CN101586077A - 新型超滤膜细胞培养器及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
新型超滤膜细胞培养器,包括瓶体,所述的瓶体内部设置有具有分子截留作用的超滤膜,超滤膜将瓶体内部分为细胞生长功能区和细胞培养液功能区,所述的细胞生长功能区内设置有若干层用于供细胞贴壁生长的细胞贴壁生长层板,瓶体上设置有各自独立的培养液进出口和细胞及目标培养产物进出口和培养产物通道。本发明实现了细胞所产生目标物质浓度和总量的快速增加和高效纯化的目的,并大大缩短后续目标培养物质浓缩和纯化所需的时间和减少所需试剂用量,明显降低科研或生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学实验和生物制药中细胞培养装置领域,具体为新型超滤膜细胞培养器及其制造方法。
背景技术
以活体细胞经体外培养或接种于动物体内进行培养获得细胞分泌或产生的抗体和多肽等大分子生物活性物质,是生物医学实验和生物制药领域的一项重要工作。而探索新的细胞培养方法,研究和开发新的细胞培养装置以提高目标培养物质的浓度和纯度、减少所需时间和成本一直是生物和制药行业的重要研究课题。
现有的细胞培养方法分为两类,即体内培养和体外培养。体内培养是将细胞接种于动物腹腔,利用动物本身的体液系统向目标细胞提供营养,其优点为细胞培养过程操作简单,成本较低,细胞分泌或产生的抗体和多肽等大分子生物活性物质浓度极高,但其重大缺陷为所获抗体物质难以纯化,所以该方法现已较少应用。
细胞体外培养方法为利用以玻璃或塑料高分子材料制成的细胞培养皿、板和瓶作为容器,将细胞接种于注有培养液的上述容器中进行培养。细胞在不断的分裂繁殖过程中可分泌和产生抗体和多肽等目标物质;经过数天培养直至细胞死亡后,以离心的方式得到含有抗体和多肽等目标物质的上清液,再通过盐析沉淀→透析→离心→层析纯化→再次浓缩→透析等复杂步骤得到高浓度的纯化目标物。虽然相对细胞体外培养来说,所获抗体物质浓度极低(一般为0.1~10微克/ml级),需经极其复杂的浓缩、透析、离心、层析等步骤才能得到高浓度的纯化目标物,整个培养、收获、纯化和浓缩过程费时且成本高昂,但是其细胞培养过程操作简单,细胞分泌或产生的抗体和多肽等大分子生物活性物质易于纯化,所以现在广泛应用。
中空纤维培养系统为90年代中期发展的细胞培养装置。该系统原理为利用中空纤维将细胞培养环境分隔为细胞生长/高浓度目标培养物和培养液两个界面。细胞在细胞生长界面内分裂繁殖并分泌抗体和多肽等目标物质,培养液界面内细胞培养液中的营养物质可通过中空纤维表面的微孔扩散至细胞生长界面而细胞生长界面内的细胞和抗体和多肽等目标物质由于分子量较大无法进入细胞生长界面。其结果为在细胞生长界面内的培养液含有高浓度的抗体和多肽等目标物质。由于两个界面均有密封的出口可供收获细胞和目标物质及更换新鲜培养液,该系统可以连续使用。但由于该装置设计复杂,在操作过程中极易引起污染,故十几年来无法普遍推广应用。
作为体外培养的大多数细胞只有在“贴壁”条件下,即细胞需贴附在容器表面方能正常分裂生长和分泌产生抗体和多肽等生物活性物质。因此,要求用于生产细胞培养皿、板和瓶的塑料高分子材料表面具有亲水性。而常规生产的塑料高分子材料表面为疏水特性,无法直接用于制作细胞培养容器。在我国,由于高分子材料表面改性技术研究、处理设备开发的落后,细胞培养容器和装置产品的开发和生产基本处于空白状态,产品完全依赖进口,或采用落后的非一次性玻璃容器。非一次性玻璃容器虽然价格低廉,但由于其细胞贴壁性能差、洗涤困难和易交叉污染的缺陷,在国外早已被淘汰。
