JP2023182712A - 自動化された製造及び収集 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞から放出又は分泌された細胞生産物の製造、単離、及び／又は収集する方法を提供する。【解決手段】細胞は、細胞増殖システムのバイオリアクターの毛細管内側（又は毛細管外側）空間において、培地によって増殖される。細胞は、バイオリアクターの流体空間に細胞生産物を放出する。放出される細胞生産物の例としては、細胞外小胞（ＥＶ）のような細胞外粒子が挙げられる。他の供給源からの細胞外粒子ではなく、増殖された細胞から放出された細胞外粒子を収集するために、増殖細胞から放出細胞外粒子を収集する前に、洗浄ステップにおいて血清タンパク質を除去する。放出細胞生産物は、出口パラメータを制御することによって、収集又は濃縮されると同時に、栄養素は、半透過性膜を通じた培地の拡散によって、細胞に到達する。そして、放出細胞生産物は収穫される。【選択図】図９

Description

本出願は、２０１６年５月５日に出願された米国特許仮出願第６２／３３２，４２６号（タイトル：自動化された製造及び収集）及び２０１６年５月６日に出願された米国特許仮出願第６２／３３３，０１３号（タイトル：自動化された製造及び収集）及び２０１７年５月３日に出願された米国特許仮出願第６２／５００，９６２号（タイトル：自動化された製造及び収集）の優先権を主張するものであり、該米国特許仮出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。

細胞増殖システム（ＣＥＳ）は、細胞を増殖させ、分化させるために使用される。細胞増殖システムを使用することにより、種々の接着性細胞や懸濁細胞を増殖（例えば、成長）させることができる。例えば、細胞増殖システムを用いて、例えば骨髄細胞のような、間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）やその他のタイプの細胞を増殖させることができる。ドナー細胞から増殖した幹細胞を使用することで、損傷を受けた又は欠陥のある組織を修復又は交換することができ、広範囲な疾病に対する幅広い臨床応用が存在する。接着性及び非接着性の両タイプの細胞の成長は、細胞増殖システムのバイオリアクターにおいて行われる。

本開示の実施形態は一般に、細胞から放出又は分泌される細胞生産物の製造、単離及び／又は収集に関する。そのような放出又は分泌される細胞生産物は、放出又は分泌された物質（ａｇｅｎｔ）、放出又は分泌された成分（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ）、細胞生産物質、細胞生産成分、放出又は分泌された粒子、放出又は分泌された分子、細胞外粒子、放出又は分泌されたタンパク質、伝達メカニズム（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）等と呼ばれる。細胞外粒子の例としては、細胞外小胞（ＥＶ）、ウイルスベクター等が挙げられるが、それらに限定されない。

細胞外小胞（ＥＶ）は細胞によって産生され、細胞培養の間に、培養又は増殖が行われている流体又は培地中に放出される（増殖中に生成される重要な副産物の存在によって、条件培地と呼ばれることが多い）。ＥＶは、例えば、エクソソームや微小小胞を含む。ＥＶには、細胞の通信やその他の重要な細胞プロセスに不可欠なタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡが含まれる。ＥＶは、例えば、血清、血漿、尿、及び細胞培養上清のような体液から単離することができる。

実施形態において、細胞間通信は、細胞生物学において重要な機能を果たす。他の細胞と通信する細胞の能力は、タンパク質合成のような複雑な機構が起こることを可能にする。 例えば、直接的な細胞－細胞接触又は分泌された分子の移動等、細胞が互いに通信することができる多くの方法がある。微小小胞及びエクソソームのようなＥＶは、細胞内通信を媒介し、遺伝情報の伝達を促進する能力を有する。微小小胞は原形質膜からの直接の芽であり、しばしば起源の膜に類似した表面マーカーを含む。小胞エンドソーム（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｓｏｍｅ）が原形質膜と融合し、細胞外空間に出芽すると、エクソソームが形成される。遺伝情報伝達におけるそれらの積極的役割のために、微小小胞及びエクソソームは治療用途に使用することができる。例えば、ＥＶは免疫応答を刺激する抗原提示細胞として作用し、微小小胞はケモカイン受容体を転移させて活性化し、抗アポトーシス効果をもたらす。

実施形態では、細胞増殖システムを使用して細胞を増殖する。このような増殖は、バイオリアクター又は細胞成長チャンバーの使用によって行われる。一実施形態では、このようなバイオリアクター又は細胞成長チャンバーは、例えば、中空糸膜を含む。このような中空糸膜は、毛細管外側（ＥＣ）空間及び毛細管内側（ＩＣ）空間を含む。細胞増殖システムは、間葉系幹細胞、癌細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、及び筋芽細胞等の様々なタイプの細胞を増殖できる。これらのタイプの細胞のそれぞれは、ＥＶを、バイオリアクターの流体空間に放出し、その後、出口バッグを介して収集することができる。バイオリアクターの半透過性中空糸により、必須栄養素（例えば、グルコース）は細胞に到達可能となり、また代謝廃棄物（例えば、乳酸塩）は拡散を介してシステムから出ることが可能になる。細胞は中空糸の毛細管内側に保持され、ＥＶは流体空間で濃縮され、次いで細胞の収穫を望まない場合は、細胞を収穫することなく、システムからＥＶが収穫される。

本開示の実施形態はさらに、増殖細胞からの放出細胞生産物（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）の収集の前に、細胞を培養又は増殖するために使用される血清タンパク質を除去するための自動洗浄手順の使用に関連する。そのような洗浄手順により、システムは、増殖中の細胞からの放出細胞生産物の収集を始める前に、まず放出された細胞生産物（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）を、細胞増殖に使用された血清又は他の供給源から除去することによって、放出された細胞生産物を精製することができる。

本開示の実施形態は、マルチコンパートメントバイオリアクターの使用によって、放出された細胞生産物の収集又は濃縮を可能にする。例えば、ＩＣ出口弁を閉じる（ＥＣ出口を開いたままにする）ことによって、出口パラメータを制御することで、放出された細胞生産物はＩＣ側の濃度を増加させるが、栄養素（例えばグルコース）は、ＥＣ側への培地の添加及び膜を通る拡散により、ＩＣ側の細胞に到達する。このような収集は、ある期間（約２４時間～約７２時間等）、継続される。一実施形態では、そのような収集は、約４８時間、継続される。放出された細胞生産物の濃度を増加させた後、放出された細胞生産物を収穫バッグ又は他の容器に収集する。一実施形態によれば、仮にあったとして、そのような細胞を放出し収穫することが望まれなくなるまで、付着した細胞は、収穫プロセスの間、バイオリアクターに残っていてもよい。

本開示の実施形態は、細胞増殖システムと共に使用するための１又は複数のプロトコル又はタスクを使用して、放出された細胞生産物のそのような生成及び／又は収集を実施することを可能にする。そのようなプロトコル又はタスクは、予めプログラムされたプロトコル又はタスクを含むことができる。他の実施形態では、そのようなプロトコル又はタスクは、カスタム又はユーザ定義のプロトコル又はタスクを含むことができる。ユーザインターフェース（ＵＩ）及びグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）要素を介して、カスタム又はユーザ定義のプロトコル又はタスクを作成することができる。タスクは、１又は複数のステップを含むことができる。他の実施形態では、予めプログラムされたタスク、初期設定タスク、又は以前に保存されたタスクを選択することができる。さらに他の実施形態では、そのような生成及び／又は収集は、細胞増殖システムと共に使用するための１又は複数の手動プロトコル又はタスクの使用を通じて実施されてもよい。

このセクションは、一連の概念を簡単な形式で提示するために設けられる。これら概念は、以下でより詳細に、詳細な説明で記載される。このセクションは、請求項が定義する主題の範囲を制限するために用いられることを意図されていない。ここで提示される特徴に加えて、等価物及び変更等を含む特徴を含んでよい。

以下では、本発明の実施形態が、添付図面を参照して説明される。図面中、同じ参照符号は、同じ構成要素を示す。

図１Ａは、細胞増殖システム（ＣＥＳ）の一実施形態の図である。 図１Ｂは、バイオリアクター内を通る循環路が示されたバイオリアクターの一実施形態の正面図である。 図１Ｃは、本開示の実施形態に係る、細胞増殖システムの動作中に細胞成長チャンバーを回転方向又は横方向に動かすための揺動装置の図である。 図２は、本開示の実施形態に係る、予め流体移送装置が取り付けられた細胞増殖システムの斜視図である。 図３は、本開示の実施形態に係る、細胞増殖システムのハウジングの斜視図である。 図４は、本開示の実施形態に係る、予め取り付けられる流体移送装置の斜視図である。 図５は、本開示の一実施形態に係る細胞増殖システムの概略図である。 図６は、本開示の他の実施形態に係る細胞増殖システムの概略図である。 図７は、本開示の実施形態に係る、放出成分を生成及び／又は集めるためのプロセスの動作特徴を示すフローチャートである。 図８は、本開示の実施形態に係る、放出細胞生産物を生成及び／又は集めるためのプロセスの動作特徴を示すフローチャートである。 図９は、本開示の実施形態に係る、放出物質を生成及び／又は集めるためのプロセスの動作特徴を示すフローチャートである。 図１０は、本開示の実施形態が実行される細胞増殖システムの処理システムの一例を示す図である。 図１１は、本開示の一実施形態に係る、細胞増殖システムにおける培地からのタンパク質の抽出結果例を示す図である。 図１２は、本開示の一実施形態に係る、細胞増殖システムを用いたＥＶ生成の結果例を示す図である。 図１３Ａは、本開示の一実施形態に係る、細胞増殖システムを用いたＥＶ生成の結果例を示す図である。 図１３Ｂは、本開示の一実施形態に係る、細胞増殖システムを用いたＥＶ生成の結果例を示す図である。 図１３Ｃは、本開示の一実施形態に係る、細胞増殖システムを用いたＥＶ生成の結果例を示す図である。 図１４は、本開示の一実施形態に係る、細胞増殖システムを用いたＥＶ生成の結果例を示す図である。

以下の詳細な説明では、例示的な実施形態が、添付図面を参照して、説明される。ここでは特定の実施形態を含むことになるが、本開示を限定又は制限するものと解釈されるべきではない。また、実施形態を記載する際、例えば、特徴、動作、及び／又は構造に対して特有な用語が使用される場合があるが、本開示の請求項の範囲は、これら特徴、動作、及び／又は構造に制限されるものではない。当業者であれば、改良を含む他の実施形態は、本開示の精神及び範囲内にあることは理解できよう。さらに、他の実施形態として挙げられている任意のものを含む任意の代替物又は追加物が、本明細書に記載された他の任意の実施形態と共に使用されても又は組み込まれてもよい。

本開示の実施形態は、一般に、細胞増殖システムにおいて放出された細胞生産物（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｄｕｃｔ）（例えば、細胞外小胞（ＥＶ）やウイルスベクター等）を生成、単離及び／又は収集するためのシステム及び方法に関する。本開示の実施形態は、例えば、マルチコンパートメントバイオリアクターの使用によって、放出された細胞生産物の収集又は濃縮を可能にすることをさらに提供する。

ある実施形態では、中空糸膜の透過性により、細胞を毛細管内側（ＩＣ）ループ内に保持することにより、細胞を他の成分から分離することができ、同時に、可溶性分子は毛細管外側（ＥＣ）ループ内を自由に通過することができるようにすることができる。これにより、追加の分離ステップを不要にできる。バイオリアクターのＥＣ側に添加された培地を用いて、培養中の細胞（例えば、グルコース、乳酸、アミノ酸、ビタミン）の代謝要求を満たすことができる。そのような培地は、バイオリアクターの半透過性膜を介して拡散することができる。膜を通って拡散するには分子量が大きすぎる培地構成成分を、限外濾過（例えば、連続的又は間欠的なボーラス添加のいずれか）を用いてバイオリアクターのＩＣ側に添加してもよい。一実施形態では、膜を通って拡散するには大きすぎる成分を、バイオリアクターのＩＣ側に維持するために、限外濾過（ＩＣ出口バルブ閉鎖）が使用される。細胞によって産生されたＥＶは、膜を通って拡散することができない、すなわち、それらの分子量は大きすぎる場合がある。従って、ＥＶは、ＥＶ濃度が連続的に増加する増殖（又は所定の収集期間）の間、バイオリアクターのＩＣ側に維持される。次いで、ＥＶは、例えば、所定の間隔又はプロセス全体の終わりに、バイオリアクターのＩＣ側から収穫容器又は収穫バッグへ収穫される。中空糸膜の２つの流体区画の恩恵がない場合、ＥＶ濃度又は収集は、細胞がＥＶを産生するレートに限定され、栄養要求を満たすために新鮮培地が培養環境に添加される。

例えば、ＩＣ出口弁を閉じる（ＥＣ出口を開いたままにする）等の出口パラメータを制御することによって、放出された細胞生産物はＩＣ側の濃度を増加させるが、栄養素（例えばグルコース）は、ＥＣ側への培地添加及び膜を介した拡散によって、依然としてＩＣ側の細胞に到達可能である。他の実施形態では、栄養素は、ＩＣ側の培地の添加によりＩＣ側の細胞に供給することができる。さらに他の実施形態では、ＩＣ側（又はＥＣ側）に培地を添加し、膜を通って拡散し細胞に到達することによって、細胞増殖をＥＣ側で行うこともできる。ＥＶの収集は、約２４時間又はそれ以上の期間にわたって継続することができる。他の実施形態では、そのような収集は約２４時間未満継続することができる。他の実施形態では、そのような収集は、例えば、約４８時間～約７２時間継続することができる。放出された細胞生産物の濃縮を増加させた後、放出された細胞生産物を収穫バッグ又は他の容器に収穫することができる。ある実施形態では、付着した細胞は、仮にあったとして、該細胞を放出し収穫することが望まれるようになるまで、収穫プロセス中は、バイオリアクター内に残存していてもよい。

実施形態は、上述のように、細胞増殖システムに関する。実施形態において、細胞増殖システムはクローズドシステムである。クローズド細胞増殖システムは、大気に直接さらされない内容物を含む。そのような細胞増殖システムは自動化されてもよい。実施形態において、接着性又は非接着性の両方のタイプ又は懸濁タイプの細胞を、該細胞増殖システムのバイオリアクターにおいて成長させることができる。実施形態によれば、細胞増殖システムは、基礎培地又は他のタイプの培地を含んでよい。培地の補充方法は、クローズド細胞増殖システムのバイオリアクターで行われる細胞成長のために提供される。実施形態において、そのようなシステムと共に使用されるバイオリアクターは、中空糸型バイオリアクターである。本発明の実施形態によれば、種々のバイオリアクターが使用されてよい。

