CN114561413B - 一种瞬时转染试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种瞬时转染试剂及其应用，属于细胞生物学和生物技术领域。本发明的瞬时转染试剂，包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液；聚乙烯亚胺盐酸盐溶液的浓度为0.8～1.2mg/mL，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；氯化钠溶液的浓度为4.8～5.3mol/L；氯化镁溶液的浓度为0.8～1.2mol/L。本发明的瞬时转染试剂用于细胞转染时，具有较高的转染效率。由于聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度较低，本发明的瞬时转染试剂具有较低的毒性。本发明的瞬时转染试剂是一种价廉、毒性小、转染效率高的瞬时转染试剂，可用于重组蛋白生产和基因治疗等方面。

Description

一种瞬时转染试剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种瞬时转染试剂及其应用，属于细胞生物学和生物技术领域。
背景技术
基因治疗的关键是如何高效地将基因递送到目标细胞内。基因递送载体包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体的递送效率远远高于非病毒载体，但病毒引起的免疫毒性及致癌性等潜在危害已成为其临床应用的障碍。近年来，高效、低毒、具生物相容性的非病毒基因载体逐步成为基因治疗载体研究的热点。常用的非病毒载体有阳离子脂质体与聚合物两类。其中，由于具有较高的转染效率，以Lipo2000为代表的阳离子脂类化合物经过三十多年的发展和完善，被广泛应用于体外基因转染实验。但这类化合物也有明显的缺点，例如，当Lipo2000用于人体实验时，会迅速从血清中被清除并在肺部聚集，诱导炎症反应，导致高水平的毒性等。相比之下，阳离子聚合物载体的研究只有不到十年的历史，但阳离子聚合物的毒性较低，生物相容性优于脂质体类载体，是非病毒基因治疗载体研究的新方向。
聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是目前人们研究最多的一种阳离子聚合物。PEI能够与DNA形成纳米级的复合物，很容易被细胞吞噬。PEI将DNA带入细胞后，能够促进复合物从内含体释放，具有很高的转染效率。PEI的毒性与其相对分子质量密切相关，低相对分子质量的PEI几乎无转染效率，随着相对分子质量的增高，PEI的基因转染效率也逐步上升，但PEI的毒性也随着相对分子质量的增加而上升。为了获得较高的转染效率，通常采用浓度较高的高分子量PEI作为瞬时转染试剂，但是这种瞬时转染试剂存在毒性较大的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种瞬时转染试剂，用于解决目前采用浓度较高的高分子量PEI作为瞬时转染试剂时存在毒性较大的问题。
本发明的另一个目的在于提供一种瞬时转染试剂在细胞转染中的应用。
为了实现上述目的，本发明的瞬时转染试剂所采用的技术方案为：
一种瞬时转染试剂，包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液；聚乙烯亚胺盐酸盐溶液的浓度为0.8～1.2mg/mL，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX40K；氯化钠溶液的浓度为4.8～5.3mol/L；氯化镁溶液的浓度为0.8～1.2mol/L。
优选地，上述瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液；聚乙烯亚胺盐酸盐溶液的浓度为1mg/mL，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；氯化钠溶液的浓度为5mol/L；氯化镁溶液的浓度为1mol/L。
优选地，当瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液时，使用时，所述聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液的体积比为4:7.5:0.6。
一种瞬时转染试剂，包括溶液A和溶液B；
所述溶液A为聚乙烯亚胺盐酸盐溶液，浓度为0.9～1.1mg/mL，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；溶液B为氯化钠和氯化镁的混合溶液，氯化钠的浓度为4.5～5.5mol/L，氯化镁的浓度为0.05～0.1mol/L；
或所述溶液A为氯化钠溶液，浓度为4.5～5.5mol/L；溶液B为聚乙烯亚胺盐酸盐和氯化镁的混合溶液，聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为0.8～1.1mg/mL，氯化镁的浓度为0.1～0.2mol/L，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；
或所述溶液A为氯化镁溶液，浓度为1mol/L；溶液B为聚乙烯亚胺盐酸盐和氯化钠的混合溶液，聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为0.35mg/mL，氯化钠的浓度为3.26mol/L，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K。
优选地，一种瞬时转染试剂，包括溶液A和溶液B；
所述溶液A为聚乙烯亚胺盐酸盐溶液，浓度为1mg/mL，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；溶液B为氯化钠和氯化镁的混合溶液，氯化钠的浓度为4.63mol/L，氯化镁的浓度为0.074mol/L；
或所述溶液A为氯化钠溶液，浓度为5mol/L；溶液B为聚乙烯亚胺盐酸盐和氯化镁的混合溶液，聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为0.87mg/mL，氯化镁的浓度为0.13mol/L，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；
或所述溶液A为氯化镁溶液，浓度为1mol/L；溶液B为聚乙烯亚胺盐酸盐和氯化钠的混合溶液，聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为0.35mg/mL，氯化钠的浓度为3.26mol/L，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K。
