JP2024510578A - 細胞接着材料、装置及びそれらの使用 - Google Patents

細胞接着材料、装置及びそれらの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2024510578A
JP2024510578A JP2023554017A JP2023554017A JP2024510578A JP 2024510578 A JP2024510578 A JP 2024510578A JP 2023554017 A JP2023554017 A JP 2023554017A JP 2023554017 A JP2023554017 A JP 2023554017A JP 2024510578 A JP2024510578 A JP 2024510578A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
peptide
polymer
cell adhesion
peptides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023554017A
Other languages
English (en)
Inventor
ナディーン・カイザー
ヴェロニク・シュヴァルツ
トビアス・メンツェル
ウーヴェ・フロイデンベルク
アンドレア・マインハルト
Original Assignee
ファセリテート・ゲーエムベーハー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP21161100.9A external-priority patent/EP4053163A1/en
Application filed by ファセリテート・ゲーエムベーハー filed Critical ファセリテート・ゲーエムベーハー
Publication of JP2024510578A publication Critical patent/JP2024510578A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/12—Esters of monohydric alcohols or phenols
    • C08F220/16—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms
    • C08F220/18—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms with acrylic or methacrylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F301/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08F10/00 - C08F299/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment
    • C12N2537/10—Cross-linking

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、剛性表面への真核細胞の接着を媒介するための材料及び方法に関する。特に、本発明は、好ましくは細胞培養装置、マイクロ流体装置、バイオセンサー又はインプラントのための、細胞接着表面を形成するためのコーティングに関する。同様に、本発明は、そのようなコーティングのためのポリマーコンジュゲート、ポリマーコンジュゲートの形成方法、ポリマーコンジュゲートの適用方法、及びそのようなポリマーコンジュゲートの使用を提供する。本発明はまた、このようなポリマーコンジュゲートで少なくとも部分的にコーティングされた表面及び装置も提供する。

Description

本発明は、剛性表面への真核細胞の接着を媒介するための材料及び方法に関する。特に、本発明は、好ましくは細胞培養装置、マイクロ流体装置、バイオセンサー又はインプラントのための、細胞接着表面を形成するためのコーティングに関する。同様に、本発明は、そのようなコーティングのためのポリマーコンジュゲート、ポリマーコンジュゲートの形成方法、ポリマーコンジュゲートの適用方法、及びそのようなポリマーコンジュゲートの使用を提供する。本発明はまた、このようなポリマーコンジュゲートで少なくとも部分的にコーティングされた表面及び装置も提供する。
動物由来のほとんどの非変性真核細胞株では、そのような細胞の表面への接着及び拡散が形成されない場合、細胞周期の進行が阻害される。従って、細胞接着は、細胞増殖を達成するために、特に、細胞培養及び組織培養において望ましいものである。更に、細胞接着は、特に真核細胞が持続的に存在することが必要とされるバイオセンサーでは、生体表面の裏打ちを生じさせるために望ましい。また、インプラントでも、炎症反応を低減させるために、非変性細胞を裏打ちすることにより恩恵が得られている。細胞接着用の生体適合性材料は、このように一般に先行技術では十分に研究されている。しかしながら、マトリゲル（商標）、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン又はビトロネクチンのようないくつかの材料には、天然に産生された物質の混合物が含まれている可能性がある。このような材料は、バッチごとに製品特性が大きく変動するのを防ぐために、品質維持に多大な労力が必要となる。他の素材では、合成したり、又は精製して有毒物質又は刺激物質を除去したりすることが難しい。
細胞接着には、単なる表面接着及び細胞周期の進行以上の効果があることが分かっている。特に、表面接着の様式は、細胞の生理学的状態に影響を与える可能性がある。例えば、多能性幹細胞は、接着用に提供される材料に依存して急速な分化を起こす。しかしながら、急速な分化は、多能性幹細胞を増殖するのに望ましいものではない。
上述した効果に鑑み、細胞の生理機能を混乱させることなく、特に、多能性幹細胞の分化を早期に誘導することなく、細胞接着に好適な表面を生成する材料を提供することが多くの研究対象となってきている。しかしながら、このような研究では、幹細胞の増殖に好適な材料が得られないことが多々あり、その主な理由は、多能性幹細胞の旺盛な分化傾向を克服することができなかったことにある。特に、多くのペプチド、特に少なくとも１つのＲＧＤモチーフを有するペプチドを表面に接着させて真核細胞用の接着アンカーを得ることができるものの、それらのいずれもが、それら単独で分化を妨げるものではないことが観察されている。このことから、細胞接着に関する異なるペプチドの順位付けは原理的には可能であるが、そのような順位付けは定性的な結果しかもたらさないという結論が導き出された（非特許文献１）。複雑な要因としては、特に以下のものがある：均一に官能化された表面は、いかなる自然の細胞環境とも明らかに異なるものであり、これだけでも細胞の発達に影響を与えるには十分であること。更に、細胞接着及び分化におけるインテグリンの役割は十分に研究されてはいるが、活性状態が異なるインテグリンでは、異なるリガンド結合活性を有する可能性があること。また、細胞が隣接細胞及び細胞外培地と相互作用し、その結果として分化が生じて、インテグリンの一過性発現が生じること。いずれかの信頼性の高い基本原理がない状態で細胞接着及び増殖に好適な材料の組み合わせを発見することは、諺通り、干し草の山から針を発見するようなものであった。
従って、本発明は、真核細胞の表面への接着を促進するための材料及び方法を提供することに関する。特に、材料は、一貫して高品質で容易に生産されるべきであり、自発的な分化が起こる前の幹細胞培養継代数で測定されることが好ましい。
ハーセル（Ｈｅｒｓｅｌ）ら著、「ＲＧＤ変性ポリマー；刺激細胞接着及びその他のための生体材料」（ＲＧＤ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ；ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄｓ）、バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、２００３年、ｐ．４３８５－４４１５
従って、本発明は、ポリマーと、そこにコンジュゲートされたペプチドの組とを含む、細胞接着ポリマーコンジュゲートであって、
ペプチドは、好ましくは、
ａ）環状インテグリン結合ペプチドと、
ｂ）線状インテグリン結合ペプチドと、
ｃ）正電荷ペプチドと、からなる群から選択される、２つの異なるインテグリン結合ペプチド及び正電荷ペプチドから構成された、少なくとも３つのペプチドを含むか、本質的になるか、又はこれらからなり、
ポリマーは、疎水性部分と、ペプチドがコンジュゲートするための連結部分とを含む、細胞接着ポリマーコンジュゲートを提供する。
同様に、本発明はまた、本発明のポリマーコンジュゲートでコーティングされた基材から構成される細胞接着表面を提供する。
また、本発明は、本発明の細胞接着表面から構成される細胞接着装置を提供する。
同様に、本発明はまた、本発明によるポリマーコンジュゲートを調製するための方法であって、
ｉ）コポリマーを提供するステップであって、両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、疎水性部分とを含むステップと、
ｉｉ）前記コポリマーにペプチドをコンジュゲートするステップであって、ペプチドは、少なくとも２つの異なるインテグリン結合ペプチドと、少なくとも１つの正電荷ペプチドとを含むか、本質的になるか、又はこれらからなり、好ましくは少なくとも３つのペプチドは、線状インテグリン結合ペプチドと、環状インテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとからなる群から選択されるステップとを含む方法を提供する。
本発明は、更に、本発明による細胞接着表面又は細胞接着装置を調製する方法であって、
ｉ）両親媒性コポリマーを提供するステップであって、両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、疎水性部分とを含むステップと、
ｉｉ）前記コポリマーにペプチドをコンジュゲートするステップであって、ペプチドは、２つの異なるインテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとを含む少なくとも３つのペプチドを含むか、本質的になるか、又はこれらからなり、好ましくは線状インテグリン結合ペプチドと、環状インテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとからなる群から選択されるステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）の前、その間、又はその後に、コポリマーで基材をコーティングするステップとを含む方法を提供する。
本発明はまた、副腎髄質細胞、血液細胞、骨髄細胞、心筋細胞、内分泌細胞、表皮細胞、上皮細胞、腺細胞、腎細胞、肺細胞、筋細胞、神経細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脾臓細胞、幹細胞、胸腺細胞、変性細胞及びこのような細胞、好ましくは体細胞又は多能性幹細胞を含む混合物を培養するための細胞接着表面及び／又は細胞接着装置の調製のための、本発明のポリマーコンジュゲートの使用を提供する。
更に、本発明は、真核細胞を、本発明のポリマーコンジュゲート、細胞接着表面又は細胞接着装置とそれぞれ接触させることを含む、真核細胞の培養方法を提供する。
また、本発明は、幹細胞を少なくとも５継代、より好ましくは８～４０継代、より好ましくは１０～２５継代の間、多能性状態に維持するための、本発明のポリマーコンジュゲートの使用を提供する。
異なるポリマー－ペプチドがコンジュゲートされた基材上のｉＰＳＣ。ｉＰＳＣをＡｄ１－ポリマー及びＡｄ１２－ポリマー上で増殖させ、経時的にマトリゲル(Matrigel)と比較して画像化した。スケールバーは２００μｍである。 異なるコーティング表面上におけるｉＰＳＣの接着及び増殖。（Ａ）ＩＰＳＣを異なるＰＰ上で培養すると、マトリゲル上で培養したｉＰＳＣと比較してより小さなコロニーが形成された。（Ｂ）接着ペプチドをＰＰと組み合わせると、より巨大な未分化のコロニーが生じた（Ａｄ１２：ＰＰ３）。３つのペプチドを混合すると、Ａｄ１２：ＰＰ３の場合よりも更に良好に細胞拡散が促進された。スケールは２００μｍである。 ポリマー－ペプチドコンジュゲート上のｉＰＳＣの顕微鏡画像。細胞をポリマー－ペプチドコンジュゲート上にＰ０で播種し、８０％のコンフルエンシーに到達した時点で分割した。ｉＰＳＣを継代２１（Ｐ２１）まで培養した。 多能性マーカーの分析。Ａ＋Ｂ：マトリゲル(Matrigel)又はポリマー－ペプチド(Polymer-peptide)上で増殖させた、細胞の多能性マーカー、ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ－１－６０のフローサイトメトリー分析。両方の培養条件で、同等の割合の細胞がこれらのマーカーに対してダブルポジティブである。Ｃ：ｐ２１における、ポリマー－ペプチドコンジュゲート上で培養したＯＣＴ３／４＋細胞のフローサイトメトリー分析。
