CN114107057A - 一种分离细胞外囊泡反应器 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种分离细胞外囊泡反应器，包括，培养单元，培养容器内设有过滤结构，过滤结构包括位于培养容器下部的滤板，滤板上具有多个第一滤孔；分离单元，包括滤膜组，滤膜组位于培养容器出样端的出料轨迹上，滤膜组包括多层过滤孔径不同的滤膜，由上至下滤膜的过滤孔径逐渐减小；培养容器与分离单元之间设有封闭件，封闭件可控制培养容器出样端与分离单元之间连通或者阻断。本方案将细胞培养过程和细胞外囊泡分离收集过程结合在一起，适用于细胞、悬浮细胞、水、发酵液等细胞外囊泡的收集，减少细胞培养和细胞外囊泡分离，收集之间的时间差，减少细胞外囊泡回收过程中产生的损耗，能够及时获取最新鲜的细胞外囊泡。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种分离细胞外囊泡反应器。
背景技术
几乎所有的细胞都可以释放由磷脂双分子层包被的类囊膜结构的小泡，国际细胞外囊泡学会（International Society of Extracellular Vesicle, ISEV）将其定义为细胞外囊泡，细胞外囊泡内涵多种信息分子，在调节免疫应答、抗原提呈、细胞间活性分子转移、病毒和朊病毒转移，肿瘤生长、转移及形成肿瘤微环境等生物学过程中发挥重要的作用。
细胞外囊泡是一组几乎可以从所有生物体液中获得的异质小泡，目前对其的分类定义并不明确，ISEV根据其直径不同，将其分为3个亚群：外泌体起源于内吞途径，直径为30-150nm；微细胞外囊泡直接从质膜释放，直径约在100-1000nm；凋亡小体由细胞凋亡产生，直径约为50nm-2μm，以及由肿瘤细胞释放的直径在1-10μm的癌小体。然而，获得某一个特定亚群的细胞外囊泡仍需要额外的纯化工艺。
目前，分离不同直径的细胞外囊泡的方法多基于尺寸排阻色谱法和差速离心法，一方面，尺寸排阻色谱法并不能获得足够量的细胞外囊泡，且差速离心法并不能有效的分离某一亚群的细胞外囊泡。在实验中常采用的差速离心方法使得细胞外囊泡4℃，37℃以及室温条件下不断转化，我们无法控制在此过程中出现的一些实验干扰因素；另一方面，自然条件下，生物体液中的细胞外囊泡产量低，需要花费大量的人力、物力、财力、时间才能收获一定量的细胞外囊泡，且不能达到长期可持续的进行体外培养和收集细胞外囊泡。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离细胞外囊泡反应器，以解决现有技术中一个及以上的问题，例如整个体外培养细胞并分离细胞外囊泡的实验时间周期长，效率低的问题。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种分离细胞外囊泡反应器，包括：
培养单元，包括培养容器，培养容器内设有过滤结构，过滤结构包括设于培养容器下部的滤板，滤板上具有多个第一滤孔；
分离单元，包括滤膜组，滤膜组位于培养容器出样端的出料轨迹上，滤膜组包括多层过滤孔径不同的滤膜，由上至下滤膜的过滤孔径逐渐减小；
培养容器与分离单元之间设有封闭件，封闭件可控制培养容器出料端与分离单元之间连通或者阻断。
本方案原理：使用时，预先通过封闭件将培养容器出样端与滤膜组之间阻断，然后向培养容器中加入细胞培养液，同时启动电机，电机通过转轴带动搅拌组件对培养液均匀搅拌，使细胞培养液达到较优的环境条件，便于细胞生长。由于培养容器出样端与滤膜组之间阻断，所以在此过程中培养液是始终在培养容器中的。
细胞培养完成后，通过封闭件将培养容器出样端与滤膜组之间连通，培养液首先经过滤板，滤板过滤掉部分大颗粒杂质，然后培养液流经滤膜组，而由于滤膜组包括多层过滤孔径不同的滤膜，由上 至下滤膜的过滤孔径逐渐减小，所以滤膜组由上至下会对细胞培养液进行层层过滤，将细胞以及其他颗粒杂质过滤掉，最后设定大小的颗粒（细胞外囊泡）从滤膜组的底部排出，通过在滤膜组底部外接收集瓶即可完成细胞外囊泡的收集。
在上述细胞培养和分离细胞外囊泡的过程中，可以根据需要向培养容器中持续加入细胞培养液，实现长期的、可持续性的细胞培养以及细胞外囊泡的获得，简化了试验步骤，工作效率更高。
