CN102188752B

CN102188752B - 制备骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的方法及装置

Info

Publication number: CN102188752B
Application number: CN 201110091845
Authority: CN
Inventors: 王金福; 宗晨
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-04-12
Filing date: 2011-04-12
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2031-04-12
Also published as: CN102188752A

Abstract

本发明提供了一种制备骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的方法及装置。本发明以柱状槽体内中央的柱体堵塞管道支架的中央通道(内孔)，以利于上盖经培养液进口流入的培养液能全部流经管道支架的管外壁孔隙，保证管道支架外壁孔隙内的细胞获得培养液营养。本发明方法提高了骨髓间充质干细胞在PCL管道支架内的接种效率，并提高了细胞在管道支架外壁内的均匀分布和扩增能力，利用这种方法可获得骨髓间充质干细胞均匀以及高密度分布的复合管道支架，有望应用于临床上管道组织损伤的修复。

Description

制备骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的方法及装置

(一)技术领域

本发明涉及一种制备骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的方法及装置。

(二)背景技术

管道组织损伤是临床上的常见问题，例如血管或胆管发生的管漏以及管道狭窄等。管道组织损伤修复方法很多：一是改进外科手术技术，如外科手术显微镜下管道吻合，减少吻合口狭窄和管漏；二是管道内支架植入技术。前者显微外科手术技术复杂、耗时，虽然可以降低管道并发症的产生，但是管道并发症仍可达5％～20％。后者最大的问题在于植入支架需经历再次创伤性操作取出，而且此类支架多为塑料或金属支架，与管道组织相容性差，易堵塞和引起逆行管道感染。因此，利用组织工程技术修复管道组织损伤将是最可行的治疗方法。利用基于干细胞和生物可降解材料支架复合的组织工程技术修复管道组织损伤时，不但可直接将受体管道套接于支架上，并且干细胞定向分化可促进修复管道组织损伤，生物可降解材料保证一定时间后可以自行降解。目前，对干细胞与可降解多孔材料支架进行复合的方法主要是采取对种植了干细胞后的支架进行灌流培养，通过这种灌流培养技术，达到干细胞在多孔材料支架内的均匀分布和快速生长。然而，如何在多孔材料管道支架内接种干细胞以及如何在灌流培养系统中立体灌流培养管道支架内的干细胞是制备干细胞-管道支架复合物的技术关键。

(三)发明内容

本发明提供一种有效地制备骨髓间充质干细胞在管道支架内均匀分布、生长良好、并具备一定力学强度的干细胞-管道支架复合物的方法及装置。

本发明采用的技术方案是：

一种骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的制备方法，所述方法包括：

(1)细胞接种：将供细胞立体培养的管道支架经消毒处理后，吸取第3代骨髓间充质干细胞的细胞悬液，均匀滴加至管道支架外表面，待吸收完全后将管道支架置于注射器内，负压抽吸2～5次；

(2)静态培养：将接种后的管道支架置于细胞培养装置中，添加干细胞培养液中静态培养20～30小时；

(3)灌流培养：静态培养结束后，将管道支架置于灌流培养槽中，所述灌流培养槽内径与所述管道支架外径相匹配，轴心位置设置有与所述管道支架中央通道相匹配的实心柱体，管道支架放置于柱体与外壁间的空腔内，空腔底部有供培养液流通的多孔底板；往灌流培养槽中通入干细胞培养液，在0.1～0.3mL/min流速下灌流培养10～15天，制备得到所述骨髓间充质干细胞-管道支架复合物。

本发明关键在于灌流培养的过程，细胞接种和静态培养可按本领域常规方法进行。

所述干细胞培养液为常规用于骨髓间充质干细胞体外培养的培养液，如DMEM、F12培养基等，本发明中选用添加10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的α-MEM培养液。

所述管道支架为常规用于组织工程修复管道组织损伤的生物可降解材料，如PEG、PLLA、PLGA等，本发明中选用聚己内酯(PCL)管道支架，为中空管状结构，管壁为嵌合在一起的内外两层，管内壁为光滑致密结构，有利于提供一定力学强度和防止胆汁的外渗，管外壁为疏松的多孔结构，有利于干细胞的接种、粘附和生长，管外壁孔隙率90.0％～95.0％，孔径280～450μm。

优选的，所述细胞悬液的细胞密度为2×10⁶个/ml，配制细胞悬液的溶剂为添加10％(v/v)胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的α-MEM培养液。