実施形態において、該システムは、少なくとも両端部を有する第１流体流路を備えるバイオリアクターを有し、前記第１流体流路の第１端部は、中空糸膜の第１ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路の第２端部は、前記中空糸膜の第２ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路は、前記中空糸膜の毛細管内側部分を有する。実施形態において、中空糸膜は、複数の中空糸を備える。該システムは、前記第１流体流路と流体的に関連付けられた流体入口路を有し、第１流体入口路を介して、前記第１流体流路には、複数の細胞が導入される。前記バイオリアクターの前記第１流体流路において流体を循環させる第１ポンプも含まれる。実施形態において、該システムは、前記第１ポンプの動作を制御するコントローラを有する。一実施形態において、前記コントローラは、例えば、プロセッサを有するコンピューティングシステムである。実施形態において、前記コントローラは、前記ポンプを制御して、前記第１流体流路内において、流体を、第１レートにて循環させる。いくつかの実施形態において、毛細管内側培地バッグからの毛細管内側投入流体を前記第１流体流路に移送する第２ポンプと、前記第２ポンプの動作を制御する第２コントローラと、をさらに備える。実施形態において、前記第２コントローラは前記第２ポンプを制御することによって、例えば、細胞を細胞投入バッグから前記第１流体流路に移送する。実施形態において、さらなるコントローラ（例えば第３コントローラ、第４コントローラ、第５コントローラ、第６コントローラ等）が使用されてもよい。本開示の実施形態において、さらなるポンプ（例えば第３ポンプ、第４ポンプ、第５ポンプ、第６ポンプ等）が使用されてもよい。さらに、本開示では、培地バッグ、細胞投入バッグ等について述べられるが、複数のバッグ、例えば、第１培地バッグ、第２培地バッグ、第３培地バッグ、第１細胞投入バッグ、第２細胞投入バッグ、第３細胞投入バッグ等、及び／又はその他のタイプの容器、が使用されてもよい。他の実施形態では、単一の培地バッグ、単一の細胞投入バッグ等が使用される。また、実施形態において、追加の又は別の流路（例えば、第２流体流路、第２流体入口路等）を設けてもよい。

他の実施形態において、該システムは、例えば、細胞増殖システムに結合されたプロセッサと、該プロセッサと通信を行い、データを表示するディスプレイ装置と、該プロセッサと通信を行い、該プロセッサによって読取可能な、一連の命令を格納するメモリと、によって制御される。実施形態において、プロセッサによって命令が実行されると、プロセッサは、例えば、バイオリアクターのコーティングを指示する命令を受け取る。その命令に応答して、プロセッサは、バイオリアクターをコーティングするための一連のステップを実行し、次に、例えば、バイオリアクター内に細胞を導入する命令を受け取る。その命令に応答して、プロセッサは、例えば、細胞投入バッグから細胞をバイオリアクター内に導入するための一連のステップを実行する。

本発明の実施形態に係る細胞増殖システム（ＣＥＳ）の一例が、図１Ａに概略的に示される。用語「ＣＥＳ」及び「システム」は交換可能に使用される。ＣＥＳ１０は、第１流体循環路１２と第２流体循環路１４とを有する。実施形態によれば、第１流体流路１６は、中空糸型細胞成長チャンバー２４（「バイオリアクター」とも呼ばれる）に流体的に関連付けられた少なくとも両端部１８、２０を有する。詳細には、端部１８は、細胞成長チャンバー２４の第１入口２２と流体的に関連付けられ、端部２０は、細胞成長チャンバー２４の第１出口２８と流体的に関連付けられる。第１循環路１２において、流体は、細胞成長チャンバー２４に配置された中空糸膜１１７（図１Ｂ参照）の中空糸１１６（図１Ｂ参照）の内部を通る（細胞成長チャンバー及び中空糸膜は以下でより詳細に説明される）。また、第１流量制御装置３０が、第１流体流路１６に動作可能に接続され、第１循環路１２における流体の流れを制御する。

第２流体循環路１４は、第２流体流路３４と、細胞成長チャンバー２４と、第２流量制御装置３２と、を有する。実施形態によれば、第２流体流路３４は、少なくとも両端部３６、３８を有する。第２流体流路３４の端部３６は、細胞成長チャンバー２４の入口ポート４０に、端部３８は、出口ポート４２にそれぞれ流体的に関連付けられる。細胞成長チャンバー２４を流れる流体は、細胞成長チャンバー２４の中空糸膜１１７（図１Ｂ参照）の外側と接触する。中空糸膜は、複数の中空糸を備える。第２流体循環路１４は、第２流量制御装置３２と動作可能に接続される。

このように、第１及び第２流体循環路１２、１４は、中空糸膜１１７（図１Ｂ参照）によって、細胞成長チャンバー２４において分離されている。第１流体循環路１２の流体は、細胞成長チャンバー２４において中空糸の毛細管内側（ＩＣ）空間を流れる。従って、第１流体循環路１２は「ＩＣループ」と呼ばれる。第２流体循環路１４の流体は、細胞成長チャンバー２４において中空糸の毛細管外側（ＥＣ）空間を流れる。従って、第２流体循環路１４は「ＥＣループ」と呼ばれる。実施形態によれば、第１流体循環路１２の流体は、第２流体循環路１４の流体の流れに対して、並流方向又は逆流方向のどちらを流れてもよい。

流体入口路４４は、第１流体循環路１２に流体的に関連付けられる。流体入口路４４によって、流体は第１流体循環路１２に導入され、流体出口路４６によって、流体は、ＣＥＳ１０から排出される。第３流量制御装置４８が、流体入口路４４に動作可能に関連付けられる。或いは、第３流量制御装置４８は、第１出口路４６に関連付けられてもよい。

実施形態によれば、ここで使用される流量制御装置としては、ポンプ、バルブ、クランプ、又はそれらの組み合わせが可能である。複数のポンプ、複数のバルブ、複数のクランプを、任意に組み合わせて配置してもよい。種々の実施形態において、流量制御装置は、蠕動ポンプであるか又は蠕動ポンプを含む。他の実施形態において、流体循環路、入口ポート、出口ポートは、任意の材料の配管で構成されてよい。

種々の部材に対して、「動作可能に関連付けられた」と記載されているが、ここで使用される「動作可能に関連付けられた」とは、動作可能な方式で互いに連結された部材を指し、部材が直接連結されている実施形態や、２つの連結された部材の間に別の部材が配置されている実施形態等も包含する。「動作可能に関連付けられた」部材は、「流体的に関連付けられる」ことができる。「流体的に関連付けられた」とは、流体が部材間を移動可能なように互いに連結された部材を指す。「流体的に関連付けられた」という用語は、２つの流体的に関連付けられた部材間に別の部材を配置する実施形態や、部材を直接接続する実施形態等を包含する。流体的に関連付けられた部材は、流体と接触しないが他の部材と接触することにより、システムを操作する部材を含んでもよい（例えば、可撓性の管の外側を圧縮することにより、該管を介して流体をポンピングする蠕動ポンプ等）。

一般に、緩衝液、タンパク質含有流体、細胞含有流体のように、如何なる種類の流体でも、循環路、入口路、出口路を流れることが可能である。本明細書で使用される用語「流体」「培地」「流体培地」は交換可能に使用される。

図１Ｂは、本発明と共に使用される中空糸型細胞成長チャンバー１００の一例を示す正面図である。細胞成長チャンバー１００は、長手方向軸ＬＡ－ＬＡを有し、細胞成長チャンバー筐体１０４を備える。少なくとも１つの実施形態において、細胞成長チャンバー筐体１０４は、４つの開口部又は４つのポート、すなわち、ＩＣ入口ポート１０８、ＩＣ出口ポート１２０、ＥＣ入口ポート１２８、ＥＣ出口ポート１３２を有する。

本発明の実施形態によれば、第１循環路内の流体は、細胞成長チャンバー１００の第１長手方向端１１２におけるＩＣ入口ポート１０８を通って細胞成長チャンバー１００に進入し、中空糸膜１１７を構成する複数の中空糸１１６の毛細管内側（種々の実施形態において、中空糸膜の毛細管内（「ＩＣ」）側又は「ＩＣ空間」と呼ぶ）に進入して通過し、細胞成長チャンバー１００の第２長手方向端１２４に位置するＩＣ出口ポート１２０を通って細胞成長チャンバー１００の外に出る。ＩＣ入口ポート１０８とＩＣ出口ポート１２０との間の流路は、細胞成長チャンバー１００のＩＣ部分１２６を構成する。第２循環路内の流体は、ＥＣ入口ポート１２８を通って細胞成長チャンバー１００に進入し、中空糸１１６の毛細管外側又は外側（該膜の「ＥＣ側」又は「ＥＣ空間」と呼ぶ）に接触して、ＥＣ出口ポート１３２を通って細胞成長チャンバー１００の外に出る。ＥＣ入口ポート１２８とＥＣ出口ポート１３２との間の流路は、細胞成長チャンバー１００のＥＣ部分１３６を構成する。ＥＣ入口ポート１２８を通って細胞成長チャンバー１００に入った流体は、中空糸１１６の外側に接触する。小分子（例えば、イオン、水、酸素、乳酸塩等）は、中空糸１１６を通じて中空糸の内部すなわちＩＣ空間から外側すなわちＥＣ空間へ、又はＥＣ空間からＩＣ空間へ拡散することができる。成長因子のような高分子量の分子は、通常は、大きすぎるため中空糸膜を通過できず、中空糸１１６のＩＣ空間内にとどまる。実施形態において、培地は、必要であれば交換してもよい。また、必要であれば、培地を酸素供給器（ｏｘｙｇｅｎａｔｏｒ）又はガス移送モジュールを通じて循環させて、ガスを交換してもよい。実施形態において、以下で説明するが、細胞は、第１循環路及び／又は第２循環路内に含有させることができ、膜のＩＣ側及び／又はＥＣ側に存在させることができる。

中空糸膜１１７を作製するために使用される材料は、中空糸になるものであれば、任意の生体適合性高分子材料でよい。本発明の一実施形態によれば、使用される材料の１つとしては、合成ポリスルホン系材料が挙げられる。細胞を中空糸の表面に付着させるため、実施形態によれば、表面は何らかの方法で修飾されてよい。例えば、少なくとも細胞成長表面をフィブロネクチン（ＦＮ）やコラーゲンのようなタンパク質でコーティングすることによって、或いは、表面を放射線で照射することによって、表面は修飾されてよい。膜表面のガンマ線処理によって、フィブロネクチンやクリオプレシピテート（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）等で追加コーティングをすることなく、付着性細胞を付着させることができる。ガンマ照射処理された膜で作製されたバイオリアクターは再利用することができる。本開示の実施形態において、細胞付着のためのその他のコーティング及び／又は処理が行われてもよい。

実施形態において、ＣＥＳ（例えば、ＣＥＳ５００（図５）及び／又はＣＥＳ６００（図６））は、回転方向及び／又は横方向揺動装置に取り付けることによって、細胞増殖システムの他の部品に対して細胞成長チャンバーを動かす、すなわち「揺らす」ように構成された装置を有する。図１Ｃは、そのような装置の１つを示す。一実施形態では、該装置において、バイオリアクター１００は、２つの回転方向揺動部品と１つの横方向揺動部品とに回転するように接続されている。

第１回転方向揺動装置部品１３８は、バイオリアクター１００を、バイオリアクター１００の中心軸１４２を中心に回転させる。回転方向揺動装置部品１３８は、バイオリアクター１００に、回転するように関連付けられる。実施形態において、バイオリアクター１００は、中心軸１４２を中心に、単一の方向（時計回り方向又は反時計回り方向）に連続して回転することができる。或いは、バイオリアクター１００は、例えば、中心軸１４２を中心に、最初は時計回り、続いて反時計回りのように、交互に回転させることも可能である。

ＣＥＳはまた、バイオリアクター１００を回転軸１４４中心に回転させる第２回転方向揺動部品を有する。回転軸１４４は、バイオリアクター１００の中心点を通り、中心軸１４２に対して垂直である。実施形態において、バイオリアクター１００は、回転軸１４４を中心に、時計回り方向又は反時計回り方向のいずれかの単一方向に連続回転可能である。或いは、バイオリアクター１００は、回転軸１４４を中心に、例えば、最初は時計回り、続いて反時計回りのように、交互に回転させることが可能である。種々の実施形態において、バイオリアクター１００を、回転軸１４４を中心に回転させることが可能であり、重力に対して水平方向姿勢に又は垂直方向姿勢に配置することができる。

実施形態において、横方向揺動部品１４０は、バイオリアクター１００と横方向に動くように関連付けられる。実施形態において、横方向揺動部品１４０の平面は、ｘ方向及びｙ方向に動く。これにより、バイオリアクターにおける細胞の沈殿は、中空糸内の細胞含有培地の動きによって、減らされる。

揺動装置の回転方向及び／又は横方向の動きによって、装置内における細胞の沈殿が減らされ、また、バイオリアクターのある部分に細胞が捕獲される可能性も抑えられる。細胞成長チャンバーにおける細胞の沈殿速度は、ストークスの式に従って、細胞と懸濁培地との密度差に比例する。ある実施形態において、上述のように、１８０°回転（速い）と休止（例えば、合計時間３０秒）を繰り返すことにより、非接着性の赤血球の懸濁状態が維持される。一実施形態では、約１８０°の最小回転が好ましい。しかしながら、３６０°以上の回転を行うこともできる。異なる揺動部品を別個に又は組み合わせて使用してもよい。例えば、バイオリアクター１００を中心軸１４２中心に回転させる揺動部品を、バイオリアクター１００を軸１４４中心に回転させる揺動部品と組み合わせることができる。同様に、異なる軸を中心に時計回り及び反時計回りを独立に組み合わせて行うこともできる。

