JPWO2014049701A1 - 細胞培養容器およびそれを用いた細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

細胞を保持、培養するための細胞培養容器であって、培地および細胞を、または培地のみを収容する第一容器と、第一容器上部に、培地および細胞を、または培地のみを収容する第二容器と、第一容器を保持しかつ第二容器を収納する本体容器と、該本体容器と係合する蓋部材とを備え、本体容器は、第一容器を該本体容器内に固定して保持する押え部を有し、第二容器は、押え部により、第一容器内に偏心して保持される。

Description

本発明は、細胞を培養する細胞培養容器とそれを用いた細胞培養装置に関するものである。

自分の細胞もしくは他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療では、生体から採取した細胞を、しばしば培養して細胞数を増やす、あるいはしかるべき形に組織を形成させて移植治療に用いられる。治療に用いる細胞の培養は、細胞プロセシングセンタ（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に準拠して行わなければならない。ここでの課題は、細胞培養は技術者の手によって行われるために、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという点と、手動で操作することによる生物学的汚染リスクがあるという点である。

これらの課題を解決する手段として、閉鎖系で細胞培養工程を自動化する装置が開発されてきた。これは、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、細胞培養工程の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成されるものである。

他方、細胞には、増殖させる過程においてフィーダー細胞という栄養細胞から産生される成長因子を必要とする細胞種と必要としない細胞種がある。再生医療において注目されている、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ）細胞やｉＰＳ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ）細胞、および皮膚上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞といった細胞種は、しばしばフィーダー細胞が必要である。培養した細胞を治療に用いる場合、フィーダー細胞と治療に用いられる細胞は分離された状態で培養することが望ましく、２層の培養層を有する細胞培養容器にて細胞培養することが望ましい。

この課題を解決する手段として、特許文献１に示すような細胞培養容器及び培養装置が提案されている。ここでは２層の培養層を有する細胞培養容器を用い、細胞や培地を供給または排出する流路、および細胞観察用機器を備えることで、皮膚上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞といった上皮系の細胞種を閉鎖系で自動培養を行い、培養状態を観察することが可能である。

また、増殖過程においてフィーダー細胞を必要としない細胞種の自動培養を実現する装置として、特許文献２に示すような培養装置が提案されている。ここでは、幹細胞を主とした細胞を１層の培養層で培養する自動培養装置が開示されている。

特許文献３には細胞と基板材料との接着状態を観察する方法が開示されている。

特許４６０２４６０号公報 特開２００７−３１２６６８号公報 特開２００５−１５１８６６号公報

通常細胞の培養時間は２から３週間要し、この期間細胞の育成状態を観察する手段として、顕微鏡や位相差顕微鏡を利用して観察している。このため培養容器には光透過性を有するポリスチレン、ポリカーボネート素材の培養容器が使用されている。また、上記の細胞種は培養が進行すると培養容器の底部に接着して広がり、やがて厚みを伴った細胞のシートとなる。細胞が培養容器に安定に接着するためには、本来疎水性であるポリスチレン等の表面を親水性とする改変処理が必要であり、通常市販されている培養皿にはコロナ放電加工により親水性処理が為されている。しかしながら特許文献１に示すような２層の培養層を有する細胞培養容器を用いて培養する場合、以下に述べる４つの課題があった。

第１の課題は、閉鎖系培養容器を用いた場合、細胞培養容器には培地等を送排出できるよう継手部材や管状部材等が設けられ、円形を成す培養面の対角に配置していた。顕微鏡観察においてはこれらが光源からの照射光を遮り、明瞭な観察画像を得にくくしていた。

特許文献２に記載の自動培養装置は、特許文献１の装置と同様に、閉鎖系の培養器（培養容器）を使用して、幹細胞の培養を主とした自動培養装置である。ここでも培養器に対して細胞観察手段が具備されているが、細胞観察手段と培養器との間に培養器を保持するインキュベータが介在しており、観察対象と観察手段との構成の工夫について具体的な明示は無かった。

特許文献３に記載の試料基板ホルダは、観察視野に支障する送排出できるよう供給ポート等の明示はないが、本例は開放容器であり、容器を密閉し、かつ液体供給の必要性から生じている上記課題を解決できない。

第２の課題は、培養容器から培地等を排出するとき、新しい培地で古い培地を押しだすように培地交換がなされていた。その結果、古い培地が新しい培地と混じり合い、古い培地成分が培養容器内に残存するため、細胞培養における再現性を損なう可能性があった。即ち培地交換の際は容器内に古い培地の残留を極力低減する必要がある。
第３の課題は、培養表面は上記した親水性処理が容器の内面に為されているが、培養容器自体が特殊な形状であるため、親水性処理は困難であった。加えて表面処理費を含めると容器価格が高価となる側面もあった。さらに培養表面処理の状態に依っては細胞培養自体が不安定となる危険性もあった。

第４の課題は、従来技術では培養容器への液体供給は着脱式の管状部材を介して行われるが、管状部材を離脱したとき、管状部材が細胞培養空間外に露出する。このとき外部からの微生物を含む粒子の侵入の恐れがあった。

本発明は、上記各課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的の１つは、細胞培養における細胞の明瞭な観察ができる細胞培養容器を提供することにある。

本発明の代表的なものの一例を示すと、次の通りである。

細胞を保持、培養するための細胞培養容器であって、培地および細胞を、または培地のみを収容する第一容器と、前記第一容器上部に、培地および細胞を、または培地のみを収容する第二容器と、前記第一容器を保持し、かつ前記第二容器を収納する本体容器と、該本体容器と係合する蓋部材とを備え、前記本体容器は、前記第一容器を該本体容器内に固定して保持する押え部を有し、前記第二容器は、前記押え部により、前記第一容器内に偏心して保持されることを特徴とする。

本発明に係る細胞培養容器によれば、第二容器が第一容器内に偏心して保持されるため、顕微鏡などの観察視野を阻害するものが排除される。このため、細胞培養の育成状態の明瞭な観察が可能となる。

本発明の第１の実施例に係る、細胞培養容器の構造を示す平面図である。 図１ＡのＢ−Ｂ‘断面図を示す図である。 第１の実施例における、細胞培養容器の分解図である。 第１の実施例における、細胞培養容器の各構成要素の相互関係を説明するための図である。 第１の実施例に係る、１個の細胞培養容器、送液手段、及び細胞観察手段を含む、細胞培養装置の構成を示す図である。 第１の実施例に係る、細胞培養装置における細胞培養の操作、観察操作のフローチャートを示す図である。 第１の実施例に係る、細胞培養装置を用いた細胞培養に係る動作タイムチャートを示す図である。 第１の実施例に係る、培地の排出方法を示す図である。 第１の実施例に係る、細胞観察結果の一例を示す図である。 第１の実施例における、複数の細胞培養容器を搭載した細胞培養装置の構成図である。 本発明の第２の実施例に係る、細胞培養容器の構造図である。 本発明の第３の実施例に係る、細胞培養容器の構造図である。 第３の実施例に係る、細胞培養容器の他の構成例を示す図である。 本発明の第４の実施例に係る、細胞培養容器の縦断面である。

本発明の細胞培養容器およびそれを用いた細胞培養装置は、上記各課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例を挙げると次の通りである。

細胞を保持、培養するための培養容器であって、培地および細胞を、または培地のみを収容する第一容器と、該第一容器上部に、培地および細胞を、または培地のみを収容する第二容器と、該第一容器を保持し、かつ該第二容器を保持する本体容器と、該本体容器と係合する蓋部材を有する培養容器において、該本体容器は該第一容器を加圧保持する押え部を有し、該第一容器と該第二容器とは、該押え部により偏心保持されることを特徴とする。

また、上記細胞培養容器において、該培養容器の蓋部材に外部の流路と接続可能な複数の管路を備え、該複数の管路は第二容器における中心線より一方の側の領域に設置されていることを特徴とする。

さらに、上記細胞培養容器において、該第一容器は該押え部により加圧固定され、該第二容器は該蓋部材によりそれぞれ加圧固定されることを特徴とする。

さらに、上記細胞培養容器において、該第一容器は弾性体を介して本体容器に固定され、該本体容器より露出した外面を有し、該蓋部材は第二の弾性体を介して固定され、該培養容器は気密に保持されることを特徴とする。

さらに、上記細胞培養容器において、該押え部における貫通穴は、第一容器の内径より狭くかつ第二容器の外径より大きいことを特徴とする。

また、上記培養容器において、該第一容器からの培地の排出する管路の開口端は、該第二容器の外面の最下点に近接配置することを特徴とする。

また、上記細胞培養容器を用いた細胞培養装置において、該培養容器の蓋部材に外部の流路と接続可能な第一、第二、第三、第四の管路を備え、該第一乃至第四の管路は第二容器における中心線より一方の側の領域に設置され、該一方の側の領域において、該第一乃至第四の管路は該第一容器への培地の供給または排出、あるいは第二容器への培地の供給または排出する送液を制御する送液制御手段に接続されることを特徴とする。

さらに、上記細胞培養容器を用いた細胞培養装置において、該第一容器は弾性体を介して本体容器に固定され、該本体容器より露出した外面を有し、該培養容器に近接かつ正対して配置された細胞観察手段を有することを特徴とする。

本発明に係る細胞培養容器によれば、第１の課題に関して、観察対象である培養皿と細胞観察手段との構成において、透明性の確保された培養皿が閉鎖された培養容器の外面に露出して正対しており、顕微鏡などの観察視野を阻害するものが排除されている。また観察視野を最大限にするため第１ポートから第４ポートを第一の容器中心より一方に集約している。このため、培養細胞の育成状態の観察が明瞭である。