本发明还涉及一种灌流培养槽，由柱状槽体和上盖组成，所述柱状槽体与上盖可脱卸连接，上盖顶部设置有培养液进口，柱状槽体底部设置有培养液出口，所述柱状槽体轴心位置设置有实心柱体，所述柱体与外壁间形成供管道支架放置的空腔，空腔底部有供培养液流通并固定实心柱体的多孔底板。培养时培养液由上盖顶部的培养液进口进入空腔内，流经放置在空腔内的管道支架，然后由柱状槽体底部的培养液出口流出。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明提供的灌流培养系统中灌流培养槽构造适合管道支架的装配，柱状槽体内中央的柱体可堵塞管道支架的内孔，以利于槽体经培养液进口流入的培养液能全部流经管道支架的管外壁孔隙，保证管道支架外壁孔隙内的细胞获得培养液营养；

(2)本发明提供的灌流培养系统中灌流培养槽内径大小以及长度可调整，因此可以适用于多种细胞-管道支架复合物的制备，适合不同管道组织的受损后修复。

(3)本发明可采用注射器多次真空处理的接种方法，提高了骨髓间充质干细胞在PCL管道支架内的接种效率，并提高了细胞在管道支架外壁内的均匀分布和扩增能力，利用这种方法可获得骨髓间充质干细胞均匀以及高密度分布的复合管道支架，有望应用于临床上管道组织损伤的修复。

(四)附图说明

图1为灌流培养装置示意图；

图2为灌流培养槽结构示意图；其中A为灌流培养槽的纵剖图，B为柱状槽体底部的横截面；

图3为荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在PCL管道支架横截面的分布情况；

图4为荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在PCL管道支架外表面的分布情况；

图5不同培养条件下PCL管道支架内骨髓间充质干细胞的细胞活力；

图6为灌流培养条件下骨髓间充质干细胞在PCL管道支架上的增殖情况。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

参见图1、图2，本发明构建由蠕动泵1、气体过滤装置2、盛装培养液的贮液瓶3、灌流培养槽4和硅胶软管5组成的灌流培养装置，通过硅胶软管5作为培养液6灌流通道连接各部件。蠕动泵1采用7524-55型(Cole-Parmer公司，上海)，以产生灌流动力，硅胶软管5(Cole-Parmer公司，上海)内径为0.35cm，灌流培养槽4由聚丙烯压模制成，用以放置细胞-管道支架复合物12，灌流培养槽4内径为8mm，灌流培养槽包括可通过螺纹14卸接的上盖10和柱状槽体11，上盖10顶部连有聚丙烯管状连接口为培养液进口，柱状槽体11底部也连有聚丙烯管状连接口为培养液出口，柱状槽体11内腔底部中央有一直径5mm的柱体15，柱体周围为多孔底板16(50目)，细胞-管道支架复合物12置于柱状槽体11内腔的多孔底板16上，细胞-管道支架复合物12外径与柱状槽体11内径相适，细胞-管道支架复合物12内径与柱状槽体上的中央柱体15直径相适，O型垫圈13置于上盖内腔顶部，用于上盖10和柱状槽体11螺纹旋接后密封灌流培养槽内腔。

贮液瓶3除了设有一个出口通过硅胶软管5连接气体过滤装置2外，分别还有一个培养液出口7和一个培养液进口8与硅胶软管5相连，连接贮液瓶3培养液出口的硅胶软管5的另一端与灌流培养槽上盖10进口相连，连接贮液瓶3培养液进口的硅胶软管5的另一端与灌流培养槽柱状槽体11出口相连，形成一个密闭的循环通道。

整个装置(除蠕动泵)均可进行高压蒸汽灭菌。灌流培养时，细胞-管道支架复合物置于灌流培养槽中，用卡头(Cole-Parmer公司，上海)将连接贮液瓶培养液出口的硅胶软管(Cole-Parmer公司，上海)中段固定到蠕动泵泵头(Cole-Parmer公司，上海)上，靠蠕动泵(Cole-Parmer公司，上海)泵头的转动作用，将贮液瓶中的培养液从贮液瓶的培养液出口泵出，经由硅胶软管进入灌流培养槽内腔后，穿过灌流培养槽中的细胞-管道支架复合物，再经由连接灌流培养槽出口的硅胶管道流回贮液瓶。灌流培养槽详细结构参见图2。细胞-管道支架复合物12外径与灌流培养槽4内径相适，再加上细胞-管道支架复合物内径与柱状槽体中央柱体15相适，使得细胞-管道支架复合物12放入灌流培养槽4中密闭情况良好，因此培养液不至于从管道支架四周或内腔流过，而主要从细胞-管道支架复合物12中穿过。装培养液的贮液瓶3瓶口装有内置0.22μm滤膜的过滤装置2用来进行气体交换。制备细胞-管道支架复合物的管状PCL管道支架由浙江大学材料与化学工程学院生物医用大分子研究所(杭州)提供。