本発明の技術的教示は、本明細書では、特に科学用語及び技術用語を使用することによって言語手段を使用して表現される。しかしながら、教示を表現する複数の方法が存在するという理由だけでも、それぞれの表現を必然的に完了させる必要があるために、必ずしもそれぞれの教示がすべての概念的なつながりを完全に表現することができないため、当業者であれば、それらが詳細且つ正確であり得るような言語手段は、技術的教示の完全な内容に近似したものに過ぎない場合があることを理解している。このことを考慮して、当業者であれば、本発明の主題は、本明細書に示される個々の技術的概念を要約したものであるか、又は、必然的に、記載された明細書の生得的制約により全体を代表する一部分として表現されていることを理解している。特に、当業者は、本明細書において、例えば、３つの概念、即ち実施形態Ａ、Ｂ及びＣの開示が、概念Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、Ａ＋Ｂ＋Ｃの簡単な表記法となるように、技術的に理解できる限りの概念の可能なそれぞれの組み合わせを表記する略語として、個々の技術的概念が表示されていることを理解するであろう。特に、特徴に関する代替案は、相似する代替形態又は具体例のリストを鑑みて本明細書に記載される。別途明記しない限り、本明細書に記載される発明は、このような代替形態の任意の組み合わせを含む。このようなリストからより好ましい又はあまり好ましくない要素を選択することは、本発明の一部であり、この選択は、それぞれの特徴によってもたらされる利点又は長所を最低限実現するための当業者の優先傾向によるものである。このような複数の組み合わされた具体例は、本発明の十分に好ましい形態を表すものである。本明細書に記載される任意の１つの請求項、実施例、実施形態又は他の教示内の任意の列挙された単一又は複数の特徴又は態様は、本明細書に記載される任意の他の請求項、実施例、実施形態又は教示内の任意の他の列挙された特徴又は態様と組み合わせることができるか、又はそれらの順序を変更することができる。
本発明で使用する場合、単数形の用語、並びに「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの単数形は、その内容に別途明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「核酸」という用語の使用は、実際には、その核酸分子の多数のコピーを任意選択的に含む。同様に、「プローブ」という用語は、任意選択的に（及び典型的には）多数の類似又は同一のプローブ分子を包含する。また、本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、明記された要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を包含するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を排除するものではないことを意味することが理解されるであろう。「好ましくは」という用語についても同様であり、このことは、本発明の範囲又はより広義の請求項の範囲を限定することを意図しない優先傾向を意味するに過ぎない。特に、「好ましくは」という用語は、あまり好ましくない変形形態又は代替形態を軽視することを意味するものではない。
本明細書で使用する場合、「及び／又は」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、並びに代替形態（「又は」）において解釈される場合は組み合わせの欠如について言及し、且つこれらを包含するものである。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語を包含する。
「約」という用語は、測定可能な値と関連して使用される場合、例えば、質量、用量、時間、温度、配列同一性などの量が、明記された値だけでなく、明記された値の±０．１％、０．２５％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％又は更に２０％で変動することを指す。従って、所与の組成物が「約５０％のＸ」を含むと記載されている場合、いくつかの実施形態では、組成物は５０％のＸを含むが、他の実施形態では、４０％～６０％程度のＸ（即ち、５０％±１０％）を含み得ることを理解されたい。
本発明による幹細胞は、幹細胞由来の臍帯以外のヒト胚から得られる幹細胞を除いた体性幹細胞又は多能性幹細胞である。好ましくは、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
本発明は、細胞接着ポリマーコンジュゲートを提供する。ポリマーコンジュゲートは、両親媒性ポリマーと、そこにコンジュゲートされたペプチドの組とを含む。本発明の特定の利点は、当該技術分野において公知の方法に従ってペプチドを化学的に合成することができ、且つ天然源からの単離及び／又は分画を必要としないことである。
ペプチドは、少なくとも２つの異なるインテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとを含むか、本質的になるか、又はこれらからなる。好ましくは、少なくとも１つのペプチドは、線状インテグリン結合ペプチドと、環状インテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとからなる群のそれぞれから選択される。ペプチドは、好ましくは連結部分を設けることによって、便宜的にポリマーを連結することができる。ポリマーは、次に、疎水性部分と、ペプチドがコンジュゲートするための連結部分とを含む。特定の任意の理論に束縛されるものではないが、現時点では、遍在する細胞表面タンパク質であるカドヘリンの負電荷を相殺するため、正電荷ペプチドが特に有用であると考えられている。
ここで、驚くべきことに、本発明によって提示されるようなペプチドの組み合わせは、ポリマーベースでコンジュゲートさせた場合、分化阻害剤又は支持細胞層、例えばマウス線維芽細胞の不在下で、有利なことに、未分化多能性幹細胞を安定的に維持することが可能であることが見出されている。従って、本発明は、有利なことに、安定的な真核細胞の接着を促進する、表面コーティング用の純粋な合成材料を提供する。本発明の更なる利点は、ペプチドをコンジュゲートさせた後のポリマーコンジュゲートが、一般的な実験室の保存条件（暗所にて４℃）で少なくとも３ヶ月、好ましくは暗所にて４℃で６ヶ月間安定していることである。従って、本発明により、ポリマーコンジュゲート、又は、下記でより詳細に説明するように、ポリマーとペプチドの組とから構成されるキットを保存し、所望の時点で新鮮な細胞接着表面を調製することができる。
以下の表は、好ましいペプチドを列挙したものである。イタリック体でない小文字はＤ－アミノ酸を示し、「ｃ（ＸＸＸ）」という表記は配列番号ＸＸＸの環状ペプチドを示す。本発明に従って好ましく選択されるペプチドの多くは、個々に先行技術で知られている。
ペプチドは、上述のペプチドからなるものであり得る。好ましくは、ペプチドは上述の表からの少なくとも１つのペプチドを含み、より好ましくは３つのペプチドを含む。これらのペプチドのうち、配列番号１～４１から選択される配列、並びにシレンギチド、エキスタチン及びエプチフィバチドが特に好ましい。より好ましくは、ペプチドの組は、配列番号１～８（Ａｄ１、Ａｄ１ｃ、Ａｄ１２、Ａｄ２１、Ａｄ２２、ＰＰ３、ＰＰ２、ＰＰ４）から選択される３つのペプチドを含む。更により好ましくは、この組は、Ａｄ１ｃと、Ａｄ１、Ａｄ１２、Ａｄ２１及びＡｄ２２からなる群の１又は２つのペプチドと、ＰＰ２、ＰＰ３及びＰＰ４からなる群の少なくとも１つのペプチドとを含む。更により好ましくは、この組は、Ａｄ１ｃと、ＰＰ３と、Ａｄ１、Ａｄ１２、Ａｄ２１及びＡｄ２２から選択される１つのペプチドとを含む。
上述の表の各ペプチドはまた、それぞれの配列から最大で４アミノ酸位、より好ましくは最大で３アミノ酸位、より好ましくは最大で２アミノ酸位、更により好ましくは最大で１アミノ酸位だけ異なる変異ペプチドであってよい。しかしながら、各変異ペプチドは、依然として、ポリマーの少なくとも１つの型の連結部分に連結することが可能でなければならない。この差異は、配列の末端における付加、アミノ酸の挿入、アミノ酸の置換、及びアミノ酸の欠失から選択される。置換の場合、置換されるアミノ酸は、以下の表から選択されることが好ましい。
好ましくは、ペプチドは、Ａｄ１ｃ、Ａｄ１２、ＰＰ３から選択されるペプチド、及びＡｄ１ｃ、Ａｄ１２又はＰＰ３とそれぞれ最大で１アミノ酸差で異なるペプチドから選択されるペプチドを含むか、本質的になるか、又はこれらからなる。実施例に示されるように、好適なポリマーにおけるこのペプチドの組み合わせにより、特に有利な細胞接着表面コーティングを調製することが可能となる。特に、このようなポリマーコンジュゲートでコーティングされた表面は、幹細胞が表現型的に健康なコロニー形態で表面に安定的に接着することができるだけでなく、このような表面から別の表面に繰り返される継代（１０回超）にわたって幹細胞を未分化の段階に維持することができる。このことは、分化を阻止又は遅らせるための分化阻害物質も、また支持細胞層も適用する必要がなかったために、一層注目に値するものである。誤解を避けるために述べるが、本発明は、分化阻害剤のない環境における操作に限定されるものではない。しかしながら、本発明の実質的な利点は、すでに分化阻害剤の不在下で達成することができる。
ペプチドの組は、
ａ）特に好ましい環状インテグリン結合ペプチドがＡｄ１ｃ、又はそれと最大で１アミノ酸差で異なるペプチドである、少なくとも１つの環状インテグリン結合ペプチド、好ましくは１～５つの環状インテグリン結合ペプチドと、
ｂ）特に好ましい線状インテグリン結合ペプチドがＡｄ１２、又はそれと最大で１アミノ酸差で異なるペプチドである、少なくとも１つの線状インテグリン結合ペプチド、好ましくは１～５つの線状インテグリン結合ペプチドと、
ｃ）特に好ましい正電荷ペプチドがＰＰ３、又はそれと最大で１アミノ酸差で異なるペプチドである、少なくとも１つの正電荷ペプチド、好ましくは１～５つの正電荷ペプチドとを含み、
ａ）：ｂ）：ｃ）によるペプチドのモル比は、（０．５～４）：１：（０．０１～１）、より好ましくは（０．７～３）：１：（０．０８～０．８）、より好ましくは（１．５～２．５）：１：（０．１～０．４）であることが特に好ましい。
下記の実施例に示されるように、上述のペプチドを前記比率で提供することにより、特に、分化しない状態で幹細胞培養物の継代数が増加する。
更に好ましくは、Ａｄ１ｃ、Ａｄ１２及びＰＰ３の合計と他のペプチドの合計とのモル比は、２：１、より好ましくは３：１、より好ましくは５：１、より好ましくは１０：１であり、最も好ましくはこの組がＡｄ１ｃ、Ａｄ１２及びＰＰ３からなるものである。
ペプチドの組のペプチドとポリマーとの総濃度は、本発明のポリマーコンジュゲートで表面をコーティングするときに、平方ｃｍ当たり少なくとも１２ｐｍｏｌの密度のペプチドの組のペプチド、より好ましくは１２～２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の密度、より好ましくは約１５～１８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２の密度、より好ましくは約２０～１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の密度、より好ましくは約３０～１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の密度が達成されるように調製されることが特に好ましい。このような密度では、特に、分化しない状態で多能性幹細胞の効率的な増殖が可能となる。