第２の課題に関しては、培地の交換操作において古い培地を排出した後、新しい培地を添加するので、古い培地が残留することを防止する。培地排出の操作では、排出ポートは培養皿の最下点に位置するよう配置され、培養容器を任意の角度で保持したとき、交換すべき培地はそれぞれの容器に最下点に集合するので吸引による排出が容易に行える。また第一容器と第二容器の中心が偏心しており、内壁に生じる培地の表面張力は小さく、培地排出の操作の際の培地の残留量が少なくなる。また、培養容器を傾けたときに第二容器の外側容器底部付近に培地排出の開口端を設ければ、第一容器の内側底部と第二容器の外側底面との間に残留する古い培地の回収量をより高めることが出来る。

第３の課題に関しては、細胞を培養する第一容器として手操作で使用している表面処理済みである培養皿を使用でき、表面状態を安定に維持できる。その結果、安定した細胞培養が可能となる。この培養皿は市販されており、同様のものを使用することで表面処理費用を安価で実現する。

第４の課題の外部からのコンタミ防止に関しては、培養容器及び流路は完全閉鎖系であって培養容器外に露出した構造をもたないので、外部からの微生物を含む粒子の侵入を防ぐことが出来る。また内部構成において、細胞培養容器の押え部が第一容器の側壁として作用する中空の節部を有しており、第一容器へフィーダー細胞液を播種する際に生じた飛沫は、この節部が障壁となって第二容器の内部に到達することを防ぐことが出来る。
本発明に係る細胞培養装置によれば、細胞培養を安定して行うことが出来、またその培養状態の観察を容易に実施できる手段を設け、なおかつ完全閉鎖系での細胞の自動培養手段を設けているので、無菌状態で細胞を安定に培養することが出来る。

以下、添付図面を参照して本発明の種々の実施例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。なお、本明細書においては、培養液を培地と称する場合がある。

以下、本発明の細胞培養容器およびそれを用いた細胞培養装置の第１の実施例を、図１Ａ〜図７を参照しながら説明する。

＜細胞培養容器の構造＞
図１Ａ、図１Ｂは、第１の実施例における細胞培養容器の構造を示す図であり、図１Ａに平面図を示し、図１Ｂに図１ＡのＢ−Ｂ‘断面図を示す。図２Ａは、第１の実施例における細胞培養容器の分解図である。図２Ｂは、細胞培養容器の各構成要素の相互関係を説明するための図である。

細胞培養容器１は、本体容器２と押え部６と蓋部材１５とを有し、全体として、外形がほぼ円筒形状の容器であって、ポリカーボネート（以下ＰＣと略記）、ポリスチレン（以下ＰＳと略記）、ポリプロピレン（以下ＰＰと略記）などの可塑性と共に剛性有するプラスチックから成る。本体容器２はその内部に第一の容器及び第二の容器を収納する機能を有し、射出成形などにより形成され、底面に開口部３が形成されている。この開口部３に隣接してリング形状であるゴムシート（第一の弾性体）４が設置され、ゴムシート４を介して本体容器２内に培養皿（上記第一の容器）５が設置される。この培養皿５は、ＰＣ、ＰＳなどの可塑性と共に剛性を有するプラスチックから成り、細胞が懸濁された培地を保持できる。また用途に応じてはガラス素材も使用できる。この培養皿５は市販のもの等入手可能であれば良い。例えば、ＢＤ社製、コーニング社製、グライナー社製などがあり、使用可能な製品は限定されない。培養皿５の内側底面は、細胞接着性能が確保された親水性などの表面処理が為され、接着性細胞等の培養・増殖が可能である。

図１Ａ、図１Ｂは、本体容器２と培養皿５とが固定化された状態を示している。押え部６は筒状であって、中空の節部９を有している。すなわち、この節部９に、外形が逆円錐台状のインサート容器（上記第二の容器）１１を受ける逆円錐台状の貫通穴１０が設けられている。この節部９の下面は培養皿５の円周上縁に接している。この押え部６は培養皿５の上方より本体容器２の内円周に沿って、はめ合いにより着脱可能に半固定される。すなわち、本体容器２の内筒面に設けられたはめ合い突起７が、押え部６の外筒面に設けられた段部付きのはめ合い溝８と係合し、押え部６と本体容器２との間にわずかに回転角度を与えたとき、はめ合い突起７がはめ合い溝８の段部に係合し押え部６と本体容器２との固定が完了する。このとき同時に培養皿５の底面に位置するゴムシート４は、培養皿５と押え部６とに挟まれ圧力を受けて弾性変形し、本体容器２と培養皿５を気密に封止する。また、この半固定状態から、押え部６を逆方向に回転角度を与えると押え部６と本体容器２とは分離する。はめ合い突起７とはめ合い溝８の組み合わせが３組以上あれば、本体容器２と押え部６の位置関係を水平に維持できる。なお、押え部６と本体容器２とを水平に着脱可能に固定する手段としては、ねじ結合等、他の手段を用いても良い。

また、細胞培養容器１は、本体容器２の底面の開口部３に面する領域において、培養皿５が外面に露出している。

押え部６は、その節部９の下方の内筒空間部１００に培養皿５を保持する一方で、第二の容器であるインサート容器１１をその節部９の上部平面に保持することができる。インサート容器１１は、図１Ａにあるように上面にフランジ部１２を有し、そのフランジ部１２と平行面をなす底面には物質透過膜１３が設けられており、この容器１１内に細胞が懸濁された培地を保持できる。インサート容器１１の素材は、ＰＣやＰＳ、ポリエチレンテレフタラート（以下ＰＥＴと略記）などの可塑性と共に剛性を有するプラスチックから成り、物質透過膜１３とインサート容器１１の枠体部分は、熱溶着や超音波溶着によって製作されている。物質透過膜１３の平均孔径は、タンパク質等は通過するが細胞は通過しない大きさ、一例として０．４μｍの大きさがよい。このインサート容器１１は市販のもので良く、例えばＢＤ社製、コーニング社製、ヌンク社製などがあり、使用可能な製品は限定されない。

細胞培養容器１の蓋部材１５は、平面形状が円形若しくはほぼ円形（以下、単に円形として説明する）をなし、インサート容器１１へ培地供給する第１ポート（インサート容器注入用の第一の管路）１７と、インサート容器１１から培地排出する第２ポート（インサート容器排出用の第二の管路）１８と、培養皿５へ培地供給する第３ポート１９（培養皿注入用の第三の管路）と、培養皿５から培地排出する第４ポート（培養皿排出用の第四の管路）２０が設けられている。第１ポート乃至第４ポートは剛性をもった管路であり、蓋部材１５の上面（細胞培養容器１の外面）から下面（細胞培養容器１の内面）へと貫通穴が通じている。第１ポート乃至第４ポートは、全て、蓋部材１５の面に直角方向、換言すると細胞培養容器１（第一容器）の中心を通る軸と一致する上下方向に伸びている。

図１Ａにおいて、Ｏ１は細胞培養容器１（本体容器２、押え部６、及び蓋部材１５）の中心であり、Ｏ２はインサート容器１１の中心を示している。すなわち、インサート容器１１は細胞培養容器１内に偏心して配置されている。なお、細胞培養容器１やインサート容器１１は、平面形状が円形に限定されるものではない。例えば正六角形や楕円形等、円形以外の場合には、それらの図形全体の中心をＯ１、Ｏ２として、同様に偏心して配置すれば良い。

第１ポート１７は、細胞容器１内部では、インサート容器１１の容器上端より少し下位に開口端が配置される。第２ポート１８は、インサート容器１１の物質透過膜１３の高さに近接して配置され、なおかつ、物質透過膜１３の外周位置付近に開口端が近接して配置される。第３ポート１９は、培養皿５容器の上端より少し下位に開口端が配置される。第４ポート２０は、培養皿５の内側底面の高さに近接して配置され、なおかつ、培養皿５の内側外縁付近の位置に開口端が配置される。加えて、インサート容器１１に接続される第１ポート１７と第２ポート１８は、インサート容器１１の容器中心Ｏ２より一方の側（図１ＡではＯ２より右側の領域）に集約する。また、培養皿５に接続される第３ポート１９と第４ポート２０は、培養皿５の容器中心Ｏ１よりも、一方の側でかつ、第１ポート１７と第２ポート１８と同じ側（図１ＡではＯ１より右側の領域）に集約する。すなわち、第１ポート乃至第４ポートは、細胞培養容器１（培養皿５）の容器中心Ｏ１に対して同じ側であって、かつ、インサート容器１１の容器中心Ｏ２とは反対の側の領域に集約して配置される。

特に、第２ポート１８と第４ポート２０は、培養皿５の円中心（Ｏ１）か、もしくはインサート容器１１の円中心（Ｏ２）から見て同じ側で、かつ半径方向の同じ直線上に配置する。