図２において、本発明の実施形態に係る、プリマウントタイプの流体輸送組立体を有する細胞増殖システム２００の実施形態が示される。ＣＥＳ２００は、細胞増殖装置２０２を有する。細胞増殖装置２０２は、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６と係合するハッチ又は閉可能なドア２０４を有する。細胞増殖装置２０２内の内部空間２０８は、プリマウントタイプの流体輸送組立体を受容し係合固定するような特徴を有する。プリマウントタイプの流体輸送組立体２１０は、細胞増殖装置２０２に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体２１０を、新しい又は未使用の流体輸送組立体２１０に比較的迅速に交換できるようになっている。単一の細胞増殖装置２０２の動作によって、第１の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第１のセットを成長又は増殖させ、その後、第１の流体輸送組立体２１０を第２の流体輸送組立体２１０に交換する際に細胞増殖装置２０２を殺菌することなく、第２の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第２のセットを成長又は増殖させることができる。プリマウントタイプの流体輸送組立体２１０は、バイオリアクター１００と酸素供給器又はガス移送モジュール２１２（図４参照）を有してよい。流体輸送組立体２１０に接続される種々の培地用配管を受容する実施形態に係る配管案内スロットが２１４として示される。

図３は、本発明の実施形態に係る、プリマウントタイプの流体輸送組立体２１０（図２参照）を取り外し可能に取り付ける前の、細胞成長装置２０２の後側部分２０６を示す。閉可能なドア２０４（図２参照）は、図３では省略されている。細胞増殖装置２０２の後側部分２０６には、流体輸送組立体２１０の構成要素と組み合わせて動作する複数の異なる構造が設けられている。詳細には、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、流体輸送組立体２１０におけるポンプループと協働する複数の蠕動ポンプ（ＩＣ循環ポンプ２１８、ＥＣ循環ポンプ２２０、ＩＣ入口ポンプ２２２、ＥＣ入口ポンプ２２４）を有する。また、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、複数のバルブ（ＩＣ循環バルブ２２６、試薬バルブ２２８、ＩＣ培地バルブ２３０、空気除去バルブ２３２、細胞入口バルブ２３４、洗浄バルブ２３６、分配バルブ２３８、ＥＣ培地バルブ２４０、ＩＣ廃棄バルブ２４２、ＥＣ廃棄バルブ２４４、収穫バルブ２４６）を有する。さらに、複数のセンサ（ＩＣ出口圧力センサ２４８、ＩＣ入口圧力／温度センサ２５０、ＥＣ入口圧力／温度センサ２５２、ＥＣ出口圧力センサ２５４）が、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に関連付けられる。一実施形態によれば、さらに、空気除去チャンバー（ＡＲＣ）のための光学センサ２５６が示されている。

実施形態によれば、バイオリアクター１００を回転させるための軸又はロッカー制御部２５８が示されている。軸又はロッカー制御部２５８と関連付けられた軸嵌合部２６０によって、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に対して、流体輸送組立体２１０又は流体輸送組立体４００の軸アクセス開口部（例えば、配管収納部３００（図４）の開口部４２４（図４））の適切な位置合わせが行える。軸又はロッカー制御部２５８の回転によって、軸嵌合部２６０及びバイオリアクター１００に対して回転運動が付与される。従って、ＣＥＳ２００のオペレータ又はユーザが、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００（図４）を、細胞増殖装置２０２に取り付ける際、位置合わせは、軸嵌合部２６０に対して、流体輸送組立体２１０又は流体輸送組立体４００の軸アクセス開口部（例えば、図４の開口部４２４）を適切に方向付けるといった比較的簡単な作業となる。

図４は、取り付け・取り外し自在のプリマウントタイプの流体輸送組立体４００の斜視図である。プリマウントタイプの流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２（図２及び図３）に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体４００を、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００に比較的迅速に交換できるようになっている。図４に示されるように、バイオリアクター１００は、軸嵌合部４０２を含むバイオリアクターカップリングに取り付けられる。軸嵌合部４０２は、細胞増殖装置２０２の軸（図３では２５８）を係合させるための１以上の軸締結機構（付勢された腕部又はバネ部材４０４）を有する。

実施形態によれば、流体輸送組立体４００は、配管４０８Ａ、４０８Ｂ、４０８Ｃ、４０８Ｄ、４０８Ｅ等及び管継手を有する。これらにより、以下で説明されるように、図５、図６に示されるような流体路が提供される。ポンプループ４０６Ａ、４０６Ｂもポンプのために設けられる。実施形態において、細胞増殖装置２０２が配置される場所に、種々の培地が設けられてもよいが、実施形態によれば、プリマウントタイプの流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２の外部に延在する程度に十分な長さの配管を有することで、培地バッグ又は培地容器に関連付けられた配管が溶着接続されることが可能となる。

次に、図５は、細胞増殖システム５００の実施形態の概略図である。図６は、他の実施形態である細胞増殖システム６００の概略図である。図５及び図６に示される実施形態では、以下で説明するように、細胞は、ＩＣ空間で成長される。しかしながら、本発明は、そのような例に限定されない。他の実施形態では、細胞はＥＣ空間で成長されてもよい。

図５は、実施形態に係るＣＥＳ５００を示している。ＣＥＳ５００は、第１流体循環路５０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路５０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路５０６は、細胞成長チャンバー５０１に流体的に関連付けられて、第１流体循環路５０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート５０１Ａを介して細胞成長チャンバー５０１に流入し、細胞成長チャンバー５０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート５０１Ｂを介して流出する。圧力測定器５１０は、細胞成長チャンバー５０１を離れる培地の圧力を測定する。培地は、培地流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ５１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ５１２は、第１方向又は第１方向の反対の第２方向に、流体をポンピング可能である。出口ポート５０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループに流入する培地は、バルブ５１４を介して流入することができる。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ、圧力測定器、圧力／温度センサ、ポート及び／又は他の装置を種々の位置に配置して、流体経路のある部分において、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ５００の複数の要素に対する１つの可能な構成であり、１以上の実施形態の範囲において、変形可能であると理解されるべきである。

ＩＣループ５０２に対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５１６又はサンプルコイル５１８から得られる。第１流体循環路５０２に配置された圧力／温度測定器５２０によって、動作中において、培地圧力及び温度が測定できる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート５０１Ａに戻って、流体循環路５０２を完了する。細胞成長チャンバー５０１で成長／増殖した細胞は、細胞成長チャンバー５０１から流し出され、バルブ５９８を通って収穫バッグ５９９に入るか、中空糸内に再分配され、さらに成長される。

第２流体循環路５０４において、流体は、ＥＣ入口ポート５０１Ｃを介して、細胞成長チャンバー５０１に入り、ＥＣ出口ポート５０１Ｄを介して細胞成長チャンバー５０１を離れる。ＥＣループ５０４では、培地は、細胞成長チャンバー５０１の中空糸の外側と接触し、それによって、小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。

実施形態において、培地が細胞成長チャンバー５０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路５０４に配置された圧力／温度測定器５２４によって、該培地の圧力及び温度が測定可能である。培地が細胞成長チャンバー５０１を離れた後、圧力測定器５２６によって、第２流体循環路５０４の培地の圧力が測定可能である。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５３０から又はサンプルコイルから得られる。

実施形態において、細胞成長チャンバー５０１のＥＣ出口ポート５０１Ｄを離れた後、第２流体循環路５０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ５２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に至る。ＥＣ循環ポンプ５２８は、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路５２２は、酸素供給器入口ポート５３４及び酸素供給器出口ポート５３６を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、酸素供給器入口ポート５３４を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、酸素供給器出口ポート５３６を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、例えば、ＣＥＳ５００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路５０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、適当なサイズの任意の酸素供給器又はガス移送装置でよい。空気又はガスは、フィルタ５３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、フィルタ５４０を介して、酸素供給器又はガス輸送装置５３２から流出する。フィルタ５３８、５４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ５００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２を介して大気にベント可能である。

ＣＥＳ５００を含む構成において、第１流体循環路５０２及び第２流体循環路５０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）細胞成長チャンバー５０１を流れる。ＣＥＳ５００は、対向流で流れるように構成してもよい。

少なくとも１つの実施形態において、（バッグ５６２からの）細胞を含む培地及びバッグ５４６からの流体培地は、第１流体流路５０６を介して第１流体循環路５０２に導入される。流体容器５６２（例えば、細胞投入バッグ又は空気をシステム外にプライミングするための生理食塩水プライミング流体）は、バルブ５６４を介して、第１流体流路５０６及び第１流体循環路５０２に流体的に関連付けられる。

流体容器（又は培地バッグ）５４４（例えば、試薬）は、バルブ５４８を介して第１流体入口路５４２に、又はバルブ５７６を介して第２流体入口路５７４に流体的に関連付けられ、流体容器５４６（例えば、ＩＣ培地）は、バルブ５５０を介して第１流体入口路５４２に、又はバルブ５７０を介して第２流体入口路５７４に流体的に関連付けられる。また、滅菌され密封可能な第１及び第２入力プライミング路５０８、５０９が設けられる。空気除去チャンバー（ＡＲＣ）５５６が、第１循環路５０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー５５６は、１以上の超音波センサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー５５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー５５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ５００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー５５６と流体的に関連付けられたライン５５８を通って、エアバルブ５６０から大気中へベント可能である。

（例えば、バッグ５６８からの）ＥＣ培地又は（例えば、バッグ５６６からの）洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。流体容器５６６は、バルブ５７０と流体的に関連付けられる。バルブ５７０は、分配バルブ５７２及び第１流体入口路５４２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７０を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６６は、第２流体入口路５７４及びＥＣ入口路５８４を介して第２流体循環路５０４と流体的に関連付けることができる。同様に、流体容器５６８は、バルブ５７６と流体的に関連付けられる。バルブ５７６は、第１流体入口路５４２及び分配バルブ５７２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７６を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６８は、第２流体入口路５７４と流体的に関連付けることができる。

培地試薬の導入又は洗浄液の導入のために、オプションで熱交換器５５２を設けてもよい。

ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ５５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ５７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器５８０がＥＣ入口路５８４と関連付けられてもよい。

少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路５０２、５０４は、廃棄ライン５８８と接続される。バルブ５９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン５８８を流れ、廃棄物バッグ又は出口バッグ５８６に至る。同様に、バルブ５８２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄ライン５８８を介して廃棄物バッグ又は出口バッグ５８６に流れる。

実施形態において、細胞は、細胞収穫路５９６を通って収穫される。ここでは、細胞成長チャンバー５０１からの細胞は、細胞収穫路５９６及びバルブ５９８を通るように、細胞を含むＩＣ培地をポンピングして、細胞収穫バッグ５９９へ送ることによって、収穫される。

ＣＥＳ５００の種々の構成要素は、細胞増殖装置２０２（図２、図３参照）のような装置又はハウジング内に収納される。そこでは、該装置が、細胞及び培地を、例えば、所定の温度に維持する。

図６は、細胞増殖システム６００の他の実施形態の概略図である。ＣＥＳ６００は、第１流体循環路６０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路６０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路６０６は、細胞成長チャンバー６０１に流体的に関連付けられて、第１流体循環路６０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート６０１Ａを介して細胞成長チャンバー６０１に流入し、細胞成長チャンバー６０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート６０１Ｂを介して流出する。圧力センサ６１０は、細胞成長チャンバー６０１を離れる培地の圧力を測定する。圧力の他に、センサ６１０は、作動中において、培地圧力及び培地温度を検知する温度センサであってもよい。培地は、培地流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ６１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ６１２は、第１方向又は第１方向の反対の第２方向に、流体をポンピング可能である。出口ポート６０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループに流入する培地は、バルブ６１４を介して流入することができる。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ、圧力測定器、圧力／温度センサ、ポート及び／又は他の装置を種々の位置に配置して、流体経路のある部分において、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ６００の複数の要素に対する１つの可能な構成であり、１以上の実施形態の範囲において、変形可能であると理解されるべきである。

ＩＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルコイル６１８から得られる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート６０１Ａに戻って、流体循環路６０２を完了する。細胞成長チャンバー６０１で成長／増殖した細胞は、細胞成長チャンバー６０１から流し出され、バルブ６９８及びライン６９７を介して収穫バッグ６９９に入る。或いは、バルブ６９８が閉じている場合、細胞は、チャンバー６０１に再分配され、さらに成長される。

第２流体循環路６０４において、流体は、ＥＣ入口ポート６０１Ｃを介して、細胞成長チャンバー６０１に入り、ＥＣ出口ポート６０１Ｄを介して細胞成長チャンバー６０１を離れる。ＥＣループでは、培地は、細胞成長チャンバー６０１の中空糸の外側と接触し、それによって、チャンバー６０１内における小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。

培地が細胞成長チャンバー６０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路６０４に配置された圧力／温度センサ６２４によって、該培地の圧力及び温度を測定することができる。培地が細胞成長チャンバー６０１を離れた後に、センサ６２６によって、第２流体循環路６０４の培地の圧力及び／又は温度を測定することができる。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート６３０から又はサンプルコイルから得られる。

細胞成長チャンバー６０１のＥＣ出口ポート６０１Ｄを離れた後、第２流体循環路６０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ６２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に至る。実施形態において、ＥＣ循環ポンプ６２８もまた、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路６２２は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２の入口ポート６３２Ａ及び出口ポート６３２Ｂを介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、入口ポート６３２Ａを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、出口ポート６３２Ｂを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、例えば、ＣＥＳ６００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路６０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、酸素供給又はガス移送に有用な、適当なサイズの任意の装置でよい。空気又はガスは、フィルタ６３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、フィルタ６４０を介して、酸素供給器又はガス移送装置６３２から流出する。フィルタ６３８、６４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ６００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２を介して大気にベント可能である。

ＣＥＳ６００として示された該構成において、第１流体循環路６０２及び第２流体循環路６０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）細胞成長チャンバー６０１を流れる。実施形態に係るＣＥＳ６００は、対向流で流れるように構成してもよい。

少なくとも１つの実施形態において、（細胞容器、例えばバッグのようなソースからの）細胞を含む培地は、取り付け点６６２に取り付けられ、培地源からの流体培地は、取り付け点６４６に取り付けられる。細胞及び培地は、第１流体流路６０６を介して第１流体循環路６０２に導入される。取り付け点６６２は、バルブ６６４を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。取り付け点６４６は、バルブ６５０を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。試薬源を、点６４４に流体的に接続して、バルブ６４８を介して流体入口路６４２に関連付けてもよいし、又はバルブ６４８、６７２を介して第２流体入口路６７４に関連付けてもよい。

