CN109153954A

CN109153954A - 自动化生产和收集

Info

Publication number: CN109153954A
Application number: CN201780027623.XA
Authority: CN
Inventors: 波阿·旺; 布莱恩·J·南柯维斯
Original assignee: Terumo BCT Inc
Current assignee: Terumo BCT Inc
Priority date: 2016-05-05
Filing date: 2017-05-05
Publication date: 2019-01-04
Also published as: JP6986031B2; US20190382709A1; JP2019514402A; WO2017193075A1; EP3452575A4; AU2017261348B2; JP2022033830A; AU2017261348A1; JP2023182712A; EP3452575A1; AU2022279399A1

Abstract

本文描述的实施方案提供从细胞释放或分泌的细胞产物的产生、分离和/或收集。细胞可以在具有培养基的细胞扩增系统的生物反应器的毛细管内(或毛细管外)空间中扩增。细胞可以将细胞产物释放到生物反应器的流体空间中。这种释放的细胞产物的实例包括细胞外颗粒(诸如细胞外囊泡(EV))。为了收集从被扩增的细胞释放的细胞外颗粒，排除来自其他来源的任何细胞外颗粒，在收集从扩增细胞释放的细胞外颗粒之前，可以使用冲洗程序来消除任何血清蛋白。可以通过控制出口参数来收集或浓缩释放的细胞产物，而营养物可以通过例如培养基的扩散通过半透膜到达细胞。然后可以收获释放的细胞产物。

Description

自动化生产和收集

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年5月5日提交的美国临时申请系列号No.62/332,426，并且题为“自动化生产和收集”；2016年5月6日提交的美国临时申请系列号No.62/333,013，并且题为“自动化生产和收集”；以及2017年5月3日提交的美国临时申请系列号No.62/500,962，并且题为“自动化生产和收集”的优先权和权益。上述申请的公开内容在此通过引用整体并入本文，如同在本文完整地阐述其所教导的和用于所有目的的所有内容。

背景技术

细胞扩增系统(CES)用于扩增和分化细胞。细胞扩增系统可用于扩增(例如生长)各种贴壁细胞和悬浮细胞。例如，细胞扩增系统可用于扩增间充质干细胞(MSC)和其他类型的细胞(诸如骨髓细胞)。从供体细胞扩增的干细胞可用于修复或替换受损或缺陷的组织，并且对于许多在不同的疾病具有广泛的临床应用。粘附和非粘附型细胞都可以在细胞扩增系统中的生物反应器中生长。

发明内容

本发明的实施方案大体上涉及产生、分离和/或收集从细胞释放或分泌的细胞产物。这种释放或分泌的细胞产物可称为释放物或分泌物(released or secreted agent(s))、释放组分或分泌组分、细胞产物、细胞生成组分、释放颗粒或分泌颗粒、释放分子或分泌分子、细胞外颗粒、释放蛋白质或分泌蛋白质、转移机制等。此类细胞外颗粒的示例包括但不限于细胞外囊泡(EV)、病毒载体等。

细胞外囊泡(EV)可以由细胞产生，并且在细胞培养期间，EV可以释放到培养或扩增其的流体或培养基(由于在扩增期产生的重要副产物的存在，通常称为条件培养基)中。EV包括例如外泌体和微囊泡。EV含有对于细胞通信和其他重要的细胞过程至关重要的RNA、DNA和蛋白质。例如，EV可以例如从体液(诸如血清、血浆、尿液)和细胞培养上清液中分离。

在实施方案中，细胞间通信在细胞生物学中起重要作用。细胞与其他细胞通信的能力使得能够发生诸如蛋白质合成等的复杂机制。例如，细胞可以通过多种方式(诸如直接细胞-细胞接触或分泌分子的转移)彼此通信。EV(诸如微囊泡和外泌体)具有介导细胞内通讯和促进遗传信息转移的能力。微囊泡是来自质膜的直接萌芽(direct buds)，并且通常包含与起源的膜类似的表面标志物。当囊泡内体与质膜融合并萌芽进入细胞外空间时，可形成外泌体。由于微囊泡和外泌体在遗传信息转移中的积极作用，微囊泡和外泌体可用于治疗应用。例如，EV可以充当抗原呈递细胞以刺激免疫应答，以及微囊泡可以转移和激活趋化因子受体，从而引起抗细胞凋亡作用。

在实施方案中，细胞扩增系统可用于扩增细胞。这种扩增可以通过使用生物反应器或细胞生长室发生。在一个实施方案中，这种生物反应器或细胞生长室包含例如中空纤维膜。这种中空纤维膜可包括毛细管外(EC)空间和毛细管内(IC)空间。细胞扩增系统可以扩增多种细胞类型(诸如间充质干细胞、癌细胞、T细胞、成纤维细胞和成肌细胞)。这些细胞类型中的每一种可以将EV释放到生物反应器的流体空间中，然后可以通过出口袋收集。生物反应器的半透性中空纤维允许必需营养物(例如葡萄糖)通过扩散到达细胞和代谢废物(例如乳酸)通过扩散离开系统。除非还需要收获细胞，否则细胞可以保留在中空纤维的毛细管内侧，而EV可以在流体空间中浓缩，然后可以从系统中收获EV而不收获细胞。

本发明的实施方案进一步涉及在从不断扩增的细胞中收集释放的细胞产物(例如EV或病毒载体等)之前使用自动冲洗程序去除用于培养或扩增细胞的血清蛋白。这种冲洗程序允许系统在从被扩增的细胞收集释放的细胞产物开始之前，通过首先从用于扩增的任何血清或其他来源去除任何释放的细胞产物(例如，EV或病毒载体等)来纯化释放的细胞产物。

本发明的实施方案进一步提供通过使用多隔室生物反应器使得能够收集或浓缩释放的细胞产物。例如，通过控制出口参数(诸如通过关闭IC出口阀(保持EC出口打开))，可以增加释放的细胞产物在IC侧的浓度，而营养物(例如葡萄糖)仍然能够通过在EC侧培养基的添加并扩散通过膜而到达IC侧的细胞。这种收集可以例如持续一段时间(诸如约二十四(24)小时至约七十二(72)小时)。在一个实施方案中，这种收集持续大约四十八(48)小时。在使释放的细胞产物的这种浓度增加后，可以将释放的细胞产物收获到收获袋或其他容器中。根据一个实施方案，附着细胞可以在这样的收获过程中保留在生物反应器中，直到可能需要释放和收获这样的细胞(如果有的话)。

本发明的实施方案提供了通过使用与细胞扩增系统一起使用的一个或更多个方案或任务来实现释放的细胞产物的这种生产和/或收集。这些方案或任务可以包括预编程的方案或任务。在其他实施方案中，此类方案或任务可包括客户或用户自定义的方案或任务。通过用户界面(UI)和图形用户界面(GUI)元素，可以创建客户或用户自定义的方案或任务。任务可以包括一个或更多个步骤。在其他实施方案中，可以选择预编程的、默认的或以其他方式先前保存的任务。还在其他实施方案中，这种生产和/或收集可以通过一个或更多个手动方案或任务与细胞扩增系统一起使用来实现。

列出本发明内容是为了以简化的形式提供一些概念，其中，这些概念在下面的具体实施方式中进一步描述。本发明内容不旨在用任何方式限制所要求保护的主题的范围。除了本文提供的那些之外，可以包括特征(包括其等同物和变体)。

附图说明

可以通过参考附图来描述本发明的实施方案。在附图中，相同的数字表示相同的项目。

图1A描绘了细胞扩增系统(CES)的一个实施方案。

图1B示出了生物反应器的一个实施方案的正视图，显示了通过该生物反应器的循环路径。

图1C描绘了根据本发明的实施方案的，用于在细胞扩增系统的操作期间旋转地或横向地移动细胞生长室的摇摆装置。

图2示出了根据本发明的实施方案的具有预安装的流体运输装置的细胞扩增系统的透视图。

图3描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的壳体的透视图。

图4示出了根据本发明的实施方案的预安装的流体运输装置的透视图

图5描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的示意图。

图6示出了根据本发明的另一个实施方案的细胞扩增系统的示意图。

图7描绘了根据本发明的实施方案的，说明用于产生和/或收集释放的组分的过程的运行特征的流程图。

图8示出了描绘根据本发明的实施方案的用于产生和/或收集释放的细胞产物的过程的运行特征的流程图。

图9描绘了说明根据本发明的实施方案的用于生产和/或收集释放物的方法的运行特征的流程图。

图10示出了根据本发明的实施方案，可以实现的细胞扩增系统的示例处理系统。

图11示出了根据本发明的实施方案，从细胞扩增系统中的培养基中提取蛋白质的示例结果。

图12示出了根据本发明的实施方案，使用细胞扩增系统来生成EV的示例结果。

图13A示出了根据本发明的实施方案，使用细胞扩增系统来生成EV的示例结果。

图13B示出了根据本发明的实施方案，使用细胞扩增系统来生成EV的示例结果。

图13C示出了根据本发明的实施方案，使用细胞扩增系统来生成EV的示例结果。

图14示出了根据本发明的实施方案，使用细胞扩增系统来生成EV的示例结果。

具体实施方式

以下具体实施方式提供了具有参考附图的示例性实施方案的讨论。本文中包括的具体实施方案不应被解释为限制(limiting)或缩限(restricting)本发明。进一步地，虽然在描述本文的实施方案中，对特征、动作和/或结构可使用特定的语言，但是权利要求不限于所描述的特征、动作和/或结构。本领域技术人员将理解，包括改进的其他实施方案在本发明的精神和范围内。进一步地，可以使用任何替代或添加，包括作为单独实施方案，或者与本文描述的任何其他实施方案结合而列出。

本发明的实施方案通常涉及用于在细胞扩增系统中产生、分离和/或收集释放的细胞产物(例如细胞外囊泡(EV)、病毒载体等)的系统和方法。本发明的实施方案进一步提供例如通过使用多隔室生物反应器能够收集或浓缩释放的细胞产物。

在实施方案中，中空纤维膜的渗透性允许通过将细胞保留在毛细管内(IC)回路中而将细胞与其他组分分离，例如，可溶性分子可以自由地进入毛细管外(EC)回路，例如，从而消除了额外的隔离步骤。使用添加到生物反应器的EC侧的培养基(例如，葡萄糖、乳酸、氨基酸、维生素)可以满足培养中细胞的新陈代谢需求。这种培养基可以扩散通过生物反应器的半透膜。分子量太大而不能扩散通过膜的培养基组分可以使用超滤(例如连续或间歇推注添加)添加到生物反应器的IC侧。在一个实施方案中，可以使用超滤(IC出口阀关闭)以保留太大而不能扩散通过在生物反应器IC侧上的膜的任何组分。由细胞产生的EV可能不能扩散通过膜，即其分子量可能太大。因此，当EV浓度可以不断增加的情况下，EV可以在扩增(或限定的收集期)期间保持在生物反应器的IC侧。然后可以例如以规定的间隔或在整个过程结束时将EV从生物反应器的IC侧收集到收获容器或收获袋中。在没有中空纤维膜的两个流体隔室的益处的情况下，根据实施方案，EV浓度或收集可以限于细胞产生EV的速率以及可以将新鲜培养基添加到培养环境中以满足营养需求的速率。

例如，通过控制出口参数(诸如通过关闭IC出口阀(保持EC出口打开))，因此可以增加在IC侧的释放的细胞产物的浓度，而营养物(例如葡萄糖)仍然能够通过在EC侧添加培养基并扩散通过膜而到达IC侧的细胞。在其他实施方案中，营养物可通过在IC侧添加培养基来供养IC侧的细胞。在进一步的实施方案中，细胞扩增可以在EC侧发生，以及在IC侧(或EC侧)添加培养基并扩散通过膜以到达细胞。EV的收集可以持续一段时间(诸如大约二十四(24)小时或更长时间)。在其他实施方案中，这种收集可以持续少于约二十四(24)小时。在其他实施方案中，这种收集可以持续例如约四十八(48)小时至约七十二(72)小时。在使释放的细胞产物的这种浓度增加后，可以将释放的细胞产物收获到收获袋或其他容器中。根据一个实施方案，附着细胞可以在这样的收获过程中保留在生物反应器中，直到需要释放和收获这样的细胞(如果有的话)。