蓋部材１５は、Ｏリング（第二の弾性体）１４を介して本体容器２に固定される。蓋部材１５の外周は、下の段が上の段よりも大きな外径を有する上下２段の段部構造になっている。本体容器２の上部にはＯリングを保持できる既定のＯリング溝が設けられ、Ｏリング１４はこのＯリング溝に蓋部材１５との接触面を露出して格納される。本体容器２のＯリング溝より外側には雄ねじが設けられており、これが蓋固定リング１６に設けられた雌ねじに螺合される。蓋固定リング１６は中央に開口部を持ち、その内径は蓋部材１５の外周の段部構造の外径に対応している。細胞培養容器１の本体容器２の上面開口部にＯリングを介して蓋部材１５を設置し、蓋固定リング１６を本体容器２の外周のねじ部にねじで固定することにより、蓋部材１５が本体容器２に固定される。それゆえに、蓋部材１５と本体容器２とで形成される内空間は、第１ポート１７から第４ポート２０を除き、気密に封止される。また、ねじ固定なので、水平状態で本体容器２から蓋部材１５を外すときも、本体容器２内の培地に外力が付与されることが殆どない。

細胞培養容器１の分解図である図２Ａによれば、本体容器２、ゴムシート４、培養皿５、押え部６、Ｏリング１４、蓋部材１５、蓋固定リング１６は円形をなし、それぞれの円の中心は高さ方向の軸Ｏ１−Ｏ１に沿って直列に配置される。培養皿５の直径（内径）をＤ１０、押え部６の節部９の貫通穴の下面の直径をＤ２１，節部９の貫通穴の上面の直径をＤ２２，インサート容器１１の底面の直径（外径）をＤ３１，インサート容器１１の上部開口の直径（外径）をＤ３２，フランジ部１２の長軸の長さをＤ３３とすると、これらは次式の関係にある。

Ｄ１０＞Ｄ２１、Ｄ２１＞Ｄ３１、Ｄ３２＞Ｄ３１、Ｄ２２＞Ｄ３２、Ｄ３３＞Ｄ２２
すなわち、培養皿５の内径Ｄ１０、貫通穴の下面の直径（特に区別しないときは貫通穴の直径）Ｄ２１，インサート容器１１の底面の直径（特に区別しないときはインサート容器の外径）Ｄ３１の間には、次式の関係がある。

Ｄ１０＞Ｄ２１＞Ｄ３１
なお、インサート容器１１の中心（Ｏ２）は他の部品（培養皿５、押え部６）の中心軸Ｏ１−Ｏ１に対し、わずかに数２から３ｍｍ偏心して配置されている。この効果は後述する。

細胞培養容器１の内空間１００において、インサート容器１１は押え部６の節部９に設けられた貫通穴１０を通り、その底面が培養皿５の内側底面に近接している。押え部６の節部９の下面と上面は平行面となっている。この節部９の下面に接する培養皿５の円周上縁と上記内側底面も平行であり、また、押え部６の節部９の上面に平行に接するインサート容器１１のフランジ部１２とインサート容器１１の物質透過膜１３は平行であるから、培養皿５の内側底面と物質透過膜１３とは平行な位置関係である。この平行な２つの培養面の間隔を規定するのは押え部６の節部９における培養皿５と接する点と、フランジ部１２と接する点間の垂直距離となっている。ここで、培養皿５の内側底面から培養皿５の上面までの高さをＨ１，押え部６の節部９の下面と上面間の距離（上記垂直距離）をＨ２，インサート容器１１の底面からフランジ１２までの高さをＨ３，インサート容器１１の底面から培養皿５の内側底までの高さをＨ４とすると、これらは次式の関係にある。

Ｈ１＋Ｈ２≒Ｈ３＋Ｈ４
すなわち、Ｈ１＋Ｈ２に対してＨ３＋Ｈ４は、同じ大きさ若しくは実質的に同じ大きさである。

本実施例では２つの培養面の間隔（垂直距離Ｈ２）を０.９ｍｍとした。これは一例であり、下層である培養皿に満たされた培地の液面が、物質透過膜１３に接してより高い位置に保持できるよう培地液量をも考慮して垂直距離の最適値を選択すればよい。

本体容器２には、位置決め溝２１が１個もしくは複数底面付近に設けられている。押え部６には位置決め穴２２が設けられている。蓋部材１５の下面には、位置決め穴２２と係合する位置決めピン２３が設けられている。本細胞培養容器１はステージ２４の凹部に設置され、本細胞培養容器１を設置するとき本体容器２の底形状に係合する様に設置する。ステージ２４の凹部の中央には、観察用開口部２５が設けられている。このとき、本体容器２の位置決め溝２１と係合する位置決め突起がステージ２４に設けられているので、ステージ２４に対する本体容器２の中心からの方向が既知となる。そして前記したはめ合い突起７とはめ合い溝８とが係合するので、押え部６の中心からの方向が既知となる。さらに押え部６の位置決め穴２２と蓋部材１５における位置決めピン２３がはめ合うので、蓋部材１５の中心からの方向が既知となる。故にステージ２４に対し、蓋に設けられた第２ポート１８、第４ポート２０について中心からの方向が既知となる。

先に、第３の課題として、２層の培養層を有する細胞培養では、下層で培養する細胞が上層で培養する細胞に汚染されることを防止する必要があることを述べた。特に細胞播種時において発生したフィーダー細胞を含む飛沫が上層のインサート容器内に付着する可能性が考えられる。第１の実施例では、節部９に設けた貫通穴１０の下部の直径Ｄ２１は、培養皿５の内径Ｄ１０よりも小さくインサート容器１１の底面の外径Ｄ３１よりも大きく構成されているので、節部９は、インサート容器１１よりも外側にある培養皿５の開口面を上から覆う側壁として作用する。これにより、第３ポート１９から培養皿５へフィーダー細胞液を播種する際に生じた飛沫は、節部９が障壁となってインサート容器１１の内部に到達することを防ぐことが出来る。

＜細胞培養容器と自動細胞培養装置の構成＞
図３は、第１の実施例の細胞培養容器を用いた自動細胞培養装置の一例である。すなわち、図３は、細胞培養容器1と、この細胞培養容器への培地の供給または排出の送液を制御する送液制御手段を備えた自動細胞培養装置における、送液・送気方法および、観察手段との関係を示す図である。細胞培養容器1は細胞培養に最適な培養温度で保持する必要があり、図３に示す細胞培養容器1等の構成品は、図示しない恒温槽に設置される。なお、本実施例においては細胞培養容器１に細胞を含む培地を送液する場合と、培地のみを排出・送液する場合とがある。また共通の送液流路を利用して細胞培養容器１送気を行う場合がある。

細胞培養容器１の第１ポート１７には、送液制御手段の第１容器開閉弁３０がゴムチューブによって接続され、その上流は２分岐され、一方は第１ポンプ３１に接続され、もう一方は第１排気開閉弁３２に接続され、さらにその上流にはフィルタが接続され、フィルタのもう一方の接続口は大気に解放されている。この第１容器開閉弁３０および第１排気開閉弁３２に使用する弁機構は、電磁弁が好適である。いわゆる電磁弁は電磁石の作用により開閉する部品にゴムチューブを挟み込み（接続）、電磁弁のＯＮＯＦＦによりゴムチューブを弾性変形させて管部を絞ったり、開放させたりする機構である。以下弁なるものは電磁弁を意味する。第１ポンプ３１に使用するポンプには、一般のローラポンプが好適である。いわゆるローラポンプはモータ軸に取り付けたローラにゴムチューブを巻きつけて（接続）、モータ回転によってゴムチューブを弾性変形させて内部の気体や液体を送液する機構である。以下ポンプはローラポンプを意味する。フィルタ３２は、流路の外部から気体を取り込んで、流路内部の気圧を調整するものであり、例えば０．２２μｍ以上の粒子を通さない品質のものを使用する。以下フィルタは同様のものを意味する。

第１ポンプ３１の上流は２分岐され、一方は第１細胞開閉弁３４に接続され、もう一方は第１培地切換え弁３５に接続する。第１細胞開閉弁３４の上流は２分岐され、一方は第１細胞減圧弁３６に接続され、その上流はフィルタに接続し、もう一方は第１細胞液３７に接続される。第１細胞液３７の構成は、細胞バックの内部に培養目的とする細胞が培地に懸濁した状態で保持される。第１細胞液３７を保持する細胞バッグには、導入管と内部の気圧を調整するフィルタが設けられる。

細胞培養容器１の第３ポート１９には、第２容器開閉弁３８がゴムチューブによって接続され、その上流は２分岐され、一方は第２ポンプ３９の方向に接続され、もう一方は第２排気開閉弁４０に接続され、さらにその上流はフィルタが接続され、フィルタのもう一方の接続口は大気に解放されている。第２ポンプ３９の上流と下流は各々２分岐され、第２ポンプ３９をバイパスするように接続され、その間に第２ガス開閉弁４１が接続される。

第２ポンプ３９の上流は２分岐され、一方は第２細胞開閉弁４２に接続され、もう一方は再度２分岐され、一方は第１ガス開閉弁４３に接続され、もう一方は第２培地切換弁４４に接続されている。

第２細胞開閉弁４２の上流は２分岐され、一方は第２細胞減圧弁４５に接続され、その上流はフィルタに接続し、もう一方は第２細胞液４６に接続される。第２細胞液４６の構成は、細胞バックの内部に培養目的とする細胞が培地に懸濁した状態で保持される。第２細胞液４６を保持する細胞バッグには、導入管と内部の気圧を調整するフィルタが設けられる。

上述した第１培地切換え弁３５と第２培地切換え弁４４の上流は共に、予熱機構４７に接続され、その上流は２分岐され培地液４８と培地液減圧弁４９とに接続する。培地液４８は、細胞バックの内部に培地が保持されており、培地は冷蔵庫２６により冷蔵保持されている。細胞培養時には、培養過程の細胞は３７℃に保持されており、冷温保持された培地を直接添加すると細胞増殖を不安定にさせるため、培地は予熱機構４７を通過することで加温されたのち細胞培養容器1に添加することが出来る。