ペプチドの組は、ポリマーのコンジュゲート部位の少なくとも約５０％、より好ましくはコンジュゲート部位の約６０～１００％、より好ましくはコンジュゲート部位の約７０～１００％、より好ましくはコンジュゲート部位の７５～９０％、より好ましくはコンジュゲート部位の約７５～１００％、より好ましくはコンジュゲート部位の８０～９５％、より好ましくはコンジュゲート部位の約８０～１００％、より好ましくはコンジュゲート部位の約９０～１００％、より好ましくはコンジュゲート部位の約１００％のコンジュゲーションを達成するのに十分な濃度で提供される。ポリマーコンジュゲートが、ポリマーにコンジュゲートされたペプチドの組以外の更なる物質も含んでもよいことが、本発明の特に有利な点である。従って、有利なことに、本発明のポリマーコンジュゲートには多用途性があり、例えば、未分化幹細胞の接着並びに／又は維持及び増殖に加えて、より多くの機能を提供することが可能となる。好ましくは、ポリマーにコンジュゲートされる更なる物質は、構造タンパク質（例えばコラーゲン及びエラスチン）、プロテオグリカン、多糖体、並びに糖タンパク質（例えばグリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸）から選択される。
ポリマーコンジュゲートは、頭－尾コンジュゲート、櫛形構造、又は樹枝状構造の構成を有してもよく、頭－尾コンジュゲート又は櫛形構造コンジュゲートが好ましい。典型的に、頭－尾コンジュゲートでは、ペプチドは線状ポリマーの一方又は両方の末端にコンジュゲートされている。通常、櫛形構造では、少なくとも１つのペプチドが線状ポリマーの主鎖に沿ってコンジュゲートされている。典型的には、樹枝状構造では、少なくとも１つのペプチドが樹枝状ポリマーの末端にコンジュゲートされている。
ペプチドは両親媒性ポリマーにコンジュゲートされているが、このことは通常、ペプチドが両親媒性ポリマーに共有結合されていることを意味する。このコンジュゲーションは、リンカーを用いて行っても、又はリンカーを用いずに行ってもよいが、リンカーを用いるのが好ましい。典型的には、コンジュゲーションには活性化試薬が使用される。好ましい形態では、活性化試薬とリンカーとを使用することによって、ペプチドを両親媒性ポリマーにコンジュゲートさせる。ペプチドのポリマーへのコンジュゲート、及びポリマーコンジュゲートの調製は、例えば、専門家には以下の総説から公知である：カナーレ（Ｃａｎａｌｌｅ）ら著、ケミカル・ソサエティー・レビュー（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．）、２０１０年、３９巻、ｐ．３２９－３５３；チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、プログレス・イン・ポリマー・サイエンス（Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）、２０２０年、１０５巻、ｐ．１０１２４１。
好適な部類の活性化試薬は、アミン反応性活性化試薬、カルボン酸反応性活性化試薬及びスルフヒドリル反応性活性化試薬である。活性化試薬は、ペプチドの特定の官能基（スルフヒドリル基など）及び両親媒性ポリマーの特定の官能基（カルボン酸基又はアミン基など）と反応することができる。更に、コンジュゲーションに化学選択的アジド－アルキン環化付加（クリック技術とも呼ばれる）を用いることができ、又は銅フリーのクリックケミストリー（ひずみ促進型アルキンアジド環化付加（ＳＰＡＡＣ：ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ａｌｋｙｎｅ ａｚｉｄｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎとも呼ばれる）を用いることができる。
好適なアミン反応性活性化試薬は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、スルホ－ＮＨＳエステル（例えば、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド）及びイミドエステルである。
好適なＮＨＳエステルは、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）のカルボキシレート基の活性化によって形成される反応性基であり得る。スルホ－ＮＨＳエステルは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド環上にスルホネート（－ＳＯ３）基を含有していることを除き、典型的にはＮＨＳエステルと同じである。好適なＮＨＳエステルは、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ＰＥＧ化スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’－ジチオビス（プロピオン酸スルホスクシンイミジル）、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス（２－（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル）スルホン）、エチレングリコールビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコールビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、トリス－（スクシンイミジル）アミノトリアセテート）である。
好適なイミドエステルは、アジプイミド酸ジメチル、ピメルイミド酸ジメチル、スベルイミド酸ジメチル、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンである。
好適なカルボン酸反応性活性化試薬は、カルボジイミド、アミニウム試薬及びホスホニウム試薬である。
好適なカルボジイミドは、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ：ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ’－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド－メチル－ｐ－トルエンスルホネート（ＣＭＣ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ：ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）である。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ：Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）又はその水溶性類似体（スルホ－ＮＨＳ）は、ＥＤＣのカップリング手順に含まれることが多い。
好適なアミニウム試薬（以前はウロニウム試薬として公知である）及びホスホニウム試薬は、
－ ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－（ジメチルアミノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、
－ ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、
－ ブロモ－トリピロリジノホスホニウム－ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）、
－ ［エチル－シアノ－（ヒドロキシイミノ）－アセタト－Ｏ２］－トリ－１－ピロリジニルホスホニウム－ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、
－ （７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、ＴＢＴＵ、
－ ２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、
－ Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＡＴＵ）、
－ ＨＡＴＵ（ＣＡＳ １４８８９３－１０－１）、
－ Ｏ－（１Ｈ－６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、ＨＤＭＣ（ＣＡＳ １０８２９５１－６２－９）、
－ １－［（１－（シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノ）］ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、
－ フルオロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）、
－ Ｏ－（５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシイミド）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＮＴＵ）、Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）、
－ ４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチル－モルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）である。
アミニウム試薬及びホスホニウム試薬は、通常、塩基、好ましくは第三級塩基、例えばＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）又はＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）と組み合わせて使用される。カルボン酸基は、通常、ＮＨＳ若しくはスルホ－ＮＨＳ、及び／又は１－ヒドロキシ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）又はシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ）などの添加剤によって前もって活性化される。
好ましい活性化試薬は、典型的なプロセス条件下では水溶性である。好適な水溶性活性化試薬は、ＥＤＣ、ＤＭＴＭＭ、ＣＭＣ、ＴＮＴＵ、ＴＳＴＵである。
好適なリンカーは、マレイミド、ハロアセチル又はピリジルジスルフィドであり、マレイミドが好ましい。
好適なマレイミドは、ビスマレイミドエタン、１，４－ビスマレイミドブタン、ビスマレイミドヘキサン、１，８－ビスマレイミドジエチレングリコール、１，１１－ビスマレイミドトリエチレングリコール、ジチオビスマレイミドエタン、トリス（２－マレイミドエチル）アミン、１－（２－アミノエチル）マレイミド、Ｎ－（３－アミノプロピル）マレイミド、マレイミド－ポリ（エチレングリコール）－アミン、１－（４－アミノフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、（Ｎ－（β－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、（Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド）、（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、Ｎ－κ－マレイミドウンデカン酸ヒドラジドである。
好ましいマレイミドは、１－（２－アミノエチル）マレイミド、Ｎ－（３－アミノプロピル）マレイミド、マレイミド－ポリ（エチレングリコール）－アミン、マレイミド－ポリ（エチレングリコール）－アミン、１－（４－アミノフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、（Ｎ－（β－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、（Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド）、（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、Ｎ－κ－マレイミドウンデカン酸ヒドラジドである。
好適なハロアセチルは、ヨード酢酸スクシンイミジル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸スクシンイミジル、スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエートである。
好適なピリジルジスルフィドは、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジドである。
好ましい形態では、ペプチドは、カルボン酸反応性活性化試薬（好ましくはカルボジイミド及びアミニウム試薬）から選択される活性化試薬と、マレイミドから選択されるリンカーとを使用することによって両親媒性ポリマーにコンジュゲートされる。