空気除去チャンバー（ＡＲＣ）６５６が、第１循環路６０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー６５６は、１以上のセンサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー６５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー６５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ６００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー６５６と流体的に関連付けられたライン６５８を通って、エアバルブ６６０から大気中へベント可能である。

ＥＣ培地源が、ＥＣ培地取り付け点６６８に取り付けられる。洗浄液源が、洗浄液取り付け点６６６に取り付けられる。これにより、ＥＣ培地及び／又は洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。取り付け点６６６は、バルブ６７０と流体的に関連付けられる。バルブ６７０は、バルブ６７２及び第１流体入口路６４２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７０を開け、バルブ６７２を閉じることにより、取り付け点６６６は、第２流体入口路６７４及び第２流体流路６８４を介して第２流体循環路６０４と流体的に関連付けることができる。同様に、取り付け点６６８は、バルブ６７６と流体的に関連付けられる。バルブ６７６は、第１流体入口路６４２及びバルブ６７２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７６を開け、分配バルブ６７２を閉じることにより、流体容器６６８は、第２流体入口路６７４と流体的に関連付けることができる。

ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ６５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ６７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器６８０がＥＣ入口路６８４と関連付けられてもよい。

少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路６０２、６０４は、廃棄ライン６８８と接続される。バルブ６９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン６８８を流れ、廃棄物バッグ又は出口バッグ６８６に至る。同様に、バルブ６９２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄物バッグ又は出口バッグ６８６に流れる。

細胞が細胞成長チャンバー６０１にて成長した後、該細胞は、細胞収穫路６９７を介して収穫される。細胞成長チャンバー６０１からの細胞は、バルブ６９８を開けた状態において、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路６９７を介して、細胞収穫バッグ６９９に収穫される。

ＣＥＳ６００の種々の構成要素は、細胞増殖装置２０２（図２、図３参照）のような装置又はハウジング内に収納される。そこでは、該装置が、細胞及び培地を、例えば、所定の温度に維持する。さらに、ＣＥＳ６００及びＣＥＳ５００（図５参照）の構成要素は、組み合わせられてもよい。他の実施形態において、ＣＥＳは、図５及び図６に示されるよりも、本発明の範囲内において、少ない構成要素又は多い構成要素を含んでもよい。本発明の特徴を含む細胞増殖システムの一例としては、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ社（コロラド州 レイクウッド）によって製造されている、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムが挙げられる。

細胞増殖システムの実施例及び詳細な説明は、米国特許第８，３０９，３４７号明細書（「細胞増殖システム及び使用方法」２０１２年１１月１３日発行）に与えられている。該米国特許出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。

細胞増殖システム及び該システムと関連付けられた方法の種々の実施形態が記載されてきたが、図７では、本開示の実施形態に係る、ＣＥＳ５００（図５）又はＣＥＳ６００（図６）のような細胞増殖システムと一緒に使用される、放出成分を製造、純化及び／又は収集するためのプロセスの動作ステップ７００の例が示される。ＳＴＡＲＴステップ７０２が開始すると、プロセス７００は、バイオリアクターに細胞を播種するステップ７０４に進む。実施形態において、細胞は０日目（Ｄａｙ０）に播種される。ある実施形態では、ＭＳＣｓが播種される。当業者であれば理解できるように、所望の細胞生産物（例えばＥＶやウイルスベクター等）を放出するのであれば、任意の細胞を用いることができる。

次に、一実施形態によれば、コンフルエントになるまで、細胞を培地で増殖させる（ステップ７０６）。他の実施形態では、所望の数の細胞倍加数が起こるまで細胞を増殖させる（例えば、細胞倍加１回、細胞倍加２回、細胞倍加３回、細胞倍加４回、細胞倍加５回、細胞倍加６回以上等）。他の実施形態では、細胞は、特定の期間にわたって増殖されてもよい。例えば、細胞は、約２４時間～約４８時間の期間にわたって増殖させることができる。他の実施形態では、細胞は、約４８時間～約７２時間の間、増殖させることができる。他の実施形態において、細胞は、約２４時間～約７２時間の期間にわたって増殖させることができる。実施形態では、このような増殖は、例えば１日目～３日目に起こる。他の実施形態によれば、細胞は、約２４時間未満の時間にわたって増殖される。他の実施形態では、７２時間を超える時間にわたって細胞を増殖させることができる。例えば、一実施形態では、エクソソームを収集する前に、細胞を約７日間～約８日間増殖させることができる。本開示の実施形態に従って、任意の期間が使用される。

細胞は、例えば、完全培地で増殖させることができる（ステップ７０６）。一実施形態では、培地は、アルファ－ＭＥＭ（α－ＭＥＭ）と血清のような、血清含有培地を含む。一実施形態では、動物由来血清を使用することができる。他の実施形態では、ヒト由来の血清を使用することができる。他の実施形態では、合成血清を使用することができる。さらに他の実施形態では、別のタイプの血清を使用することができる。血清含有培地の例には、α－ＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が含まれる。さらなる実施形態では、無血清培地を使用することができる。当業者に公知の任意のタイプの培地を使用することができる。

図７に戻って、次に、プロセス７００は、血清含有培地等の第１培地を洗い流すための任意ステップ７０８に進む。一実施形態では、血清含有培地は、第２培地、例えば基礎培地、に置換される。基礎培地の例には、α－ＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸが含まれる。当業者に公知の任意のタイプの培地を使用することができる。放出される成分を（血清又は他のタンパク質源にも存在するものとは対照的に）増殖している細胞から単離又は精製するために、洗い流し洗浄手順によって、実施形態に従って、血清（例えば、血清タンパク質）が除去される。一実施形態では、洗浄手順は、３日目に行われる。一実施形態では、例えば、動物由来の血清が使用されない場合、ヒト由来の血清のみが使用される場合、無血清培地が使用される場合、及び／又は、例えば、除去されるべき他の追加のタンパク質源がない場合は、ステップ７０８の実行は任意である。

次に、プロセス７００は、放出された構成要素又は物質（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）をループ（例えばＩＣループ）において収集するステップ７１０に進む。一実施形態では、このような収集は、ＩＣ出口を閉じる（例えば、ＩＣ出口バルブを閉じる）ことによって放出された構成要素又は物質（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）を、ＩＣループ内で濃縮することによって行われる。そのような濃縮は、規定された期間にわたって行われる。一実施形態では、このような時間は、放出された構成成分をＩＣループ内で約４８時間濃縮することを含む。他の実施形態では、このような期間は、放出された成分を約２４時間～約４８時間濃縮することを含むことができる。他の実施形態では、このような期間は、放出された成分を約２４時間～約７２時間濃縮することを含むことができる。他の実施形態では、このような期間は、放出された構成成分を約４８時間～約７２時間濃縮することを含むことができる。一実施形態では、このような期間は、放出された成分を約７２時間より長く濃縮することを含むことができる。一実施形態では、このような収集は、例えば３日目～５日目に行われる。さらに他の実施形態では、このような期間は、放出された成分を約２４時間未満で濃縮することを含むことができる。任意の期間を、本開示の実施形態に従って使用することができる。そのような収集期間中、細胞には、タンパク質を含まない培地が補充される。そのような培地は、ＥＣ側から添加され、半透過性膜を通して拡散される。他の実施形態では、培地はＩＣ側から添加され、例えば、タンパク質を含まない培地が細胞に補充される。

ＩＣ（又はＥＣ）ループ内において放出された成分を収集した後、プロセス７００は、放出された成分を収穫するステップ７１２に進む。一実施形態では、このような収穫は、例えば５日目に行われる。一実施形態では、放出された成分（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）は、懸濁状態で、バイオリアクターの毛細管内側循環ループから収穫バッグ又は収穫容器に移される。一実施形態では、タンパク質を含まない培地が、このような収穫タスクにおいて使用される。

次に、プロセス７００は、オプションステップである、追加処理を行うステップ７１４に進む。ここでは、例えば、収穫された放出成分が、分析のために処理される。他の実施形態では、追加処理を行うステップ７１４は、収穫バッグに収集された培地から放出物質をさらに濃縮することを含むことができる。他の実施形態では、追加処理を行うステップ７１４は、バッグ内の他の成分（例えば、懸濁細胞が使用されて、放出物質と一緒に収穫された場合の細胞）から、放出物質を分離することを含むことができる。一実施形態では、このような追加処理を行うステップ７１４は、放出された成分のさらなる単離及び／又は特徴付けを含み得る。オプションである追加処理を行うステップ７１４から、プロセス７００は、終了ステップ７１６で終了する。或いは、オプションである追加処理を行うステップ７１４に対する希望がない場合は、プロセス７００は、収穫ステップ７１２から終了ステップ７１６へ直接進み、終了することができる。

次に、図８が、設定例及び培地導入例と共に説明される。しかしながら、本明細書に提示された実施形態はこの例に限定されず、他の要件又はシステム設計又は構成を満たすように実施形態を修正することができる。ＳＴＡＲＴステップ８０２が開始され、プロセス８００は、ディスポーザブルチュービングセットを細胞増殖システムに装填するステップ８０４に進む。

次に、システムは、ステップ８０６において、プライミングされる。一実施形態では、例えば、ユーザ又はオペレータは、プライミングのためのタスクを選択することによってプライミングするようにシステムに指示を提供することができる。一実施形態では、プライミングのためのそのようなタスクは、予めプログラムされたタスクであってもよい。システム５００（図５）又はシステム６００（図６）は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でプライミングすることができる。バイオリアクター５０１、６０１をプライミングするために、バッグ（５４６）が、システム５００、６００に（例えば、接続点６４６に）取り付けられる。図中の符号を参照する際、例えば「参照符号、参照符号」（例えば、５００、６００）となっている場合、そのような表現形式は、「参照符号及び／又は参照符号」（例えば、５００及び／又は６００）を意味する。バルブ５５０、６５０が開けられる。次いで、ＰＢＳを第１の流体循環路５０２、６０２内にポンプ注入するようにＩＣ入口ポンプ５５４、６５４を設定することによって、ＰＢＳを第１流体循環路５０２、６０２に導く。バルブ６１４が開けられ、ＰＢＳは、入口５０１Ａ、６０１Ａを通って、バイオリアクター６０１に入り、出口５０１Ｂ、６０１Ｂから出る。一実施形態によれば、空気除去チャンバー５５６、６５６によって空気が除去されながら、バイオリアクター５０１、６０１及び／又は第１流体循環路５０２、６０２に培地が入り、バイオリアクター５０１、６０１がプライミングされる。

バイオリアクター５０１、６０１をさらにプライミングするために、バッグ５８６が、システム５００、６００に（例えば、接続点６６８に）取り付けられる。バルブ５７６、６７６が開けられる。次いで、ＰＢＳを第１流体循環路５０４、６０４内にポンプ注入するようにＩＣ入口ポンプ５５４、６５４を設定することによって、ＰＢＳを第２流体循環路５０２、６０２に導くことができる。バルブ６９２を閉じて、ＰＢＳは、入口５０１Ｃ、６０１Ｃを通り、バイオリアクター６０１に入り、ＥＣループの出口５０１Ｄ、６０１Ｄから出る。一実施形態によれば、空気除去チャンバー５８０、６８０によって空気が除去されながら、バイオリアクター５０１、６０１及び／又は第２流体循環路５０４、６０４に培地が入り、バイオリアクター５０１、６０１はプライミングされる。

次いで、プロセス８００は、バイオリアクターをコーティングするステップ８０８に進む。ここでは、バイオリアクター５０１、６０１がコーティング剤、例えば、５ｍｇのフィブロネクチン（ＦＮ）でコーティングされる。例えば、ある実施形態では、試薬バッグ５４４が空になるまで、試薬をＩＣループ５０２、６０２内に（例えば、接続点６４４から）投入することができる。試薬５４４は、空気除去チャンバー５５６、６５６からＩＣループ５０２、６０２内に流され、次いで、試薬５４４は、循環ポンプ５１２、６１２及び／又は入口ポンプ５５４、６５４を操作することによって、ＩＣループ５０２、６０２内を循環する。当業者に知られている任意のコーティング試薬（例えば、ＦＮ又はクリオプレシピテート）を使用することができる。

バイオリアクターをコーティングするためにシステム５００、６００に導入される溶液の例が、以下に示される。

バイオリアクターのコーティングは、３段階で行われる。上記の溶液を導入する第１段階のためのシステム５００、６００に対する設定の例が、以下に示される。

空気除去チャンバー５５６、６５６から試薬を流し込む、バイオリアクターをコーティングする第２段階のためのシステム５００、６００の設定の例が、以下に示される。

ＩＣループ５０２、６０２内において試薬を循環させる、バイオリアクターをコーティングする第３段階のためのシステム５００、６００の設定の例が、以下に示される。

バイオリアクターがコーティングされると、ステップ８１０において、ＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが実行される。ここでは、ＩＣ循環ループ５０２、６０２及びＥＣ循環ループ５０４、６０４における流体が置換される。置換体積は、ＩＣ体積及びＥＣ体積の置換回数によって決定される。ＩＣ／ＥＣ洗浄タスク中にＣＥＳ５００、６００に導入される溶液の例が、次に示される。

システム５００、６００のＩＣ／ＥＣ洗浄タスクの設定の例が、以下に示される。

次に、バイオリアクター膜内のファイバーにわたって適正又は所望のガス濃度を維持するために、培地調整タスク８１２を実行して、細胞がバイオリアクターに投入される前に、培地が提供されたガス供給と平衡に達するようにする。例えば、高いＥＣ循環レートを使用することによって、培地と、ガス移送モジュール又は酸素供給器５３２、６３２によって提供されるガス供給との間の迅速な接触が行われる。次いで、例えば、ユーザ又はオペレータが細胞をバイオリアクター５０１、６０１にロードする準備が整うまで、システム５００、６００は適切な状態又は所望の状態に維持される。一実施形態では、ＣＥＳ５００、６００は、例えば、完全培地で調整される。完全培地は、細胞増殖のために使用される任意の培地源である。一実施形態において、完全培地は、例えば、アルファ－ＭＥＭ（α－ＭＥＭ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。当業者に公知の任意のタイプの培地を使用することができる。