上述した第１ガス開閉弁４３の上流には加湿ボトル５０が接続され、加湿ボトル５０の上流には最適濃度で加圧された炭酸ガスのボンベ５１が接続される。細胞培養中の培地はｐＨ値が径時的に変化することを防止するため、定期的に炭酸ガスで培地液の表面よりガス交換を行う必要がある。加えて培地の蒸発による培地成分の濃縮も防止する必要がある。ボンベ５１より導出した炭酸ガスは加湿ボトルにおいて最適湿度に加湿され待機される。

細胞培養容器の第２ポート１８には、ゴムチューブによって第４ポンプ５２に接続され、その下流は第４容器開閉弁５３に接続され、その下流は上層排液ボトル５４に接続される。第４ポート２０にはゴムチューブによって第３ポンプ５５に接続され、その下流は第３容器開閉弁５６に接続され、その下流は下層排液ボトル５７に接続される。

細胞培養容器１を設置したステージ２４の観察用開口部２５の下方には、顕微観察ユニット６０が配置されている。一方、細胞培養容器１の第１ポート乃至第４ポートの上方には、顕微観察ユニットの一部である照射光部６１が配置されている。また、ステージ２４に対しては、上下駆動装置（図示略）によって、顕微観察ユニット６０に対する上下位置の調節及び傾き角の調節を行うことができる。

図３において、観察用開口部２５は、インサート容器１１における物質透過膜１３の外径よりも大きく、インサート容器１１の底面以上の観察範囲を有している。さらに本実施例では、細胞培養容器１に接続された第１ポート１７、第２ポート１８、第３ポート１９、第４ポート２０がインサート容器１１の中心Ｏ２より一方の側の領域にのみ、例えば、図１Ｂ、図２Ｂに示したように右半分の領域、さらには、培養皿５の中心Ｏ１よりも右側半分の領域にのみ、設置されている。即ち、インサート容器１１の、観察対象とする細胞の他方の領域（例えば、図１Ｂ、図２ＢのＯ２より左側半分の領域）を含む半分以上の領域において、流路およびゴムチューブの設置が回避されているので、観察視野が半分以上保証される。

７０はコンピュータを用いたコントローラであり、例えばプログラムによりコンピュータに、ポンプや電磁弁等の送液制御手段のＯＮ，ＯＦＦ制御、その他、自動細胞培養装置の全般的な制御を行う機能を実現させる。すなわち、コントローラは、第１ポート乃至第４ポートを経由した細胞培養容器1に対する送排液・送排気の制御を行い、かつ、オペレータによる細胞培養容器1内の細胞観察をサポートする。

＜細胞培養の操作、観察操作＞
図４Ａは、コントローラ７０で制御される、細胞培養装置における細胞培養、観察の全体的な操作のフローチャートを示している。まず、細胞培養容器1のインサート容器１１に細胞播種（第１細胞添加）を行い（Ｓ０１）、培養皿５に細胞播種（第２細胞添加）を行う（Ｓ０２）。さらに、細胞培養容器にＣＯ２ガスを充填したのち（Ｓ０３）、培養・静置し（Ｓ０４）、顕微鏡による観察を行い（Ｓ０５）、培地の交換を開始するかの判定を行う（Ｓ０６）。培地の交換に当たっては、インサート容器（上層）培地排出（Ｓ０７）、インサート容器（上層）培地添加（Ｓ０８）、培養皿（下層）培地排出（Ｓ０９）、培養皿（下層）培地添加（Ｓ１０）を行い、さらに、細胞培養容器にＣＯ２ガスを充填したのち（Ｓ１１）、培養・静置し（Ｓ１２）、顕微鏡による観察を行い（Ｓ１３）、細胞培養が終了したか否かの判定を行う（Ｓ１４）。細胞培養が終了したら、培養した細胞の取り出しを行う（Ｓ１５）。

図４Ｂは、コントローラ７０で制御される、細胞培養容器1おける送液・送気のタイムチャートを表している。横軸は操作項目と時間軸を示し、縦方向には図３で明示した第１細胞開閉弁３４から第４ポンプ５２の各電磁弁と各ローラポンプの動作タイミングを示している。初期状態では全ての弁がＯＦＦであるので閉止であり、全てのポンプがＯＦＦであるので、送液停止の状態である。

細胞培養容器1内のインサート容器１１に細胞播種を行うとき（図４ＡのＳ０１）は、第１細胞添加の動作に従う。初期状態から第１細胞開放弁３４と、第２容器開閉弁３８と第１容器開閉弁３０と第２排気開閉弁４１をＯＮとしてこれらの弁を開放すると、第１細胞液３７から第１細胞減圧弁３４と第１容器開閉弁３０が通じて、第１ポート１７までの流路が通じる。また外気に連通するフィルタから第２排気開閉弁４０と第２容器開閉弁３８が通じて、第２排気開閉弁４０に接続されたフィルタから第３ポート１９までの流路が通じる。次いで第１ポンプ３１を所定時間ＯＮすると、第１細胞液３７から細胞液が送液され、第１ポート１７を経てインサート容器１１に細胞液が到達する。細胞容器１は密閉されているが、第３ポート１９から外気に通じるフィルタまでが開放されているので、細胞容器１の内部のインサート容器１１及び培養皿５内の気圧は適当な値に調整される。次いで、第１ポンプ３１を所定時間ＯＦＦとし、次に第１細胞減圧弁３６をＯＮとして外気に通じるフィルタと第１細胞液３７までの流路が通じると、流路の途中（分岐位置よりも上流側）の細胞液が第１細胞液３７へ戻り、この流路内に空気の節が構成される。再度第１ポンプ３１を所定時間ＯＮすると、流路内の細胞液は第１ポート１７を経てインサート容器１１まで到達する。所定量の注入が為された後、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止する。

次に、培養皿５に細胞播種を行うとき（Ｓ０２）は、第２細胞添加の動作に従う。初期状態から第２細胞開放弁４２と、第１容器開閉弁３０と第２容器開閉弁３８と第１排気開閉弁３２をＯＮとしてこれらの弁を開放すると、第２細胞液４６から第２容器開閉弁３８が通じて、第３ポート１９までの流路が通じる。またフィルタ３３から第１排気開閉弁３２と第１容器開閉弁３０が通じて、第１ポート１７までの流路が通じる。次いで第２ポンプ３９を所定時間ＯＮすると、第２細胞液４６から細胞液が送液され、第３ポート１９を経て培養皿５に細胞液が到達する。細胞容器は密閉されているが、第１ポート１７から外気に通じるフィルタ３３までが開放されているので、細胞容器の内部の気圧が調整される。次いで、第２ポンプ３９を所定時間ＯＦＦとし、次に第２細胞減圧弁４５をＯＮとして外気に通じるフィルタと第２細胞液４５までの流路が通じると、流路の途中（分岐位置よりも上流側）の細胞液が第２細胞液４６へ戻り、流路内に空気の節が構成される。再度第２ポンプ３９を所定時間ＯＮすると、流路内の細胞液は第３ポート１９を経て培養皿５まで到達する。所定量の注入が為された後、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止する。

細胞培養容器１の内部をＣＯ２ガスで満たすとき（Ｓ０３）は、ＣＯ２ガス充填の操作に従う。初期状態から第１容器開閉弁３０と第２容器開閉弁３８と第２ガス開閉弁４１と第１排気開閉弁３２をＯＮとして各弁を開放すると、第１ガス開閉弁４３と第２容器開閉弁３８が通じて第３ポート１９までの流路が通じる。またフィルタ３３から第１排気開閉弁３２と第１容器開閉弁３０が通じて、第１ポート１７までの流路が通じる。次いで第１ガス開閉弁４３を所定時間ＯＮすると、ボンベ５１より加湿ボトル５０を通じて、第２容器開閉弁３８から第３ポート１９を経て細胞容器１に最適に加湿されたＣＯ２ガスが到達する。細胞容器１は密閉されているが、第１ポート１７から外気に通じるフィルタ３３までが開放されているので、細胞容器の内部のＣＯ２ガス圧は大気圧に調整される。所定量のＣＯ２ガスの注入が為された後、以上の各弁をＯＦＦとして閉止する。

細胞培養は、第１細胞液がインサート容器１１に保持され、第２細胞液が細胞皿５に保持され、培養容器１の空間が最適に加湿されたＣＯ２ガスで保持され、細胞培養容器１が最適な温度に保持されているので、所定時間静置して保持することによって細胞培養が継続される（Ｓ０４）。なお、細胞液の細胞はインサート容器１１の物質透過膜１３の上部、あるいは培養皿５の内底面に接着して増殖するので、培養に伴い成分変化した培地は細胞と分離して排出できる。

細胞培養中の細胞観察（Ｓ０５）は、培養静置の操作中に、顕微観察ユニット６０及び照射光部６１を用いて、実施する。ステージ２４には図示しない上下駆動装置によって細胞培養容器１を上下動可能であり、観察対象の細胞を顕微観察ユニット６０でより明瞭に観察するための焦点距離調整が可能である。本実施例では顕微観察には位相差顕微鏡を使用したが、倒立型などの光学顕微鏡であってもよい。