両親媒性ポリマーは、親水性部分と疎水性部分とを含み得る。この部分の構成は、通常、ブロックポリマー（例えば、Ａ－Ｂ又はＢ－Ａ－Ｂ、若しくはＡ－Ｂ－Ａなどのジブロック又はトリブロックポリマー）、或いは櫛型ポリマー（例えば、主鎖に疎水性部分、及び側鎖に親水性部分を有する）である。
親水性部分は、通常、ポリエチレングリコールから構成される。ポリエチレングリコールは、一方の末端にＣ１～６アルキルエーテル、例えばメチルエーテルを有し得る。親水性部分（例えば、ポリエチレングリコール）の分子量は、１００～５０，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは２００～１５，０００、特に３００～５，０００ｇ／ｍｏｌであってよい。
疎水性部分は、通常、Ｃ３～Ｃ１２アルキレンオキシド（好ましくはＣ３～Ｃ５アルキレンオキシド、特にプロピレンオキシド）をベースとするポリアルキレングリコール、又は疎水性モノマーをベースとする疎水性ポリマーから構成される。疎水性ポリマー中の疎水性モノマーのモル量は、１０～９０ｍｏｌ％、好ましくは３０～７０ｍｏｌ％のような広い範囲で調整することができる。
好適な疎水性モノマーは、例えば、
－ スチレン、フェニルアクリレート、ベンジルアクリレート、フェニルエチルアクリレート及びフェノキシエチルアクリレートなどの芳香族モノマー、
－ メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎーブチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレートなどのＣ１～Ｃ１８アルキル（メタ）アクリレート（好ましくはＣ１～４アルキル（メタ）アクリレート）、
－ イソブチレン、ジイソブチレン、１－デセン、１－ドデセン、Ｃ１８αオレフィンなどのＣ４～１８アルケン、
－ メチルビニルエーテル、並びに
－ ビニルピロリドンである。
好ましい疎水性モノマーは、芳香族モノマー（スチレンなど）及びＣ１～Ｃ１８アルキル（メタ）アクリレート（Ｃ１～４アルキル（メタ）アクリレートなど）であり、芳香族モノマーが最も好ましい。
疎水性部分は、好ましくはポリプロピレングリコール、又はスチレンなどの芳香族モノマーをベースとする疎水性ポリマーである。
両親媒性ポリマーは、通常、少なくとも１つのリンカー反応性基を含み、このリンカー反応性基は、官能化モノマー又は末端基であり得る。末端基の例としては、ヒドロキシ基又はアミン基がある。官能化モノマーの例としては、酸、アミン、又はスルフヒドリル官能基を有するモノマー、例えば、官能基を有するマレイン酸、（メタ）アクリレート（例えば、メタクリル酸）又は（メタ）アクリルアミドがある。両親媒性ポリマー中のリンカー反応性基のモル量は、０．１～７０ｍｏｌ％、好ましくは１～６０ｍｏｌ％のような広い範囲で調製することができる。
一形態では、疎水性ポリマーは、コモノマー、例えば、リンカーと反応するのに好適な官能化モノマーを更に含む。疎水性ポリマー中の更なるコモノマーのモル量は、１～７０ｍｏｌ％、好ましくは５～６０ｍｏｌ％のような広い範囲で調整することができる。
好ましい形態では、両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、疎水性部分とを含む。
好ましい形態では、両親媒性ポリマーは、
ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、
ポリプロピレングリコール、又は芳香族モノマー（スチレンなど）若しくはＣ１～Ｃ１８アルキル（メタ）アクリレート（Ｃ１～４アルキル（メタ）アクリレートなど）をベースとする疎水性ポリマーから選択される疎水性部分とを含む。
別の好ましい形態では、両親媒性ポリマーは、
一方の末端に任意選択的にメチルエーテルを有し得る、ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、
スチレンをベースとする疎水性ポリマーから選択される疎水性部分と、マレイン酸から選択される更なるコモノマーとを含む。
別の好ましい形態では、両親媒性ポリマーは、一方の末端にメチルエーテルを有するポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、
スチレンをベースとする疎水性ポリマーから選択される疎水性部分と、マレイン酸から選択される更なるコモノマーとを含み、ポリエチレングリコールは、マレイン酸の一部に結合されている。
好ましい形態では、両親媒性ポリマーは、
ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、
Ｃ１～Ｃ１８アルキル（メタ）アクリレート（Ｃ１～４アルキル（メタ）アクリレートなど）をベースとする疎水性ポリマーから選択される疎水性部分と、任意選択的に（メタ）アクリル酸から選択される更なるコモノマーとを含む。
好ましい形態では、両親媒性ポリマーは、
ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、
Ｃ１～４アルキル（メタ）アクリレートをベースとする疎水性ポリマーから選択される疎水性部分と、（メタ）アクリル酸から選択される更なるコモノマーとを含み、ポリエチレングリコールは、（メタ）アクリル酸の部分に結合されている。
別の好ましい形態では、両親媒性ポリマーは、
ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、
ポリプロピレングリコールから選択される疎水性部分とを含み、
両親媒性ポリマーは、ジブロックポリマー又はトリブロックポリマーであってよい。
両親媒性ポリマーは、５０００～５００．０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは１０．０００～１００．０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有し得る。分子量は、ゲル透過クロマトグラフィーによって測定することができる。
本発明はまた、本発明のポリマーコンジュゲートでコーティングされた基材から構成される細胞接着表面を提供する。本明細書に示されるように、このような表面により、有利なことに、コーティング基材に接着する動物の真核細胞培養物を調製することが可能になり、この培養物は表現型的に健康なものである。このコーティング表面は、下記で説明するように、完全に合成された毒素及び動物質を含まない化合物から極めて容易に調製することができるということが特に有利である。特に、本発明による細胞接着表面は、有利なことに、支持細胞層が存在しないか、又は分化阻害剤を添加しない場合であっても、幹細胞を未分化形態に維持するのに役立つ。
一般に、表面全体又は表面の部分は、ポリマーコンジュゲートの吸着層から構成される。好ましくは、通常の操作条件下で生体物質（例えば、細胞）と通常接触する表面の少なくとも一部が、ポリマーコンジュゲートの吸着層から構成される。ポリマーコンジュゲートの層は表面に吸着されるが、この吸着とは、通常、ポリマーコンジュゲートと表面との間に共有化学結合が存在しないことを意味する。「吸着される」という用語は、通常、物理吸着を指すものであり、化学吸着を指すものではない。
好ましくは、表面は、ポリマーコンジュゲート以外の他の吸着ポリマーコンジュゲートを含まない。好ましくは、表面は、ポリマーコンジュゲートの吸着層以外の他の層（例えば、吸着層又は共有結合層）を含まない。
吸着層は、少なくとも１つのポリマーコンジュゲート、例えば、１つ、２つ又は３つの異なるポリマーコンジュゲートを含んでもよい。好ましくは、吸着層は、ポリマーコンジュゲートからなるものである。一形態では、吸着層は、ポリマーコンジュゲート以外の他のポリマーコンジュゲートを含まない。別の形態では、吸着層は生体化合物、医薬品又は生物活性化合物を含まない。
細胞接着表面は、任意の生体適合性材料、例えば、細胞を増殖させることができる材料で作製することができる。例えば、表面は、ガラス、石英、シリコン、金属、金属酸化物又は有機ポリマーから少なくとも部分的に作製されている。
好適なガラスとしては、融解石英ガラス（フューズドシリカとも呼ばれる）、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、鉛ガラス、アルミノケイ酸ガラス、ガラスセラミック及びガラス繊維であってよい。好ましい材料は、融解石英ガラス及びソーダ石灰ガラスである。
別の形態では、表面は、有機ポリマー、例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、親水化ポリスチレン、ポリアミド、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリエステル、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンなど）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、フッ素化又は部分フッ素化ポリオレフィン（フッ素化ポリエチレン又はポリプロピレンなど）、ポリオレフィン［ポリエチレンなど（低密度ポリエチレン、超低密度ポリエチレン、線状低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、高分子量ポリエチレン、超高分子量ポリエチレンなど）、ポリプロピレン（配向ポリプロピレン、二軸配向ポリプロピレンなど）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ：ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｅｆｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒ、ポリノルボルネンなど）又は環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ：ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｅｆｉｎ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、エチレンとノルボルネンとのコポリマーなど）］から少なくとも部分的に作製されている。
別の形態では、表面は、ポリスチレン又は親水化ポリスチレンから少なくとも部分的に作製されている。
「表面が材料から少なくとも部分的に作製されている」という用語は、通常、表面の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９５％が、その材料から作製されていることを意味する。通常、表面とは、通常の操作条件下で生体物質（例えば、細胞）と一般に接触する装置の表面の部分を指す。一形態では、表面の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９５％が、ガラスから作製されている。
同様に、本発明はまた、本発明による細胞接着表面から構成される細胞接着装置を提供する。細胞接着装置により、特に真核細胞培養環境で、本発明のポリマーコンジュゲートによって付与される利点を実現することが可能となる。
従って、本発明の細胞接着装置は、好ましくは、真核細胞を培養するための細胞培養装置である。好ましくは、細胞培養装置は、
－ ３次元細胞培養装置であって、好ましくは足場、
－ ２次元細胞培養装置であって、好ましくはバッグ、バイオリアクター、ボトル、キャリアビーズ、細胞培養皿、フィルム、フラスコ、顕微鏡スライド、マルチウェルプレート、ペトリ皿、遊走膜、灌流膜、プレート、パウチ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織スライド、チューブ、
－ マイクロ流体装置であって、好ましくはチューブ又はリアクター、
－ バイオセンサー、
－ 埋め込み型医療装置であって、好ましくは内部人工器官装置、特に好ましくは人工椎間板、人工内耳、除細動器、歯科インプラント、関節置換装置、人工関節シャフト、ペースメーカー、脊椎ロッド、脊椎スクリュー、ステント、外科用ピン、外科用プレート、外科用ロッド、外科用ワイヤ、外科用スクリュー又は縫合糸のいずれかである。
このような装置において、真核細胞は、特に良好に装置の細胞接着表面（複数可）に接着することができる。播種された細胞は、細胞の生存に好適な条件下で好適な培養培地にさらされると、このような表面にコロニーを形成して繁殖することができ、それによって細胞の培養、特に未分化の幹細胞の増殖が促進される。
