CN112410219A - 用于持续收集外泌体的细胞培养系统 - Google Patents

Abstract

本申请公开一种用于持续收集外泌体的细胞培养系统，包括：生物反应器，用于培养产生外泌体的种子细胞；储液瓶，用于暂存含有外泌体的培养液；灌注管路，用于连接所述储液瓶的出液口和所述生物反应器的进液口，驱动管内培养液单向流入所述生物反应器；返回管路，用于连接所述生物反应器的出液口和所述储液瓶的进液口，引导管内培养液单向流入所述储液瓶。本申请包括生物反应器和储液瓶，通过灌注管路和返回管路驱动培养液在生物反应器和储液瓶之间形成循环，一方面利用生物反应器能够对种子细胞进行批量培养，另一方面也能通过储液瓶暂存含有外泌体的培养液，便于后续对外泌体进行分离提取。

Description

用于持续收集外泌体的细胞培养系统

技术领域

本申请涉及细胞培养领域，尤其涉及一种用于持续收集外泌体的细胞培养系统。

背景技术

外泌体可由多种细胞释放，如肝细胞、干细胞、上皮细胞等。外泌体释放至细胞微环境后，经胞饮作用、内吞作用和吞噬作用等方式进入靶细胞胞体。囊泡内细胞特异性的蛋白、脂质和核酸能作为信号分子传递给靶细胞从而发挥细胞间信息传递作用，调节靶细胞的多种生理功能，如抗原呈递、血管生成、肿瘤细胞迁移、细胞凋亡及免疫反应等。

现有外泌体获取方法主要通过平板培养，收集上清液提取获得，其获取量较小，不利于大规模获取外泌体；可以通过其他培养方式提高细胞的培养量从而提高外泌体的产量，但是存在种子细胞生长增殖受阻的问题。另外，如何便利地收集外泌体也是需要解决的问题之一。

发明内容

本申请的目的是，至少部分克服现有技术的不足，提供一种用于持续收集外泌体的细胞培养系统，以实现外泌体的大规模制备。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

一种用于持续收集外泌体的细胞培养系统，包括：

生物反应器，用于培养产生外泌体的种子细胞；

储液瓶，用于暂存含有外泌体的培养液；

灌注管路，用于连接所述储液瓶的出液口和所述生物反应器的进液口，驱动管内培养液单向流入所述生物反应器；

返回管路，用于连接所述生物反应器的出液口和所述储液瓶的进液口，引导管内培养液单向流入所述储液瓶。

具体地，所述储液瓶包括瓶体和瓶盖，所述瓶盖开设培养液出口、培养液入口、供氧入口和压力调节口。

进一步地，所述培养液出口插入所述灌注管路至接近储液瓶瓶底；所述培养液入口插入所述返回管路至储液瓶的最高液面以下；所述供氧入口插入供氧管路至储液瓶的最高液面以上；所述压力调节口插入通气管路至储液瓶的最高液面以上。

更进一步地，所述供氧管路连通至供氧设备，所述供氧管路中间接驳空气过滤器；所述通气管路的外露末端连接空气过滤器并处于开放状态。

优选地，所述灌注管路、返回管路、供氧管路和通气管路分别在靠近所述储液瓶的管段设置夹管阀。

进一步地，所述灌注管路上设置单向循环泵，控制管内流速在0～50ml/min。

优选地，所述灌注管路上设置单向过滤器。

进一步优选地，所述生物反应器采用中空纤维反应器。

具体地，所述生物反应器包括由中空纤维载体分隔的内腔和外腔。

优选地，所述生物反应器包括设置在所述内腔和外腔轴线上的相对的进液口和出液口，还包括设置在所述外腔侧壁的两个换液口。

与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

(1)本申请的细胞培养系统，包括生物反应器和储液瓶，通过灌注管路和返回管路驱动培养液在生物反应器和储液瓶之间形成循环，一方面利用生物反应器能够对种子细胞进行批量培养，另一方面也能通过储液瓶暂存含有外泌体的培养液，便于后续对外泌体进行分离提取。

(2)本申请的细胞培养系统，所述储液瓶不仅有暂存外泌体的作用，还可以作为空气缓冲间，一方面便于该细胞培养系统内的气泡排出，另一方面便于对该细胞培养系统进行供氧，提高该细胞培养系统运行的稳定性。

(3)本申请的细胞培养系统，采用中空纤维反应器作为生物反应器，根据中空纤维反应器的结构特点，可以分别收集其内腔和外腔的的培养液，提高外泌体的收集量；具体是利用所述储液瓶收集流过内腔的培养液，利用生物反应器的换液口收集外腔的培养液。