同时，本方案将细胞培养过程和细胞外囊泡分离收集过程结合在一起，减少细胞培养和细胞外囊泡分离收集之间的时间差，减少细胞外囊泡回收过程中产生的损耗，能够及时获取最新鲜的细胞外囊泡。利用滤膜组对细胞培养液进行层层过滤，得到粒径标准的细胞外囊泡。
附图说明
图1为本发明的示意图；
图2为实施例1中第一盖体的结构示意图；
图3为实施例3的示意图；
图4为图3中A处的局部放大图；
图5为实施例3中连接结构的示意图。
说明书附图中的附图标记包括：培养容器1、容纳室101、水浴室102、收集容器2、转轴3、电机4、毛刷5、滤板6、开关阀7、第一盖体8、第二盖体9、滤膜组10、第三盖体11、分离容器12、承载板13、抽滤管14、装载容器15、第一进样管16、第一出样管17、第二进样管18、连接套19、连杆20、方杆21、方形孔22、封闭板23、第二滤孔24、第一滤孔25、定位柱26、支撑环27、定位环28。
具体实施方式
将参照附图详细描述根据本发明的各个实施例。这里，需要注意的是，在附图中，将相同的附图标记赋予基本上具有相同或类似结构和功能的组成部分，并且将省略关于它们的重复描述。术语“依次包括A、B、C等”仅指示所包括的部件A、B、C等的排列顺序，并不排除在A和B之间和/或B和C之间包括其它部件的可能性。“第一”及其变体的描述仅仅是为了区分各部件，并不限制本发明的范围，在不脱离本发明的范围的情况下，“第一部件”可以写为“第二部件”等。
本说明书的附图为示意图，辅助说明本发明的构思，示意性地表示各部分的形状及其相互关系。
下面，参照图1-图5，详细描述根据本发明的优选实施方式。
实施例1
参见图1至图2，本实施例提供了一种分离细胞外囊泡反应器，其固定设置在机架上。本反应器具体包括培养单元和分离单元，培养单元包括培养容器1，培养容器1内设有搅拌结构和过滤结构，搅拌结构包括电机4、由电机4驱动转动的转轴3以及设置于转轴3上的搅拌组件，过滤结构包括设于搅拌结构下方的滤板6，滤板6上具有多个滤孔；分离单元包括滤膜组10，滤膜组10位于培养容器1出样端的出料轨迹上，滤膜组10包括多层过滤孔径不同的滤膜，由上至下滤膜的过滤孔径逐渐减小；培养容器1与分离单元之间设有封闭件，封闭件可控制培养容器1出样端与分离单元之间连通或者阻断。
其中，培养容器1作为本生物反应器的主要装载容器15，用于培养各类生物细胞。本实施例中，培养容器1为2L容量的透明玻璃容器，顶部盖设有第一盖体8。第一盖体8上设有第一进样管16，第一进样管16上端与储存有细胞培养液的储液罐相连（图中未示出），第一进样管16下端与培养容器1连通，培养容器1底部设有第一出样管17。
本实施例中，培养容器1下方还设有收集容器2，滤膜组10位于收集容器2内的上部，收集容器2与培养容器1结构相同，其顶部盖设有第二盖体9，第二盖体9上设有第二进样管18，第一出样管17与第二进样管18相连。第一出样管17和第二进样管18之间设有封闭件，本实施例中，封闭件为通过法兰连接在第一出样管17和第二进样管18之间的开关阀7，开关阀7用于控制第二进样管18与第一出样管17连通或者断开，并且此部分可以进行拆卸。
参见图1，本实施例中，过滤结构包括滤板6，滤板6的直径略小于培养容器1的内径，使滤板6能够放入培养容器1中且滤板6的侧边与培养容器1的内壁贴合，保证滤板6侧边不会漏液。滤板6放置在培养容器1的底壁上，为了便于培养液的流动，本实施例中培养容器1底部为四周高中间低的漏斗状，滤板6刚好放置在漏斗状底壁的上边沿上，使滤板6过滤后的培养液能够直接流至漏斗状底壁上并沿着底壁继续向下流动。本实施例中滤板6为玻璃砂芯，玻璃砂芯的滤孔孔径为1μm。
参见图1，搅拌结构包括电机4、转轴3和搅拌组件，电机4固定连接于机架上，转轴3上端通过联轴器与电机4输出轴同轴连接，第一盖体8上开设有供转轴3穿过的通孔，转轴3下端穿过通孔延伸至培养容器1，通孔处可设置轴承组件使转轴3与第一盖体8转动配合。
本实施例中，搅拌组件包括毛刷5以及多个搅拌叶，具体地，毛刷5包括通过螺钉固定在转轴3上的横杆，横杆下侧密布有刷毛，刷毛下端与滤板6上表面接触，使毛刷5随转轴3转动时刷毛能够对滤板6进行清理，避免杂质堆积和堵住滤孔。本实施例中，搅拌叶有四个并周向分布在转轴3上，且搅拌叶位于毛刷5的上方。