細胞接着装置は、細胞を培養するための装置であってよく、例えば、細胞を培養する、又はそのような細胞を取り扱うのに好適な任意の装置であってよい。別の形態では、例えば、装置は、そのような細胞の取り扱いを含む、細胞を培養するのに好適な任意の装置であってよい。特定の「細胞培養」装置に関する本明細書における言及は、対応する組織培養装置、例えば、組織培養容器も意味するものと理解される。
細胞を培養するための装置の例としては、細胞培養フラスコ、細胞培養皿、細胞培養プレート（例えば、マルチウェルプレート又はマイクロウェルプレート）、細胞培養バッグ、ローラーボトル及びリアクター（例えば、バイオリアクター）が挙げられる。
液体を含有する細胞培養物を取り扱うのに好適な、細胞を培養するための装置の更なる例としては、チューブ、プローブ、バイアル、ボトル、ピペット及びピペットチップ、シリンジ、顕微鏡スライド、マイクロ流体装置、ガラスキャピラリー、バイオチップ、ＳｉＯ２ウェーバー（ＳｉＯ２ ｗａｖｅｒ）又はＳｉＯ２アレイが挙げられる。
好ましい形態では、細胞を培養するための装置は、細胞培養フラスコ、細胞培養皿、細胞培養プレート、細胞培養バッグ、リアクター、チューブ、プローブ、バイアル、ボトル、ピペット、ピペットチップ、シリンジ、顕微鏡スライド、マイクロ流体装置、ガラスキャピラリー、バイオチップ、ＳｉＯ２ウェーバー（ＳｉＯ２ ｗａｖｅｒ）又はＳｉＯ２アレイから選択される。
別の好ましい形態では、細胞を培養するための装置は、細胞培養フラスコ、細胞培養皿、バイオリアクター、試験管、バイアル、ボトル、ピペット、シリンジ、顕微鏡スライド、マイクロ流体装置、ガラスキャピラリー、バイオチップ、ＳｉＯ２ウェーバー（ＳｉＯ２ ｗａｖｅｒ）又はＳｉＯ２アレイから選択される。
細胞を培養するための装置は、実験室スケールの装置、半工業的サイズの装置、又は工業的サイズの装置であってよい。バイオリアクターなどのリアクターの典型的な工業的サイズは、例えば３ｌ、５０～２００ｌ、１０００～２０００ｌである。細胞培養プレートのウェルの典型的なサイズは、０．００１～１０ｍｌである。
本発明によれば、ポリマーコンジュゲートは、
ｉ）両親媒性コポリマーを提供するステップであって、両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、疎水性部分とを含むステップと、
ｉｉ）前記コポリマーにペプチドをコンジュゲートするステップであって、ペプチドは、少なくとも２つの異なるインテグリン結合ペプチドと、少なくとも１つの正電荷ペプチドとを含むか、本質的になるか、又はこれらからなり、好ましくは３つのペプチドは、線状インテグリン結合ペプチドと、環状インテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとからなる群から選択されるステップとを含む方法によって調製される。
好ましいペプチド及びこれらの特に好ましい組み合わせを選択するためのガイドラインは、上記で説明されている。本発明のポリマーコンジュゲートは、細胞接着表面が必要となる時点で基本的に調製することができることが特に有利である。有利なことに、このことは、コポリマーとペプチドとをあらかじめ別々に調製し、通常の保存条件下（暗所にて４℃）で保存することができるため、本発明によって実行可能となる。更に、このポリマーコンジュゲートの調製には、例えば、表面プラズマ処理用の専用設備を必要としない。その代わりとして、コンジュゲーション反応のみで十分となる。
従って、本発明はまた、本発明の細胞接着表面又は細胞接着装置を調製する方法であって、
ｉ）両親媒性コポリマーを提供するステップであって、両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、疎水性部分とを含むステップと、
ｉｉ）前記コポリマーにペプチドをコンジュゲートするステップであって、ペプチドは、２つの異なるインテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとを含む少なくとも３つのペプチドを含むか、本質的になるか、又はこれらからなり、好ましくは線状インテグリン結合ペプチドと、環状インテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとからなる群から選択されるステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）の前、その間、又はその後に、コポリマーで基材をコーティングするステップとを含む方法を提供する。
この場合もやはり、好ましいペプチド及びこれらの特に好ましい組み合わせを選択するためのガイドラインは、上記で説明されている。特に、ペプチドの好ましい濃度、環状インテグリン結合ペプチド：線状インテグリン結合ペプチド：正電荷ペプチドの比率、及び表面密度は、上記で説明されている。
コンジュゲーションステップは、コポリマーで基材をコーティングする前、その間、又はその後に実行することができる。従って、この方法は、有利なことに、細胞接着表面及び細胞接着装置、特に細胞培養装置を製造する際に高い自由度をもたらす。
一実施形態では、コンジュゲーションは、表面のコーティングの後に行われる。従って、最初にポリマーに基材をさらし、基材上にポリマーコーティングを調製する。次いで、ペプチドを順次、続けざまに（即ち、コンジュゲーションが終了する前に）、又はより好ましくは同時に添加して、ペプチドをコーティングポリマーにコンジュゲートさせる。基材上の目的の領域を覆うのに必要とされるほどの量のポリマーを使用すればよいということが、本方法の特に有利な点である。次いで、少なくとも１つ、好ましくはすべてのペプチドを、所望の程度のコンジュゲーションを達成する量で添加することができる。好ましくは、ペプチドは、本発明による好ましい比率で、ペプチドを含有する既製の組成物中で提供される。ペプチド組成物は、基材に結合されたポリマーの完全なるコンジュゲーションを達成するために、過剰に適用されるのが好ましい。次いで、コンジュゲーション後にあらゆる過剰なペプチド組成物を取り除くことができる。上記の好ましい変形形態で説明されるように、コンジュゲーション用の追加の化学物質を必要とせずにペプチドをポリマーにコンジュゲートすることができることは、特に有利である。従って、過剰なペプチド組成物をコポリマーでコーティングされた別の表面に移して、別の細胞接着表面及び／又は細胞接着装置を調製することが可能となる。従って、細胞接着表面及び細胞接着装置の調製には、コポリマー用保存容器又はペプチド用保存容器のいずれかの、その時点で開封された保存容器が１つだけ必要となることが好ましい。このことは、このような細胞接着表面及び／又は細胞接着装置をクリーンベンチ又はクリーンルーム環境で調製する場合に特に有利である。なぜならば、取り扱い効率が向上し、保存容器の内容物が不用意にこぼれたり、移動したり、又は汚染されたりするリスクが減少するためである。
別の実施形態では、コンジュゲーションは、表面のコーティング中に行われる。従って、ポリマーと、１つ、２つ又はすべてのペプチドが、同時に、又は続けざまに添加される。特に、１つの細胞培養装置内でコポリマーとペプチドのコンジュゲーション混合物を調製し、できるだけ多くのコンジュゲートされなかった又は部分的にコンジュゲートされたコンジュゲーション混合物を、装置の所望の細胞接着表面を調製するのに必要とされる、１つ以上の更なる細胞培養装置に移すことができる。本明細書に記載されるように、コンジュゲートされたポリマーによって基材をコーティングすることができるということは、本発明の更なる利点である。従って、コンジュゲーション反応の完全性を鑑みて、特定の注意は必要とされない。その代わりとして、コポリマーとペプチドの混合物を基材上に残して、第１の細胞接着表面でポリマーコンジュゲートを形成することができるが、余剰なそのような混合物は、コンジュゲートされなかった、部分的にコンジュゲートされた、又は完全にコンジュゲートされた形態で、第２の細胞接着表面を調製するために移される。
従って、一実施形態では、コンジュゲーションは、表面のコーティングの前に行われる。次いで、本発明のコンジュゲートされたポリマーに基材をさらす。特定の理論に束縛されるものではないが、ポリマーコンジュゲートは表面に結合しており、細胞が存在する場合に、コンジュゲートされたペプチドがそのような細胞にさらされると考えられる。
本発明はまた、副腎髄質細胞、血液細胞、骨髄細胞、心筋細胞、筋細胞、内分泌細胞、表皮細胞、上皮細胞、腺細胞、腎細胞、肺細胞、神経細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脾臓細胞、幹細胞、胸腺細胞、変性細胞、例えば、腫瘍細胞、癌幹細胞、不死化細胞、及びこのような細胞、好ましくは幹細胞を含む混合物を培養するための細胞接着表面及び／又は細胞接着装置を調製するための、本発明のポリマーコンジュゲートの使用を教示するものである。本発明によって、このような多様な一連の真核細胞型の細胞培養を可能にするためのポリマーコンジュゲート及び対応する方法が提供されることは、特に有利である。
好ましくは、本発明のポリマーコンジュゲートは、幹細胞、好ましくは癌幹細胞、少能性幹細胞又は多能性幹細胞、より好ましくは人工多能性幹細胞、より好ましくはヒト人工多能性幹細胞を培養するための細胞接着表面及び／又は細胞接着装置を調製するために使用される。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、タンパク質及び核酸の組み合わせを発現するか、又は発現を誘導することで体細胞を初期化することによって生成される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生児、新生児、未成年、又は成人の体細胞を使用して生成することができる。これらの細胞は、非多能性幹細胞、例えば造血幹細胞、又は組織型細胞に分化することができる。本明細書に記載されるように、幹細胞、特に人工多能性幹細胞は、未分化の状態で、標準的な細胞培養装置内に支持細胞層が存在しないか、又は分化阻害物質を添加しない場合に、標準的な細胞培養技術を使用して繁殖（「増殖」とも呼ばれる）させることができることが特に有利である。
従って、本発明は、本発明によるポリマーコンジュゲート、細胞接着表面、又は細胞接着装置と、真核細胞、好ましくは動物細胞を接触させることを含む、真核細胞の培養方法を提供する。
上述した利点に鑑み、本発明によるこのような培養方法における細胞は、副腎髄質細胞、血液細胞、骨髄細胞、心筋細胞、内分泌細胞、表皮細胞、上皮細胞、腺細胞、腎細胞、肺細胞、神経細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脾臓細胞、幹細胞、胸腺細胞、変性細胞（非限定的な例としては、腫瘍細胞、不死化細胞及び癌幹細胞がある）、並びにこのような細胞、好ましくは幹細胞を含む混合物からなる群から選択されることが好ましい。幹細胞の中で特に好ましいのは、癌幹細胞、少能性幹細胞又は多能性幹細胞、より好ましくは人工多能性幹細胞、より好ましくはヒト人工多能性幹細胞である。
本発明の培養方法は、細胞培養物を継代することを含むことが更に好ましい。このような継代は、便宜的に、ポリマーコンジュゲートから前記細胞を遊離させ、この細胞を本発明の別の細胞接着表面又は細胞接着装置に継代することを含む。必要となるそれぞれ２つの細胞接着表面又は細胞接着装置を提供する以外には、継代のために更なる留意事項は必要とされない。従って、本発明のポリマーコンジュゲートを適用することにより、当該技術分野で公知の標準的で確立された継代技術を使用して、本明細書に記載されるような未分化の幹細胞又は他の細胞の継代が可能となる。
有利なことに、本発明は、培養細胞に細胞分化開始剤を添加することによって細胞分化を開始させることができる。この分化開始剤は、可溶性の分化開始剤であることが好ましい。分化開始剤により、好ましくは、幹細胞を内胚葉、中胚葉及び／又は外胚葉のいずれかの前駆細胞に分化させることが可能であり、次に、この前駆細胞を、以下を含むがこれらに限定されない所望の細胞型に更に分化させることができる：
－ 心筋細胞（バラフカン（Ｂａｌａｆｋａｎ）ら著、「９６ウェルマイクロプレート内でヒト人工多能性幹細胞を機能的な心筋細胞に分化させる方法（Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ９６－ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）」、サイエンティフィック・レポート（Ｓｃｉ Ｒｅｐ）、１０巻、ｐ．１８４９８（２０２０年）、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－７３６５６－２に例示的に記載されている）、