如上所述，实施方案涉及细胞扩增系统。在实施方案中，这种细胞扩增系统是封闭的，其中封闭细胞扩增系统包含不直接暴露于大气的内容物。这种细胞扩增系统可以是自动化的。在实施方案中，贴壁和非非贴壁或悬浮类型的细胞可以在细胞扩增系统中的生物反应器中生长。根据实施方案，细胞扩增系统可包括基础培养基或其他类型的培养基。提供了用于在封闭细胞扩增系统的生物反应器中发生的细胞生长的补充培养基的方法。在实施方案中，与这种系统一起使用的生物反应器可以是中空纤维生物反应器。根据本发明的实施方案，可以使用许多类型的生物反应器。

在实施方案中，该系统可包括生物反应器，该生物反应器进一步包括具有至少相对端的第一流体流动路径，第一流体流动路径的第一相对端与中空纤维膜的第一端口流体相连，以及第一流体流动路径的第二端与中空纤维膜的第二端口流体相连，其中第一流体流动路径包括中空纤维膜的毛细管内部分。在实施方案中，中空纤维膜包含多个中空纤维。该系统可进一步包括与第一流体流动路径流体相连的流体入口路径，其中多个细胞通过第一流体入口路径引入第一流体流动路径。还可以包括用于在生物反应器的第一流体流动路径中循环流体的第一泵。在实施方案中，该系统包括用于控制第一泵的运行的控制器。在一个实施方案中，控制器例如是包括处理器的计算机系统。在实施方案中，控制器被配置为控制泵以在第一流体流动路径内以第一速率循环流体。在一些实施方案中，包括用于将毛细管内入口流体从毛细管内培养基袋转移到第一流体流动路径的第二泵和用于控制第二泵的操作的第二控制器。在实施方案中，第二控制器控制第二泵，例如将细胞从细胞入口袋转移到第一流体流动路径。根据实施方案，可以使用额外的控制器，例如第三控制器、第四控制器、第五控制器、第六控制器等。进一步地，根据本发明的实施方案，可以使用额外的泵，例如第三泵、第四泵、第五泵、第六泵等。另外，虽然本发明可以涉及培养基袋、细胞入口袋等，多个袋(例如第一培养基袋、第二培养基袋、第三培养基袋、第一细胞入口袋、第二培养基、第三细胞入口袋等)和/或其他类型的容器可以在实施方案中使用。在其他实施方案中，可以使用单个培养基袋、单个细胞入口袋等。进一步地，在实施方案中可以包括额外的的或其他流体路径(例如第二流体流动路径，第二流体入口路径等)。

在其他实施方案中，系统例如由下项述控制：耦合到细胞扩增系统的处理器；显示装置，与处理器通信，并可操作以显示数据；和存储器(memory)，与处理器通信并可由处理器读取，并包含一系列指令。在实施方案中，当指令由处理器执行时，处理器接收例如涂覆生物反应器的指令。响应涂覆生物反应器的指令，处理器可以执行一系列步骤以涂覆生物反应器，并且可以接下来接收将细胞装载到生物反应器中的指令。响应装载细胞的指令，处理器可以执行一系列步骤以将细胞从例如细胞入口袋装载到生物反应器中。

根据本发明的实施方案，图1A中描绘了示例性细胞扩增系统(CES)的示意图。“CES”和“系统”可以互换使用。CES 10包括第一流体循环路径12和第二流体循环路径14。根据实施方案，第一流体流动路径16具有至少相对的端部18和20，它们与中空纤维细胞生长室24(在本文中也称为“生物反应器”)流体相连。具体地，相对端部18可以与细胞生长室24的第一入口22流体相连，并且相对端部20可以与细胞生长室24的第一出口28流体相连。第一循环路径12中的流体流过设置在细胞生长室24中的中空纤维膜117(参见图1B)的中空纤维116(参见图1B)(细胞生长室和中空纤维膜在下文中更详细地描述)的内部。进一步地，第一流体流动控制装置30可以可操作地连接第一流体流动路径16并且可以控制第一循环路径12中的流体流动。

第二流体循环路径14包括第二流体流动路径34、细胞生长室24和第二流体流动控制装置32。根据实施方案，第二流体流动路径34具有至少相对的端部36和38。第二流体流动路径34的相对端部36和38可以分别与细胞生长室24的入口端口40和出口端口42流体相连。流过细胞生长室24的流体可以与在细胞生长室24中的中空纤维膜117的外部接触(参见图1B)，其中，中空纤维膜包含多个中空纤维。第二流体循环路径14可以可操作地连接第二流体流动控制装置32。

因此，第一和第二流体循环路径12和14可以通过中空纤维膜117在细胞生长室24中分离(参见图1B)。第一流体循环路径12中的流体流过细胞生长室24中的中空纤维的毛细管内(“IC”)空间。第一循环路径12可以被称为“IC回路”。第二循环路径14中的流体流过细胞生长室24中的毛细管外(“EC”)空间，第二流体循环路径14可以称为“EC环路”。根据实施方案，第一流体循环路径12中的流体可以相对于第二流体循环路径14中的流体以并流或对流的方式流动。

流体入口路径44可以与第一流体循环路径12流体相连。流体入口路径44允许流体进入第一流体循环路径12，而流体出口路径46允许流体离开CES 10。第三流体流动控制装置48可以可操作地连接流体入口路径44。或者，第三流体流动控制装置48可替代地连接第一出口路径46。

根据实施方案，如本文所使用的流体流动控制装置可包括泵、阀、夹具或其组合。多个泵、阀和夹具可以任意组合布置。在各种实施方案中，流体流动控制装置是或包括蠕动泵。在实施方案中，流体循环路径、入口端口和出口端口可由任何材料的管道构成。

本文使用的各种组件“可操作地连接”。如本文所用，“可操作地连接”是指以可操作的方式连接在一起的组件，并且包括其中组件直接连接的实施方案，以及其中附加组件放置在两个链接组件之间的实施方案。“可操作地连接”组分可以是“流体相连”。“流体相连”是指连接在一起的组分，使得流体可以在器之间运输。“流体相连”包括其中附加部件设置在两个流体相连部件之间，以及直接连接的部件的实施方案。流体相连部件可包括不接触流体但接触其他部件以操纵系统的部件(例如，通过压缩管的外部将流体泵送通过柔性管的蠕动泵)。

通常，任何种类的流体(包括例如缓冲液、含蛋白质的流体和含有细胞的流体)可以流过各种循环路径、入口路径和出口路径。如本文所用，“流体”，“培养基”和“流体培养基”可互换使用。

转到图1B，以正面正视图示出了可以与本发明使用的中空纤维细胞生长室100的实例。细胞生长室100具有纵向轴线LA-LA并且包括细胞生长室壳体104。在至少一个实施方案中，细胞生长室壳体104包括四个开口或端口：IC入口端口108、IC出口端口120、EC入口端口128和EC出口端口132。

根据本发明的实施方案，第一循环路径中的流体通过在细胞生长室100的第一纵向端部112的IC入口端口108进入细胞生长室100，进入并穿过包括中空纤维膜117的多个中空纤维116的毛细管内侧(参见在各种实施方案中，作为中空纤维膜的毛细管内(“IC”)侧或“IC空间”)，并且通过位于细胞生长室100的第二纵向端部124的IC出口端口120离开细胞生长室100。IC入口端口108和IC出口端口120之间的流体路径限定了细胞生长室100的IC部分126。第二循环路径中的流体通过EC入口端口128流入细胞生长室100中，与中空纤维116的毛细管外侧或外部(称为膜的“EC侧”或“EC空间”)接触，并通过EC出口端口132离开细胞生长室100。EC入口端口128和EC出口端口132之间的流体路径包括细胞生长室100的EC部分136。经由EC入口端口128进入细胞生长室100的流体可以与中空纤维116的外部接触。小分子(例如，离子、水、氧、乳酸等)可以通过中空纤维116从中空纤维的内部或IC空间扩散到外部或EC空间，或者从EC空间到IC空间。大分子量分子(诸如生长因子)通常太大而不能通过中空纤维膜，并且可能保留在中空纤维116的IC空间中。在实施方案中，可根据需要更换培养基。培养基也可以通过氧合器或气体转移模块循环以根据需要交换气体。根据实施方案，细胞可以包含在如下所述的第一循环路径和/或第二循环路径内，并且可以在膜的IC侧和/或EC侧上。

用于制造中空纤维膜117的材料可以是任何生物相容的聚合物材料，其能够制成中空纤维。根据本发明的实施方案，可以使用的一种材料是合成的基于聚砜的材料。根据实施方案，为了使细胞粘附在中空纤维的表面上，可以某种方式改变表面，可以通过用蛋白质(诸如纤连蛋白(FN)或胶原蛋白)至少涂覆细胞生长表面，或通过暴露表面在辐射下。γ射线处理的膜表面的允许贴壁细胞的附着，而无需另外用纤连蛋白、冷凝蛋白等涂覆膜。由γ射线处理的膜制成的生物反应器可以重复使用。可以根据本发明的实施方案使用用于细胞附着的其他涂层和/或处理。

在实施方案中，CES(诸如CES 500(参见图5)和/或CES 600(例如参见图6))可包括配置成通过将细胞生长室连接到旋转和/或侧向摇摆装置，相对于细胞扩增系统的其他部件上移动或“摇动”细胞生长室的装置。图1C示出了一种这样的装置，其中根据一个实施方案，生物反应器100可以旋转地连接到两个旋转摇摆部件和一个侧向摇摆部件。

第一旋转摇摆部件138使生物反应器100围绕生物反应器100的中心轴线142旋转。旋转摇摆部件138可以与生物反应器100旋转地相连。在实施方案中，生物反应器100可以围绕中心轴线142以顺时针或逆时针方向在单个方向上连续旋转。或者，根据实施方案，生物反应器100可以例如围绕中心轴线142以交替方式旋转，例如，首先顺时针旋转，然后逆时针旋转。

CES还可以包括第二旋转摇摆部件，其使生物反应器100围绕旋转轴线144旋转。旋转轴线144可以穿过生物反应器100的中心点并且可以垂直于中心轴线142。在实施方案中，生物反应器100可以围绕旋转轴线144以顺时针或逆时针方向在单个方向上连续旋转。或者，生物反应器100可以例如围绕中心轴线144旋转以交替方式旋转，首先顺时针旋转，然后逆时针旋转。在各种实施方案中，生物反应器100还可以围绕旋转轴线144旋转并且相对于重力在水平或垂直方向放置。

在实施方案中，侧向摇摆部件140可以与生物反应器100侧向相连。在实施方案中，侧向摇摆部件140的平面在-x和-y方向上横向移动。根据实施方案，可以通过中空纤维内的含细胞的培养基的移动来减少生物反应器中细胞的沉降。

摇摆装置的旋转和/或侧向移动可以减少装置内细胞的沉降并降低在生物反应器的一部分内捕获细胞的可能性。根据斯托克定律(Stoke’s Law)，细胞在细胞生长室中沉降的速率与细胞和悬浮培养基之间的密度差成正比。在某些实施方案中，如上所述重复180度旋转(快速)并暂停(例如具有30秒的总组合时间)使得非粘附性红细胞悬浮。在一个实施方案中，优选旋转最少约180度；然而，可以使用多达360度或更多的旋转。不同的摇摆组件可以单独使用，或者可以以任何组合联合。例如，围绕中心轴线142旋转生物反应器100的摇摆部件可以与围绕轴线144旋转生物反应器100的摇摆部件组合。同样，在任何组合中可以独立地执行围绕不同轴线的顺时针和逆时针旋转。