図６は、本実施例において細胞培養容器により培養実験により得られたインサート容器１１上の細胞観察結果の一例である。従来技術では培養容器の自体の透明度が低く、明瞭な観察が得にくいことが課題であったが、本実施例の観察結果においては、インサート容器において培養された細胞が明瞭に観察できる。また顕微鏡ユニット６０に対して培養皿５のほうがインサート容器１１よりも近接配置されているが、培養皿５上の細胞についても明瞭に観察可能である。即ち２層培養において顕微鏡からの焦点位置の異なる観察対象の場合においても、細胞培養容器１の上下駆動装置によって焦点距離を適宜調整することで、培養過程の複数の細胞を明瞭に観察可能である。

次に、細胞培養容器１より培地の交換を行うとき（Ｓ０６）は、図４Ｂの動作タイムチャートにおける、上層培地排出、上層培地添加、下層培地排出、下層培地添加の操作に従う。上層培地排出の操作（Ｓ０７）は、初期状態から第１容器開閉弁３０と第１排気開閉弁３２と第４容器開閉弁５３をＯＮとして各弁を開放すると、第２ポート１８から第４容器開閉弁５３を通じて、上層排液ボトル５４までの流路が通じる。またフィルタ３３から第１排気開閉弁３２と第１容器開閉弁３０が通じて、第１ポート１７までの流路が通じる。次いで第４ポンプ５２を所定時間ＯＮすると、インサート容器１１から細胞液が吸引され、上層排液ボトル５４へ培地が到達する。細胞培養容器１は密閉されているが、第１ポート１７から外気に通じるフィルタ３３までが開放されているので、細胞培養容器の内部の気圧は調整される。所定量の培地の吸引が為された後、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止する。

インサート容器１１に培地の添加を行うとき（Ｓ０８）は、上層培地添加の動作に従う。初期状態から第１培地切換弁３５と第１容器開閉弁３０と第２容器開閉弁３８と第２排気開閉弁４０をＯＮとして弁を開放し、予熱機構４７をＯＮすると、培地４８から予熱機構４７と第１培地切換弁３５と第１容器開閉弁３０が通じて、第１ポート１７までの流路が通じる。またフィルタから第２排気開閉弁４０と第２容器開閉弁３８が通じて、第３ポート１９までの流路が通じる。次いで第１ポンプ３１を所定時間ＯＮすると、培地４８から培地が送液され、第１ポート１７を経てインサート容器１１に細胞液が到達する。細胞容器は密閉されているが、第３ポート１９から外気に通じるフィルタまでが開放されているので、細胞容器の内部の気圧は調整される。次いで、第１ポンプ３１を所定時間後ＯＦＦとし、次に培地液減圧弁４９をＯＮとして外気に通じるフィルタと培地４８まで流路が通じると、流路の途中（分岐位置よりも上流側）の培地が培地４８へ戻り、流路内に空気の節が構成される。再度第１ポンプ３１を所定時間ＯＮすると、流路内の培地は第１ポート１７を経てインサート容器１１まで到達する。所定量の注入が為された後、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止する。

下層培地排出の操作（Ｓ０９）は、初期状態から第１容器開閉弁３０と第１排気開閉弁３２と第３容器開閉弁５６をＯＮとして弁を開放すると、第４ポート２０から第３容器開閉弁５６を通じて、下層排液ボトル５７までの流路が通じる。またフィルタ３３から第１排気開閉弁３２と第１容器開閉弁３０が通じて、第１ポート１７までの流路が通じる。次いで第３ポンプ５５を所定時間ＯＮすると、培養皿５から細胞液が吸引され、第４ポート２０を経て下層排液ボトル５７へ培地が到達する。細胞培養容器１は密閉されているが、第１ポート７から外気に通じるフィルタまでが開放されているので、細胞培養容器の内部の気圧は調整される。所定量の培地の吸引が為された後、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止する。

次に、培養皿５に培地の添加を行うとき（Ｓ１０）は、下層培地添加の動作に従う。初期状態から第２培地切換弁４４と第１容器開閉弁３０と第２容器開閉弁３８と第１排気開閉弁３２をＯＮとして弁を開放し、予熱機構をＯＮすると、培地４８から第２培地切換弁４４と第２容器開閉弁３８が通じて、第３ポート１９までの流路が通じる。またフィルタ３３から第１排気開閉弁３２と第１容器開閉弁３０が通じて、第１ポート１７までの流路が通じる。次いで第２ポンプ３９を所定時間ＯＮすると、培地４８から培地が送液され、第３ポート１９を経て培養皿５に細胞液が到達する。細胞容器は密閉されているが、第１ポート１７から外気に通じるフィルタまでが開放されているので、細胞容器の内部の気圧は調整される。次いで、第２ポンプ３９を所定時間後ＯＦＦとし、次に培地液減圧弁４９をＯＮとして外気に通じるフィルタと培地４８まで流路が通じると、流路の途中の培地が培地４８へ戻り、流路内に空気の節が構成される。再度第２ポンプ３９を所定時間ＯＮすると、流路内の培地は第３ポート１９を経て培養皿５まで到達する。所定量の注入が為された後、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止する。

次いで、細胞培養容器１には大気が満たされているので、ＣＯ２ガスで満たすために、ＣＯ２ガス充填の操作（Ｓ１１）を上記に従って行う。

上層培地排出および下層培地排出の操作においては、成分変化した培地は各容器に残留なきよう、極力全量排出する必要がある。図５は培地排出の際の細胞培養容器１の様子を示したものである。具体的には細胞培養容器１はステージ２４上にはめ合い設置されており、ステージ２４には図示しない上下駆動装置によって水平より１０度の傾きθが与えられている。このときステージ２４に対する第２ポート１８および第４ポート２０の中心からの方向が既知となっているので、上下駆動制御は容易である。図５に示す状態では、第２ポート１８はインサート容器１１の最下点であり、また第４ポート２０は培養皿５の最下点に位置するよう傾けられているので、交換すべき培地はそれぞれの容器に最下点に集合し、吸引による排出が容易に可能である。細胞培養容器１を傾ける角度θは任意であるが、上下駆動装置と第３ポンプ５５あるいは第４ポンプ５２の作動タイミングを適宜調整すれば、水平方向から目的の角度θにまで順次傾けながら吸引することや、吸引速度を排出開始時は遅く、終了時は早くするなど最適な方法で培地排出が可能である。

加えて、本実施例では、インサート容器１１の中心Ｏ２は培養皿５の中心Ｏ１と偏心しており、インサート容器１１をなす外壁と培養皿５をなす内壁との間隔が一様ではない。そのため、培養皿５からの培地排出の操作の際、インサート容器１１をなす外壁と培養皿５をなす内壁との間の培地のもつ表面張力は、両者が等心円であるとき外周円に沿って最大であるが、本実施例では、両者が偏心しているため表面張力は小さく、培地排出の操作の際の培地の残留量が少なくなる効果がある。

また、ステージ２４に設けた上下駆動機構は、細胞培養容器を傾ける機能を有し最下点の方向を水平方向のすべてに与えることが出来る。これを連続的に行うことで細胞容器に保持された液体に外円周に沿った流れを生じさせ回転的な運動（以降回転運動とする）を与えることが出来る。細胞播種の操作において、細胞は培養皿、あるいはインサート容器の底面で一定の間隔で定着して培養が為されることが必要であり、その際手作業では細胞皿を揺らし、目視で細胞の均一化を図っている。本実施例においては、上記した細胞播種の操作以後に上下駆動機構の操作によって、細胞を含む培地に回転運動を与えることができる。

さらに第１の実施例ではインサート容器１１の中心は培養皿５の中心と偏心しており、培養皿５の中心から内壁円周体積はインサート容器をなす外壁の存在によって一様ではない。そのため、細胞皿５の細胞播種の操作において培地に回転運動を与えたとき、本来均等な回転運動がインサート容器１１の存在によって乱され、培地は回転しつつもさらに撹拌運動が与えられるので、細胞がより一定の間隔で定着するようになる。

自動化された細胞培養では、細胞培養の過程（Ｓ１２）でしばしば細胞の状態をモニタリングし、培養状態を確認してその観察結果を記録し、場合によっては細胞培養のプロセスを変更する機能も必要である。本実施例では、細胞播種後に細胞が適度な間隔で播種されていることを、顕微観察結果（Ｓ１３）を元に確認できる。確認時、細胞が適度な間隔でない場合さらに細胞容器に回転運動を追加して、より均一で安定な細胞培養を実現する。

本実施例では、先に述べたように、第１ポートから第４ポートを第一の容器中心より一方に集約することにより、細胞培養容器１の一方の側の領域に流路およびゴムチューブが設置され、他方の領域において、流路およびゴムチューブの設置が回避されているので、顕微観察における観察視野が半分以上保証される。図６において、図の上方には容器の一部が細胞とともに観察画像に記録されており、広い観察視野を有していることが分かる。

＜細胞培養装置の全体図＞
図１と図３は、細胞培養容器１を１個搭載した構成を示しているが、これは説明簡略化のためであり、本実施例の細胞培養装置全体としては複数の細胞培養容器を搭載し、順次電磁弁とポンプを切換え実行し、送液を行うことで大量の細胞培養を行うことが可能である。