培地調整タスク８１２は、２段階プロセスである。第１ステップでは、システム５００、６００は、高いＥＣ循環レートを使用することによって、培地とガス供給とを迅速に接触させる。第２ステップでは、システム５００、６００は、オペレータが細胞を投入する準備が整うまで、バイオリアクター５０１、６０１を適切な状態に維持する。培地調整タスク８１２の間に、ＣＥＳ５００、６００に投入される溶液の一例が、以下に示される。

培地調整タスク８１２の第１ステップの設定の例が、以下に示される。

培地調整タスク８１２の第２ステップの設定の例が、以下に示される。

プロセス８００は、次に、細胞投入バッグ５６２（接続点６６２）からバイオリアクター５０１、６０１に細胞を投入するステップ８１４に進む。細胞投入は３段階のプロセスであってよい。第１段階では、バッグ５６２が空になるまで、（接続点６６２における）セル投入バッグ５６２からバイオリアクター５０１、６０１へ、均一な懸濁液で細胞が投入される（ステップ８１４）。他の実施形態では、細胞は、例えばブルズアイ投入（ｂｕｌｌｓ－ｅｙｅ ｌｏａｄｉｎｇ）手順のような、別のタイプの投入手順によって投入されてもよい（ステップ８１４）。任意のタイプの投入手順が、実施形態に従って使用されてよい。第２段階では、細胞は、空気除去チャンバー５５６、６５６からバイオリアクター５０１、６０１に向かって流し込まれる。より大きな流し込み体積を利用する構成では、細胞は、拡がり、ＩＣ出口５９０、６９０に向かって移動することができる。第３段階では、ＩＣ循環を通じて（例えば、ＩＣ投入無しの状態のＩＣ循環ポンプ５１４、６１４を通じて）、膜にわたった細胞の分散が促進される。

細胞を投入するステップ８１４においてシステム５００、６００に導入される溶液の例が、以下に示される。

上述したように、細胞投入ステップ８１４は、３つの段階で行われる。第１段階のためのシステム５００、６００に対する設定の一例が、以下に示される。

第２段階のためのシステム５００、６００に対する設定の一例が、以下に示される。

第３段階のためのシステム５００、６００に対する設定の一例が、以下に示される。

さらに、細胞（例えば、接着性細胞）は、例えば中空糸に付着させることができる（８１６）。一実施形態では、細胞を付着させる際（８１６）、ＩＣループ５０２、６０２に対するポンプ５１４、６１４の流量をゼロにした状態で、ＥＣ循環ループ５０４、６０４上でのフローを行いながら、接着性細胞をバイオリアクター膜に付着させることが可能である。膜に細胞を付着させるプロセス８１６においてＣＥＳ５００、６００に導入される溶液の例が、以下に示される。

システム５００、６００における膜への付着８１６のための設定例が以下に示される。

細胞は、ステップ８１８でフィーディングされる。ある流量（例えば、低流量）がＩＣ循環ループ５０２、６０２及び／又はＥＣ循環ループ５０４、６０４に連続的に付加される。出口設定は、システム５００、６００に加えられる流体の除去を考慮した設定である。フィーディングステップ８１８において、システム５００、６００に導入される溶液の例が、以下に示される。

システム５００、６００におけるフィーディングステップ８１８のための設定例が以下に示される。

次に、プロセス８００は、オプションのステップ８２０に進み、血清含有培地を洗い流し、基礎培地又はタンパク質を含まない培地に置換する。前の処理で、タンパク質を含まない培地を用いて細胞の投入、細胞へのフィーディング等を行った場合、ステップ８２０は行う必要はない。しかしながら、血清含有タンパク質が使用される場合は、放出された細胞生産物（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター）の単離及び／又は収集を見込んで、例えば、細胞がコンフルエントに達した後、又は規定された期間後、又は所望の細胞倍加の数に達した後、洗浄手順８２０が開始される。

例えば、最小２回の細胞倍加、３回の細胞倍加、４回の細胞倍加、５回の細胞倍加、６回以上の細胞倍加等の後に、放出された細胞生産物の精製及び／又は収集を開始することが望ましい。１又は複数のプロセスを行うことで、放出されたＥＶ生成物の収集のために、システム５００、６００内の培地を浄化することができる。そのような浄化手順としては、５×ＩＣ・ＥＣ洗浄（５回のＩＣ・ＥＣ洗浄）８２０、陰圧限外濾過洗浄８２２、ＩＣ・ＥＣ洗浄８２４、及び／又は別のタイプの洗浄手順がある。第１に、５×ＩＣ・ＥＣ洗浄８２０は、ＩＣ循環ループ５０２、６０２及びＥＣ循環ループ５０４、６０４両方の流体を置換することを含む。ここで、置換体積は、置換されるＩＣ体積及びＥＣ体積の回数によって指定される。

５×ＩＣ／ＥＣ洗浄タスク８２０において、システム５００、６００に導入される溶液の例が、以下に示される。

システム５００、６００の５×ＩＣ／ＥＣ洗浄タスク８２０の設定例が以下に示される。

さらに、オプションの陰圧限外濾過洗浄８２２は、陰圧限外濾過を使用してＩＣ循環ループ５０２、６０２を洗浄して、中空糸のＩＣ側に沈着した可能性のある成分をリフトオフするのを助けることができる。陰圧限外濾過８２２においてＣＥＳ５００、６００に導入される溶液の例が、以下に示される。

システム５００、６００の陰圧限外濾過８２２のための設定例を以下に示す。

さらに、オプションステップであるＩＣ・ＥＣ洗浄ステップ８２４を使用することにより、ＩＣ循環ループ５０２、６０２及びＥＣ循環ループ５０４、６０４両方の流体を置換することができる。置換体積は、ＩＣ体積及びＥＣ体積の置換回数によって指定される。そのような洗浄手順において、使用される培地は、例えば、基礎培地又はタンパク質を含まない培地である。オプションステップであるＩＣ・ＥＣ洗浄８２４においてシステム５００、６００に導入される溶液の例が、以下に示される。

システム５００、６００のＩＣ・ＥＣ洗浄８２４のための設定例を以下に示す。

上述のタスクは、カスタムタスク又はユーザ定義タスクである。他の構成では、そのようなタスクは、予めプログラムされたタスク又はデフォルトのタスクでもよい。他の実施形態では、そのようなタスクは、例えば、ユーザ又はオペレータによって手動で実行されてもよい。

実施形態では、血清又は血清タンパク質の除去（例えば、完全な除去）を実証確認するため、システム５００、６００における総タンパク質は、洗浄手順中に、異なる時点で（例えば、５×洗浄の前、５×洗浄８２０の後、陰圧限外濾過８２２の後、基礎培地置換８２４の後に）、ＩＣ側（又は他の構成ではＥＣ側）において測定される。さらに、例えば、動物由来の血清を使用しない場合、ヒト由来の血清のみを使用する場合、無血清培地を使用する場合、及び／又は除去すべき他のそのような追加タンパク質源がない場合は、ステップ８２０、８２２、及び／又はステップ８２４は、任意に行えばよい。

一実施形態によれば、上記の方法の有効性は、図１１のグラフ１１００によって表される。グラフ１１００は、上述した手順を実施するシステム５００、６００のようなシステムによって、もたらせ得るタンパク質の測定結果を表す。示されるように、システム５００、６００におけるタンパク質の量は、ライン１１０４によって表される。上記の手順８２０、８２２、８２４の前では、システム５００、６００におけるタンパク質の量は、ピーク１１０８（例えば、７０００μｇ／ｍＬ以上）である。５×洗浄８２０の間、タンパク質の量は、ライン１１０４の部分１１１２によって表されるように、徐々に低下する。実際に、５×洗浄８２０の終わりでは、タンパク質濃度は、ライン１１０４の部分１１１６によって表されるように、略０μｇ／ｍＬである。そのような場合には、例えば、陰圧限外濾過洗浄８２２も基礎培地置換８２４も行う必要はない。しかしながら、手順８２２、８２４は、一実施形態によれば、システム５００、６００においてタンパク質をさらに効果的に除去することができる。

バイオリアクターから血清含有培地を洗い流した後、バイオリアクター５０２、６０２のＥＣ側５０４、６０４に培地を添加し半透過性膜中を拡散させることで、規定の時間（例えば約４８時間）、バイオリアクター中の細胞はタンパク質を含まない培地でフィーディングされる（８２６）。ＥＣ入口６６８は、放出された細胞生産物が濃縮されている間に細胞に栄養素を提供するために、ＥＣ培地（例えば、タンパク質を含まない培地）を供給することができる。このような構成においては、ＩＣ投入は行わない。代わりに、バイオリアクター５０２、６０２の半透過性中空糸によって、必須栄養素（例えば、グルコース）は、連続灌流（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を通じて、細胞に到達することが可能になり、代謝老廃物（例えば、乳酸）は能動的に除去され、拡散を通じて、システム５００、６００から外に出る（ＥＣ出口を開５８２、６９２）。そのようなフィーディングは、所定の期間（例えば、約４８時間）、行われる。他の状況において、細胞への補給を行うために、タンパク質を含まない培地が、約２４時間～約７２時間にわたって使用される。他の実施形態では、タンパク質を含まない培地（例えば、第２培地）によるこのようなフィーディングは、細胞への補給を行うために約４８時間～約７２時間の間、行われる。他の実施形態では、第２培地（例えば、タンパク質を含まない培地）によるこのようなフィーディングは、約２４時間～約４８時間にわたって、行われる。他の実施形態では、第２培地によるこのようなフィーディングは、約２４時間～約４８時間行われる。さらに他の実施形態では、タンパク質を含まない培地を用いたそのようなフィーディングは、約２４時間未満、行われる。第２培地による任意の時間のフィーディングが、実施形態に従って使用される。別の構成では、ＩＣ入口は、細胞に栄養素を提供するために、ＩＣ培地（例えば、タンパク質を含まない培地）を供給することができる。そのようなフィーディングは、本開示の実施形態に従う任意の期間にわたって行われる。このような細胞のフィーディング８２６は、ＩＣ出口バルブ５９０、６９０を閉じることによってＩＣ出口を閉じることを含む。細胞フィーディング８２６におけるシステム５００、６００に導入される溶液の例が
、以下に示される。

システム５００、６００における細胞フィーディング８２６のための設定例が、以下に示される。

他の実施形態では、放出された細胞生産物の収集を可能にするＩＣ出口の閉鎖は、例えば、ステップ８２８で行われる。このようなＩＣ出口の閉鎖（バルブ５９０、５９８又はバルブ６９０、６９８の閉鎖による）は、細胞によって放出された細胞生産物をバイオリアクターにおいて集める又は濃縮することを可能にする（８２８）。ＥＣ出口を開いた状態に保つことによって（バルブ５８２、６９２）、限外濾過により、ＥＣ側５０４、６０４を介して老廃物を能動的に除去することができる。さらに、半透過性膜により、必須栄養素が連続灌流によって細胞に到達することができる。例えば、表２４、２５に示されているように、一実施形態によれば、細胞は、ＩＣ側に（例えば、タンパク質を含まない）培地を任意に添加することによってフィーディングされる（８２６）。一実施形態では、培地バッグ５４６を接続点６４６に接続することができる。バッグ５４６からの培地（例えばタンパク質なし）は、バルブ５５０、６５０を介してＩＣ入口ライン５０６、６０６に送られる。入口ライン５０６、６０６から、培地はＩＣループ５０２、６０２に入り、バイオリアクター５０１、６０１のＩＣ部分において細胞に対してフィーディングを行う。

追加的又は代替的に、ステップ８２６及び／又はステップ８２８は、出口バッグ又は廃棄物バッグ５８６、６８６の交換ステップ８２７、８２９も任意に含むことができる。一実施形態において、出口バッグ又は廃棄物バッグ５８６、６８６の交換を行うことによって、バッグの内容物の監視又は試験が実施可能となり、グルコース／乳酸量の監視、（ＩＣ出口が閉鎖されているので）放出された細胞生成物が膜を横切っているかどうかの決定等が行える。上記のように、細胞によって産生される細胞生産物（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）は、膜を通って拡散するには大きい（例えば、分子量が大きい）。ＩＣ出口が閉鎖されている場合、放出された細胞生産物（例えばＥＶ）は、放出された細胞生成物（例えば、ＥＶ）濃度が継続的に増加する増殖中において（又は規定の収集期間において）、バイオリアクター５０１、６０１のＩＣ側に維持される。細胞フィーディング８２６は、ＩＣ出口の閉鎖と同時に行うことができる。他の実施形態では、ステップ８２６は、例えば、収集ステップ８２８においてＩＣ出口の閉鎖の後に行われる。さらに他の実施形態では、ステップ８２６は、例えば、収集ステップ８２８においてＩＣ出口の閉鎖の前に行われる。他の実施形態では、出口バッグ５８６、６８６は、ＩＣ出口の閉鎖後に試験／監視が望まれない場合には交換されない。さらに他の実施形態では、出口容器又は廃棄物容器又は出口バッグ又は廃棄物バッグは、放出された物質を収集及び収穫するために使用される。プロセス８００においてＩＣ出口が閉じられると記載されているが、例えば、ＥＣ側で細胞成長が行われる他の実施形態では、ＥＣ出口が閉じられることに留意すべきである。

（例えば、約４８時間後、又は別の時間期間の後等に）、ループ（例えば、ＩＣループ５０２、６０２）内の濃縮又は収集された細胞生産物８２８の収集を開始すると決定された場合、一実施形態では、収穫バルブ５９８、６９８が開けられ、細胞生産物は、バイオリアクター５０１、６０１のＩＣ側５０２、６０２から収穫容器５９９、６９９へ収穫される（８３０）。一実施形態では、収穫可能にするため、ＩＣ出口５８６、６８６のＩＣバルブ５９０、６９０が開けられる。他の実施形態では、収穫バッグ５９９、６９９又は収穫容器に収穫できるように、収穫バルブ５９８、６９８が開けられる。一実施形態では、このような収穫はプロセス全体の終わりに行われる。他の実施形態では、そのような収穫は、所定の間隔で行われる。一実施形態では、細胞生産物（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）は、バイオリアクター５０１、６０１内の毛細管内側循環ループ５０２、６０２から懸濁状態で、収穫バッグ５９９、６９９又は収穫容器に移送される。一実施形態では、タンパク質を含まない培地が、このような収穫タスクにおいて使用される。濃縮又は収集された細胞生産物の収集８２８においてシステム５００、６００に導入される溶液の例が、以下に示される。