转到图2，根据本发明的实施方案示出了具有预安装的流体运输组件的细胞扩增系统200的实施方案。CES 200包括细胞扩增机202，细胞扩增机202包括用于与细胞扩增机202的后部206接合的舱口或可关闭的门204。细胞扩增机202内的内部空间208包括适于接收和接合预安装的流体运输组件210的特征。预安装的流体运输组件210可拆卸地连接到细胞扩增机202，以便于在细胞扩增机202处促进在同一细胞扩增机202上使用过的预安装的流体运输组件210相对快速地更换新的或未使用的预安装的流体运输组件210。可以操作单细胞扩增机202以使用第一预安装的流体运输组件210而生长或扩增第一组细胞，并且此后可以是用于使用第二预安装流体运输组件210生长或扩增第二组细胞，而不需要在第一预安装的流体运输组件210和第二预安装的流体运输组件210更换之间进行消毒。预安装的流体运输组件210包括生物反应器100和氧合器或气体传输模块212(也参见图4)。根据实施方案，管道引导槽示为214，用于接收管接到预安装的流体运输组件210的各种培养基。

接下来，图3示出了根据本发明的实施方案的在可拆卸地附着预安装的流体运输组件210(图2)之前的细胞扩增机202的后部206。图3中省略了可关闭门204(图2中所示)。细胞扩增机202的后部206包括许多不同的结构，用于与预安装的流体运输组件210的元件组合工作。更具体地，细胞扩增机202的后部206包括多个用于与预安装的流体运输组件210上的泵回路配合的蠕动泵，包括IC循环泵218、EC循环泵220、IC入口泵222和EC入口泵224。此外，细胞扩增机202的后部206包括多个阀，包括IC循环阀226、试剂阀228、IC培养基阀230、空气去除阀232、细胞入口阀234、洗涤阀236、分配阀238、EC培养基阀240、IC废液阀242、EC废液阀244和收集阀246。多个传感器也与细胞扩增机202的后部206相连，包括IC出口压力传感器248、IC入口压力和温度组合传感器250、EC入口组合压力和温度传感器252，以及EC出口压力传感器254。根据一个实施方案，还示出了用于空气去除室(ARC)的光学传感器256。

根据实施方案，示出了用于旋转生物反应器100的轴或摇杆控制器258。与轴或摇杆控制器258相连的轴配件260允许轴穿过孔的合适的对准，参见例如管道组织器的424(图4)、参见例如预安装运输组件210的300(图4)或与细胞扩增机202的后部206一起的400。轴或摇杆控制器258的旋转赋予轴配件260和生物反应器100旋转运动。因此，当CES 200的操作者或用户附加新的或未使用的预先安装的流体运输组件400(图4)到细胞扩增机202，对准是相对简单的事，其合适地定向预先安装的流体运输组件210或400的轴穿过孔424(图4)与配有轴配件260。

转到图4，示出了可拆卸地连接的预安装的流体运输组件400的透视图。预安装的流体运输组件400可以可拆卸地连接到细胞扩增机202(图2和3)，以便于在细胞扩增机202处相对快速地将在同一细胞扩增机202处使用过预先安装的流体运输组件400更换为新的或未使用的预安装的流体运输组件400。如图4所示，生物反应器100可以连接到包括轴配件402的生物反应器连轴器。轴配件402包括一个或多个轴紧固机构，诸如用于接合细胞扩增机202的轴(例如258(在图3示出))的偏置臂或弹簧构件404。

根据实施方案，预安装的流体运输组件400包括管道408A、408B、408C、408D、408E等，以及各种管道配件，以提供如下所述如图5和6所示的流体路径。还可以为泵提供泵回路406A和406B。在实施方案中，尽管可以在细胞扩增机202所在的位置处提供各种培养基，但是根据实施方案，预安装的流体运输组件400可以包括足够的管长度以延伸到细胞扩增机202的外部并且能够焊接到与培养基袋或容器相连的管道。

接下来，图5示出了细胞扩增系统500的实施方案的示意图，而图6示出了细胞扩增系统600的另一个实施方案的示意图。如图5和6中的实施方案所示，并且如下所述，细胞在IC空间中生长。然而，本发明不限于这些实施例，并且在其他实施方案中可以提供细胞在EC空间中生长。

根据实施方案，图5示出了CES 500，其包括第一流体循环路径502(也称为“毛细管内环路”或“IC环路”)和第二流体循环路径504(也称为“毛细管外环路”或“EC环路”)。第一流体流动路径506可以与细胞生长室501流体相连以形成第一流体循环路径502。流体通过IC入口端口501A流入细胞生长室501，通过细胞生长室501中的中空纤维，并通过IC出口端口501B离开。压力计510测量离开细胞生长室501的培养基的压力。培养基流过可用于控制培养基流速的IC循环泵512。IC循环泵512可以沿第一方向或与第一方向相反的第二方向泵送流体。出口501B可以用作反向的入口。进入IC回路的培养基可以通过阀514进入。如本领域技术人员将理解的，可以在各个位置放置额外的阀、压力计、压力/温度传感器、端口和/或其他装置以隔离和/或测量沿着流体路径的部分的培养基特征。因此，应该理解，所示的示意图表示CES 500的各种元件的一种可能的配置，并且所示的示意图的修改在一个或更多个现有实施方案的范围内。

关于IC回路502，可以在操作期间从样品端口516或样品线圈518获得培养基样品。设置在第一流体循环路径502中的压力/温度计520允许在操作期间检测培养基压力和温度。然后培养基返回到IC入口端口501A以完成流体循环路径502。在细胞生长室501中生长/扩增的细胞可以通过阀门598从细胞生长室501冲洗到收获袋599中，或者在中空纤维内重新分布以进一步生长。

第二流体循环路径504中的流体经由EC入口端口501C进入细胞生长室501，并经由EC出口端口501D离开细胞生长室501。EC回路504中的培养基可以与细胞生长室501中的中空纤维的外部接触，从而允许小分子扩散进出中空纤维。

根据一个实施方案，设置在第二流体循环路径504中的压力/温度计524允许在培养基进入细胞生长室501的EC空间之前测量培养基的压力和温度。压力计526允许在培养基离开细胞生长室501之后测量第二流体循环路径504中的培养基的压力。关于EC回路，可以在操作期间从样品端口530或样品线圈获得培养基样品。

在实施方案中，在离开细胞生长室501的EC出口端口501D之后，第二流体循环路径504中的流体通过EC循环泵528到达氧合器或气体传输模块532。EC循环泵528也可以相反的方向泵送流体。第二流体流动路径522可通过氧合器入口端口534和氧合器出口端口536与氧合器或气体传输模块532流体相连。在操作中，流体培养基经由氧合器入口端口534流入氧合器或气体传输模块532，并且通过氧合器出口端口536离开氧合器或气体传输模块。例如，氧合器或气体传输模块532向CES 500中的培养基添加氧气并从中除去气泡。在各种实施方案中，第二流体循环路径504中的培养基可以与进入氧合器或气体传输模块532的气体处于平衡。氧合器或气体传输模块532可以是任何适当尺寸的氧合器或气体传输装置。空气或气体经过过滤器538流入氧合器或气体传输模块532，并通过过滤器540流出氧合器或气体传输装置532。过滤器538和540减少或防止氧合器或气体传输模块532和相关培养基的污染。在灌注事件(priming sequence)部分期间从CES 500净化的空气或气体可通过氧合器或气体传输模块532排放到大气中。

在针对CES 500描绘的配置中，第一流体循环路径502和第二流体循环路径504中的流体培养基以相同方向(并流配置)流过细胞生长室501。CES 500还可以配置成以对流的结构流动。

根据至少一个实施方案，可以经由第一流体流动路径506将包括细胞的培养基(来自袋562)和来自袋546的流体培养基引入第一流体循环路径502。流体容器562(例如，用于将空气引出系统的细胞入口袋或盐水灌注液)可以经由阀564与第一流体流动路径506和第一流体循环路径502流体相连。

流体容器或培养基袋544(例如，试剂)和546(例如，IC培养基)可分别经由阀548和550与第一流体入口路径542，或经由阀570和576与第二流体入口路径574流体相连。还提供了第一和第二无菌可密封输入灌注路径508和509。空气移除室(ARC)556可以与第一循环路径502流体相连。空气移除室556可以包括一个或更多个超声波传感器，该超声传感器包括上部传感器和下部传感器以检测空气、流体缺乏，和/或空气/流体界面(例如，在空气去除室556内的某些测量位置处的气体/流体界面)。例如，可以在空气去除室556的底部附近和/或顶部附近使用超声波传感器来检测这些位置处的空气、流体和/或空气/流体界面。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，实施方案提供了许多其他类型的传感器的使用。例如，可以根据本发明的实施方案使用光学传感器。在灌注事件或其他方案的部分期间从CES500净化的空气或气体可经由管线558排放到空气阀560外的大气，管线558可与空气移除室556流体相连。

可以将EC培养基(例如，来自袋568)或洗涤溶液(例如，来自袋566)添加到第一或第二流体流动路径中。流体容器566可以与阀570流体相连，阀570可以经由分配阀572和第一流体入口路径542与第一流体循环路径502流体相连。或者，通过打开阀570和关闭分配阀572，流体容器566可以经由第二流体入口路径574和EC入口路径584与第二流体循环路径504流体相连。同样地，流体容器568可以与阀576流体相连，阀576可以经由第一流体入口路径542和分配阀572与第一流体循环路径502流体相连。或者，通过打开阀门576和关闭分配阀572，流体容器568可以与第二流体入口路径574流体相连。

可以提供可选的热交换器552用于培养基试剂或洗涤溶液引入。

在IC回路中，流体可以最初由IC入口泵554推进。在EC回路中，流体可以最初由EC入口泵578推进。诸如超声波传感器的空气检测器580也可以与EC入口路径584相连。

在至少一个实施方案中，第一和第二流体循环路径502和504连接到废物管线588。当阀门590打开时，IC培养基可以流过废物管线588并流到废物袋或出口袋586。同样，当阀582打开时，EC培养基可以通过废物管线588流到废物袋或出口袋586。

在实施方案中，可以通过细胞收获路径596收获细胞。此处，可以通过将含有细胞的IC培养基通过细胞收获路径596和阀598泵送至细胞收获袋599来收获来自细胞生长室501的细胞。

CES 500的各种部件可以包含或容纳在机器或壳体内(诸如细胞扩增机202(图2和3))，其中该机器例如在预定温度下维持细胞和培养基。

转到图6，显示了细胞扩增系统600的另一个实施方案的示意图。CES 600包括第一流体循环路径602(也称为“毛细管内环路”或“IC环路”)和第二流体循环路径604(也称为“毛细管外环路”或“EC环路”)。第一流体流动路径606可以与细胞生长室601流体相连以形成第一流体循环路径602。流体通过IC入口端口601A流入细胞生长室601，通过细胞生长室601中的中空纤维，并通过IC出口端口601B离开。压力传感器610测量离开细胞生长室601的培养基的压力。除了压力之外，在实施方案中，传感器610也可以是在操作期间检测培养基压力和温度的温度传感器。培养基流过可用于控制培养基流速的IC循环泵612。IC循环泵612可以沿第一方向或与第一方向相反的第二方向泵送流体。出口601B可以用作反向的入口。进入IC回路的培养基可以通过阀门614进入。如本领域技术人员将理解的，可以在各个位置放置额外的阀门、压力计、压力/温度传感器、端口和/或其他装置以隔离和/或测量沿着流体路径的各部分的培养基特征。因此，应该理解，所示的示意图表示CES 600的各种元件的一种可能的配置，并且所示的示意图的修改在一个或更多个本实施方案的范围内。

关于IC回路，可以在操作期间从样品线圈618获得培养基样品。然后培养基返回到IC入口端口601A以完成流体循环路径602。在细胞生长室601中生长/扩增的细胞可以通过阀门698和管线697从细胞生长室601冲洗到收获袋699中。或者，当阀门698关闭后，可以在室601内重新分配细胞以进一步生长。

第二流体循环路径604中的流体经由EC入口端口601C进入细胞生长室601，并经由EC出口端口601D离开细胞生长室601。根据一个实施方案，EC回路中的培养基可以与细胞生长室601中的中空纤维的外部接触，从而允许小分子扩散进入和离开可在室601内的中空纤维。