本发明所用的供细胞立体培养的管道支架为聚己内酯(PCL)管道支架，管道支架参数：中央通道直径(内径)5mm，壁厚约1.5mm，长度约6cm，孔隙率90.0％～95.0％；孔径280～450μm。

实施例2：

本发明方法采取的一个具体方法是：取离体成人骨髓进行单个核细胞的分离后进行骨髓间充质干细胞的纯化和原代扩增培养，制备基于骨髓间充质干细胞的组织工程的种子细胞。

1、取离体成人骨髓3～5ml，加入40ml不含钙镁的磷酸缓冲液(PBS)后，900×g离心5分钟，弃去脂肪层及上清。沉淀用8ml含10％(v/v)胎牛血清(FBS，杭州四季青生物技术公司，杭州)的α-MEM培养液重新混匀，缓慢加入到4ml密度为1.077g/ml的Ficoll分离液上(Pharmacia公司，上海)，900×g离心20分钟，收集单个核细胞层，用PBS洗涤2-3次后，再用含10％胎牛血清的α-MEM培养液重悬细胞并记数。调节细胞密度至2×10⁶/ml后，接种于底面积为25cm²的培养瓶中，放置于37℃、5％CO₂培养箱内培养，3～5天后半量换液，以后每隔3天换液一次。

2、当原代培养的细胞生长到培养瓶底的大约90％时，用0.25％胰酶/1mM EDTA室温下消化5分钟，然后以1∶1的比例加入含10％胎牛血清的α-MEM培养基以中和胰蛋白酶的活性，并用吸管轻轻吹打细胞，直到贴壁细胞悬浮。离心洗涤细胞一次，再用10％胎牛血清的α-MEM培养液重新悬浮细胞，按1∶3进行传代培养。传代培养过程中隔日更换一次培养液，进行扩增培养。传至第三代的骨髓间充质干细胞备用于接种管道支架。

实施例3：

取经2小时95％酒精前期处理，再经过75％酒精消毒过夜的PCL管道支架，用无菌纱布吸干后，在超净台中慢速风机吹干，收集备用。

取上述第三代的骨髓间充质干细胞，用含10％FBS的α-MEM培养液调节细胞密度至2×10⁶个/ml后，吸取400μl细胞悬液均匀滴至管道支架管外壁的外表面上，待其吸收完全后将整个管道支架置于无菌的20ml注射器内，多次抽真空处理以使得细胞能均匀地进入管道支架的管外壁内部。以400μl细胞悬液均匀接种加上抽真空处理的接种方法和400μl细胞悬液均匀接种加自然渗透的接种方法作对照。

接种完毕后，取出管道支架放于细胞培养板六孔板中，2h后，加5ml含10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的α-MEM培养液，于静态培养24小时后转移到动态培养体系制备细胞-管道支架复合物。然后分别于0天、6天、12天、18天取出细胞-管道支架复合物，用PBS洗2～3次后，取管道支架中段截面置于24孔板内，加入5μg/ml的荧光素二乙酯(FDA，Merck公司，上海)工作液1ml于24孔板内，37℃孵育10分钟。吸去FDA染液，PBS洗2～3次后将管道支架转移到载玻片，荧光显微镜下观察细胞在管道支架管外壁内部的分布情况，结果见图3、图4。

上述两种细胞悬液接种方法所产生的PCL管道支架管外壁内骨髓间充质干细胞的分布情况如下：荧光染色图片显示，每个时间点上，采取自然渗透法接种的人骨髓间充质干细胞主要分布于管道支架管外壁的外表面，横截面的内部几乎没有细胞存在；相比之下，采取抽真空处理法接种人骨髓间充质干细胞在PCL管道支架管外壁横截面上的分布则均匀很多，尤其在灌流培养18天后，细胞在管道支架管外壁的整个截面几乎都有分布。可见，采取抽真空处理法可以使细胞在PCL管道支架的管外壁内分布得更均匀。

实施例4：不同培养方法获得的PCL管道支架上骨髓间充质干细胞的细胞活力检测

设置静态培养、0.2ml/min流速灌流培养两种培养方法。取上述均匀接种辅助抽真空处理的接种方法接种后静态培养一天的细胞-管道支架复合物，继续在六孔板中静态培养，为静态培养组；取上述均匀接种辅助抽真空处理的接种方法接种后静态培养一天的细胞-管道支架复合物，转入灌流培养体系的灌流培养槽中以0.2ml/min流速灌流培养，为0.2ml/min流速灌流培养组。两种培养方法下培养18天，期间每6天对上述细胞-管道支架复合物进行MTT法检测细胞活力情况，结果见图5，可见在低流速灌流培养条件下，PCL管道支架上种子细胞的活力在培养后期明显高于静态培养对照组。此外，每0天、6天、12天和18天通过DNA总含量的测定对灌流培养条件下PCL管道支架上的细胞数量进行检测，分析人骨髓间充质干细胞在管道支架上的增殖能力，结果见图6，可见在低流速培养条件下，种子细胞能有效地黏附，细胞数量稳定增加。