システム５００、６００を用いた濃縮又は収集された細胞生産物８２８の収集のための設定例が、以下に示される。

放出された物質の収穫８３０後、プロセス８００は、追加処理８３２又は細胞の収穫８３６が望まれない場合、細胞生産物収穫８３０から直接ＥＮＤステップ８３８に進み、終了することができる。

或いは、収穫ステップ８３０から、プロセス８００は任意に、追加処理８３２を可能にするように進むことができる。このような追加処理８３２は、一実施形態において、分析のための処理を含む。他の実施形態では、このような追加処理８３２は、収穫バッグに集められた培地又は流体からの細胞生産物のさらなる濃縮を含む。他の実施形態では、このような追加処理８３２は、バッグ中の他の成分（懸濁細胞を成長して放出物と共に収穫する場合、そのような細胞）から細胞生産物を分離することを含む。一実施形態では、このような追加処理８３２は、放出された細胞生産物のさらなる単離及び／又は特徴付けを含む。バイオリアクター内に残っている細胞（例えば、接着性細胞等）を収穫しない場合は、プロセス８００は、任意選択の追加処理ステップ８３２から、ＥＮＤステップ８３８で終了することができる。

一方、バイオリアクター内に残っている細胞（例えば、接着性細胞又は付着した細胞）を収穫することが望ましい場合、プロセス８００は細胞を剥離するステップ８３４に進む。或いは、追加処理８３２が所望されないがバイオリアクターからの細胞の剥離８３４が望まれる場合は、プロセス８００は、細胞生産物収穫ステップ８３０から直接細胞剥離ステップ８３４に進む。付着した細胞は、バイオリアクターの膜から剥離され（８３４）、例えばＩＣループ中に懸濁される。ある実施形態では、細胞を剥離するための試薬を添加するために備えてＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが、ステップ８３４の一部として実行される。例えば、ＩＣ／ＥＣ培地は、接着性細胞を剥離するためにトリプシン又は他の化学剥離剤を添加するのに備えて、タンパク質、カルシウム（Ｃａ²⁺）及びマグネシウム（Ｍｇ²⁺）を除去するために、例えば、ＩＣ／ＥＣ培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に置換される。試薬は、試薬バッグが空になるまで、システムに投入される。試薬はＩＣループ内に流し込まれ、該試薬はＩＣループ内で混合される。接着性細胞の剥離後、収穫ステップ８３６において、例えば、バイオリアクターに残存する細胞を含むＩＣ循環ループから、懸濁状態の細胞が、収穫バック又は収穫容器へ移送される。そして、プロセス８００は、ＥＮＤステップ８３８で終了する。

次に、図９は、本開示の実施形態によるＣＥＳ５００（図５）又はＣＥＳ６００（図６）のような細胞増殖システムと共に使用することができる、放出された物質（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター）を製造、単離及び／又は収集するためのプロセスの例示的な動作ステップ９００を示す。ＳＴＡＲＴステップ９０２が開始され、プロセス９００は、ディスポーザブルチュービングセットを細胞増殖システムに装填するステップ９０４に進む。次に、システムは、ステップ９０６において、プライミングされる。一実施形態では、例えば、ユーザ又はオペレータは、プライミングのためのタスクを選択することによってプライミングするようにシステムに指示を提供することができる。一実施形態では、プライミングのためのそのようなタスクは、予めプログラムされたタスクであってもよい。次いで、プロセス９００は、バイオリアクターをコーティングするステップ９０８に進む。ここでは、バイオリアクターは、コーティング剤によってコーティングされる。例えば、ある実施形態では、試薬容器が空になるまで、試薬はＩＣループに投入される。試薬は、空気除去チャンバーからＩＣループ内に流し込まれてもよく、その後、試薬はＩＣループ内を循環する。フィブロネクチン又はクリオプレシピテートのような、当業者に公知の任意のコーティング試薬を使用することができる。バイオリアクターがコーティングされると、ＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが実行される（９１０）。ここでは、ＩＣ循環ループ及びＥＣ循環ループ上の流体が置換される。一実施形態によれば、置換体積は、ＩＣ体積及びＥＣ体積の置換回数によって決定される。

次に、バイオリアクター膜内の糸にわたって適正又は所望のガス濃度を維持するために、培地調整タスク９１２を実行して、細胞をバイオリアクターに投入する前に、培地と提供されたガス供給とが平衡状態になるようにする。例えば、高いＥＣ循環レートを使用することによって、培地と、ガス移送モジュール又は酸素供給器によって提供されるガス供給との間の迅速な接触が行われる。次いで、システムは、例えば、ユーザ又はオペレータが細胞をバイオリアクターにロードする準備が整うまで、適切な状態又は所望の状態に維持される。一実施形態では、システムは、例えば、完全培地で調整される。完全培地は、細胞成長のために使用される任意の培地源である。一実施形態において、完全培地は、例えば、アルファ－ＭＥＭ（α－ＭＥＭ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。当業者に公知の任意のタイプの培地を使用することができる。

次に、プロセス９００は、ステップ９１４に進み、例えば、細胞投入バッグからバイオリアクターへ細胞の投入を行う。一実施形態において、細胞は、細胞投入バッグが空になるまで、該バッグからバイオリアクターへ投入される。細胞は空気除去チャンバーからバイオリアクターへ流し込まれる。より大きな流し込み体積を利用する実施形態では、細胞は拡がって投入され、ＩＣ出口へと向かうことができる。細胞の膜への分配は、例えば、ＩＣの投入ではなく、例えば、ＩＣ循環ポンプを介して、ＩＣ循環によって、促進される。さらに、細胞（例えば、接着性細胞）は、ステップ９１６において、中空糸に付着させられ、ステップ９１８においてフィーディングされる。一実施形態では、細胞を付着させる際（９１６）、ＩＣループに対するポンプの流量をゼロに設定した状態で、ＥＣ循環ループ上でのフローを可能にしながら、接着性細胞をバイオリアクター膜に付着させることが可能である。細胞は、ステップ９２０において成長／増殖する。一実施形態では、細胞は３日間～４日間にわったて増殖する。他の実施形態では、細胞は、所望の細胞倍加の数を達成するための期間だけ、増殖する。他の実施形態では、細胞は、コンフルエントに達するための期間だけ、増殖する。一実施形態では、細胞は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）を集める前の、約７日間～約８日間、増殖させられる。本開示の実施形態に従えば、任意の期間でよい。

次に、プロセス９００は、クエリステップ９２２へ進み、細胞成長／増殖ステップ９２０中に条件培地に細胞が放出した細胞生産物（ＥＶ又はウイルスベクター等）の収集が所望されているかどうかを判断する。例えば、２回の倍加、３回の倍加、４回の倍加、５回の倍加、６回以上の細胞倍加等、特定の又は規定された回数の細胞倍加後に、収集のため、放出された物質の単離又は精製を開始することが望ましい。例えば、一実施形態では、最小２回の細胞倍加後に放出された物質の単離及び／又は収集を開始することが望ましい。他の実施形態では、例えば、最小５回以上の細胞倍加後に、放出された物質の精製及び／又は収集を開始することが望ましい。一実施形態では、放出された物質の単離及び／又は収集を開始する前に、定められた数の細胞倍加が設定されない場合もある。当業者に理解されるように、任意の数の細胞倍加、所定期間、及び／又は他の指標を使用することができる。

クエリステップ９２２に戻って、放出された物質を単離及び／又は収集することが望まれる場合、プロセス９００は、「Ｙｅｓ」に分岐し、洗浄置換ステップ９２４へ進む。一実施形態では、ステップ９２４では、血清含有培地の洗い流しが行われる。ここでは、例えば、該培地は基礎培地に置換される。一実施形態において、洗浄置換ステップは、以下のステップのうちの１又は複数のステップを有する：（１）５×ＩＣ・ＥＣ洗浄、（２）バイオリアクターからできるだけ多くの血清を除去するためのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による陰圧限外濾過洗浄、（３）ＰＢＳ洗浄において失われた代謝産物分を補給するための基礎培地による２．５×ＩＣ・ＥＣ洗浄。一実施形態では、上記ステップ（１）～（３）の全てが行われる。他の実施形態では、上記ステップ（１）～（３）のうちの１つのみが行われる。他の実施形態では、上記ステップ（１）～（３）のうちの２つが行われる。さらに、実施形態に従っていれば、ステップは任意の順番でよい。さらに他の実施形態では、洗浄ステップ９２４は行わなくてもよい。例えば、動物由来の血清を使用しない場合、ヒト由来の血清のみを使用する場合、無血清培地を使用する場合、及び／又は除去すべき他のそのような追加タンパク質源がない場合は、ステップ９２４は任意に行われればよい。

バイオリアクターから血清含有培地が洗い流された（９２４）後、ＩＣ出口バルブを閉鎖することによってＩＣ出口を閉じて（９２６）、細胞によって放出された物質の濃度をバイオリアクター内で増加させる。ステップ９２６の一部として、出口バッグ又は廃棄物バッグの交換を任意に行ってもよい（９２８）。出口バッグ又は廃棄物バッグの交換を行うことによって、バッグの内容物の監視又は試験が実施可能となり、グルコース／乳酸量の監視、（ＩＣ出口が閉鎖されているので）放出された物質が膜を横切っているかどうかの決定等が行える。上記のように、細胞によって産生される放出物質（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）は、膜を通って拡散するには大きすぎる（例えば、分子量が大きすぎる）。ＩＣ出口が閉鎖されている場合、放出された物質（例えばＥＶ）は、放出された物質（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）濃度が継続的に増加する増殖中において（又は規定の収集期間において）、バイオリアクターのＩＣ側に維持される。一実施形態では、ステップ９２８は、ＩＣ出口の閉鎖と同時に行うことができる。他の実施形態では、ステップ９２８は、ＩＣ出口の閉鎖の後に行われる。さらに他の実施形態では、ステップ９２８は、ＩＣ出口の閉鎖の前に行われる。他の実施形態では、出口バッグは、ＩＣ出口の閉鎖後に試験／監視又は出口バックの別目的のための使用が望まれない場合には交換されなくてもよい。プロセス９００においてＩＣ出口が閉じられると記載されているが、例えば、ＥＣ側で細胞成長が行われる他の実施形態では、ＥＣ出口が閉じられることに留意すべきである。

次に、プロセス９００は、細胞フィーディングステップ９３０、放出物質収集ステップ９３２へ進み、タンパク質を含まない培地をバイオリアクターのＥＣ側に添加し、半透過性膜を通じてＩＣ側に拡散させる。このような実施形態において、ＥＣ入口では、放出された物質が濃縮されている間に、細胞に栄養素を提供するために、ＥＣ培地（例えば、タンパク質を含まない培地）が供給される。この場合、例えば、ＩＣ投入は行わない。代わりに、バイオリアクターの半透過性中空糸によって、必須栄養素（例えば、グルコース）は、連続灌流（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を通じて、細胞に到達することが可能になり、代謝老廃物（例えば、乳酸）は能動的に除去され、拡散を通じて、システムから外に出る（ＥＣ出口を開）。他の実施形態では、細胞は、培地をＩＣ側に添加することによってフィーディングされる。一実施形態では、細胞への補給を行うために、基礎培地が約４８時間、使用される。他の実施形態では、細胞への補給を行うため、基礎培地が、約２４時間～約７２時間、使用される。実施形態では、ＩＣループ（ＩＣ出口閉９２６）における放出された物質（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）の収集又は濃縮は、規定の時間、例えば約４８時間、又は他の実施形態では、約２４時間～約７２時間、行われる。他の実施形態では、基礎培地によるフィーディング及び放出粒子の収集は、約７２時間よりも長い期間（例えば、約７２時間～約９６時間）、行われる。他の実施形態では、第２培地によるフィーディング及び放出粒子の収集は、約７２時間～約１２０時間、行われる。さらに他の実施形態では、そのようなフィーディング及び収集は、２４時間よりも短い期間、行われる。

（例えば、約４８時間後、又は別の時間期間の後に）、濃縮又は収集された放出物質の収穫を開始すると決定された場合、一実施形態では、収穫用バルブが開けられ（９３４）、放出物質は、バイオリアクターのＩＣ側から収穫容器に収穫される（９３６）。一実施形態では、収穫可能にするため、ＩＣ出口のＩＣバルブが開けられる。他の実施形態では、収穫バッグ又は収穫容器に収穫できるように、収穫バルブが開けられる。一実施形態では、このような収穫はプロセス全体の終わりに行われる。他の実施形態では、そのような収穫は、所定の間隔で行われる。一実施形態では、放出物質（例えば、ＥＶ又はウイルスベクター等）は、バイオリアクター内の毛細管内側循環ループから懸濁状態で、収穫バッグ又は収穫容器に移送される。一実施形態では、タンパク質を含まない培地が、このような収穫タスクにおいて使用される。

放出物質収穫ステップ９３６の後、プロセス９００は任意に、追加処理９４４に進むことができる。このような追加処理９４４は、一実施形態において、分析のための処理を含む。他の実施形態では、このような追加処理９４４は、収穫バッグに集められた培地からの放出物質のさらなる濃縮を含む。他の実施形態では、このような追加処理９４４は、バッグ中の他の成分（懸濁細胞を成長して放出物質と共に収穫する場合、そのような細胞）から放出物質を分離することを含む。一実施形態では、このような追加処理９４４は、放出物質のさらなる単離及び／又は特徴付けを含む。バイオリアクター内に残っている細胞（例えば、接着性細胞等）を収穫しない場合は、プロセス９００は、任意選択の追加処理ステップ９４４から、ＥＮＤステップ９４６に進み、終了することができる。他の実施形態において、プロセス９００は、追加処理９４４も細胞の収穫９４０も望まれない場合、生産物収穫ステップ９３６から直接ＥＮＤステップ９４６に進み、終了することができる。