设置在第二流体循环路径604中的压力/温度传感器624允许在培养基进入细胞生长室601的EC空间之前测量培养基的压力和温度。传感器626允许在第二流体循环路径604中的培养基在离开细胞生长室601之后测量其压力和/或温度。关于EC回路，可以在操作期间从样品端口630或样品线圈获得培养基样品。

在离开细胞生长室601的EC出口端口601D之后，第二流体循环路径604中的流体通过EC循环泵628到达氧合器或气体传输模块632。根据实施方案，EC循环泵628也可以沿相反方向泵送流体。第二流体流动路径622可以经由氧合器或气体传输模块632的入口端口632A和出口端口632B与氧合器或气体传输模块632流体相连。在操作中，流体培养基经由入口端口632A流入氧合器或气体传输模块632，并经由出口端口632B离开氧合器或气体传输模块632。例如，氧合器或气体传输模块632将氧气添加到CES 600中的培养基中并从中去除气泡。在各种实施方案中，第二流体循环路径604中的培养基可以与进入氧合器或气体传输模块632的气体相平衡。氧合器或气体传输模块632可以是用于氧合或气体传输的任何适当尺寸的装置。空气或气体经过过滤器638流入氧合器或气体传输模块632，并通过过滤器640流出氧合器或气体传输装置632。过滤器638和640减少或防止氧合器或气体传输模块632和相关培养基的污染。在灌注事件的部分期间从CES 600净化的空气或气体可通过氧合器或气体转移模块632排放到大气中。

在针对CES 600描绘的配置中，第一流体循环路径602和第二流体循环路径604中的流体培养基以相同方向(并流配置)流过细胞生长室601。根据实施方案，CES 600还可以配置成以对流的结构流动。

根据至少一个实施方案，包括细胞的培养基(来源于诸如细胞容器，例如袋)可以附着在附接点662，并且来自培养基源的流体培养基可以附着在附接点646。可以经由第一流体流动路径606将细胞和培养基引入第一流体循环路径602。附接点662可以经由阀664与第一流体流动路径606流体相连，并且附接点646可以经由阀650与第一流体流动路径606流体相连。试剂源可以流体地连接到点644并且通过阀648与流体入口路径642，或通过阀648和672与第二流体入口路径674流体相连。

空气移除室(ARC)656可以与第一循环路径602流体相连。空气移除室656可以包括一个或更多个超声波传感器，超声传感器包括上部传感器和下部传感器以检测空气、流体缺乏，和/或空气/流体界面(例如，在空气去除室656内的某些测量位置处的气体/流体界面)。例如，可以在空气去除室656的底部附近和/或顶部附近使用超声波传感器来检测这些位置处的空气、流体和/或空气/流体界面。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，实施方案提供了许多其他类型的传感器的使用。例如，可以根据本发明的实施方案使用光学传感器。在灌注事件或其他方案的部分期间从CES 600净化的空气或气体可经由管线658排放到空气阀660外的大气，管线658可与空气移除室656流体相连。

EC培养基源可以附接到EC培养基附接点668，并且洗涤溶液源可以附接到洗涤溶液附接点666，以将EC培养基和/或洗涤溶液添加到第一或第二流体流动路径。附接点666可以与阀670流体相连，阀670可以经由阀672和第一流体入口路径642与第一流体循环路径602流体相连。或者，通过打开阀670和关闭阀672，附接点666可以经由第二流体入口路径674和第二流体流动路径684与第二流体循环路径604流体相连。同样地，连接点668可以与阀676流体相连，阀676可以经由第一流体入口路径642和阀672与第一流体循环路径602流体相连。或者，通过打开阀676和关闭分配阀672，流体容器668可与第二流体入口路径674流体相连。

在IC回路中，流体可以最初由IC入口泵654推进。在EC回路中，流体可以最初由EC入口泵678推进。诸如超声波传感器的空气检测器580也可以与EC入口路径684相关联。

在至少一个实施方案中，第一和第二流体循环路径602和604连接到废物管线688。当阀门690打开时，IC培养基可以流过废物管线688并流到废物袋或出口袋686。同样，当阀692打开时，EC培养基可以流到废物袋或出口袋686。

当细胞在细胞生长室601中生长之后，可以通过细胞收获路径697收获细胞。此处，可以通过将含有细胞的IC培养基通过细胞收获路径697，在阀698打开的情况下，泵送至细胞收获袋699来收获来自细胞生长室601的细胞。

CES 600的各种部件可以包含或容纳在机器或壳体内(诸如细胞扩增机202(图2和3))，其中例如在预定温度下维持细胞和培养基的机器。进一步应注意，在实施方案中，可以组合CES 600和CES 500(图5)的组件。在其他实施方案中，CES可以包括比图5和6中所示的组件更少或额外的组件，并仍然在本发明的范围内。可以结合本发明的特征的细胞扩增系统的实例是细胞扩增系统，其由科罗拉多州莱克伍德的Terumo BCT公司制造。

在美国专利No.8,309,347(“细胞扩增系统及其使用方法”，2012年11月13日发布)中提供了细胞扩增系统的实例和进一步描述，其以引用的方式整体并入本文作为其教导和用于所有目的。

虽然已经描述了细胞扩增系统的各种示例实施方案和与其相关的方法，根据本发明的实施方案，图7示出了用于产生、纯化和/或收集释放的组分(例如，EV或病毒载体等)的过程的示例性操作步骤700，其可以与细胞扩增系统(诸如CES 500(图5)或者CES 600(图6))一起使用。启动开始操作702，并且过程700进行到生物反应器中的接种细胞704。在一个实施方案中，在第0天接种细胞。在一个实施方案中，接种MSC。如本领域技术人员所理解的，可以使用释放所需细胞产物(例如EV或病毒载体等)的任何细胞类型。

接下来，根据一个实施方案，可以用培养基扩增706细胞直至汇合。在另一个实施方案中，细胞可以扩增直至发生所需细胞倍增的次数，例如，一次细胞倍增、两次细胞倍增、三次细胞倍增、四次细胞倍增、五次细胞倍增、六次或更多次细胞倍增等。在另一个实施方案中，细胞可以扩增特定的一段时间。例如，细胞可以扩增约二十四(24)小时至约四十八(48)小时的时间。在另一个实施方案中，细胞可以扩增约四十八(48)小时至约七十二(72)小时的时间。在另一个实施方案中，细胞可以扩增约二十四(24)小时至约七十二(72)小时的时间。在实施方案中，这种扩增例如在第1天到第3天发生。根据另一个实施方案，细胞可以扩增小于约二十四(24)小时的时间。在另一个实施方案中，细胞可以扩增大于七十二(72)小时的时间。例如，在一个实施方案中，细胞可以在收集外泌体之前扩增约七(7)至约八(8)天。可以根据本发明的实施方案使用任何的一段时间。

例如，可以用完全培养基扩增细胞706。在一个实施方案中，所述培养基包含含血清的培养基(诸如α-MEM)和血清。在一个实施方案中，可以使用动物来源的血清。在另一个实施方案中，可以使用人源血清。在另一个实施方案中，可以使用合成血清。在又一个实施方案中，可以使用另一种类型的血清。含血清培养基的实例包括α-MEM+GlutaMAX+10％胎牛血清(FBS)。在进一步的实施方案中，可以使用无血清培养基。可以使用本领域技术人员已知的任何类型的培养基。

回到图7，过程700接下来进行到例如可选步骤708，用于冲洗出第一培养基(诸如任何含血清的培养基)。在一个实施方案中，含有血清的培养基用第二培养基(例如基础培养基)替代。基础培养基的示例包括α-MEM+GlutaMAX。可以使用本领域技术人员已知的任何类型的培养基。为了从扩增的细胞中分离或纯化的释放成分(与血清或其他蛋白质来源中存在的任何成分对照)，根据实施方案，冲洗程序除去任何血清(例如血清蛋白)。在一个实施方案中，冲洗程序在第3天发生。在一个实施方案中，当例如，不使用动物来源的血清，仅使用人源血清，使用无血清培养基，和/或例如，没有其他这样的额外蛋白质来源被除去的情况下，步骤708可以是可选的。

接下来，过程700继续在回路(例如IC回路)中收集释放的组分或释放物710(例如EV或病毒载体等)。在一个实施方案中，通过关闭IC出口(例如关闭IC出口阀)将释放的组分或物质(例如EV或病毒载体等)在IC回路中浓缩，从而进行这种收集。这种浓缩可以发生一段规定的时间。在一个实施方案中，这样的时间段可包括将释放的组分在IC回路中浓缩大约四十八(48)小时。在另一个实施方案中，这样的时间段可包括将释放的组分浓缩大约二十四(24)小时至大约四十八(48)小时。在另一个实施方案中，这样的时间段可包括将释放的组分浓缩大约二十四(24)小时至大约七十二(72)小时。在另一个实施方案中，这样的时间段可包括将释放的组分浓缩大约四十八(48)小时至大约七十二(72)小时。在一个实施方案中，这样的时间段可包括将释放的组分浓缩大于约七十二(72)小时。在一个实施方案中，例如，这种收集发生在第3天到第5天。还在另一个实施方案中，这样的时间段可包括将释放的组分浓缩少于约二十四(24)小时。可以根据本发明的实施方案使用任何时间段。在这样的收集期间，细胞可以补充不含蛋白质的培养基，其中这种培养基可以从EC侧加入并扩散通过半透膜。在另一个实施方案中，例如，可以从IC侧添加培养基，其中细胞可以补充不含蛋白质的培养基。

在IC(或EC)回路中收集释放的组分之后，过程700继续收获释放的组分712。在一个实施方案中，这种收获例如在第5天发生。在一个实施方案中，释放的组分(例如EV或病毒载体等)可以悬浮的形式从生物反应器中的毛细管内循环回路转移到收获袋或收获容器中。在一个实施方案中，不含蛋白质的培养基可用于此类收获计划。

接下来，过程700可选地进行到进一步的处理步骤714，其中例如可以处理收获的释放的组分以用于测定。在另一个实施方案中，这种进一步的处理714可以包括来自收获袋中收集的培养基的释放物的进一步浓缩。在另一个实施方案中，例如在使用悬浮细胞的情况下，这样的进一步处理714可以包括将释放物与袋中的其他组分(诸如细胞)分离，从而收获释放物。在一个实施方案中，这种进一步处理714可以包括释放的组分的进一步分离和/或表征。从可选的进一步处理步骤714，过程700可以在结束操作716处终止。或者，过程700可以从收获步骤712直接进行到结束操作716，并且在不需要可选的进一步处理步骤714的情况下终止。

接下来，将结合示例设置和培养基介绍来描述图8。然而，这里给出的实施方案不限于该实施例，而是可以修改实施方案以满足其他要求或系统设计或配置。启动开始操作802，并且过程800继续将一次性管道组804装载到细胞扩增系统上。

接下来，系统可以被灌注806。在一个实施方案中，例如，用户或操作员可以通过选择例如用于灌注的任务来向系统提供用于灌注的指令。在一个实施方案中，这种用于灌注的任务可以是预编程的任务。系统500(图5)或600(图6)可以例如用磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌注。为了灌注生物反应器501、601，可以将袋(546)附接(例如，连接到连接点646)到系统500、600。当参考附图中的数字时，例如，诸如“数字，数字”(例如，500、600)，这样的术语可以表示“数字和/或数字”(例如，500和/或600)。阀550、650可以打开。然后可以通过IC入口泵554、654开始将PBS泵送到第一流体循环路径502、602中，而将PBS泵送到第一流体循环路径502、602中。当PBS进入通过入口501A、601A生物反应器601并从出口501B、601B流出时，可以打开阀614。根据一个实施方案，一旦生物反应器501、601和/或第一流体循环路径502、602在其中具有通过空气移除室556、656移除空气的培养基，生物反应器501、601就被灌注。