－ 神経細胞（チャンバース（Ｃｈａｍｂｅｒｓ）ら著、「ＳＭＡＤシグナル伝達の二重阻害によるヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の高効率の神経変換（Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｎｅｕｒａｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＥＳ ａｎｄ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｄｕａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＳＭＡＤ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）」、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、２７巻、ｐ．２７５－２８０（２００９年）、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｂｔ．１５２９に例示的に記載されている）、
－ アストロサイト（シャルトウキ（Ｓｈａｌｔｏｕｋｉ）ら著、「定義された条件におけるアストロサイトのヒト多能性幹細胞からの効率的な生成（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、ステム・セルズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）、２０１３年５月；３１（５）巻：ｐ．９４１－５２、ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１３３４）、
－ 肝細胞様細胞（シー・タイエブ（Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ）ら著、「ヒト肝細胞様細胞の人工多能性幹細胞からの高効率の生成（Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」、ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０１０年１月；５１（１）巻：ｐ．２９７－３０５、ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２３３５４に例示的に記載されている）、
－ 成熟膵臓インスリン産生細胞（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、「ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の成熟膵臓インスリン産生細胞への高効率の分化（Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｍａｔｕｒｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）」、セル・リサーチ（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ）、１９巻、ｐ．４２９－４３８（２００９年）、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｃｒ．２００９．２８に例示的に記載されている）。
多能性幹細胞を少なくとも５継代、より好ましくは８～４０継代、より好ましくは１０～２５継代の間、多能性状態に維持するために、本発明のポリマーコンジュゲートを使用することができることは、本発明の特に有利な点である。更に、少能性幹細胞では、少なくとも５継代、より好ましくは８～４０継代、より好ましくは１０～２５継代の間、少能性状態に維持することができる。従来では、培養中に幹細胞培養物の自発的な望ましくない分化を防止するために細心の注意を払う必要があった。このため、研究又は他の用途のための少能性幹細胞又は多能性幹細胞の利用可能性は著しく制限されていた。その理由は、採取した幹細胞を容易に増殖させることができなかったためである。しかしながら、本発明により、幹細胞培養物に支持細胞の存在又は分化阻害剤の添加を必要とすることなく、自発的な幹細胞の分化のリスクが大幅に低減される。
本明細書に記載される材料、方法及び使用を、以下の実施例で更に説明するが、これらは例示として提供されており、限定することを意図するものではない。示された構成要素の要素の割合における変形形態及び代替形態は、当業者には明らかであり、開示される形態の範囲内であることが理解されよう。
実施例１－両親媒性ポリマーの調製
メチルポリエチレングリコール（平均モル質量５００ｇ／ｍｏｌ）３７１．４ｇ、無水マレイン酸７６．９ｇ及び４－メトキシフェノール３．９ｇを、窒素下、１３０ｒｐｍで撹拌した。反応混合物を９０℃まで加熱し、更に１０分間撹拌した。スチレン８０ｇを４時間かけて添加した。同時に、メチルポリエチレングリコール２８．４ｇ中のｔｅｒｔ－ブチルペルオキシ－２－エチルヘキサノエート５．６ｇを、５時間かけて添加した。その後、９０℃で更に１時間撹拌を続けた。続いて、反応混合物を１３５℃まで加熱して、３時間撹拌した。反応混合物を１００℃まで冷却し、脱塩水２３９ｇを添加した。水蒸気蒸留を１時間にわたって行った。反応混合物を７５℃まで冷却し、脱塩水４６．９ｇ中の５％過酸化水素溶液９．１ｇを添加した。反応混合物を７５°Ｃで３０分間撹拌し、続いて周囲温度まで冷却した。４０％水酸化ナトリウム溶液９６ｇで反応混合物のｐＨを８．５に調製した。反応物を４０°Ｃで更に２時間撹拌し、周囲温度まで冷却して凍結乾燥した。
実施例２：リンカーの添加
溶液Ａを調製するために、実施例１の凍結乾燥生成物１０００ｍｇをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）９０００ｍｇに溶解させ、この溶液を４℃に冷却した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド３９０７ｍｇを添加し、反応混合物を４℃で１時間撹拌した。その後、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩２２１３ｍｇを添加し、４℃で１時間撹拌を続けた。溶液Ｂを調製するために、アミノエチルマレイミド１２９５ｍｇをＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）４５００ｍｇに溶解させ、４℃まで冷却した。溶液Ａと溶液Ｂを４℃で混合し、周囲温度まで温めながら１６時間撹拌した。
以下のように粗生成物を精製した：４ｋＤの限外濾過膜（ＵＨ００４、マイクロダイン・ナディール社（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ－Ｎａｄｉｒ）、ドイツ、ヴィースバーデン）を装着した撹拌式（５００ｒｐｍ）ステンレス鋼セル（ＨＰ７４５０、スターリテック社（Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ）、米国）内で、限外濾過を周囲温度で行った。固形分３８．４％を含むマレイミド化後のＦ３１０Ａ水溶液を、最終容量が７０ｍｌとなるように脱塩水（ｐＨ４、ＨＣｌで調整）で希釈した。このポリマー溶液を、脱塩水（ｐＨ４、ＨＣｌで調整）を用いて、８バールの圧力下、透析濾過係数７で透析濾過した。限外濾過後、この試料を凍結乾燥した。
実施例３－ペプチドコンジュゲーション
以下の例に記載されるようにペプチド－ポリマーコンジュゲートを合成した：０．００３４ｍｍｏｌの量の実施例２（５８９６７ｇ／ｍｏｌ）からの生成物を、０．２ＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水に溶解させ、０．０６４ｍｍｏｌの量のペプチドＡｄ１ｃ（６００ｇ／ｍｏｌ）を、全体積が０．０１５ＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水（φｉ＝９０％）／ＤＭＳＯ（φｉ＝５％）混合物に溶解させ、０．０３２ｍｍｏｌの量のペプチドＡｄ１２（１７９０ｇ／ｍｏｌ）を、全体積が０．０４７ＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水（φｉ＝９０％）／ＤＭＳＯ（φｉ＝５％）混合物に溶解させ、０．００６４ｍｍｏｌの量のペプチドＰＰ３（２２４１ｇ／ｍｏｌ）を、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水０．００９５Ｌに溶解させた。ペプチド溶液を混合し、Ｆ３１０Ａの溶液に添加した。添加量０．００１ＬのＤＭＳＯを反応混合物に添加し、反応混合物のｐＨ値を７．５に調整した。反応混合物を２０℃で２時間撹拌し、１ＭのＮａＣｌに対する透析（ＭＷＣＯ＝２５ｋＤａ）を３回、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水に対する透析を３回行うことによって精製し、その後凍結乾燥した。
実施例４：
異なるポリマー－ペプチド（Ａｄ１又はＡｄ１２）コンジュゲート上で人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を培養するために、６ウェルプレート（非組織培養処理プレート、グレイナー社（Ｇｒｅｉｎｅｒ）、ドイツ）をポリマー－ペプチドコンジュゲートでコーティングした。この目的のために、実施例２に記載されるようなリンカーを含む実施例１のポリマーをＰＢＳ（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解させ、この溶液１ｍｌを６ウェルプレートのウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。その後、ポリマー溶液を１ｍｌピペットでピペット操作することで除去し、ウェルをｄＨ２Ｏで１回洗浄した。ペプチドＡｄ１及びＡｄ１２（０．６７ｍＭ）（Ａｄ１が０．９９ｍｇ／ｍｌ、Ａｄ１２が１．７９ｍｇ／ｍｌ；カスロ社（Ｃａｓｌｏ）、デンマーク）を１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むｄＨ２Ｏ中に希釈した。このペプチド溶液１ｍｌをポリマー処理ウェルプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。その後、ウェルをｄＨ２Ｏで３回洗浄した。対照として、６ウェルの組織培養処理プレート（ＴＰＰ社、ドイツ）を、コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のマトリゲル、ｈＥＳＣ最適化マトリックス（マトリゲル、コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ドイツ）でコーティングした。製造業者の指示に従って、マトリゲルをＤＭＥＭ－Ｆ１２中に希釈した（バッチ間で変動）。希釈したマトリゲル１ｍｌをピペット操作でウェルに入れ、室温で１時間インキュベートした。溶液を除去した後、マトリゲルのウェルと同様、ポリマー－ペプチドコンジュゲートで処理したウェルに１ｍｌのｍＴｅＳＲ１（商標）培地（ステム・セル・テクノロジーズ社（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ドイツ）を充填し、ｉＰＳＣを播種した。細胞の播種には、ＣＲＴＤ３ ｉＰＳＣを使用した。これらの細胞は、健康なドナー由来の末梢血から単離したヒトＣＤ３４＋細胞（ドレスデン工科大学再生医療センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， ＴＵ Ｄｒｅｓｄｅｎ）、ドレスデン）から初期化したものであった。３７℃及び５％ＣＯ２のｍＴｅＳＲ１（商標）培地中のマトリゲル上で、ｉＰＳＣを標準培養下で培養した。細胞をコロニー内で増殖させ、８０％のコンフルエンシーとなった時点でｉＰＳＣを１：６の比率で分割し、プレコーティングしたウェルに播種した。細胞を剥離させるため、ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、その後、ＲｅＬｅＳＲ継代試薬（ステム・セル・テクノロジーズ社（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））と３分間インキュベートした。３０秒後、ＲｅＬｅＳＲ継代試薬を除去し、細胞を３７℃でインキュベートした。その後、細胞を１ｍｌのｍＴｅＳＲ１（商標）培地中に希釈し、（マトリゲル、ポリマー－ペプチドコンジュゲートを）プレコーティングした６ウェルプレートの各ウェルに、この懸濁液１６６．６μｌを添加した。プレートを３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。