ステップ９４４に戻って、バイオリアクター内に残っている細胞（例えば、接着性細胞又は付着した細胞）を収穫することが望ましい場合、プロセス９００は任意選択の細胞剥離ステップ９３８に進む。或いは、追加処理９４４が所望されないがバイオリアクターからの細胞の剥離９３８が望まれる場合は、プロセス９００は、細胞生産物収穫ステップ９３６から直接、任意選択の細胞剥離ステップ９３８に進む。付着した細胞は、バイオリアクターの膜から剥離され（９３８）、例えばＩＣループ中に懸濁される。ある実施形態では、細胞を剥離するための試薬を添加するために備えてＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが、ステップ９３８の一部として実行される。例えば、接着性細胞を剥離するためにトリプシン又は他の化学剥離剤を添加するのに備えて、タンパク質、カルシウム（Ｃａ²⁺）及びマグネシウム（Ｍｇ²⁺）を除去するために、ＩＣ／ＥＣ培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に置換される。試薬は、試薬バッグが空になるまで、システムに投入されてもよい。試薬はＩＣループ内に流し込まれ、ＩＣループ内で混合される。接着性細胞の剥離後、収穫ステップ９４０において、例えば、バイオリアクターに残存する細胞を含むＩＣ循環ループから懸濁状態の細胞が、収穫バック又は収穫容器へ移送される。そして、プロセス９００の一部として、ステップ９４２において、ディスポーザブルセットが細胞増殖システムから任意に取り外され、プロセス９００は、ＥＮＤステップ９４６で終了する。

本開示の実施形態によれば、図７、図８、図９に示されるプロセスにおいて記述された動作ステップは、あくまで例示の目的であり、変更されてもよく、他のステップと組み合わせてもよく、又他のステップと並行に行われてもよい。実施形態では、本開示の精神及び範囲から逸脱しなければ、ステップを減らしてもよいし、ステップを追加してもよい。また、例えば、プライミング、バイオリアクターのコーティング、細胞の投入のようなステップ（及びサブステップ）は、いくつかの実施形態では、例えば、メモリに記憶された予めプログラムされたタスクを実行するプロセッサによって、自動的に行ってもよい。ここでは、そのようなステップは、あくまでも例示の目的で提示されている。

細胞増殖システムと共に用いられるカスタムタスクや予めプログラムされたタスク等のタスク及びプロトコルの例や詳細な説明は、米国特許出願公開第１３／２６９，３２３号明細書（２０１１年１０月７日出願 タイトル「中空糸バイオリアクターシステムにおける細胞成長及び細胞収穫の設定可能な方法及びシステム」）及び米国特許出願公開第１３／２６９，３５１号明細書（２０１１年１０月７日出願 タイトル「中空糸バイオリアクターシステムにおける細胞成長及び細胞収穫のカスタマイズ可能な方法及びシステム」）に提示される。該米国特許出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。

次に、図１０は、本発明の実施形態を実行するコンピューティングシステム１０００の構成要素の一例を示す。コンピューティングシステム１０００は、例えば、上述のプロセス７００、８００、９００のようなプロセスの一部として、カスタムタスクや予めプログラムされたタスクのようなタスクを実行するために、細胞増殖システムがプロセッサを使用する実施形態において使用される。実施形態において、予めプログラムされたタスクは、例えば、「ＩＣ／ＥＣ洗浄」及び／又は「細胞フィーディング」を含んでよい。

コンピューティングシステム１０００は、ユーザインターフェース１００２、処理システム１００４、及び／又は記憶装置１００６を有する。ユーザインターフェース１００２は、当業者であればわかるように、出力装置１００８、及び／又は入力装置１０１０を有する。出力装置１００８は、１以上のタッチスクリーンを有してよい。タッチスクリーンは、１以上のアプリケーションウィンドウを提供するためのディスプレイ領域を有してよい。タッチスクリーンはまた、例えば、ユーザやオペレータからの物理的な接触を受容及び／又は取り込み可能な入力装置１０１０であってもよい。タッチスクリーンは、当業者であれば理解できるように、処理システム１００４による接触位置の推定を可能とする静電容量構造の液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）でもよい。この場合、処理システム１００４は、接触位置を、アプリケーションウィンドウの所定位置に表示されるＵＩ要素にマッピングすることができる。また、タッチスクリーンは、本発明において、１以上のその他の電子構造を介して接触を受容してもよい。他の出力装置１００８としては、プリンター、スピーカ等が挙げられる。その他の入力装置１０１０としては、当業者であれば理解できるように、キーボード、その他のタッチ式入力装置、マウス、音声入力装置等が挙げられる。

本発明の実施形態において、処理システム１００４は、処理ユニット１０１２、及び／又はメモリ１０１４を有してもよい。処理ユニット１０１２は、メモリ１０１４に記憶された命令を実行するために動作可能な汎用プロセッサであってよい。処理ユニット１０１２は、本発明の実施形態では、単一のプロセッサ又は複数のプロセッサを含んでよい。さらに、実施形態では、各プロセッサとしては、別個に命令を読み込んで実行するための１以上のコアを有するマルチコアプロセッサが可能である。プロセッサは、当業者であれば理解できるように、汎用プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、その他の集積回路を含んでよい。

本発明の実施形態において、メモリ１０１４は、データ及び／又はプロセッサ実行可能命令を短期に又は長期に記憶する任意の記憶装置を含んでよい。メモリ１０１４は、当業者であれば理解できるように、例えば、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリ・メモリ（ＲＯＭ）、又は電気的消去・プログラム可能型リード・オンリ・メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）を含む。他の記憶媒体としては、例えば、当業者であれば理解できるように、ＣＤ－ＲＯＭ、テープ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、又は、他の光学記憶装置、テープ、磁気ディスク記憶装置、磁気テープ、その他の磁気記憶装置等がある。

記憶装置１００６は、任意の長期データ記憶装置又は部品である。本発明の実施形態において、記憶装置１００６は、メモリ１０１４と関連して記載されたシステムのうちの１以上を含んでよい。記憶装置１００６は、常設してもよいし、取り外し可能でもよい。一実施形態において、記憶装置１００６は、処理システム１００４によって生成された又は与えられたデータを記憶する。

実施例
実施形態の態様を実施することができる方法／プロセス／プロトコル／構成のいくつかの例を以下に説明する。特定の特徴はこれらの実施例に記載されているかもしれないが、それらはあくまで説明の目的のために提供されているだけである。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１
上記のシステム及び方法の実施による細胞の増殖及び細胞外粒子の収集の結果の例を図１２のグラフ１２００に示す。グラフ１２００は、例えば、上述の方法７００、８００、９００及びＣＥＳ５００、６００を用いた一連のＥＶ製造実行結果を示す。例えば、製造／収集においては、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ社（コロラド州、レイクウッド）製のＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システム（Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）システム又はＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）ＣＥＳ）を用いることができる。示されるように、上記プロセス及びシステムを用いて、種々の濃度のＥＶを製造・収集することができる。そのような製造によって、２．５Ｅ＋０７ ＥＶｓ／ｍＬを超える高い値（１２０８）から５．００Ｅ＋０６ ＥＶｓ／ｍＬと１．００Ｅ＋０７ ＥＶｓ／ｍＬとの間の低い値（１２１２）にわたって、種々の濃度のＥＶが得られる。

実施例２
実施形態に係る上記の方法７００、８００、９００及び／又はシステム５００、６００を用いて細胞外粒子の生成及び／又は収集の結果の例を図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃのグラフ１３００、１３０４、１３０８に示す。システム５００、６００によって生成された場合のＥＶ濃度１３１２ａ、１３１２ｃのそれぞれは、２２５ｃｍ²の組織培養フラスコ（Ｔ２２５）内で生成された場合のＥＶ濃度１３１６ａ、１３１６ｃに近いか、又はそれより高い。ここで、該フラスコは、比較のために、システム５００、６００と実質的に同様の細胞密度で播種され、同様に処理された（例えば、同様の細胞密度及び同様のフィーディングを用いる）。図１３Ｂに示すように、２２５ｃｍ²の組織培養フラスコ（Ｔ２２５）内で生成された場合のＥＶ濃度１３１６ｂは、システム５００、６００によって生成された場合のＥＶ濃度１３１２ｂよりも高い。ここで、該フラスコは、比較のために、システム５００、６００と実質的に同様の細胞密度で播種され、同様に処理された。

一例として、図１３Ａは、Ｔフラスコ（Ｑ１４６８Ｔ－ｆｌａｓｋ）内で製造及び／又は収集されるＥＶ１３１６ａと比較して、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムの「Ｑ１４６８」１３１２ａとして番号付けした実験におけるＥＶ生成収集の結果を示す。該フラスコは、比較のために、実質的に同様の細胞密度で播種され、同様に処理される。例えば、Ｑ１４６８では、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）システム（２１，０００ｃｍ²の表面積）中のバイオリアクターには、１．２５Ｅ＋０８の培養細胞が投入され、Ｑ１４６８Ｔ－ｆｌａｓｋのＴフラスコ（２２５ｃｍ²の表面積）には、９．２４Ｅ＋０５の培養細胞が投入された。これは、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）システム及びＴフラスコの両方に実質的に同様の細胞密度を投入することと同等である。図１３Ａの結果では、１３１２ａ（Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）システム）及び１３１６ａ（Ｔフラスコ）の両方について、６．００Ｅ＋０７ ＥＶｓ／ｍＬと７．００Ｅ＋０７ ＥＶｓ／ｍＬの間の濃度を示し、グラフ１３００は、Ｔフラスコ（Ｑ１４６８Ｔ－ｆｌａｓｋ）から集められたＥＶ濃度１３１６ａと比較して、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）システムから集められたＥＶ濃度１３１２ａは高いことを示す。

図１３Ａ及び図１３Ｃの結果は、例えば、従来のＴフラスコ内で同様の細胞投入（例えば、同様の細胞密度）及びフィーディング量を使用することによって得られる濃度よりも、該システム（例えば、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ社（コロラド州、レイクウッド）製のＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システム）の製造／収集によって得られるＥＶ濃度の方が高いことを示す。ＣＥＳ５００、６００を使用した場合、いくつかの機能の自動化が可能であるため、労力を下げることができ、また、いくつかの実施形態では、より大きな表面積で細胞を成長させるため、より多くのＥＶを提供することができる。

実施例３
例えば、実施形態に係る、上記の方法７００、８００、９００及び／又はシステム５００、６００を用いた場合における抗原特異的細胞外粒子（例えばＥＶ）の生成及び／又は収集の結果の例を図１４に示す。図１４に示すように、従来のＴフラスコ及びシステム５００、６００（例えば、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ社（コロラド州、レイクウッド）製のＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システム）から得られた精製エクソソームの代表的なサンプルから、例示的な結果を得ることができる。グラフ１４００に示すように、抗原特異的エクソソームのタイプは、ＣＤ９、ＣＤ６３及び／又はＣＤ８１を含む。システム５００、６００から製造され収集されたＣＤ９エクソソームの数はコラム１４０４で示され、システム５００、６００から製造され収集されたＣＤ６３エクソソームの数はコラム１４０８で示され、システム５００、６００から製造され収集されたＣＤ８１エクソソームの数はコラム１４１２で示される。さらに、細胞は、２２５ｃｍ²組織培養フラスコ（Ｔ２２５）において、比較のために、システム５００、６００（例えばＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）システム）と実質的に同様の細胞密度で播種され且つ同様に処理される。グラフ１４００に示されるように、組織培養フラスコ（Ｔ２２５）から製造され収集されたＣＤ９エクソソームの数はコラム１４１６で示され、組織培養フラスコ（Ｔ２２５）から製造され収集されたＣＤ６３エクソソームの数はコラム１４２０で示され、組織培養フラスコ（Ｔ２２５）から製造され収集されたＣＤ８１エクソソームの数はコラム１４２４で示される。図１４に示すように、各抗原に関して、システム５００、６００によって製造及び収集されたエクソソームの数は、組織培養フラスコ（Ｔ２２５）によって製造され収集されたエクソソームの数よりも高い。例えば、図１４は、一実施形態によれば、ＣＥＳ収穫からの抗原特異的エクソソームの各々の量は、Ｔ２２５収穫の場合の２～３倍であることを示している。

実施例４
図８に関して説明したように、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）システム（例えばＣＥＳ５００、６００）はＰＢＳでプライミングされ、５ｍｇのＦＮで一晩コーティングされる。次の日、システムは、２．５×ＩＣ・ＥＣ洗浄を受け、完全培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ）で調整される。予め選択したＭＳＣをバイオリアクターに播種し、４～５日間増殖させる。この時点で、システムは、バイオリアクターからできるだけ多くの血清を除去するために、ＰＢＳで、５×ＩＣ・ＥＣ洗浄及び陰圧限外濾過洗浄を受ける。次いで、ＰＢＳ洗浄中に失われた代謝産物を補充するために、基礎培地（ＧｌｕｔａＭＡＸのみを含むαＭＥＭ）を用いた２．５×ＩＣ・ＥＣ洗浄が実施される。基礎培地を用いて、４８時間、細胞への補給が行われ、同時に条件培地は収穫バッグへ集められる。フラスコはまた、比較目的のために、バイオリアクターと実質的に同様の播種密度で播種され、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）システムと同様に処理される。

例えば、実施例４の一部として使用される、上記の方法７００、８００、９００及び／又はシステム５００、６００からの結果では、９．９×１０⁶個の細胞をバイオリアクター５０１、６０１に投入し、６日間増殖し、システムから血清を除去し、エクソソームをＩＣループで２日間収集した場合、合計で４．７１×１０¹¹個のエクソソームを生成することが観察された。エクソソームが収集された後、エクソソームは、ＩＣループから収穫され、この場合、１億３５００万個のＭＳＣがバイオリアクター５０１、６０１から回収されることが観察された。

本開示の実施形態は、例えば、以下のように１又は複数の態様を含む。

本発明の実施形態及び／又は実施態様は、細胞生産物を収集する方法を含む。該方法は、細胞をバイオリアクターに投入するステップと、培地によって前記細胞へフィーディングを行うステップと、前記細胞を増殖するステップであって、前記細胞が細胞生産物を放出するステップと、放出された前記細胞生産物を濃縮するステップと、前記バイオリアクターから濃縮された前記細胞生産物を収穫するステップと、を有する。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、放出された前記細胞生産物は、細胞外粒子を含む。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記細胞外粒子は、細胞外小胞を含む。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記細胞外小胞は、エクソソームを含む。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記細胞外小胞は、微小小胞を含む。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記細胞外粒子は、ウイルスベクターを含む。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、収穫された前記細胞生産物は、バッグに集められる。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記方法はさらに、前記培地を置換するステップを有する。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記培地は血清を含む。