为了进一步灌注生物反应器501、601，可以将袋586附接(例如，连接到连接点668)到系统500、600。可以打开阀576、676。然后可以通过IC入口泵554、654开始将PBS泵送到第一流体循环路径502、602中，而将PBS泵送到第一流体循环路径504、604中。当PBS通过入口501C、601C进入生物反应器601并从EC回路的出口501D、601D流出时，阀692可以关闭。根据一个实施方案，一旦生物反应器501、601和/或第二流体循环路径504、604在其中具有通过空气移除室580、680移除空气的培养基，生物反应器501、601就被灌注。

然后，过程800进行至涂覆生物反应器808，其中生物反应器501、601可以涂覆有涂层剂(例如5mg纤连蛋白(FN))。例如，在实施方案中，可以将试剂袋544装载(例如，在连接点644上)到IC环502、602中，直到试剂容器544为空。可以从空气移除室556、656将试剂544引到(chased)IC回路502、602中，然后可以通过操作循环泵512、612和/或入口泵554、654使试剂544在IC回路502、602中循环。可以使用本领域技术人员已知的任何涂覆试剂(诸如FN或冷凝蛋白)。

引入生物反应器的系统500、600以涂覆生物反应器的溶液的实例可以如下所示：

表1

生物反应器的涂覆可以在三个阶段中进行。用于引入上述溶液的第一阶段的系统500、600的设置的实例可以如下所示：

表2

用于涂覆从空气移除室556、656中捕获试剂的生物反应器的第二阶段的系统500、600的设置的实例可以如下所示：

表3

用于涂覆在IC回路502、602中循环试剂的生物反应器的第三阶段的系统500、600的设置的实例，可以如下所示：

表4

一旦涂覆了生物反应器，就可以在步骤810中执行IC/EC冲洗任务，其中可以替换IC循环回路502、602上和EC循环回路504、604上的流体。替换容积可以通过交换的IC容积和EC容积的数量来确定。IC/EC冲洗任务期间引入CES 500、600的溶液实例如下所示：

表5

系统500、600的IC/EC冲洗任务的设置的实例可以如下所示：

表6

接下来，为了维持穿过生物反应器膜中纤维上的适当或所需的气体浓度，可以执行条件培养基任务812以允许培养基在将细胞装载到生物反应器中之前与所提供的气体供应达到平衡。例如，通过使用高EC循环速率提供培养基与由气体传输模块或氧合器532、632提供的气体供应之间的快速接触。然后，系统500、600可以保持在适当或所需的状态，直到例如用户或操作者准备将细胞装载到生物反应器501、601中。在一个实施方案中，CES 500、600可以例如用完全培养基调节。完全培养基可以是用于细胞生长的任何培养基来源。在一个实施方案中，完全培养基可包含例如α-MEM和胎牛血清(FBS)。可以使用本领域技术人员已知的任何类型的培养基。

条件培养基任务812可以是两步骤的过程，在第一步骤中，系统500、600通过使用高EC循环速率提供培养基和气体供应之间的快速接触。在第二步骤中，系统500，600将生物反应器501、601维持在适当的状态，直到操作者准备好装载细胞。在条件培养基任务812期间引入CES 500、600的溶液的实例可以如下所示：

表7

条件培养基任务812的第一步骤的设置的实例可以如下所示：

表8

条件培养基任务812的第二步骤的设置的示例可以如下所示：

表9

接下来，过程800进行到例如将细胞814从细胞入口袋562(在连接点662处)装载到生物反应器501、601中。装载细胞可以是三步过程。首先，例如细胞可以从细胞入口袋562以均匀的悬浮液814装载到生物反应器501、601中(在连接点662处)，直到袋562为空。在另一个实施方案中，可以通过例如另一种类型的装载程序(诸如通过靶心装载程序)来装载细胞814。根据实施方案可以使用任何类型的装载程序。其次，然后可以将细胞从空气移除室556、656捕获到生物反应器501、601。在利用更大的捕获体积的配置中，细胞可以扩散并朝向IC出口590、690移动。在第三步骤中，例如，通过没有IC入口的IC循环(诸如通过IC循环泵514、614)，可以促进细胞的分布穿过膜。

引入CES 500、600以装载细胞814的的溶液的实例可以如下所示：

表10

如上所述，装载细胞814可以在三个阶段中发生。用于第一阶段的系统500、600的设置的实例可以如下所示：

表11

用于第二阶段的系统500、600的设置的实例可以如下所示：

表12

用于第三阶段的系统500、600的设置的实例可以如下所示：

表13

进一步，例如，可以允许细胞(例如，贴壁细胞)附着816到中空纤维。在一个实施方案中，在允许细胞附着816时，贴壁细胞能够附着到生物反应器膜上，同时允许在EC循环回路504、604上流动，泵514、614到IC回路502、602的流量设定为零。在细胞附着至膜816的过程中引入CES 500、600的溶液的实例可以如下所示：

表14

用于附着到系统500、600中的膜816的设置的实例可以如下所示：

表15

可以在步骤818中供养细胞，其中可以以流速(例如，低流速)连续地添加到IC循环回路502、602和/或EC循环回路504、604。出口设置允许添加到系统500、600的流体移除。在供养步骤818期间引入系统500、600的溶液的示例可以如下所示：

表16

系统500、600中的供养步骤818的设置的实例可以如下所示：

表17

接下来，过程800可以进行到可选的步骤820以冲洗出任何含血清的培养基并用基础培养基或不含蛋白质的培养基替换。如果先前的处理使用不含蛋白质的培养基来装载细胞、供养细胞等，则可能不需要步骤820。然而，如果使用含血清的蛋白质，则例如可以在细胞达到汇合后、在达到规定的时间段，或在达到一定所需的细胞倍增的次数之后，在预期分离和/或收集释放的细胞产物(例如，EV或病毒载体等)之后启动清洗程序820。

例如，可能需要在最少两次细胞倍增、三次细胞倍增、四次细胞倍增、五次细胞倍增，六次或更多次细胞倍增后等，启动释放的细胞产物的纯化和/或收集。可以使用一个或更多个过程来纯化系统500、600中的培养基以收集释放的EV产品。此类纯化程序可包括5XIC EC冲洗820、负超滤冲洗822、IC EC冲洗824和/或另一种类型的冲洗程序。首先，5X ICEC冲洗820可以包括更换IC循环回路502、602和EC循环回路504、604两者上的流体，其中可以通过IC容积和EC容量交换的数量来指定替换容积。

在5x IC/EC冲洗任务820期间引入系统500、600的溶液的实例可以如下所示：

表18

系统500、600的5x IC/EC冲洗任务820的设置的实例可以如下所示：

表19

进一步，可选的负超滤冲洗822可以包括使用负超滤洗涤IC循环回路502、602以帮助提升可能已经沉积在纤维的IC侧的任何组分。在负超滤822期间引入CES 500、600的溶液的实例可以如下所示：

表20

系统500，600的负超滤822的设置的实例可以如下所示：

表21

进一步，可选的IC EC冲洗824可用于替换IC循环回路502、602和EC循环回路504、604上的流体，其中替换容积可由IC容积和EC容积交换的数量来指定替换容积。在这种冲洗程序中，所用的培养基可以是，例如基质培养基或不含蛋白质的培养基。在可选的IC EC冲洗824期间引入系统500、600的溶液的实例可以如下所示：

表22

系统500、600的IC EC冲洗824的设置的实例可以如下所示：

表23

上述这些任务可以是客户或用户定制的任务。在其他配置中，这样的任务可以是预编程的或默认任务。在其他实施方案中，这样的任务可以由，例如用户或操作员手动执行。

在实施方案中，例如，在冲洗程序期间的不同点处(例如，在5x冲洗之前、在5x冲洗820之后、在负超滤冲洗822之后、在基础培养基交换824之后)的其他配置中，系统500，600中的总蛋白质可以在IC侧(或EC侧)测量，用于证明血清或血清蛋白的去除(例如，完全去除)。进一步地，例如，在不使用动物来源的血清，仅使用人源血清，使用无血清培养基，和/或例如，没有其它此类额外的蛋白质来源被除去的情况下，步骤820、822，和/或824可以是可选的。

根据一个实施方案，上述方法的功效可以由图11中的图表1100表示。图1100表示实施上述程序的系统(诸如系统500、600)中蛋白质测量的可能结果。如图所示，系统500、600中的蛋白质的量可以由线1104表示。在上述程序820、822、824之前，系统500、600中的蛋白质的量可以处于峰值1108(例如，超过7000μg/mL)。在5x冲洗820期间，蛋白质的量可以稳定下降，如线1104的部分1112所示。实际上，在5x冲洗820结束时，蛋白质浓度可以基本上为0μg/mL，如线1104的部分1116所示。在这种情况下，可能不需要例如，负超滤冲洗822或基础培养基交换824。然而，根据一个实施方案，程序822和824可以进一步有效地提取系统500、600中的蛋白质。

在从生物反应器中洗去任何含血清的培养基后，可以通过添加的培养基至生物反应器502、602的EC侧504、604并扩散通过半透膜，将生物反应器中的细胞与不含蛋白质的培养基一起供养826规定的一段时间(例如约四十八(48)小时)。EC入口668可以供应EC培养基(例如不含蛋白质的培养基)用于向细胞提供营养，同时允许释放的细胞产物浓缩。在这种配置中，可能没有IC入口。代替地，生物反应器502、602的半透性中空纤维允许基本营养物(例如，葡萄糖)通过连续灌注到达细胞，并且可以主动去除代谢废物(例如乳酸)并且可以通过扩散离开系统500、600(EC出口开口582、692)。这种供养可以发生一段规定的时间(例如大约四十八(48)小时)。在另一种情况下，使用不含蛋白质的培养基约二十四(24)小时至约七十二(72)小时以补充细胞。在另一个实施方案中，用不含蛋白质的培养基(例如第二培养基)进行这种供养，持续约四十八(48)小时至约七十二(72)小时以补充细胞。在另一个实施方案中，用第二培养基(例如不含蛋白质的培养基)进行这种供养可持续约二十四(24)小时至约四十八(48)小时。在另一个实施方案中，用第二培养基进行这种供养大约二十四(24)小时至大约四十八(48)小时。还在另一个实施方案中，用不含蛋白质的培养基进行这种供养的时间少于约二十四(24)小时。根据实施方案，可以使用第二培养基供养任何时间段。在另一种配置中，IC入口可以提供IC培养基(例如不含蛋白质的培养基)，用于向细胞提供营养。根据本发明的实施例，这种供养可以发生任何时间段。细胞的这种供养826可以包括通过闭合IC出口阀590、690来关闭IC入口。在细胞的供养826期间引入系统500、600的溶液的示例可以如下所示：

表24

具有系统500、600的细胞826的供养的设置的示例可以如下所示：

表25

在另一个实施方案中，例如，关闭IC出口允许收集释放的细胞产物发生在步骤828中。IC出口的这种关闭(通过关闭阀590、598或690、698)允许细胞释放的细胞产物在生物反应器中收集或浓缩828。通过保持EC出口打开(阀582、692)超滤允许通过EC侧504、604主动去除废物。进一步地，半透膜允许必需营养物通过连续灌注到达细胞。如表24和25中所述，例如，根据一个实施方案，可以通过可选地在IC侧添加培养基(例如，没有蛋白质)来供养细胞826。在一个实施方案中，培养基袋546可以连接到连接点646。来自袋546的培养基(例如，不含蛋白质)可以通过阀550、650被送入IC入口管线506、606。培养基可以从入口管线506、606进入IC回路502、602以供养生物反应器501、601的IC部分中的细胞。