これらの手法では、ポリマー－ペプチドコンジュゲート上にほんのわずかな接着したコロニーが見られた（図１）。Ａｄ１２上で培養されたｉＰＳＣでは、コロニーに穴があることが明らかとなった。この穴は分化の兆候である。更に、Ａｄ１上のｉＰＳＣは、その形態を変化させた扁平な接着細胞が示されており、多能性分析によって多能性マーカーであるＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１－６０及びＯＣＴ３／４の発現が明らかとなり、細胞が依然として多能性であることが示された。
実施例５：
異なるポリマー－ペプチド（ＰＰ１、ＰＰ３、ＰＰ５、ＰＰ６、ＰＰ７、及びＡｄ１／ＰＰ２、Ａｄ１／ＰＰ３、Ａｄ１／ＰＰ４、Ａｄ１２／ＰＰ２、Ａｄ１２／ＰＰ３、Ａｄ１２／ＰＰ４、Ａｄ１／Ａｄ１２／ＰＰ３の組み合わせ）コンジュゲート上でｉＰＳＣを培養するために、６ウェルプレートをポリマー－ペプチドコンジュゲートでコーティングした。実施例４に記載されているようにコーティングを行った。ペプチドの組み合わせは、以下の比率で混合したものであった：Ａｄ１／ＰＰ２、Ａｄ１／ＰＰ３、Ａｄ１／ＰＰ４、Ａｄ１２／ＰＰ２、Ａｄ１２／ＰＰ３及びＡｄ１２／ＰＰ４を別々にＨ２Ｏ中に希釈し、１：１の比率で混合した。Ａｄ１／Ａｄ１２／ＰＰ３を組み合わせたペプチドも別々にＨ２Ｏ中に希釈し、１（Ａｄ１）：１（Ａｄ１２）：０．２（ＰＰ３）のモル比で混合した。対照として、１つのウェルを実施例４に従ってマトリゲルでコーティングした。実施例４に記載されるように、コーティングした６ウェルプレート中に細胞を播種した。
ＰＰ１、ＰＰ５、ＰＰ６、ＰＰ７を単独で添加したものは、細胞が接着することができず、１日後に小さなコロニーによってｉＰＳＣの拡散が示された（図２Ａ）。細胞接着は、ＰＰ３－コンジュゲート上で改善されており、細胞が拡散し、大きな細胞のコロニーが示された。更に、ＰＰの濃度が高いと、細胞が接着することが明らかとなったが、細胞分割のための細胞遊離は不可能であった。Ａｄ１をＰＰ２、ＰＰ３又はＰＰ４と組み合わせると、コロニー形成が改善されたが、細胞の拡散はマトリゲルに匹敵するものではなかった（図２Ｂ）。Ａｄ１２と組み合わせたＰＰ３は、マトリゲルに匹敵する細胞接着及び細胞の拡散を目に見えて裏付けるものであった。それにもかかわらず、細胞は最大で継代１しか増殖することができなかった。対照的に、Ａｄ１、Ａｄ１２及びＰＰ３を組み合わせると、未分化のｉＰＳＣの増殖は更に継代２まで可能となった。記載されたペプチドの組み合わせである、ＰＰ１、ＰＰ３、ＰＰ５、ＰＰ６、ＰＰ７及びＡｄ１／ＰＰ２、Ａｄ１／ＰＰ３、Ａｄ１／ＰＰ４、Ａｄ１２／ＰＰ２、Ａｄ１２／ＰＰ３、Ａｄ１２／ＰＰ４、Ａｄ１／Ａｄ１２／ＰＰ３では、ｉＰＳＣの培養を維持することができなかった。
実施例６：
実施例５と比較して、Ａｄ１をＡｄ１ｃに置換した。実施例４に記載されるように、６ウェルプレートを処理した。ペプチドＡｄ１ｃ：Ａｄ１２：ＰＰ３を、実施例５に記載したＡｄ１：Ａｄ１２：ＰＰ３と同じように混合した：実施例４に記載のコーティングした６ウェルプレートに細胞を播種した。実施例４の手順に従い、コンフルエンシーが８０％に到達した時点で細胞を継代した。多能性マーカーを発現する細胞の定量をフローサイトメトリーで行った。細胞分析のために、２５０μｌのＰＢＳ中の７５０ ０００個の細胞を、１．２５μｌのＴｒａ－１－６０ ＦＩＴＣ（ＩｇＭ、メルク・ミリポア社（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ） ＣＳ２０４４６０）及び１．０μｌのＳＳＥＡ－４ ＰＥ（ＩｇＧ３、メルク・ミリポア社（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ） ＣＳ２０４４３８）と３０分間インキュベートした。対照として、細胞を適切なアイソタイプ対照：マウスＩｇＧ Ｋ１ ４８８（１μｌ、ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） ５５７７２１）及びマウスＩｇＧ３ ＰＥ（＋１μｌ、ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） ５５７７４９）で染色し、２つの試料をＴｒａ－１－６０ ＦＩＴＣ及びＳＳＥＡ－４ ＰＥ単独で染色した。ＰＢＳ中の５％ＦＢＳで試料を洗浄した後、細胞を固定してフローサイトメトリーで分析した。ＯＣＴ３／４及びＮａｎｏｇを細胞内染色するため、固定／透過処理緩衝液（Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍキット；ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） ５５４７１４）を使用することによって、製造業者の指示に従って細胞を固定して透過処理した。その後、５０μｌのＰＢＳ中の７５０ ０００個の細胞を、１．２５μｌのＮＡＮＯＧ－６４７（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） ５６１３００）及び１．２５μｌのＯＣＴ３／４－４８８（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） ５６０２５３）で染色し、対照として、それぞれ適切なアイソタイプ対照を含有する２つの別々の試料を調製した（１μｌのアイソタイプ対照であるＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）４８８（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） ５５７７２１）及び１μｌのアイソタイプ対照であるＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）６４７（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） ５５７７８３）。更に、２つの試料をＯＣＴ３／４又はＮａｎｏｇ単独で染色した。すべての試料を３０分間インキュベートし、ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に５％ＦＢＳを含む２５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。
実験により、ペプチドＡｄ１ｃ：Ａｄ１２：ＰＰ３の組み合わせを使用した場合に（１（Ａｄ１ｃ）：１（Ａｄ１２）：０．２（ＰＰ３）のモル比）、多くの継代にわたって細胞の接着及び増殖が著しく改善されることが明らかになった。最初の継代（Ｐ１、図４）の後、細胞は適切に接着し、扁平な接着細胞体を有する長い細胞突起によって特徴付けられる最低限の分化を示した。分化した大きな接着細胞は、掻き取って除去した。Ｐ３では、細胞の形態はマトリゲル上で培養された細胞と同等であり、細胞は大きく密集したコロニー内で増殖した。Ｐ２０までは、大きなコロニー内に、境界が明瞭でほとんど分化していない細胞の巨大なコンフルエント領域（長い突起と大きな細胞質とを有する大きな接着細胞）が見られた。細胞分化の増加はＰ２１から続いて見られた。
Ｐ１２における細胞の多能性を免疫染色によって検査すると、細胞表面マーカーであるＯｃｔ３／４（多能性マーカー）が高発現していたことが明らかとなった（データは示さず）。ＩＰＳＣの典型的な顕著な特徴である小核と細胞質の比率は、ポリマー－ペプチドコンジュゲート上で培養したＩＰＳＣで見られた。更に、フローサイトメトリー測定では、Ｔｒａ １－６０及びＳＳＥＡ４のダブルポジティブ細胞の割合が高いことが示され（８６％）、これはマトリゲル上で培養した細胞に匹敵するものであった（８７．５％）（図４Ａ／Ｂ）。ポリマー－ペプチドコンジュゲート上でＩＰＳＣを２１回継代した後では、９７．５％の細胞がＯｃｔ３／４＋及びＮａｎｏｇ＋となり、ＩＰＳＣの多能性が証明された（図４Ｃ）。これらの結果により、幹細胞の維持及び高継代に至るｉＰＳＣの増殖において、非合成のマトリゲルに匹敵する新規合成ポリマーを検証することができた。
Ａｄ１ｃ：Ａｄ１２：ＰＰ３コンジュゲートを用いた培養の再現性を証明するために、本発明者らは別の系列を再び開始し、この細胞を１２回継代した後にフローサイトメトリー分析によって分析した。細胞増殖は上記に記載された結果と同様であった：細胞接着及び増殖は良好であり、分化の兆候はごくわずかしか観察することができず、すべての細胞は容易に剥離することができた。詳細な分析により、このコーティングでは９６．２％のダブルポジティブなＯＣＴ３／４＋／ＮＡＮＯＧ＋細胞及び９４．９％のダブルポジティブなＴＲＡ－１－６０＋／ＳＳＥＡ４細胞＋となることが明らかとなったことが示された。これらの結果は、それぞれ９８．７％のＯＣＴ３／４＋／ＮＡＮＯＧ＋細胞及び９５．７％のＴＲＡ－１－６０＋／ＳＳＥＡ４細胞であるマトリゲルと同様であった。これらの結果は、培養及びコーティング手順の再現性、並びにＦ３１０－ペプチドコンジュゲートの安定性を確証するものである。

Claims (17)

  1. 両親媒性ポリマーと、そこにコンジュゲートされたペプチドの組とを含む、細胞接着ポリマーコンジュゲートであって、
    前記ペプチドは、好ましくは、
    ａ）環状インテグリン結合ペプチドと、
    ｂ）線状インテグリン結合ペプチドと、
    ｃ）正電荷ペプチドと、からなる群から選択される、２つの異なるインテグリン結合ペプチド及び正電荷ペプチドから構成された、少なくとも３つのペプチドを含むか、本質的になるか、又はこれらからなり、
    前記ポリマーは、疎水性部分と、前記ペプチドがコンジュゲートするための連結部分とを含む、ポリマーコンジュゲート。
  2. 請求項１に記載のポリマーコンジュゲートであって、
    ｉ）前記線状若しくは環状インテグリン結合ペプチドは、ｃ（ｐｈｇ－イソＤＧＲＸ）、ｃ（ＲＧＤｆＣ）、ｃ（ＲＧＤｆＫ）、ｃ（ＲＧＤｆＶ）、ｃ（ＲＧＤｙＫ）、ＧＲＧＤＮＰ、ＧＲＧＤＴＰ、ＲＴＤＬＤＳＬＲＴ、（Ｇａ）ＮＯＰＯ＊－ｃ（ＲＧＤｆＫ）、４４ｂ、Ａ２０ＦＭＤＶ２、ＡＴＮ１６１、ｃ（ＦＲＧＤＬＡＦｐ（ＮＭｅ）Ｋ）、シレンギチド、エキスタチン、エプチフィバチド、Ｆ－ガラクト－ｃ（ＲＧＤｆＫ）、フルシラチド、ＧＲ１４４０５３、ＪＳＭ６４２７、Ｍｏ／１１＊、ＮＣ１００７１７、ＲＧＤ－４Ｃ、ＲＧＤ１０、ｓｎ２４３、チロフィバン、ＲＧＤＳ、ＲＧＤＴ、ＲＧＤＶ、ＧＲＧＤ、ＧＲＧＤＧ、ＧＲＧＤＦ、ＧＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＹ、ＹＲＧＤＧ、ＹＲＧＤＳ、ＹＧＲＧＤ、ＲＧＤＳＧ、ＲＧＤＳＰ、ＲＧＤＳＹ、ＲＧＤＶＹ、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＤＳＧ、ＧＲＧＤＳＹ、ＧＲＧＤＶＹ、ＧＲＧＤＳＰＫ、ＣＧＲＧＤＳＰＫ、ＣＧＲＧＤＳＹ、ＲＧＤｆＫ、ＹＡＶＴＧＲＧＤＳ、ＣＧＧＮＧＥＰＲＧＤＹＲＡＹ、ＧＣＧＹＧＲＧＤＳＰＧ、ＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ、ＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＧ、ＣＷＧＧＲＧＤＳ、ＣＷＧＧＲＧＤＴ、ＣＷＧＧＲＧＤＶ、ＣＷＧＧＲＧＤＳＧ、ＣＷＧＧＲＧＤＳＹ、ＣＷＧＧＲＧＤＶＹ、Ａｄ１、Ａｄ１ｃ、Ａｄ１２、Ａｄ２１及びＡｄ２２、
    好ましくは線状若しくは環状ＲＧＤペプチド、
    更により好ましくはＡｄ１ｃ及びＡｄ１２からなる群から選択される、線状若しくは環状ペプチドから選択されるペプチドを含むか、本質的になるか、若しくはこれらからなり、並びに／又は、
    ｉｉ）前記正電荷ペプチドは、ＰＰ２、ＰＰ３及びＰＰ４から選択されるペプチドを含むか、本質的になるか、若しくはこれらからなり、並びに／又は、
    ｉｉｉ）ｉ）若しくはｉｉ）による前記ペプチドと最大で１アミノ酸差で異なるペプチドであって、各ペプチド内で少なくとも１つのＲＧＤモチーフが保存されている、ポリマーコンジュゲート。
  3. ａ）：ｂ）：ｃ）による前記ペプチドの比率が、（０．５～４）：１：（０．０１～１）、より好ましくは（０．７～３）：１：（０．０８～０．８）、より好ましくは（１．５～２．５）：１：（０．１～０．４）である、請求項１～２のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  4. 前記両親媒性ポリマーが、ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、疎水性部分とを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  5. 前記親水性部分が、Ｃ３～Ｃ１２アルキレンオキシドをベースとするポリアルキレングリコール、又は疎水性モノマーをベースとする疎水性ポリマーから構成される、請求項４に記載のポリマーコンジュゲート。