由于受到关键技术瓶颈的限制,几十年来,细胞培养装置一直使用功能单一的传统细胞培养瓶。培养结束后目标培养物质(如单克隆抗体和多肽)浓度极低,且后续浓缩、纯化步骤十分复杂、费时及成本高昂。因此探索新的细胞培养方法,研究和开发新的细胞培养装置以提高目标培养物质的浓度、产量和纯度,减少细胞培养及其后续目标培养物质的收获、提纯和浓缩所需的时间和成本一直是生物和制药行业的重要研究课题。
发明内容
本发明的目的是针对以上所述细胞培养瓶存在的不足,提供一种操作简单、不易被污染、细胞贴壁特性好、使目标培养物质的浓度和总量显著提高,从而达到细胞所产生的物质的快速获得和高效分离、纯化,并大大缩短后续目标培养物质浓缩和纯化所需的时间和减少所需试剂用量,明显降低科研或生产成本的新型超滤膜细胞培养器及其制造方法。
本发明是这样实现的:新型超滤膜细胞培养器,包括瓶体,所述的瓶体内部设置有具有分子截留作用的超滤膜,超滤膜将瓶体内部分为细胞生长功能区和细胞培养液功能区。
所述的细胞生长功能区内设置有若干层用于供细胞贴壁生长的细胞贴壁生长层板,以增加细胞贴壁的表面积和贴壁率。
所述的瓶体上设置有各自独立的培养液进出口和细胞及目标培养产物进出口和培养产物通道,细胞及目标培养产物进出口供在细胞培养过程中部分收获细胞产生的生物活性物质;培养液进出口供更换细胞培养液,以不断补充细胞分裂成长所需的营养物质;此一独特的设计使得该装置成为连续培养系统,提高了细胞存活和生长周期。
所述的培养液进出口和细胞及目标培养产物进出口配有相同大小的瓶盖,培养液进出口的瓶盖为设置有聚四佛乙烯透气膜的透气盖,以利在无污染状态下的空气对流。
新型超滤膜细胞培养器的制造方法,其制造步骤如下:(1)、瓶体外壳以及内部构件注塑加工成型;(2)、细胞生长区塑料组件低温等离子体表面处理;(3)、细胞贴壁生长层板组装;(4)、超滤膜熔接或以硅胶垫片密封粘接;(5)、细胞培养器内部构件与瓶体的组装;(6)、瓶体的超声无缝熔接;(7)、内包装及外包装;(8)、产品伽玛射线灭菌;(9)、产品检验。
所述的等离子体表面处理为将干燥后的瓶体和细胞贴壁生长层板放入等离子处理器中,在真空或负压状态下引入氧气、氮气或其他等离子体气体,等离子发生器放电,在细胞培养容器内表面形成等离子层,使其由疏水状态改变为具亲水特性,从而增强细胞的贴壁率;在处理过程中,其工艺条件为:工作压力50~900毫吨,电源功率100~500瓦,处理时间100~500秒。
所述的等离子体表面处理的处理过程中,其工艺条件为:工作压力为50毫吨,处理时间为100秒,电源功率为500瓦。
所述的超滤膜是通过超滤膜熔接或者硅胶垫片密封后与瓶体内壁牢固的融合在一起,将瓶体内部分为细胞培养液功能区和细胞生长功能区上下两室;所述的超滤膜熔接可以是将软质的超滤膜设置在透明的、带有筛孔的两个垫板之间;硅胶垫片密封可以是超滤膜以两块硅胶垫片密封粘接在一体。
所述的瓶体的超声无缝熔接是内部构件以超声焊接机在不添加任何焊接剂条件下与瓶体的上下体牢固的融合在一起;其工艺条件为:频率20k,焊接时间:0.1”,保压时间:0.6”,气压:30psi,高度:30cm。
所述的超滤膜的孔径大小可以为可以0.05μm~1nm,可分离的相对分子质量范围为500~1,000,000D的大分子和胶体粒子,操作压力可以为0.2~0.4MPa,透过速率可以为0.5~5m3/(m2·d)。