本発明の実施形態及び／又は実施態様は、細胞増殖システムを有する。該細胞増殖システムは、中空糸膜を有するバイオリアクターと、少なくとも両端部を有する第１流体流路と、プロセッサと、前記プロセッサと通信を行い、前記プロセッサによって読取可能なメモリと、を備える。前記第１流体流路は、前記中空糸膜の毛細管内側部分と流体的に関連付けられる。前記メモリは一連の命令を有し、前記一連の命令が、前記プロセッサによって実行される場合、前記プロセッサは、選択を受けて、細胞へのフィーディングを行い、選択を受けて、前記毛細管内側部分の出口を閉じて、前記毛細管内側部分の前記細胞から放出された粒子を濃縮し、前記粒子を収穫バッグへ移動させる動作を行う。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記プロセッサはさらに、５回の洗い流し洗浄を行うこと、陰圧限外濾過を行うこと、洗い流し洗浄を行うこと、のうち少なくとも１つを行う。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記細胞から放出された前記粒子は、細胞外粒子を含む。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記細胞外粒子は、エクソソームを含む。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記細胞外粒子は、微小小胞を含む。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記プロセッサはさらに、選択を受けて、前記中空糸膜の前記毛細管内側部分及び毛細管外側部分の流体を置換する。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記流体を置換する際、前記細胞へのフィーディングのために使用される第１培地からタンパク質が取り出される。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記細胞へのフィーディングのために使用される前記第１培地は、タンパク質を含まない第２培地に置換される。

１以上の上記実施形態及び／又は１以上の上記実施態様のいずれかにおいて、前記プロセッサはさらに、前記バイオリアクター内の前記第１培地及び／又は前記第２培地の試験を行って、前記タンパク質が除去されたかどうかを判断する。

本発明の実施形態及び／又は実施態様は、細胞増殖システムを含む。該細胞増殖システムは、中空糸膜を有するバイオリアクターと、前記バイオリアクターの少なくとも両端部に第１入口と第１出口とを有し、前記中空糸膜の毛細管内側部分と流体的に関連付けられた第１流体流路と、第２入口と第２出口とを有し、前記中空糸膜の毛細管外側部分と流体的に関連付けられた第２流体流路と、前記第１流体流路に流体的に関連付けられた第１接続ポートと、前記第１流体流路に流体的に関連付けられた第２接続ポートと、前記第１流体流路と前記第２流体流路とに流体的に関連付けられた第３接続ポートと、前記第２流体流路に流体的に関連付けられた第４接続ポートと、前記第１流体流路に流体的に関連付けられた収穫バッグと、を備える。前記第１接続ポートに取り付けられた第１バッグによって、前記バイオリアクターに細胞が導入され、タンパク質を含む第１培地が入った第２バッグが前記第２接続ポートに接続され、前記第２バッグから、前記第１培地が前記第１流体流路を通って前記バイオリアクターへ供給され、所定数の細胞倍加が起きるまで、前記細胞へのフィーディングが行われ、第２培地が入った第３バッグが前記第３接続ポートに接続され、前記第３バッグから、前記第２培地が前記第１流体流路及び前記第２流体流路を通って前記バイオリアクターへ供給され、前記バイオリアクターから前記第１培地を洗い流して洗浄し、前記洗浄の後、タンパク質を含まない第３培地が入った第４バッグが前記第４接続ポートに接続され、前記細胞へのフィーディングが行われ、前記第３培地で前記細胞にフィーディングを行う際、前記第１流体流路の前記第１出口は閉じられ、前記バイオリアクターの前記毛細管内側部分において、前記細胞から放出される粒子が濃縮され、濃縮された前記粒子は前記収穫バッグへ移送される。

本発明の実施形態及び／又は実施態様は、細胞増殖システムにおいて細胞粒子を生成する方法を含む。前記細胞増殖システムは、毛細管内側部分と毛細管外側部分とを有する中空糸膜を備えるバイオリアクターと、前記バイオリアクターの少なくとも両端部に第１入口と第１出口とを有し、前記中空糸膜の毛細管内側部分と流体的に関連付けられた第１流体流路と、第２入口と第２出口とを有し、前記中空糸膜の毛細管外側部分と流体的に関連付けられた第２流体流路と、前記第１流体流路に流体的に関連付けられた第１接続ポートと、前記第１流体流路に流体的に関連付けられた第２接続ポートと、前記第１流体流路と前記第２流体流路とに流体的に関連付けられた第３接続ポートと、前記第２流体流路に流体的に関連付けられた第４接続ポートと、収穫バッグと、を備える。該方法は、前記細胞増殖システムにプライミングを行うステップと、前記第１接続ポートに第１バッグを接続して、前記バイオリアクターに細胞を導入するステップと、前記第２接続ポートに、タンパク質を含む第１培地が入った第２バッグを接続して、前記第１培地を、前記第１流体流路を介して前記バイオリアクターに供給し、所定数の細胞倍加が起きるまで、前記細胞へのフィーディングを行うステップと、前記所定数の細胞倍加が起きた後、前記第３接続ポートに、第２培地が入った第３バッグを接続して、前記第２培地を、前記第１流体流路と前記第２流体流路とを介して前記バイオリアクターに供給し、前記バイオリアクターから前記第１培地を洗い流して洗浄するステップと、前記洗浄の後、前記第１流体流路の前記第１出口を閉じて、前記バイオリアクターの前記毛細管内側部分において、前記細胞から放出された粒子を濃縮するステップと、前記第４接続ポートに、タンパク質を含まない第３培地が入った第４バッグを接続し、前記細胞へのフィーディングを行うステップと、収穫のために、前記第１流体流路に前記収穫バッグを接続するステップと、濃縮された前記粒子を前記収穫バッグに収穫するステップと、を有する。

本発明の実施形態及び実施態様は、上記実施形態及び上記実施態様のうちの１以上又はそれらを組み合わせたもののうちのいずれかを含む。

本発明の実施形態及び実施態様は、上記実施形態及び上記実施態様のうちの１以上を実行する手段を含む。

本発明の実施形態及び適用例が示され説明されてきたが、本発明は、上記した構成に制限されないと理解されるべきである。当業者に明らかな種々の変形、変更等は、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の構成、動作、また方法及びシステムにおける詳細において行うことが可能である。

ここで使用される「少なくとも１つ」、「１以上の」、「及び／又は」は、結合的及び選言的の両方として機能する非限定的表現である。例えば、「Ａ、Ｂ及びＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ又はＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ及びＣのうち１以上」、「Ａ、Ｂ又はＣのうち１以上」、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」のこれら各表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣ、又は、ＡとＢとＣ、のいずれかであることを意味する。

当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の方法及び構造に対して種々の変形及び変更を行えることは理解できよう。従って、本発明は、上記の特定の実施形態又は実施例に限定されないと理解されるべきである。むしろ、本発明は、以下の請求項及びそれらの等価物の範囲内において、変形形態及び変更形態をも含むことが意図されている。

Claims (20)

1. 細胞生産物を収集する方法であって、該方法は、
   細胞をバイオリアクターに投入するステップと、
   培地によって前記細胞へフィーディングを行うステップと、
   前記細胞を増殖するステップであって、前記細胞が細胞生産物を放出するステップと、
   放出された前記細胞生産物を濃縮するステップと、
   前記バイオリアクターから濃縮された前記細胞生産物を収穫するステップと、
   を有する、
   方法。
2. 請求項１記載の方法において、放出された前記細胞生産物は、細胞外粒子を含む、
   方法。
3. 請求項２記載の方法において、前記細胞外粒子は、細胞外小胞を含む、
   方法。
4. 請求項３記載の方法において、前記細胞外小胞は、エクソソームを含む、
   方法。
5. 請求項３記載の方法において、前記細胞外小胞は、微小小胞を含む、
   方法。
6. 請求項２記載の方法において、前記細胞外粒子は、ウイルスベクターを含む、
   方法。
7. 請求項１記載の方法において、収穫された前記細胞生産物は、バッグに集められる、
   方法。
8. 請求項１記載の方法において、前記方法はさらに、前記培地を置換するステップを
   有する
   方法。
9. 請求項１記載の方法において、前記培地は血清を含む、
   方法。
10. 中空糸膜を有するバイオリアクターと、
    少なくとも両端部を有する第１流体流路と、
    プロセッサと、
    前記プロセッサと通信を行い、前記プロセッサによって読取可能なメモリと、
    を備える細胞増殖システムであって、
    前記第１流体流路は、前記中空糸膜の毛細管内側部分と流体的に関連付けられ、
    前記メモリは一連の命令を有し、前記一連の命令が、前記プロセッサによって実行される場合、前記プロセッサは、
    選択を受けて、細胞へのフィーディングを行い、
    選択を受けて、前記毛細管内側部分の出口を閉じて、前記毛細管内側部分の前記細胞から放出された粒子を濃縮し、
    前記粒子を収穫バッグへ移動させる動作を行う、
    細胞増殖システム。
11. 請求項１０記載の細胞増殖システムにおいて、前記プロセッサはさらに、
    ５回の洗い流し洗浄を行うこと、
    陰圧限外濾過を行うこと、
    洗い流し洗浄を行うこと、
    のうち少なくとも１つを行う、
    細胞増殖システム。
12. 請求項１０記載の細胞増殖システムにおいて、前記細胞から放出された前記粒子は、細胞外粒子を含む、
    細胞増殖システム。
13. 請求項１２記載の細胞増殖システムにおいて、前記細胞外粒子は、エクソソームを含む、
    細胞増殖システム。
14. 請求項１２記載の細胞増殖システムにおいて、前記細胞外粒子は、微小小胞を含む、
    細胞増殖システム。
15. 請求項１０記載の細胞増殖システムにおいて、前記プロセッサはさらに、
    選択を受けて、前記中空糸膜の前記毛細管内側部分及び毛細管外側部分の流体を置換する、
    細胞増殖システム。
16. 請求項１５記載の細胞増殖システムにおいて、前記流体を置換する際、前記細胞へのフィーディングのために使用される第１培地からタンパク質が取り出される、
    細胞増殖システム。
17. 請求項１６記載の細胞増殖システムにおいて、前記細胞へのフィーディングのために使用される前記第１培地は、タンパク質を含まない第２培地に置換される、
    細胞増殖システム。
18. 請求項１７記載の細胞増殖システムにおいて、前記プロセッサはさらに、
    前記バイオリアクター内の前記第１培地及び／又は前記第２培地の試験を行って、前記タンパク質が除去されたかどうかを判断する、
    細胞増殖システム。
19. 中空糸膜を有するバイオリアクターと、
    前記バイオリアクターの少なくとも両端部に第１入口と第１出口とを有し、前記中空糸膜の毛細管内側部分と流体的に関連付けられた第１流体流路と、
    第２入口と第２出口とを有し、前記中空糸膜の毛細管外側部分と流体的に関連付けられた第２流体流路と、
    前記第１流体流路に流体的に関連付けられた第１接続ポートと、
    前記第１流体流路に流体的に関連付けられた第２接続ポートと、
    前記第１流体流路と前記第２流体流路とに流体的に関連付けられた第３接続ポートと、
    前記第２流体流路に流体的に関連付けられた第４接続ポートと、
    前記第１流体流路に流体的に関連付けられた収穫バッグと、
    を備えた細胞増殖システムであって、
    前記第１接続ポートに取り付けられた第１バッグによって、前記バイオリアクターに細胞が導入され、
    タンパク質を含む第１培地が入った第２バッグが前記第２接続ポートに接続され、前記第２バッグから、前記第１培地が前記第１流体流路を通って前記バイオリアクターへ供給され、所定数の細胞倍加が起きるまで、前記細胞へのフィーディングが行われ、
    第２培地が入った第３バッグが前記第３接続ポートに接続され、前記第３バッグから、前記第２培地が前記第１流体流路及び前記第２流体流路を通って前記バイオリアクターへ供給され、前記バイオリアクターから前記第１培地を洗い流して洗浄し、
    前記洗浄の後、タンパク質を含まない第３培地が入った第４バッグが前記第４接続ポートに接続され、前記細胞へのフィーディングが行われ、前記第３培地で前記細胞にフィーディングを行う際、前記第１流体流路の前記第１出口は閉じられ、前記バイオリアクターの前記毛細管内側部分において、前記細胞から放出される粒子が濃縮され、
    濃縮された前記粒子は前記収穫バッグへ移送される、
    細胞増殖システム。
20. 細胞増殖システムにおいて細胞粒子を生成する方法であって、
    前記細胞増殖システムは、
    毛細管内側部分と毛細管外側部分とを有する中空糸膜を備えるバイオリアクターと、
    前記バイオリアクターの少なくとも両端部に第１入口と第１出口とを有し、前記中空糸膜の毛細管内側部分と流体的に関連付けられた第１流体流路と、
    第２入口と第２出口とを有し、前記中空糸膜の毛細管外側部分と流体的に関連付けられた第２流体流路と、
    前記第１流体流路に流体的に関連付けられた第１接続ポートと、
    前記第１流体流路に流体的に関連付けられた第２接続ポートと、
    前記第１流体流路と前記第２流体流路とに流体的に関連付けられた第３接続ポートと、
    前記第２流体流路に流体的に関連付けられた第４接続ポートと、
    収穫バッグと、
    を備え、
    前記方法は、
    前記細胞増殖システムにプライミングを行うステップと、
    前記第１接続ポートに第１バッグを接続して、前記バイオリアクターに細胞を導入するステップと、
    前記第２接続ポートに、タンパク質を含む第１培地が入った第２バッグを接続して、前記第１培地を、前記第１流体流路を介して前記バイオリアクターに供給し、所定数の細胞倍加が起きるまで、前記細胞へのフィーディングを行うステップと、
    前記所定数の細胞倍加が起きた後、前記第３接続ポートに、第２培地が入った第３バッグを接続して、前記第２培地を、前記第１流体流路と前記第２流体流路とを介して前記バイオリアクターに供給し、前記バイオリアクターから前記第１培地を洗い流して洗浄するステップと、
    前記洗浄の後、前記第１流体流路の前記第１出口を閉じて、前記バイオリアクターの前記毛細管内側部分において、前記細胞から放出された粒子を濃縮するステップと、
    前記第４接続ポートに、タンパク質を含まない第３培地が入った第４バッグを接続し、前記細胞へのフィーディングを行うステップと、
    収穫のために、前記第１流体流路に前記収穫バッグを接続するステップと、
    濃縮された前記粒子を前記収穫バッグに収穫するステップと、
    を有する、
    方法。

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