取出上述细胞-管道支架复合物，用PBS洗3次后，将管道支架剪成小片后加入1m10.5mg/ml的MTT工作液，37℃培养箱孵育4～5小时。然后将支架取出后，再将其继续剪碎后加入0.8ml二甲基亚砜(DMSO)，振荡溶解，于8000r/min离心5分钟后，取上清液加于96孔板中检测，酶标仪于490nm处读取吸光值。

取出细胞-管道支架复合物，PBS洗3次，于ddH₂O中保存于-20℃，待检。检测时，取出管道支架，室温融解，加细胞裂解液裂解30分钟，取裂解液50μl加于96孔板，与50μlTNE缓冲液混合，再加入100μl Hoechst33258染色液(Sigma，上海，2×，2μg/ml)，室温孵育5分钟，多功能酶标仪(Infinite M200，Tecan，Austrilia)测荧光强度(Ex350nm/Em450nm)。小牛胸腺DNA(Sigma，上海)作为标准品绘制标准曲线。

依据上述实验结果，在构建基于骨髓间充质干细胞的组织工程产品时，以低流速进行的灌流培养是最适合的，既可以促进骨髓间充质干细胞的增值，又可以确保管道支架内的干细胞不会流失。

结论：

(1)基于干细胞为基础的组织工程研究，本发明提供的配合灌流培养系统的灌流培养槽构造设计适合细胞-管道支架复合物的灌流培养。柱状槽体内中央的柱体可堵塞管道支架的中央通道(内孔)，以利于上盖经培养液进口流入的培养液能全部流经管道支架的管外壁孔隙，保证管道支架外壁孔隙内的细胞获得培养液营养。

(2)采用抽真空处理辅助均匀接种的方法在PCL管道支架上接种骨髓间充质干细胞，达到了较高的种子细胞接种效率以及细胞在管道支架管外壁内的均匀分布：比较常用的自然渗透方法，采取真空处理辅助均匀滴种的方法接种的PCL管道支架中细胞分布明显比前种方法均匀很多。表明真空处理辅助均匀滴种的方法接种具有更好的接种效果。

(3)在低流速灌流培养条件下，PCL管道支架上种子细胞的活力在培养后期明显高于静态培养对照组。同时，在低流速培养条件下，种子细胞能有效地黏附，细胞数量稳定增加。说明低流速灌流培养方法更有利于骨髓间充质干细胞在PCL管道支架内粘附、增殖和均匀分布。比较静态培养，低流速灌流培养有利于PCL管道支架内部种子细胞的存活和增殖，使得细胞分布均匀。

Claims

1.一种骨髓间充质干细胞-管道支架复合物的制备方法，所述方法包括：

（1）细胞接种：将供细胞立体培养的管道支架经消毒处理后，吸取第3代骨髓间充质干细胞的细胞悬液，均匀滴加至管道支架外表面，待吸收完全后将管道支架置于注射器内，负压抽吸2～5次；所述管道支架为聚己内酯管道支架，管内壁为光滑致密结构，管外壁为疏松的多孔结构，管外壁孔隙率90.0%～95.0%，孔径280～450μm；

（2）静态培养：将接种后的管道支架置于细胞培养装置中，添加干细胞培养液中静态培养20～30小时；

（3）灌流培养：将管道支架置于灌流培养槽中，所述灌流培养槽内径与所述管道支架外径相匹配，轴心位置设置有与所述管道支架中央通道相匹配的实心柱体，管道支架放置于柱体与外壁间的空腔内，空腔底部有供培养液流通的多孔底板；往灌流培养槽中通入干细胞培养液，在0.1～0.3mL/min流速下灌流培养10～15天，制备得到所述骨髓间充质干细胞-管道支架复合物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述干细胞培养液为添加10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的α-MEM培养液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞悬液的细胞密度为2×10⁶个/ml，配制细胞悬液的溶剂为添加10%胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的α-MEM培养液。

4.一种灌流培养槽，由柱状槽体和上盖组成，所述柱状槽体与上盖可脱卸连接，上盖顶部设置有培养液进口，柱状槽体底部设置有培养液出口，所述柱状槽体轴心位置设置有实心柱体，所述柱体与外壁间形成供管道支架放置的空腔，空腔底部有供培养液流通并固定实心柱体的多孔底板。