本发明具备如下特点:(1)应用具分子截留作用的超滤膜将细胞培养瓶分隔为两个培养界面;(2)构筑细胞生长功能区的高分子材料以低温等离子体表面改性技术进行表面改性处理,增加细胞的贴壁率;(3)构筑细胞生长功能区设置细胞贴壁生长层板的多层结构,极大地增加构筑细胞生长功能区的高分子材料的表面积;(4)独特的功能区独立进出口的设计,可供定期收获细胞和目标培养物质,更换补充细胞培养液,这样使得该装置成为一连续培养系统。本发明继承了传统体外培养方法所收获的大分子目标物质(如单克隆抗体)易于纯化的优点,又可获得类似活体培养的高浓度目标物质的特性,同时还保留了传统产品便于观察细胞生长状态的特征。本实用新型实现了细胞所产生目标物质浓度和总量的快速增加和高效纯化的目的,并大大缩短后续目标培养物质浓缩和纯化所需的时间和减少所需试剂用量,明显降低科研或生产成本。
附图说明
图1为本发明的立体结构图;
图2为本发明的A-A剖面结构示意图;
图3为本发明的制造工艺流程图;
图4为本发明的与现有细胞培养瓶的优缺点对比;
图5为本发明的与常规细胞培养瓶的技术指标比较表;
图6为本发明的与常规细胞培养瓶对单克隆抗体生产的经济指标比较表。
其中,1:细胞及目标培养产物进出口;2:瓶体;3:培养液进出口;4:超滤膜;5:培养产物通道;6:细胞贴壁生长层板;7:细胞生长功能区;8:细胞培养液功能区;9:可视区。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明新型超滤膜细胞培养器及其制造方法进行详细的说明。
新型超滤膜细胞培养器,如图1和图2所示,包括瓶体2,所述的瓶体2内部设置有具有分子截留作用的超滤膜4,超滤膜4将瓶体内部分为细胞生长功能区7和细胞培养液功能区8;细胞生长功能区7位于瓶体2的下层,细胞培养液功能区8位于瓶体2内细胞生长功能区8的上层。超滤膜4是通过超滤膜熔接或者硅胶垫片密封后与瓶体内壁牢固的融合在一起,将瓶体内部分为细胞培养液功能区8和细胞生长功能区8上下两室;超滤膜熔接是将软质的超滤膜设置在透明的、带有筛孔的两个垫板之间;硅胶垫片密封是超滤膜以两块硅胶垫片密封粘接在一体硅胶垫片上设置有筛孔。在细胞生长功能区7内设置有若干层用与供细胞贴壁生长的细胞贴壁生长层板6,以增加细胞贴壁的表面积和贴壁率。瓶体2上设置有专门独立的培养液进出口3、细胞及目标培养产物进出口1以及培养产物通道5,培养产物通道5为细胞生长功能区7穿过细胞培养液功能区8通往外部的通道。细胞及目标培养产物进出口1供在细胞培养过程中部分或全部收获细胞产生的生物活性物质;培养液进出口3供更换细胞培养液,以不断补充细胞分裂成长所需的营养物质;此一独特的设计使得该装置成为连续培养系统,提高了细胞存活和生长周期。培养液进出口3和细胞及目标培养产物进出口1均配有瓶盖,培养液进出口的瓶盖为设置有聚四佛乙烯透气膜的透气盖,以利在无污染状态下的空气对流。培养液进口3设置瓶体侧壁中部,口壁倾斜伸出侧壁,直接与培养液区相通;细胞及目标培养产物进出口1设置在培养液进口的对侧,内陷于瓶体的边缘,管道穿过培养液区进入细胞生长功能区。培养液进出口3和细胞及目标培养产物进出口1的瓶颈直径和瓶盖大小相同。瓶体2上设置有透明的可视区9。瓶体2的内表面以及细胞生长功能区内细胞贴壁生长层板6应用低温等离子体表面改性技术进行处理过,使其由疏水状态改变为具亲水特性,从而增强细胞的贴壁率。
新型超滤膜细胞培养器的制造方法,如图3所示,其制造步骤如下:
(1)、注塑加工成型,根据不同的细胞培养的要求加工成不同大小尺寸、不同形状等的瓶体外壳、细胞生长区塑料组件--层板以及瓶盖等部件;
(2)、细胞生长区塑料组件低温等离子体表面处理;