(4)本申请的细胞培养系统，采用中空纤维反应器作为生物反应器，配合在储液瓶处接入的供氧设备，可以优化中空纤维反应器的供氧情况，克服现有中空纤维反应器供氧不足的问题，保证生物反应器内种子细胞的活性。

附图说明

图1为本申请的用于持续收集外泌体的细胞培养系统的示意图。

图中的附图标号说明如下：

1-生物反应器；11-进液口；12-出液口；13-换液口；2-储液瓶；21-瓶体；22-瓶盖；221-培养液出口；222-培养液入口；223-供氧入口；224-压力调节口；3-灌注管路；31-单向循环泵；32-单向过滤器；4-返回管路；5-供氧管路；51-空气过滤器；6-通气管路；61-空气过滤器。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。

参考图1，本申请的用于持续收集外泌体的细胞培养系统，包括生物反应器1和储液瓶2，还包括将该生物反应器1和储液瓶2连接成培养液循环通路的灌注管路3和返回管路4。

具体地，所述生物反应器1优选采用中空纤维反应器，一种可能的实施方式中，所述中空纤维生物反应器1具有相对的进液口11和出液口12，在所述进液口11和出液口12之间布设维持合理间距的中空纤维材料，使得所述中空纤维材料将整个中空纤维反应器分隔为内腔和外腔，所述进液口11和出液口12基本布设在所述内腔和外腔的轴线上。通常，所述中空纤维材料用于对细胞进行固定化培养，即细胞在中空纤维材料的外表面和内表面进行贴壁生长，通过中空纤维材料的空间结构的支持，模拟出细胞的立体生长的微环境，以此提高细胞的生物活性。

所述储液罐用于暂存含有外泌体的培养液，该储液罐包括瓶体21和瓶盖22，瓶体21可以用标准化制造的培养基瓶进行替换，所述瓶盖22优选采用螺纹盖，以便于与瓶体21盖合严实。进一步地，所述瓶盖22开设有以下开口：培养液出口221、培养液入口222、供氧入口223和压力调节口224。

具体地，所述培养液出口221通过所述灌注管路3与所述生物反应器1的进液口11连通，所述灌注管路3通过培养液出口221插入至接近储液瓶2瓶底，以便于储液瓶2内的培养液尽可能参与该细胞培养系统的内部循环。进一步地，所述灌注管路3上还设有单向循环泵31，为该细胞培养系统内的液体循环提供流动的动力，也便于在生物反应器1的进液口11上游提供灌注动力，所述单向循环泵31的流速控制范围在0～50ml/min，可以根据需要合理调节流速。储液罐中含有外泌体的培养液含有大分子，也可能含有游离的细胞或细胞团，因此，所述灌注管路3上还设有单向过滤器32，可以过滤进入生物反应器1前的培养液，避免中空纤维材料被大分子或游离的细胞堵塞影响生物反应器1内的细胞生长增殖。

所述培养液入口222通过所述返回管路4与所述生物反应器1的出液口12连通，所述返回管路4通过培养液入口222插入至储液瓶2最高液面以下，但一般不会插入至瓶底，以便于从生物反应器1流出的培养液灌入储液瓶2时尽可能减少气泡的产生，也便于培养液中的气泡快速上升至气液交界面以离开培养液，减少该细胞培养系统中循环管路内的气泡。所述返回管路4也可以设置循环泵，与灌注管路3的单向循环泵31配合。

所述供氧入口223通过供氧管路5与外接的供氧设备连接，所述供氧管路5通过供氧入口223插入至储液瓶2的最高液面以上，一方面为细胞培养系统补充供氧，优化生物反应器1、特别是中空纤维反应器的溶解氧的供给条件，另一方面避免不必要的气泡产生，与液面保持距离也可以防止循环通路内瞬间压差变化导致培养液被吸入供氧设备，损坏供氧设备。优选地，所述供氧管路5由至少两条管材接驳而成，接驳处设置空气过滤器51，所述空气过滤器51可以避免空气中的微生物污染细胞培养系统中的细胞。

所述压力调节口224通过通气管路6与外界大气连通，所述通气管路6通过压力调节口224插入至储液瓶2的最高液面以上，所述通气管路6的外露末端连接空气过滤器61并处于开放状态。所述通气管路6的作用在于平衡细胞培养系统内的压力，避免差压过大导致管路堵塞或者渗漏。所述通气管路6下末端的位置的设置情况，以及上末端所设置的空气过滤器61，其原理与上述的供氧管路5的相同。在必要时，所述通气管路6也可以作为加液通道，例如是通过注射器进行添加剂的注入；该通气管路6也可以作为样通道，例如是通过注射器抽取检测样品。

