用于压紧固定所述滤膜的箍体，沿所述箍体的边缘部设置有环状凹槽，所述环状凹槽内设置有密封圈，所述密封圈的厚度略大于环状凹槽的深度；和/或，所述箍体包括依次连接设置的固定外环和固定内环，在所述固定内环和固定外环之间形成所述环状凹槽；和/或，在所述固定内环内还设置有两条以上的第二支撑条，所述第二支撑条的一端与固定内环连接，另一端与固定内环中心的箍体固定中心体连接。

10.根据权利要求1所述的预装微载体的一次性摇瓶，其特征在于还包括：无菌密封袋，所述预装微载体的一次性摇瓶无菌密封于所述无菌密封袋中。