附加地或替代地，步骤826和/或828还可包括出口或废物袋586、686的可选替换物827、829。在一个实施方案中，出口或废物袋586，686的这种替换，允许监测或测试要进行监测葡萄糖/乳酸量的袋的内容物，以确定任何释放的细胞产物是否穿过膜(因为IC出口关闭)等。如上所述，由细胞产生的细胞产物(例如EV或病毒载体)等可能太大而不能扩散通过膜(例如，其分子量太大)。在IC出口关闭的情况下，释放的细胞产物(例如EV)可以在释放的细胞产物(例如EV)的浓度不断增加的情况下的扩增(或限定的收集期)期间保持在生物反应器501、601的IC侧。细胞的供养826可以与IC出口的关闭同时发生。在另一个实施方案中，收集步骤828在例如关闭IC出口之后发生。还在另一个实施方案中，步骤826在例如收集步骤828关闭IC出口之前发生。在其他实施方案中，在IC出口关闭之后不需要测试/监视的情况下，不更换出口袋586、686。在又一个实施方案中，出口或废物容器或袋可用于收集和收获释放物。尽管在过程800中IC出口被认为关闭，但应注意，例如，其他实施方案中，在EC侧可发生细胞生长的情况下，EC出口可以是关闭的。

根据一个实施方案，当确定开始在回路(例如IC回路502、602)中收集浓缩或收集的细胞产物828时(诸如在大约四十八(48)小时之后，或例如，另一段时间)，用于收获的阀598、698是打开的830，并且可以从生物反应器501、601的IC侧502、602收获细胞产物830到收获容器599、699。在一个实施方案中，IC出口586、686的IC阀590、690打开以允许收获。在另一个实施方案中，打开收获阀598、698以允许收获收获袋599、699或收获容器。在一个实施方案中，这种收获发生在整个过程的最后。在另一个实施方案中，这种收获以限定的间隔发生。在一个实施方案中，细胞产物(例如EV或病毒载体等)可以悬浮方式从生物反应器501、601中的毛细管内循环回路502、602转移到收获袋599、699或收获容器中。在一个实施方案中，不含蛋白质的培养基可用于此类收获任务。在收集浓缩或收集的细胞产物828期间引入系统500、600的溶液的实例可以如下所示：

表26

具有系统500、600的浓缩和收集细胞产物的收集的设置的实例可以如下所示：

表27

在收获释放物830之后，在不需要进一步处理832或收获细胞836的情况下，过程800可以直接从收获细胞产物830进行以终止于结束操作838。

或者，从收获物830，过程800可选地进行以允许进一步处理832。在一个实施方案中，此类进一步处理832可包括用于测定的处理。在另一个实施方案中，此类进一步处理832可以包括来自收获袋中收集的培养基或流体的细胞产物的进一步浓缩。在另一个实施方案中，在可以扩增悬浮细胞并收获释放产物的情况下，此类进一步处理832可以包括将细胞产物与袋中的其他组分(诸如细胞)分离。在一个实施方案中，此类进一步处理832可以包括释放的细胞产物的进一步分离和/或表征。从可选的进一步处理步骤832，在不需要收获保留在生物反应器中的细胞(例如任何贴壁细胞)的情况下，过程800可以在结束操作838处终止。

另一方面，如果需要收获保留在生物反应器中的细胞(例如，任何贴壁细胞或附着的细胞)，则过程800进行释放细胞834。或者，在不需要进一步处理832并且需要从生物反应器释放细胞834的情况下，过程800可以直接进行从收获细胞产物830释放细胞834。例如，附着的细胞可以从生物反应器的膜释放834并悬浮在IC回路中。在实施方案中，准备添加试剂以释放细胞而进行IC/EC冲洗任务作为操作834的一部分。例如，在准备添加胰蛋白酶或其他化学释放剂以释放任何贴壁细胞时，IC/EC培养基可以用磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替以去除蛋白质、钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)。可以将试剂装载到系统中直到试剂袋为空。可以将试剂捕获到IC回路中，并且可以在IC回路内混合试剂。在释放任何贴壁细胞后，收获操作836将悬浮细胞从IC循环回路(例如，包括留在生物反应器中的任何细胞)转移到收获袋或容器中。最后，过程800然后在结束操作838处终止。

接下来，图9示出了根据本发明的实施方式的，用于产生、分离和/或收集释放物(例如EV或病毒载体等)的过程的示例性操作步骤900，其可以与细胞扩增系统一起使用(诸如CES 500(图5)或者CES 600(图6))。启动开始操作902，并且过程900进行将一次性管道组904装载到细胞扩增系统上。接下来，系统可以灌注906。在一个实施方案中，例如，用户或操作者可以通过选择用于灌注的任务来向系统提供用于灌注的指令。在一个实施方案中，这种用于灌注的任务可以是预编程的任务。然后，过程900进行涂覆生物反应器908，其中生物反应器可以涂覆有涂层剂。例如，在实施方案中，可以将试剂装载到IC回路中直到试剂容器为空。可以将试剂从空气去除室捕获到IC环路中，然后可以在IC环路中循环试剂。可以使用本领域技术人员已知的例如任何涂覆试剂(诸如纤连蛋白或冷凝蛋白)。一旦生物反应器被涂覆，就可以执行IC/EC冲洗任务910，其中可以替换IC循环回路上和EC循环回路上的流体。根据一个实施方案，替换体积可以由交换的IC体积和EC体积的数量确定。

接下来，为了维持穿过生物反应器膜中纤维上的适当或所需的气体浓度，可以执行条件培养基任务912以允许培养基在将细胞装载到生物反应器中之前与所提供的气体供应达到平衡。例如，通过使用高EC循环速率提供培养基与由气体传输模块或充氧器提供的气体供应之间的快速接触。然后可以将系统维持在适当或所需的状态，直到例如用户或操作者准备将细胞装载到生物反应器中。在一个实施方案中，例如，系统可以用例如完全培养基来调节。完全培养基可以是用于细胞生长的任何培养基来源。在一个实施方案中，完全培养基可包含例如α-MEM和胎牛血清(FBS)。可以使用本领域技术人员已知的任何类型的培养基。

接下来，过程900继续将细胞从例如细胞入口袋装载到生物反应器中914。在一个实施方案中，细胞可以从细胞入口袋装载到生物反应器中直到袋为空。然后可以将细胞从空气去除室捕获到生物反应器。在利用较大的捕获体积的实施方案中，细胞可以伸展并朝向IC出口移动。通过例如没有IC入口的IC循环(诸如通过IC循环泵)促进细胞分布穿过膜。进一步地，可以允许细胞(例如贴壁细胞)附着916到中空纤维并供养918。在一个实施方案中，在允许细胞附着916的情况下，贴壁细胞能够附着到生物反应器膜上同时允许流动在EC循环回路上到IC回路的泵流量设置为零。细胞可以生长/扩增920。在一个实施方案中，细胞可以扩增三(3)到四(4)天。在另一个实施方案中，细胞可以扩增一段时间以实现特定的所需次数的细胞倍增。在另一个实施方案中，细胞可以扩增一段时间以达到汇合。在一个实施方案中，细胞可以在收集EV(例如外泌体)之前扩增约七(7)至约八(8)天。可以根据本发明的实施方案使用任何时间段。

接下来，过程900进行到查询922，其中确定是否需要在细胞生长/扩增期间收集由细胞释放到条件培养基中的细胞产物(例如EV或病毒载体等)。例如，可能希望在特定或限定次数(诸如两次倍增，三次倍增，四次倍增，五次倍增，六次或更多次细胞倍增)的细胞倍增后开始分离或纯化释放物用于收集。例如，在一个实施方案中，可能希望在最少两次细胞倍增后开始分离和/或收集释放物。在另一个实施方案中，例如，可能需要在最少五次细胞倍增后开始纯化和/或收集释放物。在一个实施方案中，在开始分离和/或收集释放物之前，可以不设定限定次数的细胞倍增。如本领域技术人员所理解的，可以使用任何次数的细胞倍增、限定的时间段和/或其他指示物。

返回到查询922，如果需要分离和/或收集释放物，则过程900将“是”分支到可选的冲洗和替换步骤924。在一个实施方案中，可以发生冲洗出含血清的培养基，其中这种培养基可以用基础培养基替换，例如，924。在一个实施方案中，这种冲洗程序可以包括以下步骤中的一个或更多个：(1)5X IC EC冲洗；(2)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行负超滤冲洗，以尽可能多地从生物反应器中除去血清(如果有的话)；和/或(3)用基础培养基冲洗2.5X IC EC以补充PBS冲洗期间丢失的任何代谢物。在一个实施方案中，执行所有上面列出的(1)-(3)步骤。在另一个实施方案中，仅执行上面列出的(1)-(3)步骤之一。在另一个实施方案中，进行上面列出的(1)-(3)步骤中的两个步骤。此外，根据实施方案可以使用任何步骤顺序。在更进一步的实施方案中，当例如，不使用动物来源的血清、仅使用人源血清、使用无血清培养基，和/或例如，没有其他这样的额外蛋白质源被除去的情况下，在步骤924没有发生冲洗，并且这样的步骤924可以是可选的。

在从生物反应器中冲洗出任何含血清的培养基924之后，可以通过关闭IC出口阀来关闭IC出口926，以允许细胞释放物浓度在生物反应器中增加。作为这样的步骤926的一部分，可以可选地更换出口或废物袋928。这样的出口或废物袋的更换允许要执行袋子的内容物监测或测试，以监测葡萄糖/乳酸量，确定任何释放物是否穿过膜(因为IC出口关闭)等。如上所述，由细胞产生的释放物(例如EV或病毒载体)等可能太大而不能扩散通过膜(例如，其分子量太大)。根据实施方案，在IC出口关闭的情况下，释放物(例如EV)可以在释放物(例如EV或病毒载体等)的浓度持续增加的情况下的扩增(或限定的收集期)期间保持在生物反应器的IC侧。在一个实施方案中，步骤928与IC出口的关闭同时发生。在另一个实施方案中，步骤928在关闭IC出口之后发生。还在另一个实施方案中，步骤928发生在关闭IC出口之前。在其他实施方案中，在IC出口关闭之后，在不需要测试/监视或其他特定使用出口袋的情况下，可以不更换出口袋。虽然在过程900中IC出口为关闭，但应注意，例如，在其他实施方案中，在EC侧可发生细胞生长的情况下，EC出口是关闭。

接下来，过程900进行以供养细胞930并收集释放物932，其中可以将不含蛋白质的培养基添加到生物反应器的EC侧并且可以扩散通过半透膜到IC侧。在这种实施方案中，EC入口可以包含EC培养基(例如不含蛋白质的培养基)用于向细胞提供营养，同时允许释放的细胞产物浓缩。在这种实施方案中，例如，可能没有IC入口。代替地，生物反应器的半透性中空纤维允许必须营养物(例如，葡萄糖)通过连续灌注到达细胞，并且可以主动去除代谢废物(例如乳酸)并且可以通过扩散离开系统(EC出口开启)。在一个实施方案中，可以通过在IC侧上添加培养基供养细胞。在一个实施方案中，使用基础培养基约四十八(48)小时以补充细胞。在另一个实施方案中，使用基础培养基约二十四(24)小时至约七十二(72)小时以补充细胞。在实施方案中，IC环路(IC出口关闭926)中释放物(例如EV或病毒载体等)的收集或浓缩可以发生限定的时间段，例如，大约四十八(48)小时，或者在其他实施方案中，例如大约二十四(24)小时至大约七十二(72)小时。在其他实施方案中，这种用基础培养基供养和收集释放颗粒可以进行大于约七十二(72)小时(诸如例如，大约七十二(72)小时至大约九十六(96)小时)。在另一个实施方案中，用第二培养基进料和收集释放颗粒可以进行约七十二(72)小时至约一百二十(120)小时。在其他实施方案中，这种进料和收集可以进行少于二十四(24)小时的时间段。

根据一个实施方案，当确定开始收获收集的或浓缩的释放物时(例如在大约四十八(48)小时之后，或者例如在另一个时间段之后)，用于收获的阀934可以打开，并且可以将释放物936从生物反应器的IC侧收获到收获容器中。在一个实施方案中，可以打开用于IC出口的IC阀以允许收获。在另一个实施方案中，可以打开收获阀以允许收获到收获袋或收获容器。在一个实施方案中，这种收获可以在整个过程结束时发生。在另一个实施方案中，这种收获可以以限定的间隔发生。在一个实施方案中，释放物(例如EV或病毒载体等)可以悬浮的形式从生物反应器中的毛细管内循环回路转移到收获袋或收获容器中。在一个实施方案中，不含蛋白质的培养基可用于此类收获任务。