(3)、细胞贴壁生长层板组装,将细胞贴壁生长层板组装成层板架,以便在瓶体外壳内安装;
(4)、超滤膜熔接或以硅胶垫片密封粘接,将软质的超滤膜设置在透明的、带有筛孔的两个垫板之间,以便于超滤膜与瓶体内壁的连接;超滤膜也可以是以两块硅胶垫片密封粘接在一体。
(5)、细胞培养器内部构件与瓶体的组装,内部构件包括细胞生长区塑料组件以及熔接的超滤膜等,将上述步骤处理完成的内部构件在瓶体内组装起来,形成本发明所述的超滤膜细胞培养瓶的内部结构;在组装前,瓶体的下部分需要进行低温等离子体表面处理。
(6)、瓶体的超声无缝熔接,将上述步骤瓶体内部组装好的内部构件以超声焊接机在不添加任何焊接剂条件下与瓶体的上下体牢固的融合在一起。
(7)、内包装及外包装;
(8)、产品伽玛射线灭菌,将内外包装完整的产品送入伽玛射线辐照室,辐照剂量不低于12KGY。;
(9)、产品检验,合格的产品入库、出货。
所述的低温等离子体表面处理为将干燥后的瓶体和细胞贴壁生长层板放入等离子处理器中,在真空或负压状态下引入氧气、氮气或其他等离子体气体,等离子发生器放电,在细胞培养容器内表面形成等离子层,使其由疏水状态改变为具亲水特性,从而增强细胞的贴壁率;在处理过程中,其工艺条件为:工作压力50~900毫吨,电源功率100~500瓦,处理时间100~500秒。优选工艺条件为:将等离子体处理器的电源接通,设定工艺参数:工作压力为50毫吨,处理时间为100秒,电源功率为500瓦,接通氧气和压缩空气,然后将预处理的细胞培养容器放入等离子体处理器中,对细胞培养容器的表面进行处理。通过等离子体处理高分子材料,有选择地在表面引入新的基团,改变表面湿润性、表面电位、表面能极性分量和色散分量以及表面微结构,达到改善高分子材料生物相容性的目的,由此可获得一系列不同湿润性的表面,适用于用作特定场合的生物医用材料。等离子体气体是指利用非聚合性气体(如Ar、N2、CO、NH4、O2、H2等)等离子体。等离子体与高分子材料表面相互作用,使在表面上形成新的官能团和改变高分子链结构,以改善亲(疏)水性、粘接性、表面电学性能、光学性能以及生物相容性等,从而达到表面改性的目的。在等离子体处理过程中,随不同的放电条件,往往以某种作用为主,几种作用并存。等离子体处理的优点是效果显著,工艺简单,无污染,可通过改变不同的处理条件获得不同的表面性能,应用范围广。更为重要的是,处理效果只局限于表面而不影响材料本体性能。低温等离子体一方面具有足够高能量的活性物种使反应物分子激发、电离或断键,另一方面不会使被处理材料热解或烧蚀,在改性高分子材料表面方面具有独特的应用价值。
经过低温等离子表面处理后的细胞贴壁生长层板处理效果按以下检验规程予以确认:
1、引用标准及原理:
引用标准:ASTM Standard D2578;
工作原理:塑料表面能量(表面张力)的测定是通过测试油墨按照DINISO 8296,是以已知不同表面能量的墨在拟测的薄膜上刷上约100mm长的墨条,并观察其90%以上的墨条边在2秒钟内是否发生收缩并形成墨滴,如有,则换低一级表面能的墨再刷墨条,进行同样的观察,直至不收缩和出现墨滴,此测试墨的表面能即相对应为该产品的表面能,这种方法能准确测出基材的表面张力。
2、试验方法:
产品经过表面处理机处理后,即刻取出按照AQL取样值取出需测试的产品,用达因试笔(60达因/厘米)测试细胞贴壁生长表面。当测试笔在处理过的塑料表面划出一条线,如果是连续成线并在一分钟内无任何收缩现象则为合格。(说明:该材料表面能不低于达因/厘米,如断断续续不连成线,说明该材料表面能不到60mN/m,处理不足或甚至未处理,不符合贴壁处理要求。)