本实施例中，滤膜组10为尺寸排阻色谱组件，具体地，滤膜组10由上下多层滤膜组10合构成，且滤膜的过滤孔径各有不同，本实施例中，滤膜的过滤孔径由上至下逐渐减小，具体地，滤膜组10由上至下分别包括过滤孔径1.2μm的滤膜两层、0.8μm的滤膜两层、0.65μm的滤膜两层、0.45μm的滤膜两层、0.22μm的滤膜两层，通过各过滤规模的滤膜对细胞液过滤，过滤效果好，而且不同过滤孔径的滤膜所收集的杂质不同，便于实现对杂质和细胞的分类收集和处理。每个规格的过滤膜中间都是由筛板隔开，筛板为带多个孔径为1μm的玻璃平底，筛板边沿与收集容器2内壁贴合，使筛板边沿不漏液。
参见图1，收集容器2底部的侧壁上还设有抽滤管14，抽滤管14外接抽滤泵（图中未示出），通过抽滤泵将细胞外囊泡抽取至指定容器储存，同时抽滤泵可以加速滤膜组10对培养液的过滤，也可以提高抽吸力度，便于收集足量的细胞外囊泡。收集容器2底部上还设有出料管，工作过程中出料管封闭，收集到足够的细胞外囊泡悬液后打开出料管排出剩余悬液。
基于上述基本结构，使用时，预先关闭开关阀7，使培养容器1和收集容器2之间阻断，然后向培养容器1中加入细胞培养液，同时启动电机4，电机4通过转轴3带动搅拌组件对培养液均匀搅拌，使细胞培养液达到较优的环境条件，便于细胞生长。搅拌过程中，毛刷5可以作为另一种形式的搅拌叶对培养液进行搅拌，加强搅拌效果，而且毛刷5搅拌过程中还可对滤板6表面进行清理，防止滤板6堵塞。
细胞培养完成后，打开开关阀7使培养容器1与收集容器2连通，同时启动抽滤泵，使培养液通过开关阀7流入收集容器2中，在此过程中，培养液首先经过滤板6，滤板6过滤掉部分大颗粒杂质，然后培养液再流入收集容器2中经过滤膜组10，滤膜组10再对细胞培养液进行层层过滤，将细胞以及其他颗粒杂质过滤掉，最后设定大小的颗粒（细胞外囊泡）将通过收集容器2底部的抽滤管14排出，完成细胞外囊泡的收集。
在上述细胞培养和分离细胞外囊泡的过程中，可以根据需要向培养容器1中持续加入细胞培养液，从收集容器2出样端持续的排出培养液，实现长期的、可持续性的细胞培养以及细胞外囊泡的获得，简化了试验步骤，工作效率更高。
同时，本方案将细胞培养过程和细胞外囊泡分离收集过程结合在一起，减少细胞培养和细胞外囊泡分离收集之间的时间差，减少细胞外囊泡回收过程中产生的损耗，能够及时获取最新鲜的细胞外囊泡。
基于上述结构及使用方法，本实施例中进行了相关实验，得出以下公式：
y=6.275*108*X±2.18*107
其中，x是细胞液的体积（ml），y是囊泡数量（个），培养细胞是大肠杆菌，培养环境是37℃，培养时间16h，可以根据上述公式，有选择的获得自己拟获得囊泡的数量，避免了过度培养浪费资源，也避免了重复培养，浪费时间精力。
而根据上述实验，本实施例在相同的实验条件下进行了对照实验，将培养单元和分离单元进行单独设置，使细胞外囊泡的培养和分离过程分开进行，例如公开号为CN110872562A的专利申请文件所公开的方式，发现细胞外囊泡培养和分离结合在一起时所收集到的囊泡数量远多于细胞外囊泡培养和分离分开时所收集到的囊泡数量。
实施例2
参见图1，本实施例在实施例1的基础上进行改进，具体地，本实施例中，培养容器1和收集容器2均为具有夹层空间的双层玻璃容器，培养容器1和收集容器2的内层均为容纳室101，内、外层之间的夹层均为水浴室102，水浴室102通过水管外接有恒温水浴箱。通过恒温水浴箱向水浴室102中持续注入循环的恒温热水，使容纳室101内部环境保持在恒温状态，提供较好的环境条件，利于细胞的生长。其中，恒温水浴箱选用上海衡平仪器的DC-0506水浴箱，恒温水浴箱的进水端和出水端分别与水浴室102的下部和上部连通。
在一些实施例中，第一盖体8上还开设有多个开口，包括出气口、进气口、进样口、三个安装口，进气口外部连接输送氮气的氮气罐，出气口外部连接抽气泵，如需要无氧条件，通过进气口向培养容器1中输入氮气，通过出气口排出培养容器1内部的氧气，进气口和出气口上均连接有0.22μm孔径的过滤器。进样口安装上述的第一进样管16。三个安装口分别连接有伸入培养容器1中的pH传感器、溶解氧传感器、二氧化碳传感器，上述传感器与电脑等处理终端通过通讯线等连接方式进行通讯连接，处理终端接收上述传感器所反馈的信号并存储至云端（上述传感器与电脑的连接以及信号的反馈均采用现有技术，本实施例中不再赘述）。其中，溶解氧传感器选用AMT-D300智能型溶解氧传感器，pH传感器选用AMT-PH300智能型酸碱度传感器，二氧化碳传感器选用AMT-CO2300智能型二氧化碳传感器。
