CN109735573A - 一种瞬时转染试剂及其应用方法 - Google Patents

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冷毅斌
吴亭
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Abstract

本发明提供一种瞬时转染试剂及其应用方法，包括2,4‑戊二醇二丙烯酸盐和聚乙烯亚胺，溶液pH为7.05。转染试剂成本低，转染效率极高，稳定性高，操作简便，适应宿主细胞范围广，培养基中抗生素对其转染效率没有影响。

Description

一种瞬时转染试剂及其应用方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种瞬时转染试剂及其应用方法。
背景技术
细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障，它保证了细胞内环境的相对稳定。也正是因为细胞膜的生物屏障作用阻止了许多生物大分子物质进入细胞内，从而很大程度地限制了这些物质在治疗领域的应用。因此，如何引导这些物质穿透细胞膜是一个迫切需要解决的问题。
基因转染是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内,并使核酸在细胞内维持其生物功能”。将基因导入真核细胞的方法有许多,归纳有生化方法转染、物理方法转染、以及病毒介导的转染。病毒介导的转染效率最高。
转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到宿主细胞内。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们的特点和病毒类似，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。
发明内容
本发明提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种瞬时转染试剂及其应用方法，转染试剂成本低，转染效率极高，稳定性高，操作简便，适应宿主细胞范围广，培养基中抗生素对其转染效率没有影响。
根据本发明实施例的第一个方面，提供一种瞬时转染试剂，包括2,4-戊二醇二丙烯酸盐和聚乙烯亚胺，溶液pH为7.05。
作为优选的，将支链PEI600和2,4-戊二醇二丙烯酸盐分别溶解到1.0mL无水DMSO中，充分混合并在室温反应6h；用0.5mol/L的HCl终止反应并调节pH值至4.5；将聚合物放置在HCl溶液(pH4.0)中，使用透析袋于4℃透析过夜，去除相对分子质量低于3000的化合物；将样品冻干备用；
将聚合物和质粒DNA分别用Opti MEM稀释，然后将聚合物逐滴加入等体积的质粒DNA稀释液中,充分振荡混匀；复合物在室温放置15min后，加入0.3％琼脂糖凝胶中，在TAE缓冲液中，以100V电泳30min；
将聚合物用pH7.3的PBS缓冲液稀释，终浓度为640μg/mL；将稀释液放置到37℃温箱分别保存1、2、4、8、12、18和24h；取20μg聚合物样品与适量的甘油混合后，加入1.0％的琼脂糖凝胶中，将样品端放置在电场正极，以100V电泳30min；进行蛋白染色，使用考马斯亮蓝对凝胶进行染色、脱色。
作为优选的，质粒DNA稀释液的终浓度为20μg/mL；TAE缓冲液包括40mmol/LTris-醋酸，1mmol/L EDTA，pH7.4。
一种如本发明实施例的第一个方面所述的瞬时转染试剂应用方法，包括：
将聚合物和质粒DNA分别用Opti MEM稀释，将聚合物的稀释液逐滴加入质粒DNA稀释液中，边加边振荡，使之充分混匀,室温放置15min；以15μL/孔的量将混合物加到培养板中、混匀，将细胞置于培养箱培养24h。
作为优选的，用于转染质粒包括pEGFP-N1和pCMV-Luc。
本发明提出一种瞬时转染试剂及其应用方法，包括2,4-戊二醇二丙烯酸盐和聚乙烯亚胺，溶液pH为7.05。转染试剂成本低，转染效率极高，稳定性高，操作简便，适应宿主细胞范围广，培养基中抗生素对其转染效率没有影响。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
根据本发明实施例的第一个方面，提供一种瞬时转染试剂，包括2,4-戊二醇二丙烯酸盐和聚乙烯亚胺，溶液pH为7.05。
作为优选的，将支链PEI600和2,4-戊二醇二丙烯酸盐分别溶解到1.0mL无水DMSO中，充分混合并在室温反应6h；用0.5mol/L的HCl终止反应并调节pH值至4.5；将聚合物放置在HCl溶液(pH4.0)中，使用透析袋于4℃透析过夜，去除相对分子质量低于3000的化合物；将样品冻干备用；