図７は、実施例１記載の細胞培養容器１を複数個ステージ２４の上面に設置した細胞培養装置６２の上面図である。加えて本図では顕微鏡観察ユニット６０と細胞培養容器１に接続されるゴムチューブ、電磁弁、ローラポンプ等の送排液流路の一部を模式的に示している。明示していないその他の構成は図３と同等である。なお、細胞培養容器１を複数Ｎ個備えるに当たっては、第１ポンプ３１と各々細胞培養容器の第１容器開閉弁３０との流路の間にＮ数の流路に分岐できる第１ポンプ分岐６３、および第２ポンプ３９と各々細胞培養容器の第２容器開閉弁３８の流路との間にＮ数の流路に分岐できる第２ポンプ分岐６４、および各々細胞培養容器の第２ポート１８と第４ポンプ５２の流路の間にＮ数の流路に分岐できる第４ポンプ分岐６５、および各々細胞培養容器の第４ポート２０と第３ポンプ５５の流路の間にＮ数の流路に分岐できる第３ポンプ分岐６５を設ける。

図４Ａのローチャート及び図４Ｂにおける送液・送気のタイムチャートを参照し、複数の細胞培養容器の各々の細胞培養容器に相対する第１容器開閉弁３０と第２容器開閉弁３８を操作すれば、細胞培養容器が複数となっても細胞培養に必要な送液・送気が実現できる。

図７の例では５個の細胞培養容器１をステージ２４に直列に配置している。細胞観察ユニット６０は直線状のステージ２４と並行に矢印方向に移動して、それぞれ細胞培養容器１の内部の細胞を観察する。その際細胞培養容器１における第１ポートから第４ポートの方向はステージ２４に対し外側の方向（図７では下方向）に配置する。その結果、第１ポートから第４ポートはインサート容器１１の中心Ｏ２より一方の領域（図７では下側の領域）にのみ設置されかつ、ステージの外側（図７では下側）に配管されるので、直線状のステージ２４に沿った顕微鏡観察ユニット６０の移動制御に支障なく送液することが可能である。またこのようなポート設置の結果、細胞培養容器１内に偏心配置されたインサート容器１１は、ステージ２４の奥側（図７では上側）に配置されるので、細胞観察の範囲は顕微鏡観察ユニット６０により近い範囲に限定できる。即ちステージ２４の形状をより小さく出来るので、自動培養装置６２自体の形状も小さく出来る。

＜培養した細胞の取り出し＞
細胞培養終了後には、細胞培養装置と細胞培養容器１の接続を解除する必要がある。本実施例においては、細胞培養容器１の第１ポート１７と第２ポート１８と第３ポート１９と第４ポート２０はそれぞれゴムチューブで自動装置内の流路に接続されている。細胞容器を取り出すときゴムチューブの途中にクレンメ等のゴムチューブを閉鎖する部材で遮断し、遮断した細胞培養から遠いチューブを滅菌済のハサミ等で切断し、細胞培養装置から細胞培養容器１を取り出すことが出来る。またゴムチューブの途中に閉鎖系システムを可能とする部材、いわゆるジョイントを設けておき、細胞培養容器と細胞培養装置の接続を解除する方法でもよい。

その際、自動培養装置の内部は３７℃に温度制御が為され、接続解除作業に長時間を要していては恒温保持するための扉等の開放時間も長く、未だ取り出しされていない細胞培養容器が温度低下を招く恐れがある。本実施例では、細胞培養容器１の第１ポート１７と第２ポート１８と第３ポート１９と第４ポート２０は、インサート容器１１の中心線より一方の領域に設置されかつ、ステージ２４の外側に整然と配管されているので、目的の細胞培養容器のゴムチューブを容易に認識でき接続解除が可能である。

細胞培養には温度環境維持が重要である。気密維持を目的として培養皿５の全体を覆うような容器内に保持して培養することは、気密容器を形成する材料の厚みが増加する分、熱伝達効率の面で不利である。それは細胞を所定の培養温度に到達するまでの加熱時間が長時間となる等の影響となる。一方で本実施例１の細胞培養容器１は、本体容器２の底面の開口部３に面する領域において、培養皿５が外面に露出しており、外気との熱伝達は培養皿５の底面を通して行われる。即ち本実施例１の細胞培養容器１は、組織培養の実現と培養容器内を気密に維持する最低限の厚みを有した培養皿が開口部３を介して気密容器の外面に露出しているので、内部の温度管理に優れているといえる。

細胞培養装置より細胞培養容器１を取り出した後、培養した細胞は滅菌エリアにおいて無菌的に取り出して移植手術などに利用する。細胞培養はＣＰＣなど無菌エリア内で行われ、移植手術も無菌的な手術室で行われるが、ＣＰＣと手術室は必ずしも併設ではないので、培養細胞は細胞培養容器に保持したまましばしば一般の病院廊下を移動する。即ち無菌清浄ではないエリアを通過する場合、細胞培養容器自体がいかに気密であってもその外面は無菌保証が為されないこととなる。従って、細胞培養容器より細胞を取り出す際は、内部の培地が漏出して、細胞培養容器の外面に触れない配慮が必須である。

本実施例では、細胞培養容器１の蓋部材１５に第１ポート１７と第２ポート１８と第３ポート１９と第４ポート２０を設け、蓋部材１５の上部より蓋固定リング１６に設けたねじ接合によって本体容器２に固定し、内部の空間を気密に維持している。培養細胞を取り出す際は、細胞培養容器１を図示しないホットプレート上に細胞培養容器を静置して温度維持し、蓋固定リング１６を回転させてねじ接合を解除する。このように細胞培養容器１を静置して、水平回転の動作によりねじ接合を解除するから、培地に外力が付与されず、培地がこぼれ出ることがない。

細胞培養容器１の蓋部材１５は、Ｏリング１４を介して蓋固定リング１６により本体容器２にねじにより加圧固定されており、また培養皿５はゴムシート４を介して、押え部６と本体容器２の結合により本体容器２に加圧固定されている。上記のように培養細胞を取り出す際に蓋固定リング１６のねじ接合を解除しても、培養皿５の加圧固定は蓋部材１５のねじ止めによる加圧固定と独立であるので、培養皿５の加圧固定が維持される。このことは培養細胞を取り出す際に培養皿５に保持されている培地の漏出を防止し、漏出範囲が限定されるので無菌的取り出しに有効である。

第１の実施例記載の細胞培養容器１は、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレンなどのプラスチックで構成されているので、多様な滅菌技術に対しても耐性があり、細胞培養の使用前の無菌維持に効果がある。使用可能な滅菌法には、過酢酸除菌剤や、エタノール除菌法、過酸化水素水滅菌法、エチレンオキサイドガス滅菌器を利用する方法などに適用できる。

さらに細胞培養容器１は多様な滅菌技術に対しても耐性があるので、繰り返し使用してはならない培養皿、インサート容器の構成品を除き、使用後に洗浄して滅菌実施を繰り返すことで用途に応じて再使用できる。このことは産業廃棄物の低減を図ることが出来る。

以下に第１の実施例の細胞培養容器を用いた、角膜上皮細胞培養による角膜上皮組織作製方法、およびその結果について説明する。

＜閉鎖系細胞培養容器の作製方法＞
図１に示した細胞培養容器のうち本体容器２、押え部６、蓋部材１５および蓋固定リング１６はＰＣを材料として射出成形により作製した。Ｏリング１４はＪＩＳ型Ｓ６０（太さ２ｍｍ、内径５９.５ｍｍ）を使用し、ゴムシート４はシリコンゴムより打ち抜き作成した。培養皿５には３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ、型番４３０１６５、コーニング社を使用した。インサート容器１１には、セルカルチャインサート（６ウェル）型番 ３５３０９０，ＢＤ社を使用し、物質透過膜９に温度応答性高分子モノマーであるN-イソプロピルアクリルアミドを電子線重合させることで、温度応答性培養表面を作製した。本培養表面上での角膜上皮細胞の接着、脱着が正常になされることを確認した。

以上の構成部品を安全キャビネット内で無菌的に組み立て、細胞培養容器を作成した。次いで、細胞培養容器を滅菌バックに入れて封止した後、エチレンオキサイドガス滅菌器、型番ＥＣ−８００、サクラ精機社、の庫内に設置して、装置取り扱い手順に従って滅菌処理を行った。

＜角膜上皮細胞の準備＞
角膜上皮細胞の培養方法について説明する。角膜上皮細胞を培養する前日に、フィーダー細胞として、マイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃、２時間処理したＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２×１０^４／ｃｍ^２となるように培地で懸濁して、第２細胞液４６である細胞バックに保持した。角膜上皮細胞はフナコシ社より購入したウサギ眼球の角膜輪部から常法に従って角膜上皮細胞を採取し、４×１０^４／ｃｍ^２となるように培地で懸濁して、第１細胞液３７である細胞バックに保持した。上記を含め培地には、５％ＦＢＳを含むＫＣＭ培地を使用し、培地４８である培地ボトルに保持し、装置の冷蔵庫２６に保持した。

＜角膜上皮細胞の培養開始＞
ＣＰＣ内に設置した細胞培養装置６２に相当する自動培養装置の内部に、上記製作した細胞培養容器を１０個設置した。各々の電磁弁と細胞培養容器をゴムチューブで接続したのち、自動培養装置の内部を３７℃に恒温保持を開始した。１時間の静置の後、自動培養操作を開始した。上層への送液量は１．５ｍＬ、下層への送液量は２.５ｍＬであり、ポンプ送液流量５ｍＬ／分より、ポンプ作動総時間は、それぞれ１８秒、３０秒に設定した。培地の送液量もこれと同様である。排出時は全量排出する目的から、上層からの送液量は３ｍＬ、下層からの送液量は４ｍＬとした。ＣＯ２ガスは湿度９５％Ｈに制御し、その送気量は送気流量１Ｌ／分であり、細胞培養容器の内容積３７ｃｍ^３より、過剰に注入することとし電磁弁開放時間を５秒（５０ｍＬ）とした。以上の動作タイムチャートは図４Ｂの概要に従った。