  6. 前記疎水性モノマーが、芳香族モノマー及びＣ１～Ｃ１８アルキル（メタ）アクリレートである、請求項５に記載のポリマーコンジュゲート。
  7. 前記両親媒性ポリマーが、５０００～５００，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲートでコーティングされた基材を含む、細胞接着表面。
  9. 請求項８に記載の細胞接着表面から構成される、細胞接着装置。
  10. 請求項１～７のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲートを調製する方法であって、
    ｉ）コポリマーを提供するステップであって、前記両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、疎水性部分とを含むステップと、
    ｉｉ）前記コポリマーにペプチドをコンジュゲートするステップであって、前記ペプチドは、少なくとも２つの異なるインテグリン結合ペプチドと、少なくとも１つの正電荷ペプチドとを含むか、本質的になるか、又はこれらからなり、好ましくは少なくとも３つのペプチドは、線状インテグリン結合ペプチドと、環状インテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとからなる群から選択されるステップとを含む方法。
  11. 請求項８に記載の細胞接着表面又は請求項９に記載の細胞接着装置を調製する方法であって、
    ｉ）コポリマーを提供するステップであって、前記両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコールから選択される親水性部分と、疎水性部分とを含むステップと、
    ｉｉ）前記コポリマーにペプチドをコンジュゲートするステップであって、前記ペプチドは、２つの異なるインテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとを含む少なくとも３つのペプチドを含むか、本質的になるか、又はこれらからなり、好ましくは線状インテグリン結合ペプチドと、環状インテグリン結合ペプチドと、正電荷ペプチドとからなる群から選択されるステップと、
    ｉｉｉ）ステップｉｉ）の前、その間、又はその後に、前記コポリマーで基材をコーティングするステップとを含む方法。
  12. 副腎髄質細胞、血液細胞、骨髄細胞、心筋細胞、筋細胞、内分泌細胞、表皮細胞、上皮細胞、腺細胞、腎細胞、肺細胞、神経細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脾臓細胞、幹細胞、胸腺細胞、変性細胞及びこのような細胞、好ましくは幹細胞を含む混合物の培養のための細胞接着表面及び／又は細胞接着装置の調製のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲートの使用。
  13. 真核細胞を、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲート、請求項８に記載の細胞接着表面又は請求項９に記載の細胞接着装置と接触させることを含む、真核細胞の培養方法。
  14. 前記細胞が、副腎髄質細胞、血液細胞、骨髄細胞、心筋細胞、筋細胞、内分泌細胞、表皮細胞、上皮細胞、腺細胞、腎細胞、肺細胞、神経細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脾臓細胞、幹細胞、胸腺細胞、変性細胞及びこのような細胞、好ましくは体細胞、少能性幹細胞又は多能性幹細胞を含む混合物からなる群から選択される、請求項１３に記載の培養方法。
  15. 前記ポリマーコンジュゲートから前記細胞を遊離させ、前記細胞を別の請求項８に記載の細胞接着表面又は請求項９に記載の細胞接着装置に継代するステップを更に含む、請求項１４に記載の培養方法。
  16. 細胞分化開始剤を適用するステップを更に含む、請求項１３又は１４に記載の培養方法。
  17. 好ましくは分化阻害剤の不在下で、幹細胞を少なくとも５継代、より好ましくは８～４０継代、より好ましくは１０～２５継代の間、多能性状態に維持するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲートの使用。
JP2023554017A 2021-03-05 2022-03-04 細胞接着材料、装置及びそれらの使用 Pending JP2024510578A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21161100.9 2021-03-05
EP21161100.9A EP4053163A1 (en) 2021-03-05 2021-03-05 Cell attachment materials, devices and uses thereof
EP21196941.5 2021-09-15
EP21196941 2021-09-15
PCT/EP2022/055562 WO2022184899A1 (en) 2021-03-05 2022-03-04 Cell attachment materials, devices and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024510578A true JP2024510578A (ja) 2024-03-08

Family

ID=80685348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023554017A Pending JP2024510578A (ja) 2021-03-05 2022-03-04 細胞接着材料、装置及びそれらの使用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240109979A1 (ja)
EP (1) EP4301788A1 (ja)
JP (1) JP2024510578A (ja)
WO (1) WO2022184899A1 (ja)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110183418A1 (en) * 2009-07-29 2011-07-28 Arthur Winston Martin Peptide-Polymer Cell Culture Articles and Methods of Making
JP5681285B2 (ja) * 2010-07-28 2015-03-04 コーニング インコーポレイテッド 細胞培養コーティングのためのプレポリマー調製品
WO2012027218A2 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Corning Incorporated Peptide-modified surfaces for cell culture
WO2012150475A1 (en) * 2011-05-05 2012-11-08 Corning Incorporated Synthetic composition and coating for cell culture.

Also Published As

Publication number Publication date
US20240109979A1 (en) 2024-04-04
WO2022184899A1 (en) 2022-09-09
EP4301788A1 (en) 2024-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Aisenbrey et al. Synthetic alternatives to Matrigel
Christoffersson et al. Fabrication of modular hyaluronan-PEG hydrogels to support 3D cultures of hepatocytes in a perfused liver-on-a-chip device
Derda et al. Defined substrates for human embryonic stem cell growth identified from surface arrays
JP5501981B2 (ja) 既知組成培地中で細胞を培養するための合成表面
Cai et al. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides
Higuchi et al. External stimulus-responsive biomaterials designed for the culture and differentiation of ES, iPS, and adult stem cells
KR20210069036A (ko) 3d 프린팅용 바이오 잉크
Deng et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on peptide-decorated poly (OEGMA-co-HEMA) brushes under fully defined conditions
WO2008039483A9 (en) Modified self-assembling peptides
Sarvi et al. Surface-functionalization of PDMS for potential micro-bioreactor and embryonic stem cell culture applications
Lin et al. Peptide modification of polyethersulfone surfaces to improve adipose-derived stem cell adhesion
US20110207216A1 (en) Synthetic Peptide (Meth) Acrylate Microcarriers
JP2007504823A (ja) 細胞の付着および増殖のための、共有結合によって付着したコラーゲンｖｉ
Utrata-Wesołek et al. Thermoresponsive polymer surfaces and their application in tissue engineering
Sung et al. Poly (vinyl alcohol-co-itaconic acid) hydrogels grafted with several designed peptides for human pluripotent stem cell culture and differentiation into cardiomyocytes
US8362144B2 (en) Monomers for making polymeric cell culture surface
Smith et al. Synthesis of an enzyme-mediated reversible cross-linked hydrogel for cell culture
US9546349B2 (en) Supports for cell culture and cell sheet detachment and methods for cell sheet detachment
JP2024510578A (ja) 細胞接着材料、装置及びそれらの使用
EP4053163A1 (en) Cell attachment materials, devices and uses thereof
CN117279955A (zh) 细胞附着材料、装置及其用途
JP2018201463A (ja) 幹細胞を調製するための方法およびキット
Paone et al. A 3D-printed blood-brain barrier model with tunable topology and cell-matrix interactions
Ziaee Engineering self-assembling peptide hydrogels for pluripotent stem cell and cardiac organoid culture
Jiabei et al. Protocols in stem cell culture