在收获释放物936之后，过程900可以可选地进行以允许进一步处理944。在一个实施方案中，这种进一步的处理944可以包括用于测定的处理。在另一个实施方案中，这种进一步的处理944可以包括从收获袋中收集的培养基中的释放物的进一步浓缩。在另一个实施方案中，在悬浮细胞生长和收获释放物的情况下，此类进一步处理944可以包括将释放物与袋中的其他组分(诸如细胞)分离。在一个实施方案中，此类进一步处理944可包括释放物的进一步分离和/或表征。从可选的进一步处理步骤944，在不需要收获保留在生物反应器中的细胞(例如任何贴壁细胞)的情况下，过程900可以在结束操作946处终止。在另一个实施方案中，在不需要进一步处理944或收获细胞940的情况下，过程900可以直接从收获物936进行以在结束操作946处终止。

返回到步骤944，如果需要收获例如，保留在生物反应器中的细胞(例如，任何粘附或附着的细胞)，则过程900进行到可选的释放细胞步骤938。或者，在不需要进一步处理944，并且需要从生物反应器释放细胞938的情况下，过程900可以直接从收获物936进行到可选释放细胞步骤938。例如，附着细胞可以从生物反应器的膜释放938并悬浮在IC回路中。在实施方案中，准备添加试剂以释放细胞而进行IC/EC冲洗任务作为操作938的一部分。例如，在准备添加胰蛋白酶或其他化学释放剂以释放任何贴壁细胞时，IC/EC培养基可以用磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替以去除蛋白质、钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)。可以将试剂装载到系统中直到试剂袋为空。可以将试剂捕获到IC回路中，并且可以在IC回路内混合试剂。在释放任何贴壁细胞后，收获操作940将悬浮细胞从IC循环回路(例如，包括留在生物反应器中的任何细胞)转移到收获袋或容器中。最后，一次性设置可以可选地从细胞扩增系统卸载作为过程900的一部分的942，然后过程900在结束操作946处终止。

关于图7、8和9中所示的过程，根据本发明的实施方式，所描绘的操作步骤是出于说明的目的而提供的，并且可以被重新排列、组合成其他步骤、与其他步骤并行使用等。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在实施方案中使用更少或额外的步骤。此外，在一些实施方案中，诸如通过执行存储在存储器中的预编程任务的处理器，可以自动执行步骤(和任何子步骤)(诸如灌注，涂覆生物反应器，装载细胞)，其中，提供这样的步骤仅用于说明目的。

在美国专利申请系列号No.13/269,323(“在中空纤维生物反应器系统中生长和收获细胞的可配置方法和系统”，2011年10月7日提交)和美国专利申请系列号No.13/269,351(“在中空纤维生物反应器系统中生长和收获细胞的可定制方法和系统”，2011年10月7日提交)中提供了用于细胞扩增系统的任务和方案的实例和进一步描述，包括定制任务和预编程任务，这些申请在此通过引用整体并入本文，用于其所教导的和用于所有目的。

接下来，图10示出了可以在其上实现本发明的实施方案的计算机系统1000的示例组件。例如，在细胞扩增系统使用处理器来执行任务(如作为诸如上述过程700、800和900的过程的一部分执行的定制任务或预编程任务)的情况下，计算机系统1000可以用在实施方案中。在实施方案中，预编程的任务可以包括，例如，遵循“IC/EC冲洗”和/或“供养细胞”。

如本领域技术人员所理解的，计算机系统1000可以包括用户界面1002、处理系统1004和/或贮存器(storage)1006。用户界面1002可以包括输出设备1008，和/或输入设备1010。输出设备1008可以包括一个或更多个触摸屏，其中触摸屏可以包括用于提供一个或更多个应用窗口的显示区域。触摸屏还可以是输入设备1010，其可以例如从用户或操作者接收和/或捕获物理触摸事件。触摸屏可以包括具有电容结构的液晶显示器(LCD)，该电容结构允许处理系统1004推断出触摸事件的位置，如本领域技术人员所理解的。然后，处理系统1004可以将触摸事件的位置映射到在应用窗口的预定位置中呈现的UI元素。根据实施方案，触摸屏还可以通过一个或更多个其他电子结构接收触摸事件。其他输出设备1008可以包括打印机、扬声器等。如本领域技术人员所理解的，其他输入设备1010可以包括键盘、其他触摸输入设备、鼠标、语音输入设备等。

根据本发明的实施方案，处理系统1004可以包括处理单元1012和/或存储器1014。处理单元1012可以是可操作以执行存储在存储器1014中的指令的通用处理器。根据实施方案，处理单元1012可以包括单个处理器或多个处理器。此外，在实施方案中，每个处理器可以是具有一个或更多个核心的多核处理器，以读取和执行单独的指令。如本领域技术人员所理解的，处理器可以包括通用处理器、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、其他集成电路等。

根据实施方案，存储器1014可以包括用于数据和/或处理器可执行指令的任何短期或长期存储。如本领域技术人员所理解的，存储器1014可以包括例如随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)或电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)。如本领域技术人员所理解的，其他贮存介质可以包括例如CD-ROM、磁带、数字通用盘(DVD)或其他光学贮存器、磁带、磁盘贮存器、磁带(magnetic tape)、其他磁贮存设备等。

贮存器1006可以是任何长期数据贮存设备或组件。根据实施方案，贮存器1006可以包括结合存储器1014描述的一个或更多个系统。贮存器1006可以是永久的或可移动的。在实施方案中，贮存器1006存储由处理系统1004生成或提供的数据。

实施例

以下描述可以实现实施方案的方面的一些方法/过程/方案/配置的实施例。尽管可以在这些示例中描述特定特征，但是提供其仅用于说明和描述目的。本发明不限于以下提供的实施例。

实施例1

通过实施上述系统和方法扩增细胞和收集细胞外颗粒(例如EV)的实例结果显示在图1200的图表1200中。图表1200示出了使用例如根据实施方案的上述方法700、800和/或900以及CES 500、600运行的一系列1204 EV产物。例如，这种系统生产/收集可以使用由科罗拉多州莱克伍德的Terumo BCT公司制造的细胞扩增系统(系统或)。如图所示，可以使用上述过程和系统产生和收集各种浓度的EV。生产运行可以产生各种浓度的EV，从超过2.5E+07 EV/mL的高值1208到5.00E+06 EV/mL和1.00E+07EV/mL之间的低值1212。

实施例2

根据实施方案，利用上述方法700、800和/或900和/或利用系统500、600产生和/或收集细胞外颗粒(例如EV)的实例结果显示在图13A、13B和/或13C的图表1300、1304和/或1308中。可由系统500、600产生的EV 1312a和/或1312c的每个浓度可接近或大于在225cm²组织培养瓶(T225)中产生的EV 1316a和/或1316c的浓度，其中这种瓶子可以以与系统500、600基本相似的细胞密度接种，并且进行类似地处理(例如，使用相似的细胞密度和供养)以进行比较。如图13B所示，在225cm²组织培养瓶(T225)中产生的EV 1316b的浓度可以大于由系统500、600产生的EV 1312b的浓度，其中这种瓶子可以以与系统500、600基本相似的接种密度接种并且进行类似地处理以进行比较。

作为示例，图13A示出了相对于在以基本相似的接种密度接种并进行类似处理以进行比较的T型瓶(“Q1468T-瓶”)1316a中生产和/或收集的那些EV，在Quantum细胞扩增系统的编号为“Q1468”1312a的运行中生成和/或收集EV的可能结果。例如，用于Q1468的系统(表面积为21,000cm²)的生物反应器可装载1.25E+08培养的细胞，而Q1468T型瓶(表面积225cm²)可装载9.24E+05培养的细胞，其可能等同于装载具有基本相似的细胞密度的Quantum系统和T型瓶。虽然在图13A中的示例结果显示1312a(系统)和1316a(T型瓶)的浓度在6.00E+07EV/mL和7.00E+07EV/mL之间，图表1300显示与从T型瓶(Q1468T型瓶)收集的EV 1316a的浓度相比，从系统收集的EV1312a浓度更高。

例如，图13A和13C中示例结果可以显示相对于在常规T型瓶中使用相似的细胞载量(例如，相似的细胞密度)和供养量而获得的浓度，通过系统生产/收集(例如，使用由科罗拉多州莱克伍德的Terumo BCT公司制造的细胞扩增系统)获得的EV浓度更高。使用CES 500、600可能由于几种功能的可能的自动化而劳动强度较小，并且由于更大的表面积来生长细胞，因此在一些实施方案中可以提供更多数量的EV。

实施例3

根据实施方案，用例如上述方法700、800和/或900和/或用系统500、600产生和/或收集抗原特异性细胞外颗粒(例如EV)的实例结果示于图14中。如图14所示，可以从获自常规T型瓶和诸如由科罗拉多州莱克伍德的Terumo BCT公司制造的细胞扩增系统的系统500、600的纯化的外泌体的代表性样品中获得实例结果。如图1400所示，抗原特异性外泌体的类型可包括CD9、CD63和/或CD81。从系统500、600产生和收集的许多CD9外泌体可以在柱1404中显示；从系统500、600产生和收集的许多CD63外泌体可以在柱1408中显示；从系统500，600产生和收集的许多CD81外泌体可在列1412中显示。进一步地，细胞可以以与系统500、600(例如，系统)基本相似的细胞密度接种在225cm²组织培养瓶(T225)中，并进行类似处理以进行比较。如图表1400所示，从组织培养瓶(T225)产生和收集的许多CD9外泌体可在列1416中显示；从组织培养瓶(T225)产生和收集的许多CD63外泌体可在柱1420中显示；从组织培养瓶(T225)产生和收集的许多CD81外泌体可在柱1424中显示。如图14所示，系统500、600针对每种抗原产生并收集的外泌体的数量可以高于组织培养瓶(T225)针对每种抗原产生并收集的外泌体的数量。例如，根据一个实施方案，图14显示可观察到来自CES收获物的每种抗原特异性外泌体的量比T225收获物的量高2-3倍。

实施例4

如关于图8所解释的，可以用PBS灌注系统(例如CES 500和/或600)，并用5mg FN涂覆过夜。第二天，系统可以经历2.5X IC EC冲洗并且可以用完全培养基(具有GlutaMAX加10％FBS的αMEM)调节。可以将预先选择的MSC接种到生物反应器中并扩增4-5天。此时，系统可以用PBS进行5X IC EC冲洗和负超滤冲洗，以从生物反应器中除去尽可能多的血清。然后可以进行用基础培养基的2.5X IC EC冲洗(仅具有GlutaMAX的αMEM)以补充在PBS冲洗期间丢失的代谢物。基础培养基可用于补充细胞四十八(48)小时，同时可将条件培养基收集到收获袋中。也可以以与生物反应器基本相似的接种密度接种瓶并且与系统类似地进行处理以用于比较目的。

例如，由于990万细胞装载生物反应器501、601，扩增六(6)天，系统中的血清被冲洗出，外泌体在IC回路中收集两(2)天，可以观察到来自作为实施例4的一部分使用上述方法700、800和/或900和/或系统500、600，以产生4.71x10¹¹总外泌体的可能结果。在收集外泌体后，可以从IC回路收获外泌体，其中可以观察到从生物反应器501、601中回收了1.35亿个MSC。

本发明的实施方案可以具有一个或更多个方面，包括例如：

本发明的实施方案和/或方面可包括收集细胞产物的方法，该方法包括：将细胞装载到生物反应器中；用培养基供养细胞；扩增细胞，其中细胞释放细胞产物；浓缩释放的细胞产物；并从生物反应器中收集浓缩的细胞产物。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，经释放的细胞产物包括细胞外颗粒。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，细胞外颗粒包括细胞外囊泡。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，细胞外囊泡包括外泌体。

一个或多个上述实施方式和/或方面中的任一个，其中，细胞外囊泡包括微囊泡。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，细胞外颗粒包括病毒载体。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，将经收获的细胞产物收集到袋中。