培地の交換は、培養開始日より５日目、７日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目に各１回実施した。ＣＯ２ガスの送気は１日に４回、６時間ごとに実施した。顕微鏡観察は５日目より、毎日１回、各細胞培養容器の下層細胞と上層細胞を各々１０エリア取得し、細胞育成状態の判断データとした。

＜角膜上皮組織の回収方法＞
培養１６日目において培地交換操作の後、細胞培養を終了し、上記に従って細胞培養容器を取り出した。安全キャビネット内に細胞培養容器を置き、室温（約２５℃）で３０分静置した。上記に従ってセルインサート容器を取り出し、その後、支持膜として、ドーナツ状にカットした親水性ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）を用いて、シート状の細胞を物質透過膜の表面より剥離回収した。

＜対照実験方法＞
培養皿として２インチ×３インチのプレートに６ウェル（ウェル内径３５ｍｍ）が構成されたセルカルチャインサートコンパニオンプレート、型番３５３５０２、ＢＤ社を使用し、インサート容器１１には、上記と同じものを使用し、温度環境およびＣＯ２ガス環境は、ＣＯ２インキュベータ、型番ＭＣＯ１９−ＡＩＣ、三洋電機社を使用し、３７℃設定、湿度９３％Ｈ設定、ＣＯ２濃度５％設定により、細胞培養を実施した。対照とした細胞は上記と同じものを使用した。

細胞播種および培地交換は手操作により実施し、滅菌されたメスピペッタを使用して上記と同じ液量を添加した。培地の交換頻度および間隔は上記実施例と同じとし、ＣＯ２ガスの制御は培養を通して同じ設定とした。なお、培地交換時はコンパニオンプレートを３７℃のホットプレート上に設置して作業実施して温度維持を図った。
（培養実験結果）
本実施例の細胞培養容器で作製した角膜上皮組織は、１０個のシート状細胞とも同等の大きさ、厚みを有しており、安定した剥離回収が可能であった。育成過程の顕微鏡画像の比較においても、１０個の細胞の育成に有意差はなかった。一方、対照実験により実施して回収された培養細胞とも形状としては同等であった。

角膜上皮組織の切片を作成しヘマトキシリン―エオジン染色、および免疫組織染色によって培養細胞を観察した結果、本実施例群、対照実験群とも上皮細胞に発現するＣＫタンパク質ファミリは、全ての細胞で発現していた。分化した角膜上皮細胞に発現するＣＫ３は、基底層以外での細胞で発現し、上皮組織のバリア機能に必要な閉鎖結合タンパクであるクローディン１は、最表層に発現しており、これも２群において有意差は無かった。

以上本発明に係る細胞培養容器によれば、第１の課題に関して、第１の課題である、観察対象である培養皿と細胞観察手段との構成において、透明性の確保された培養皿が閉鎖された培養容器の外面に露出して正対しており、顕微鏡などの観察視野を阻害するものが排除されている。また観察視野を最大限にするため第１ポートから第４ポートを第一の容器中心より一方に集約している。このため、培養細胞の育成状態の観察が明瞭である。

第２の課題に関しては、培地の交換操作において古い培地を排出した後、新しい培地を添加するので、古い培地が残留することを防止する。培地排出の操作では、排出ポートは培養皿の最下点に位置するよう配置され、培養容器を任意の角度で保持したとき、交換すべき培地はそれぞれの容器に最下点に集合するので吸引による排出が容易に行える。また第一容器と第二容器の中心が偏心しており、内壁に生じる培地の表面張力は小さく、培地排出の操作の際の培地の残留量が少なくなる。また、培養容器を傾けたときに第二容器の外側容器底部付近に培地排出の開口端を設ければ、第一容器の内側底部と第二容器の外側底面との間に残留する古い培地の回収量をより高めることが出来る。

第３の課題に関しては、細胞を培養する第一容器として手操作で使用している表面処理済みである培養皿を使用でき、表面状態を安定に維持できる。その結果、安定した細胞培養が可能となる。この培養皿は市販されており、同様のものを使用することで表面処理費用を安価で実現する。

第４の課題の外部からのコンタミ防止に関しては、培養容器及び流路は完全閉鎖系であって培養容器外に露出した構造をもたないので、外部からの微生物を含む粒子の侵入を防ぐことが出来る。また内部構成においても細胞培養容器の押え部が第一容器の側壁として作用する中空の節部を有しており、第一容器へフィーダー細胞液を播種する際に生じた飛沫は、この節部が障壁となって第二容器の内部に到達することを防ぐことが出来る。
さらに、細胞培養終了後に細胞培養容器から培養細胞を取り出す際に、培地の漏出を最小限に留めて培養細胞を回収できる。これらの手段を用いることによって細胞培養を安定して行うことが出来、またその培養状態の観察を容易に実施できる手段を設け、なおかつ完全閉鎖系での細胞の自動培養手段を設けているので、無菌状態で細胞を安定に培養することが出来る。

実施例１の細胞培養容器およびそれを用いた細胞培養装置は、その構成を一部変更するのみで、培養皿５のみを使用する１層培養にも適用可能である。

図８は、実施例１記載の細胞容器１に対して、インサート容器１１を設置せず、培養皿５のみ使用した培養形態を示すものである。１層培養においても、培養表面における細胞接着性能の必要性や培養中の細胞観察に対する課題は２層培養と同様であり、１層培養を用いた自動培養における必要性も同様である。

実施例１記載のように、細胞培養容器１における本体容器２に対する培養皿５の加圧固定は蓋部材１５のねじ止めによる加圧固定と独立であるので、インサート容器１１が取り外された状態でも、本体容器２に対する培養皿５の加圧固定が維持され気密に構成される。この場合、蓋部材１５に設置されたインサート容器注入用の第１ポート１７は、培養皿５に細胞播種を行うときに細胞容器の内部の気圧を調整するために必要である。一方、第２ポート１８は、インサート容器１１から培地を排出する目的で使用されるのみであり、１層培養の際にはインサート容器１１を設置しないため不要である。そこで、コントローラによる１層培養動作モードと２層培養モードの２つの動作モードを選択できるように構成する。そして、２層培養モードの場合は実施例１と同じ構成とし、１層培養動作モードで使用する際には第２ポート１８にキャップ６７を取り付け第４ポンプ５２との接続を解除し、さらに、図３記載の細胞培養容器1における送液・送気方法の実施例おける、第１細胞添加の動作、上層培地添加の動作、上層培地排出の各動作を行わないようにする。例えば上層培地排出に関係した第２ポート１８と第４ポンプ５２と接続するローラポンプを作動させないよう動作シーケンスに変更するなどして、２層培養モードの場合とおよそそのままの構成で、培養皿５だけを使用した１層培養による自動培養が可能である。

本実施例の１層培養でも、上記実施例１の２層培養の場合と同様の効果を有する。

実施例１の細胞培養容器およびそれを用いた細胞培養装置では、培養皿５内にインサート容器１１を設置するため、培地が残留し、培養皿５内から第４ポート２０で培地を充分に回収するのに工夫を要する場合が考えられる。

本実施例は、残留した培地を充分に回収するのに適した構成の第４ポートを設けている。

図９Ａは、第４ポート２０ａについて、その開口端２００ａがインサート容器１１の外側底部５Ａの最下点の位置するように、第４ポート２０ａをＬ字型としている。培地排出の際、使用する培地や培養皿の表面状態に依っては、インサート容器１１の外側底面部５Ａと培養皿５の内側底部との間で表面張力によって培地が残留する場合がある。このような場合、本実施例のＬ字型第４ポート２０ａのように、細胞培養容器１を傾けたとき、インサート容器１１の本体容器の最下点の近傍に培地排出の開口端２００ａを設ければインサート容器１１の外側底面部と培養皿５の内側底部との間における培地の排出に有効である。

また、図９Ｂに示した構造は、第４ポート２０ｂを、蓋部材１５及び押え部６に対して傾斜して設けられた貫通穴に配置し、その開口端２００ｂがインサート容器１１の底部５Ａに近接するようにしている。第１ポート乃至第４ポートは蓋部材に対して上下方向に伸びている。すなわち、第１ポート乃至第３ポートは細胞培養容器１の中心軸に一致する上下方向に伸び、第４ポートは中心軸に対して傾斜した角度で細胞培養容器１の上下方向に伸びている。
この傾斜構造によれば、細胞培養容器１を傾けたときインサート容器１１の底部５Ａの最下点に培地排出の開口端２００ｂが位置する。この例でも培地の排出に有効である。

実施例１の細胞培養容器およびそれを用いた細胞培養装置では、押え部６の節部９に設けられインサート容器１１及びこのインサート容器１１を受ける貫通穴１０が逆円錐台状であった。しかし、本発明では市販のインサート容器１１を使用できることが特徴の１つであり、インサート容器１１の外形を逆円錐台状に限定するものではない。従って、貫通穴１０の形状も、使用するインサート容器１１の外形に合わせて決めればよい。

図１０に示した実施例４に係るインサート容器１１１の外形は、円筒状である。この場合、節部９に設ける穴１１０は、インサート容器１１の外形に対応した円筒状である。

実施例４においては、培養皿５の直径をＤ１０、押え部６の節部９の貫通穴の直径をＤ２０，インサート容器１１の直径（外径）をＤ３０とすると、これらは次式の関係にある。

Ｄ１０＞Ｄ２０＞Ｄ３０
すなわち、押え部に設けられた貫通穴の径Ｄ２０は、培養皿（第一容器）５の内径Ｄ１０より狭くかつインサート容器（第二容器）１１の外径より大きい。