在优选的方案中，所述灌注管路3、返回管路4供氧管路5和通气管路6分别在靠近所述储液瓶2的管段设置夹管阀，以便按需集中控制各个管路的通断。

进一步优选地，所述生物反应器1在所述外腔的侧壁开设两个换液口13，用于外接循环管路更换所述生物反应器1外腔的培养液，提高外泌体的收集量。通常，培养液从所述生物反应器1的进液口11灌注到出液口12的过程，培养液主要流过生物反应器1的内腔，外腔的培养液是内腔的培养液穿过中空纤维材料渗透而成的，外腔的培养液受反应器内液体湍流的影响较小，外腔的培养液仅有少量流出反应器，继而进入该细胞培养系统的内部循环，因此外腔的培养液参与该细胞培养系统的内部循环程度较低。然而为了可能地收集外泌体，外腔的培养液也不能忽略，另外，外腔的培养液若不及时更换也会影响反应器内细胞的生长增殖，因此有必要设置所述换液口13，及时更换外腔的培养液。换液时，将新鲜的培养液从其中一个换液口13灌入所述生物反应器1，同时从含有外泌体的培养液从另一个换液口13导出，新鲜的培养液灌入一段时间之后，可以认为生物反应器外腔的培养液更换完毕。

本申请的用于持续收集外泌体的细胞培养系统的运作方式如下：

(1)启动

作为种子细胞的细胞前期经过复苏和扩增培养后，制成细胞悬液并且通过专用的螺纹注射器接种至生物反应器1的外腔，然后在单向循环泵31的驱动下，将暂存在储液罐中的培养液灌注到生物反应器1的内腔，待排空该细胞培养系统的各个管路中的所有气体之后(各个管路内的空气通过所述通气管路6排出)，利用所述供氧管路5接通供氧设备，保持所述通气管路6的开放状态，然后，将整个细胞培养系统放置于37℃的恒温培养箱内进行培养。

(2)稳定运转

所述细胞培养系统正常运转的过程，需要定期监测培养液的理化指标，确定细胞生长增殖处于正常状态，所述理化指标包括但不限于：葡萄糖含量、pH值、温度值、溶解氧含量、乳酸含量和尿素含量等。当发现指标数据处于在正常范围之外，需要及时采取必要的措施进行调整，以保持该细胞培养系统持续运转。

(3)收集外泌体

定期收集外泌体。一方面通过更换储液瓶2中的培养液收集含有种子细胞分泌的外泌体的培养液，另一方面通过所述换液口13更换生物反应器1外腔的培养液收集含有外泌体的培养液。汇集两部分收集的培养液之后，通过特定的分离提取方法，获得纯化的外泌体。由此，在保持该细胞培养系统持续稳定运转的情况下实现持续不断的获取相关种子细胞分泌的外泌体的目的。

综上所述，本申请包括生物反应器和储液瓶，通过灌注管路和返回管路驱动培养液在生物反应器和储液瓶之间形成循环，一方面利用生物反应器能够对种子细胞进行批量培养，另一方面也能通过储液瓶暂存含有外泌体的培养液，便于后续对外泌体进行分离提取。

上述实施例为本申请较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本申请的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于持续收集外泌体的细胞培养系统，其特征在于，包括：

生物反应器，用于培养产生外泌体的种子细胞；

储液瓶，用于暂存含有外泌体的培养液；

灌注管路，用于连接所述储液瓶的出液口和所述生物反应器的进液口，驱动管内培养液单向流入所述生物反应器；

返回管路，用于连接所述生物反应器的出液口和所述储液瓶的进液口，引导管内培养液单向流入所述储液瓶。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述储液瓶包括瓶体和瓶盖，所述瓶盖开设培养液出口、培养液入口、供氧入口和压力调节口。

3.如权利要求2所述的系统，其特征在于，所述培养液出口插入所述灌注管路至接近储液瓶瓶底；所述培养液入口插入所述返回管路至储液瓶的最高液面以下；所述供氧入口插入供氧管路至储液瓶的最高液面以上；所述压力调节口插入通气管路至储液瓶的最高液面以上。

4.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述供氧管路连通至供氧设备，所述供氧管路中间接驳空气过滤器；所述通气管路的外露末端连接空气过滤器并处于开放状态。

5.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述灌注管路、返回管路、供氧管路和通气管路分别在靠近所述储液瓶的管段设置夹管阀。

6.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述灌注管路上设置单向循环泵，控制管内流速在0～50ml/min。

7.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述灌注管路上设置单向过滤器。

8.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述生物反应器采用中空纤维反应器。

9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述生物反应器包括由中空纤维载体分隔的内腔和外腔。

10.如权利要求9所述的系统，其特征在于，所述生物反应器包括设置在所述内腔和外腔轴线上的相对的进液口和出液口，还包括设置在所述外腔侧壁的两个换液口。

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