将聚合物和质粒DNA分别用Opti MEM稀释，然后将聚合物逐滴加入等体积的质粒DNA稀释液中,充分振荡混匀；复合物在室温放置15min后，加入0.3％琼脂糖凝胶中，在TAE缓冲液中，以100V电泳30min；
将聚合物用pH7.3的PBS缓冲液稀释，终浓度为640μg/mL；将稀释液放置到37℃温箱分别保存1、2、4、8、12、18和24h；取20μg聚合物样品与适量的甘油混合后，加入1.0％的琼脂糖凝胶中，将样品端放置在电场正极，以100V电泳30min；进行蛋白染色，使用考马斯亮蓝对凝胶进行染色、脱色。
作为优选的，质粒DNA稀释液的终浓度为20μg/mL；TAE缓冲液包括40mmol/LTris-醋酸，1mmol/L EDTA，pH7.4。
一种如本发明实施例的第一个方面所述的瞬时转染试剂应用方法，包括：
将聚合物和质粒DNA分别用Opti MEM稀释，将聚合物的稀释液逐滴加入质粒DNA稀释液中，边加边振荡，使之充分混匀,室温放置15min；以15μL/孔的量将混合物加到培养板中、混匀，将细胞置于培养箱培养24h。
作为优选的，用于转染质粒包括pEGFP-N1和pCMV-Luc。
本发明提出一种瞬时转染试剂及其应用方法，包括2,4-戊二醇二丙烯酸盐和聚乙烯亚胺，溶液pH为7.05。转染试剂成本低，转染效率极高，稳定性高，操作简便，适应宿主细胞范围广，培养基中抗生素对其转染效率没有影响。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的实施例的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明的实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明的实施例各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种瞬时转染试剂，其特征在于，包括2,4-戊二醇二丙烯酸盐和聚乙烯亚胺，溶液pH为7.05。
2.根据权利要求1所述的瞬时转染试剂，其特征在于，将支链PEI600和2,4-戊二醇二丙烯酸盐分别溶解到1.0mL无水DMSO中，充分混合并在室温反应6h；用0.5mol/L的HCl终止反应并调节pH值至4.5；将聚合物放置在HCl溶液(pH4.0)中，使用透析袋于4℃透析过夜，去除相对分子质量低于3000的化合物；将样品冻干备用；
将聚合物和质粒DNA分别用Opti MEM稀释，然后将聚合物逐滴加入等体积的质粒DNA稀释液中,充分振荡混匀；复合物在室温放置15min后，加入0.3％琼脂糖凝胶中，在TAE缓冲液中，以100V电泳30min；
将聚合物用pH7.3的PBS缓冲液稀释，终浓度为640μg/mL；将稀释液放置到37℃温箱分别保存1、2、4、8、12、18和24h；取20μg聚合物样品与适量的甘油混合后，加入1.0％的琼脂糖凝胶中，将样品端放置在电场正极，以100V电泳30min；进行蛋白染色，使用考马斯亮蓝对凝胶进行染色、脱色。
3.根据权利要求2所述的瞬时转染试剂，其特征在于，质粒DNA稀释液的终浓度为20μg/mL；TAE缓冲液包括40mmol/LTris-醋酸，1mmol/L EDTA，pH7.4。
4.一种如权利要求1所述的瞬时转染试剂应用方法，其特征在于，包括：
将聚合物和质粒DNA分别用Opti MEM稀释，将聚合物的稀释液逐滴加入质粒DNA稀释液中，边加边振荡，使之充分混匀,室温放置15min；以15μL/孔的量将混合物加到培养板中、混匀，将细胞置于培养箱培养24h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用于转染质粒包括pEGFP-N1和pCMV-Luc。
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CN112695056A (zh) * 2020-12-29 2021-04-23 苏州汇桢生物技术有限公司 一种提高瞬时转染效率的转染试剂及转染方法

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CN101124316A (zh) * 2004-12-17 2008-02-13 日东电工株式会社 用于转染真核细胞的固定的可降解阳离子聚合物

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