その他の構成は、実施例１と同じであり、例えば、インサート容器１１の中心（Ｏ２）は他の部品（培養皿５、押え部６）の中心（Ｏ１）に対し、若干偏心して配置されている。

本実施例でも、実施例１と同様の効果がある。

１…細胞培養容器、２…本体容器、３…開口部、４…ゴムシート、５…培養皿、６…押え部、７…はめ合い突起、８…はめ合い溝、９…節部、１０…貫通穴、１１…インサート容器、１２…フランジ、１３…物質透過膜、１４…Ｏリング、１５…蓋部材、１６…蓋固定リング部、１７…第１ポート（インサート容器注入）、１８…第２ポート（インサート容器排出）、１９…第３ポート（培養皿注入）、２０、２０ａ、２０ｂ…第４ポート（培養皿排出）、２１…位置決め溝、２２…位置決め穴、２３…位置決めピン、２４…ステージ、２５…観察用開口部、２６…冷蔵庫、３０…第１容器開閉弁、３１…第１ポンプ、３２…第１排気開閉弁、３３…フィルタ、３４…第１細胞開閉弁、３５…第1培地切換弁、３６…第１細胞減圧弁、３７…第１細胞液、３８…第２容器開閉弁、３９…第２ポンプ、４０…第２排気開閉弁、４１…第２ガス開閉弁、４２…第２細胞開閉弁、４３…第１ガス開閉弁、４４…第２培地切換弁、４５…第２細胞減圧弁、４６…第２細胞液、４７…予熱機構、４８…培地、４９…培地液減圧弁、５０…加湿ボトル、５１…ボンベ、５２…第４ポンプ、５３…第４容器開閉弁、５４…上層排液ボトル、５５…第３ポンプ、５６…第３容器開閉弁、５７…下層排液ボトル、６０…顕微観察ユニット、６１…照射光、６２…自動培養装置、６３…第１ポンプ分岐、６４…第２ポンプ分岐、６５…第３ポンプ分岐、６６…第４ポンプ分岐、６７…キャップ、７０…コントローラ。

Claims (15)

1. 細胞を保持、培養するための細胞培養容器であって、
   培地および細胞を、または培地のみを収容する第一容器と、
   前記第一容器上部に、培地および細胞を、または培地のみを収容する第二容器と、
   前記第一容器を保持し、かつ前記第二容器を収納する本体容器と、
   該本体容器と係合する蓋部材とを備え、
   前記本体容器は、前記第一容器を該本体容器内に固定して保持する押え部を有し、
   前記第二容器は、前記押え部により、前記第一容器内に偏心して保持されることを特徴とする細胞培養容器。
2. 請求項１記載の細胞培養容器において、
   前記培養容器の蓋部材に外部の流路と接続可能な複数の管路を備え、
   該複数の管路は第二容器の中心より一方の側であって、かつ、前記第一容器の容器中心とは反対の側の領域に設置されている
   ことを特徴とする細胞培養容器。
3. 請求項２記載の細胞培養容器において、
   前記複数の管路は、前記蓋部材に対して上下方向に伸びる第一、第二、第三、第四の管路であり、
   前記第一の管路は、前記第二容器への注入用の管路であり、
   前記第二の管路は、前記第二容器からの排出用の管路であり、
   前記第三の管路は、前記第一容器への注入用の管路であり、
   前記第四の管路は、前記第一容器からの排出用の管路であり、
   前記第二の管路及び前記第四の管路は、半径方向の同じ直線上に配置されている
   ことを特徴とする細胞培養容器。
4. 請求項２記載の細胞培養容器において、
   前記押え部には貫通穴が設けられており、
   前記貫通穴の直径は、前記第一容器の内径より狭くかつ前記第二容器の外径より大きい
   ことを特徴とする細胞培養容器。
5. 請求項４記載の細胞培養容器において、
   前記第一容器は、該第一容器の上面が前記押え部により押されることで前記本体容器内に加圧して固定され、
   前記第二容器は、前記貫通穴に挿入された状態で、前記蓋部材により押されることで前記押え部に加圧して固定される
   ことを特徴とする細胞培養容器。
6. 請求項２記載の細胞培養容器において、
   前記押え部は前記第一容器の側壁として作用する中空の節部を有しており、
   前記第二容器は、前記側壁の上面に保持されるフランジを有しており、
   前記第一容器の内側底面から該第一容器の上面までの高さをＨ１，前記節部の下面と上面間の垂直距離をＨ２，前記第二容器の底面から該第二容器のフランジまでの高さをＨ３，前記第二容器の底面から前記第一容器の内側底までの高さをＨ４とすると、これらは次式の関係にある
   Ｈ１＋Ｈ２≒Ｈ３＋Ｈ４
   ことを特徴とする細胞培養容器。
7. 請求項３記載の細胞培養容器において、
   前記第一容器からの培地の排出する前記第四の管路の開口端は、前記第二容器の外面の最下点に近接配置されている
   ことを特徴とする細胞培養容器。
8. 細胞を保持、培養するための細胞培養容器であって、
   培地および細胞を、または培地のみを収容する円筒状の第一容器と、
   該第一容器の上部に、培地および細胞を、または培地のみを収容する円筒状若しくは逆円錐台状の第二容器と、
   前記第一容器を保持し、かつ前記第二容器を収納する本体容器と、
   該本体容器と係合する蓋部材とを備え、
   前記本体容器は、前記第一容器を該本体容器内に固定して保持する押え部を有し、
   該押え部に設けられた貫通穴の直径は、前記第一容器の内径より狭くかつ前記第二容器の外径より大きい
   ことを特徴とする細胞培養容器。
9. 請求項８記載の細胞培養容器において、
   前記培養容器の蓋部材に外部の流路と接続可能な複数の管路を備え、
   前記複数の管路は、前記蓋部材に対して上下方向に伸びており、
   前記第一容器は、該第一容器の上面が前記押え部により押されることで前記本体容器内に加圧して固定され、
   前記第二容器は、前記貫通穴に挿入された状態で、前記蓋部材により押されることで前記押え部に加圧して固定される
   ことを特徴とする細胞培養容器。
10. 請求項８記載の細胞培養容器において、
    前記第一容器は、該第一容器の底面が第一の弾性体を介して前記本体容器内に固定され、
    前記本体容器は、底面に開口部を有し、該開口部に面する領域において、前記第一容器は、前記本体容器より露出した外面を有し、
    前記蓋部材は第二の弾性体を介して前記本体容器に固定され、
    前記培養容器内において、前記第一容器及び前記第二容器を気密に保持する
    ことを特徴とする細胞培養容器。
11. 請求項８記載の細胞培養容器において、
    前記第二容器の底面には物質透過膜が設けられており、
    前記押え部は、前記第一容器に満たされた培地の液面を、前記物質透過膜に接してより高い位置に保持できる長さの垂直距離を有する
    ことを特徴とする細胞培養容器。
12. 請求項８記載の細胞培養容器において、
    前記第一容器は、培養皿であり、
    前記第二容器は、外形が逆円錐台状のインサート容器であり、
    前記貫通穴は、該インサート容器を受ける逆円錐台状の穴であり、
    前記培養皿の内径をＤ１０、前記貫通穴の直径をＤ２１，前記インサート容器１１の外径をＤ３１とした時、これらは次式の関係にある
    Ｄ１０＞Ｄ２１＞Ｄ３１
    ことを特徴とする細胞培養容器。
13. 請求項８記載の細胞培養容器において、
    前記第一容器は、培養皿であり、
    前記第二容器は、外形が円筒状のインサート容器であり、
    前記貫通穴は、該インサート容器を受ける円筒状の穴であり、
    前記培養皿の内径をＤ１０、前記貫通穴の直径をＤ２０，前記インサート容器１１の外径をＤ３０とした時、これらは次式の関係にある
    Ｄ１０＞Ｄ２０＞Ｄ３０
    ことを特徴とする細胞培養容器。
14. ステージ上に設置された複数個の細胞培養容器と、前記細胞培養容器への培地の供給または排出の送液を制御する送液制御手段を備えた自動培養装置であって、
    前記各細胞培養容器は、
    培地および細胞を、または培地のみを収容する第一容器と、
    前記第一容器上部に、培地および細胞を、または培地のみを収容する第二容器と、
    前記第一容器を保持し、かつ前記第二容器を収納する本体容器と、
    該本体容器と係合する蓋部材とを備え、
    前記本体容器は、前記第一容器を該本体容器内に固定して保持する押え部を有し、
    前記第二容器は、前記押え部により、前記第一容器内に偏心して保持されており、
    前記培養容器の蓋部材に外部の流路と接続可能な第一、第二、第三、第四の管路を備え、
    前記第一乃至第四の管路は、前記第二容器における中心より一方の側の領域に設置されており、
    前記第一容器は弾性体を介して前記本体容器に固定され、
    前記本体容器は、底面に開口部を有し、該開口部に面する領域において、前記第一容器は、前記本体容器より露出した外面を有し、
    該培養容器に近接かつ正対して配置された細胞観察手段を有する
    ことを特徴とする自動培養装置。
15. 請求項１４記載の自動培養装置において、
    前記第一乃至第四の管路は、前記ステージに対し外側の一方の領域に配管される
    ことを特徴とする自動培養装置。

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