3、仪器与用具
达因笔、游标尺、工具显微镜、投影机。
超滤膜4是通过超滤膜熔接或者硅胶垫片密封后与瓶体内壁牢固的融合在一起,将瓶体内部分为细胞培养液功能区8和细胞生长功能区8上下两室;超滤膜熔接是将软质的超滤膜设置在透明的、带有筛孔的两个垫板之间;硅胶垫片密封是超滤膜以两块硅胶垫片密封粘接在一体硅胶垫片上设置有筛孔。细胞贴壁生长层板6和超滤膜4经过超滤膜熔接或者硅胶垫片密封后可以是通过超声无缝焊接技术,将超滤膜牢固地镶嵌在细胞培养瓶的塑料材质中。超声无缝熔接是内部构件以超声焊接机在不添加任何焊接剂条件下与瓶体的上下体牢固的融合在一起;其工艺条件为:频率20k,焊接时间:0.1”,保压时间:0.6”,气压:30psi,高度:30cm。
所述的超滤膜的孔径大小可以是从0.05μm~1nm,可分离的相对分子质量范围为500~1,000,000D的大分子和胶体粒子,操作压力一般为0.2~0.4MPa,透过速率为0.5~5m3/(m2·d)。如对抗体IgG选用20kd分子截留孔径的超滤膜、IgM选用90kd分子截留孔径的超滤膜等。
本发明应用具有分子截留作用的超滤膜将细胞培养容器分隔为两个功能区,形成细胞生长/目标培养物质界面和培养液界面。在细胞生长/目标培养物质界面内,细胞和目标培养物质(如单克隆抗体和多肽)由于分子量大被阻隔积聚于该区内;细胞培养液界面内的营养物质以及细胞生长功能区中的细胞代谢产物由于分子量小,可因渗透压和浓度差自由流动。另外应用低温等离子体表面改性技术对构筑细胞附着贴壁的塑料高分子材料表面进行处理,使其由疏水状态改变为具亲水特性,从而增强细胞的贴壁率。由于上述两种技术的应用,与目前常规使用的细胞培养瓶相比较,产品结构发生了以下变化:本项目产品应用超滤膜将细胞培养容器分隔为两个物理功能区,该两功能区既相互独立又互相连通,细胞和目标培养物质(如单克隆抗体和多肽)由于分子量大被阻隔积聚于该区内,使得在该区内的目标培养物质浓度高于普通细胞培养瓶者数十倍至上百倍;细胞培养液界面内的营养物质以及细胞生长功能区中的细胞代谢产物由于分子量小,可因渗透压和浓度差自由流动,从而实现细胞生长/目标培养物质界功能区内营养物质不断补充和细胞代谢产物的连续稀释。在细胞生长功能区内,增加了多层用以供细胞贴壁生长的层板结构,层板表面均以等离子体表面改性技术进行处理,增加了细胞贴壁支撑板的表面积和贴壁率。还有细胞培养容器的细胞生长/目标培养物质和培养液两个功能区均设计有各自独立的进出引流口:细胞生长/目标培养物质功能区引流口供在细胞培养过程中部分收获细胞产生的生物活性物质;培养液功能区引流口供更换细胞培养液,以不断补充细胞分裂成长所需的营养物质。此一独特的设计使得该装置成为连续培养系统,提高了细胞存活和生长周期。
如图4、图5和图6所示,和现有的细胞培养之装置相比,本发明的结构和功能更为完善,已完全突破传统意义上的细胞培养瓶仅作为提供细胞生长环境的容器,增加了连续培养和得到高浓度、高纯度的目标培养物质的功能,实现了细胞所产生目标物质浓度和总量的快速增加和高效纯化的目的,大幅度降低细胞培养及其后续目标培养物质的收获、提纯和浓缩所需的时间和成本。
Claims (10)
1、新型超滤膜细胞培养器,包括瓶体,其特征在于:所述的瓶体内部设置有具有分子截留作用的超滤膜,超滤膜将瓶体内部分为细胞生长功能区和细胞培养液功能区。
2、如权利要求1所述的新型超滤膜细胞培养器,其特征在于:所述的细胞生长功能区内设置有若干层用于供细胞贴壁生长的细胞贴壁生长层板。