使用时，首先启动恒温水浴箱，并设置水温为37℃，恒温水浴箱输出的循环水从水浴室102底部进入，再从水浴室102上部排出，开始水浴循环，使容纳室101的内部环境维持恒温状态。工作过程中，通过电脑实时监控培养液的pH、溶氧量、二氧化碳浓度、温度等特征值，确保反应室的培养环境。
实施例3
参见图3，本实施例与实施例1的区别在于，本实施例还包括装载容器15，用装载容器15代替收集容器2，且装载容器15也为具有夹层空间的双层结构。本实施例中，装载容器15为透明玻璃容器，其顶部盖设有第三盖体11，第三盖体11的结构与第一盖体8相同。第三盖体11上设有进样单元，进样单元包括进样管，进样管上端位于装载容器15上方并与储存有细胞培养液的储液罐相连（图中未示出），进样管下端伸入装载容器15内。装载容器15底部具有出样单元，出样单元包括出样管，出样管与装载容器15底部连通，而出样管外接有抽滤泵，抽滤泵用于排出细胞外囊泡至收集瓶中。
参见图3，培养容器1可拆卸的设置于装载容器15的上部，具体地，本实施例中，装载容器15上部为上大下小的扩口状，而培养容器1整体也为上大下小的喇叭状，其中，培养容器1瓶身的弧线轨迹与装载容器15上部瓶身的弧线轨迹对应，且培养容器1从上至下的横截面直径均小于装载容器15相对应部分的横截面直径，使培养容器1能够放入装载容器15内。当培养容器1放置在装载容器15内时，其底部位于装载容器15的中部，其顶部被支撑在装载容器15顶部的扩口内壁上。取放培养容器1时只需直上直下的拿取培养容器1即可，操作简单。
参见图3，本实施例中，滤膜组10设置于分离容器12中，分离容器12为上下开口的容器，其可拆卸的设置于装载容器15内并位于培养容器1的正下方，多层滤膜均设置于分离容器12内。装载容器15下部内壁上粘接有承载板13，承载板13上开设有多个3cm的筛孔，分离容器12放置于承载板13上，承载板13为支撑件，可以使分离容器12自由的放置在承载板13上，便于取放。分离容器12上端也为扩口状，且分离容器12上端开口的口径略小于装载容器15下部的内径，使分离容器12能够放入装载容器15中并且其上端开口与装载容器15内壁贴合。
参见图3和图4，本实施例中，滤板6为具有多个第一滤孔25的开孔板，滤板6放置于培养容器1的下部且与培养容器1底壁相距一定距离，具体地，培养容器1下部侧壁上粘接固定有支撑环27，滤板6被支撑在支撑环27上，安装时将滤板6卡扣在支撑环27上使其与支撑环27固定，滤板6侧边与培养容器1内壁贴合。
本实施例中，封闭件包括封闭板23，封闭板23的直径小于支撑环27的内径，封闭板23位于滤板6的下方，封闭板23通过防水轴承与转轴3下端转动配合。封闭板23上开设有多个第二滤孔24，第二滤孔24与第一滤孔25交错设置，且封闭板23与滤板6相抵时第二滤孔24和第一滤孔25刚好完全错开，使封闭板23能够将第一滤孔25封堵住，封闭板23上固定连接有多个定位柱26，定位柱26插入在第一滤孔25中，且定位柱26直径与第一滤孔25适配，使定位柱26与第一滤孔25之间无间隙，而封闭板23与转轴3下端之间通过转轴3转动配合。
参见图3和图5，转轴3与电机4输出轴之间设有连接结构，具体地，连接结构包括连接套19，转轴3与连接套19通过焊接、螺钉连接等方式固定连接，连接套19上端开设有方形孔22，转轴3下端固定连接有方杆21，方杆21与方形孔22滑动配合。机架上通过螺钉或者卡接的方式安装有定位环28，定位环28为连接套之间固定连接有连杆20。
基于上述结构，本实施例使用原理如下，初始状态下，封闭板23抵住滤板6，使培养容器1封闭，然后将细胞液导入培养容器1中等待培养。导入细胞液后启动电机4，电机4带动转轴3转动对细胞液进行搅拌。当细胞液培养完成，向下移动定位环28，定位环28带动转轴3和封闭板23向下移动，打开第一滤孔25，使细胞液可流入分离容器12中。
本实施例通过驱动封闭板23升降实现第一滤孔25的开启或封闭，简化操作，更加方便；而且封闭板23还可对细胞液进行一定程度的过滤，使滤膜组10的杂质更少，提升过滤性能；并且封闭板23可对细胞液进行分散处理，使细胞液均匀扩散至滤膜组10中，防止细胞液过于集中在滤膜组10某部分而导致堵塞，提升了过滤性能。