一个或多个上述实施方式和/或方面中的任一个，进一步包括：替换培养基。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，培养基包含血清。

本发明的实施方案和/或方面可包括细胞扩增系统，其包含：生物反应器，其中所述生物反应器包含中空纤维膜；第一流体流动路径，具有至少相对的端部，其中第一流体流动路径与中空纤维膜的毛细管内部分流体相连；处理器；存储器，与处理器通信并且可由处理器读取，并且包含一系列指令，当由处理器执行时，使得处理器：接收选择以供养细胞；接受选择以关闭毛细管内部分的出口，其中关闭毛细管内部分的出口使从毛细管内部分中的细胞释放的颗粒浓缩；并进行操作以将颗粒移动到收获袋中。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，进一步包括以下中的一个或多个：进行操作以执行5x冲洗；进行操作以执行负超滤；和/或进行操作以执行冲洗。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，从细胞释放的颗粒包括细胞外颗粒。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，细胞外颗粒包括外泌体。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，细胞外颗粒包括微囊泡。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，进一步包括：接收选择以替换中空纤维膜的毛细管内部分和毛细管外部分中的流体。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，所述流体的替换从用于供养细胞的第一培养基中提取蛋白质。

一个或多个上述实施方案和/或方面中的任一个，其中，不含蛋白质的第二培养基取代第一培养基以供养细胞。

一个或更多个上述实施方案和/或方面中的任一个，进一步包括进行操作以在生物反应器中执行第一和/或第二培养基测试以确定蛋白质是否已被移除。

本发明的实施方案和/或方面可包括细胞扩增系统，包含：生物反应器，其中所述生物反应器包含中空纤维膜；第一流体流动路径，在生物反应器的至少相对的两端具有第一入口和第一出口，其中第一流体流动路径与中空纤维膜的毛细管内部分流体相连；第二流体流动路径，具有第二入口和第二出口，其中第二流体流动路径与中空纤维膜的毛细管外部分流体相连；第一连接端口，与第一流体流动路径流体相连，其中附接到第一连接端口的第一袋将细胞引入生物反应器；第二连接端口，其与第一流体流动路径流体相连，其中包含第一培养基的第二袋连接到第二连接端口，以通过第一流体流动路径将第一培养基提供给生物反应器，以供养细胞直到已发生预定次数的细胞倍增，所述第一培养基含有蛋白质；第三连接端口，其与第一流体流动路径和第二流体路径流体相连，其中包含第二培养基的第三袋连接到第三连接端口，以通过第一流体流动路径将第二培养基提供给生物反应器，并且第二连接端口通过第一流体流动路径提供第二培养基。流体路径从生物反应器中冲洗出第一培养基；第四连接端口，其与第二流体流动路径流体相连，其中，在冲洗之后，包含第三培养基的第四袋连接到第四连接端口以供养细胞，其中当用第三培养基供养细胞时，第一流体流动路径的第一出口关闭，以浓缩从生物反应器的毛细管内部分中的细胞释放的颗粒，所述第三培养基不含蛋白质；收获袋与第一流体流动路径流体相连，其中浓缩颗粒移动到收获袋中。

本发明的实施方案和/或方面可包括用于在细胞扩增系统中产生细胞颗粒的方法，该方法包括：灌注细胞扩增系统，其中细胞扩增系统包括：生物反应器，其中生物反应器包括：中空纤维膜，具有毛细管内部分和毛细管外部分；第一流体流动路径，在生物反应器的至少相对的两端具有第一入口和第一出口，其中第一流体流动路径与中空纤维膜的毛细管内部分流体相连；第二流体流动路径，具有第二入口和第二出口，其中第二流体流动路径与中空纤维膜的毛细管外部分流体相连；第一连接端口，与第一流体流动路径流体相连；第二连接端口，与第一流体流动路径流体相连；第三连接端口，与第一流体流动路径和第二流体路径流体相连；第四连接端口，与第二流体流动路径流体相连；和收获袋；将第一袋连接到第一连接端口以将细胞引入生物反应器；将包含第一培养基的第二袋连接到第二连接口，以通过第一流体流动路径将第一培养基提供给生物反应器，以供养细胞直至发生预定次数的细胞倍增，所述第一培养基含有蛋白质；在已经发生预定次数的细胞倍增之后，将包含第二培养基的第三袋连接到第三连接端口，以通过第一流体流动路径和第二流体路径将第二培养基提供给生物反应器，以从生物反应器中冲洗出第一培养基；在冲洗之后，关闭第一流体流动路径的第一出口，以浓缩从生物反应器的毛细管内部分中的细胞释放的颗粒；将包含第三培养基的第四袋连接到第四连接口以供养细胞，所述第三培养基不含蛋白质；将收获袋连接到第一流体流动路径以收获；并将浓缩的颗粒收获到收获袋中

本发明的实施方案和/或方面可包括一个或更多个上述实施方案和/或方面中的任一个的组合。

本发明的实施方案和/或方面可包括用于执行一个或更多个上述实施例和/或方面中的任何一个的方法。

虽然已经说明和描述了本发明的示例实施方案和应用，但是应该理解，本发明不限于上述精确配置和资源。在不脱离本发明的范围的情况下，可以在本文公开的本发明的方法和系统的布置、操作和细节中进行对本领域技术人员显而易见的各种修改、改变和变化。

如本文所用，“至少一个(种)”，“一个(种)或更多个(种)”以及“和/或”是既涵盖结合用时的含义又涵盖分开用时的含义的开放式表达。例如，表达“A、B和C中的至少一个(种)”，“A、B或C中的至少一个(种)”，“A、B和C中的一个(种)或更多个(种)”，“A、B或C的一个(种)或更多个(种)”和“A、B和/或C”表示仅A，仅B，仅C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，或A、B和C一起。

对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对本发明的方法和结构进行各种修改和变化。因此，应该理解，本发明不限于给出的具体实例。相反，本发明旨在覆盖所附权利要求及其等同物的范围内的修改和变化。

Claims

1.一种收集细胞产物的方法，所述方法包括：

将细胞装载到生物反应器中；

用培养基供养所述细胞；

扩增所述细胞，其中，所述细胞释放细胞产物；

浓缩经释放的细胞产物；以及

从所述生物反应器中收获经浓缩的细胞产物。

2.权利要求1所述的方法，其中，所述经释放的细胞产物包括细胞外颗粒。

3.权利要求2所述的方法，其中，所述细胞外颗粒包括细胞外囊泡。

4.权利要求3所述的方法，其中，所述细胞外囊泡包括外泌体。

5.权利要求3所述的方法，其中，所述细胞外囊泡包括微囊泡。

6.权利要求2所述的方法，其中，所述细胞外颗粒包括病毒载体。

7.权利要求1所述的方法，其中，将所述经收获的细胞产物收集到袋中。

8.权利要求1所述的方法，进一步包括：

替换所述培养基。

9.权利要求1所述的方法，其中，所述培养基包含血清。

10.一种细胞扩增系统，包括：

生物反应器，其中，所述生物反应器包括中空纤维膜；

第一流体流动路径，其具有至少相对的端部，其中，所述第一流体流动路径与所述中空纤维膜的毛细管内部分流体相连；

处理器；

存储器，所述存储器与所述处理器通信并且能由所述处理器读取，并且包含一系列指令，当由所述处理器执行时，使得所述处理器：

接收选择以供养细胞；

接收选择以关闭所述毛细管内部分的出口，其中，关闭毛细管内部分的出口使从所述毛细管内部分中的所述细胞释放的颗粒浓缩；以及

进行操作以将所述颗粒移动到收获袋中。

11.权利要求10所述的细胞扩增系统，进一步包括以下项的一个或更多个：

进行操作以执行5x冲洗；

进行操作以执行负超滤；和/或

进行操作以执行冲洗。

12.权利要求10所述的细胞扩增系统，其中，从所述细胞释放的所述颗粒包括细胞外颗粒。

13.权利要求12所述的细胞扩增系统，其中，所述细胞外颗粒包括外泌体。

14.权利要求12所述的细胞扩增系统，其中，所述细胞外颗粒包括微囊泡。

15.权利要求10所述的细胞扩增系统，进一步包括：

接收选择以替换在所述中空纤维膜的所述毛细管内部分和毛细管外部分中的流体。

16.权利要求15所述的细胞扩增系统，其中，所述流体的替换从用于供养所述细胞的第一培养基中提取蛋白质。

17.权利要求16所述的细胞扩增系统，其中，不含蛋白质的第二培养基替换所述第一培养基以供养所述细胞。

18.权利要求17所述的细胞扩增系统，进一步包括：

进行操作以在所述生物反应器中执行所述第一培养基和/或第二培养基的测试以确定所述蛋白质是否已被移除。

19.一种细胞扩增系统，包括：

生物反应器，其中，所述生物反应器包括中空纤维膜；

第一流体流动路径，其在所述生物反应器的至少相对的两端具有第一入口和第一出口，其中，所述第一流体流动路径与所述中空纤维膜的毛细管内部分流体相连；

第二流体流动路径，其具有第二入口和第二出口，其中，所述第二流体流动路径与所述中空纤维膜的毛细管外部分流体相连；

第一连接端口，其与所述第一流体流动路径流体相连，其中，附接到所述第一连接端口的第一袋将细胞引入所述生物反应器；

第二连接端口，其与所述第一流体流动路径流体相连，其中，包含第一培养基的第二袋连接到所述第二连接端口，以通过所述第一流体流动路径将所述第一培养基提供给所述生物反应器，来供养所述细胞直到已发生预定次数的细胞倍增，所述第一培养基含有蛋白质；

第三连接端口，其与所述第一流体流动路径和所述第二流体路径流体相连，其中，包含第二培养基的第三袋连接到所述第三连接端口，以通过所述第一流体流动路径和所述第二流体路径将所述第二培养基提供给所述生物反应器，来从所述生物反应器中冲洗出所述第一培养基；

第四连接端口，其与所述第二流体流动路径流体相连，其中，在所述冲洗之后，包含第三培养基的第四袋连接到所述第四连接端口以供养所述细胞，其中，当用所述第三培养基供养细胞时，所述第一流体流动路径的第一出口是关闭的以浓缩从所述生物反应器的毛细管内部分中的所述细胞释放的颗粒，所述第三培养基不含蛋白质；以及

收获袋，其与所述第一流体流动路径流体相连，其中，经浓缩的颗粒移动到所述收获袋中。

20.一种在细胞扩增系统中产生细胞颗粒的方法，所述方法包括：

灌注所述细胞扩增系统，其中，所述细胞扩增系统包括：

生物反应器，其中，所述生物反应器包括：

中空纤维膜，所述中空纤维膜具有毛细管内部分和毛细管外部分；

第一连接端口，其与所述第一流体流动路径流体相连；

第二连接端口，其与所述第一流体流动路径流体相连；

第三连接端口，其与所述第一流体流动路径和所述第二流体路径流体相连；

第四连接端口，其与所述第二流体流动路径流体相连；以及

收获袋；

将第一袋连接到所述第一连接端口以将细胞引入所述生物反应器；

将包含第一培养基的第二袋连接到所述第二连接端口，以通过所述第一流体流动路径将所述第一培养基提供给所述生物反应器，来供养所述细胞直至发生预定次数的细胞倍增，所述第一培养基含有蛋白质；

在已经发生所述预定次数的细胞倍增之后，将包含第二培养基的第三袋连接到所述第三连接端口，以通过所述第一流体流动路径和所述第二流体路径将所述第二培养基提供给生物反应器，来从所述生物反应器中冲洗出所述第一培养基；

在所述冲洗之后，关闭所述第一流体流动路径的第一出口，以浓缩从所述生物反应器的毛细管内部分中的所述细胞释放的颗粒；

将包含第三培养基的第四袋连接到所述第四连接端口以供养所述细胞，所述第三培养基不含蛋白质；

将所述收获袋连接到所述第一流体流动路径以收获；以及

将经浓缩的颗粒收获到所述收获袋中。