3、如权利要求1所述的新型超滤膜细胞培养器,其特征在于:所述的瓶体上设置有各自独立的培养液进出口和细胞及目标培养产物进出口和培养产物通道,细胞及目标培养产物进出口供在细胞培养过程中部分收获细胞产生的生物活性物质;培养液进出口供更换细胞培养液。
4、如权利要求3所述的新型超滤膜细胞培养器,其特征在于:所述的培养液进出口和细胞及目标培养产物进出口配有相同大小的瓶盖,培养液进出口的瓶盖为设置有聚四佛乙烯透气膜的透气盖。
5如权利要求1所述的新型超滤膜细胞培养器的制造方法,其特征在于:其制造步骤如下:(1)、瓶体外壳以及内部构件注塑加工成型;(2)、细胞生长区塑料组件低温等离子体表面处理;(3)、细胞贴壁生长层板组装;(4)、超滤膜熔接或以硅胶垫片密封粘接;(5)、细胞培养器内部构件与瓶体的组装;(6)、瓶体的超声无缝熔接;(7)、内包装及外包装;(8)、产品伽玛射线灭菌;(9)、产品检验。
6、如权利要求5述的新型超滤膜细胞培养器的制作方法,其特征在于:所述的低温等离子体表面处理为将瓶体和细胞贴壁生长层板放入等离子处理器中,在真空或负压状态下引入等离子体气体,等离子发生器放电,在细胞培养容器内表面形成等离子层,使其由疏水状态改变为具亲水特性;在处理过程中,其工艺条件为:工作压力50~900毫吨,电源功率100~500瓦,处理时间100~500秒。
7、如权利要求6述的新型超滤膜细胞培养器的制作方法,其特征在于:所述的低温等离子体表面处理的处理过程中,其工艺条件为:工作压力为50毫吨,处理时间为100秒,电源功率为500瓦。
8、如权利要求5所述的新型超滤膜细胞培养器的制作方法,其特征在于:所述的超滤膜是通过超滤膜熔接或者硅胶垫片密封后与瓶体内壁牢固的融合在一起,将瓶体内部分为细胞培养液功能区和细胞生长功能区上下两室;所述的超滤膜熔接是将软质的超滤膜设置在透明的、带有筛孔的两个垫板之间;硅胶垫片密封是超滤膜以两块硅胶垫片密封粘接在一体。
9、如权利要求5所述的新型超滤膜细胞培养器的制作方法,其特征在于:所述的瓶体的超声无缝熔接是内部构件以超声焊接机在不添加任何焊接剂条件下与瓶体的上下体牢固的融合在一起;其工艺条件为:频率20k,焊接时间:0.1”,保压时间:0.6”,气压:30psi,高度:30cm。
10、如权利要求1和/或5所述的新型超滤膜细胞培养器,其特征在于:所述的超滤膜的孔径大小为0.05μm~1nm,可分离的相对分子质量范围为500~1,000,000D的大分子和胶体粒子,操作压力为0.2~0.4MPa,透过速率为0.5~5m3/(m2·d)。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Guangzhou Jet Bio-Filtration Products Co., Ltd. Assignor: Yuan Jianhua|Yuan Ye Contract record no.: 2010440001130 Denomination of invention: Novel ultrafiltration membrane cell incubator and manufacture method thereof License type: Exclusive License Open date: 20091125 Record date: 20100812 |
|
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20091125 |