本方案可控制在不同温度、氧气、PH等环境条件下培养多种生物材料，比如：细胞、悬浮细胞、水，发酵产品等，并安装不同的探头可实施监控培养。通过一定的流速供给新培养液的进入和旧的培养的排除，实现以恒定流速培养反应液。本方案可以实现长期可持续的收集培养液的细胞外囊泡，并且可以控制收集到尺径在0.22μm以下的细胞外囊泡。
该生物反应器设有循环水浴、气体交换、输液装置。本方案将培养过程和细胞外囊泡收集过程结合在一起，适用于细胞、悬浮细胞、水、发酵液等细胞外囊泡的收集，减少培养过程和细胞外囊泡收集之间的时间差，减少细胞外囊泡收集过程中的损耗，及时获得最新鲜的细胞外囊泡。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于，包括：
培养单元，包括培养容器（1），培养容器（1）内设有过滤结构，过滤结构包括设于培养容器（1）内的滤板（6），滤板（6）上具有多个第一滤孔（14）；
分离单元，包括滤膜组（10），滤膜组（10）位于培养容器（1）出样端的出料轨迹上，滤膜组（10）包括多层过滤孔径不同的滤膜，由上至下滤膜的过滤孔径逐渐减小；
培养容器（1）与分离单元之间设有封闭件，封闭件用于控制培养容器（1）出样端与分离单元之间连通或者阻断。
2.根据权利要求1所述的一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于：分离单元还包括收集容器（2），滤膜组（10）设置于收集容器（2）内上部，收集容器（2）进样端与培养容器（1）出样端通过连接管相连，所述封闭件为设置于连接管上的开关阀（7）。
3.根据权利要求1所述的一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于：所述反应器还包括装载容器（15），培养容器（1）可拆卸连接于装载容器（15）内的上部，滤膜组（10）可拆卸连接于装载容器（15）内的下部。
4.根据权利要求3所述的一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于：所述装载容器（15）下部可拆卸连接有上下开口的分离容器（12），所述滤膜组（10）可拆卸连接于所述分离容器（12）内，所述分离容器（12）上端端口与装载容器（15）内壁贴合。
5.根据权利要求4所述的一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于：所述培养容器（1）和所述分离容器（12）均为具有夹层空间的双层结构，所述培养容器（1）和所述分离容器（12）的夹层空间用于循环恒温热水。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于：培养容器（1）内还设有搅拌结构，搅拌结构位于滤板（6）上方，搅拌结构包括电机（4）、由电机（4）驱动转动的转轴（3）以及设置于转轴（3）上的搅拌组件（6）。
7.根据权利要求6所述的一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于：搅拌组件包括固定连接于转轴（3）下部的毛刷（5），毛刷（5）下部的刷毛与滤板（6）表面接触。
8.根据权利要求7所述的一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于：所述搅拌组件还包括固定连接于转轴（3）上的多个搅拌叶。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于：每个过滤孔径规格的滤膜均有两张，同规格过滤孔径的两张滤膜之间均设有筛板。
10.根据权利要求1所述的一种分离细胞外囊泡反应器，其特征在于：所述培养容器（1）顶部设有第一盖体（8），第一盖体（8）设有出气口、进气口、进样口以及供转轴（3）穿过的通孔，第一盖体（8）上还连接有伸入培养容器（1）中的pH传感器、溶解氧传感器、二氧化碳传感器。
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