优选地，当溶液A为聚乙烯亚胺盐酸盐溶液时，使用时，所述溶液A和溶液B的体积比为4:8.1；当溶液A为氯化钠溶液时，使用时，所述溶液A和溶液B的体积比为7.5:4.6；当溶液A为氯化镁溶液时，使用时，所述溶液A和溶液B的体积比为0.6:11.5。
一种瞬时转染试剂，主要由聚乙烯亚胺盐酸盐、氯化钠、氯化镁和水组成；所述聚乙烯亚胺盐酸盐、氯化钠和氯化镁的质量比为4:2191.5:57.126；所述聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K，聚乙烯亚胺盐酸盐在瞬时转染试剂中的浓度为0.33mg/mL，所述瞬时转染试剂的pH为6.9～7.1。例如，所述瞬时转染试剂主要由聚乙烯亚胺盐酸盐、氯化钠、氯化镁和水组成，所述瞬时转染试剂的pH为7.0。
本发明的瞬时转染试剂在使用时，虽然聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度较低，具有较低的毒性；并且尽管聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度较低，但由于氯化钠和氯化镁具有增加细胞膜通透性的作用，使得瞬时转染试剂仍然具有较高的转染效率。另外，本发明的瞬时转染试剂在-20℃下经低温冻存及反复冻融后均能保持较高的活性，具有较长的保质期，是一种价廉、毒性小、转染效率高的瞬时转染试剂，可用于重组蛋白生产和基因治疗等方面。
优选地，当瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液时，所述聚乙烯亚胺盐酸盐溶液由包括以下步骤的方法制得：使用pH调节剂将浓度大于1mg/mL的聚乙烯亚胺盐酸盐的水溶液调整pH值至6.9至7.1，然后加入水定容至溶液中聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为1mg/mL，最后进行过滤除菌，得到聚乙烯亚胺盐酸盐溶液。优选地，所述pH调节剂为氢氧化钠溶液或盐酸。优选地，所述过滤除菌采用真空膜进行。将溶解后的液体的pH值调至6.9至7.1，可以促进外源DNA进入细胞，即有利于转染的进行。
优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L；所述盐酸的浓度为1mol/L。采用pH调节剂调节液体的pH值时，优选使用氢氧化钠溶液进行调节，如果调节后的液体的pH值意外超过7.1，可以使用盐酸进行调节至液体的pH值为6.9至7.1。
优选地，浓度大于1mg/mL的聚乙烯亚胺盐酸盐的水溶液由包括以下步骤的方法制得：按照每1g聚乙烯亚胺盐酸盐对应采用的水的体积为900mL的比例取聚乙烯亚胺盐酸盐与水混合得到浓度大于1mg/mL的聚乙烯亚胺盐酸盐的水溶液。优选地，混合采用搅拌进行。优选地，所述搅拌所用的搅拌装置的表面涂有PTFE涂层。例如，搅拌所用的搅拌装置为涂有PTFE涂层的搅拌棒。
优选地，当瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液时，所述氯化钠溶液由包括以下步骤的方法制得：将浓度为5mol/L的氯化钠水溶液进行过滤除菌，得到氯化钠溶液。优选地，在氯化钠溶液的制备过程中，所述过滤除菌采用真空膜进行。
优选地，当瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液时，所述氯化镁溶液由包括以下步骤的方法制得：将浓度为1mol/L的氯化镁水溶液进行过滤除菌，得到氯化镁溶液。优选地，在氯化镁溶液的制备过程中，所述过滤除菌采用真空膜进行。
本发明的瞬时转染试剂可以储存在-20～4℃的环境中。当瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液时，制备好的聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液优选储存在-20～4℃的环境中。例如，将制备好的聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液储存在4℃的环境中备用；将制备好的聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液放入-20℃的环境中长期保存。
本发明的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用所采用的技术方案为：
上述瞬时转染试剂在细胞转染中的应用，包括以下步骤：
(1)将质粒、瞬时转染试剂和DMEM培养基混匀，静置后得到转染复合物；
(2)然后将转染复合物与含有待转染细胞的DMEM培养基混合进行培养。
本发明的瞬时转染试剂在细胞转染中应用时，具有毒性小、转染效率高的优点。
优选地，所述静置的时间为5～20min。例如，所述静置的时间为20min。静置5～20min，可以使质粒、瞬时转染试剂和DMEM培养基混合均匀，提高转染复合物的均一性。
优选地，所述瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液；聚乙烯亚胺盐酸盐溶液的浓度为1mg/mL，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX40K；氯化钠溶液的浓度为5mol/L；氯化镁溶液的浓度为1mol/L。
优选地，所述瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液，所述聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液的体积比为4:7.5:0.6。
优选地，所述瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液；步骤(1)中，所述混匀包括以下步骤：按照每1μg质粒溶液对应采用的DMEM培养基的体积为50mL的比例取质粒与DMEM培养基混合得到含有质粒的DMEM培养基；按照聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液、氯化镁溶液和DMEM培养基的体积比为4:7.5:0.6:50000的比例取聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液、氯化镁溶液和DMEM培养基混合得到含有瞬时转染试剂的DMEM培养基；再将含有质粒的DMEM培养基和含有瞬时转染试剂的DMEM培养基混合均匀；所述质粒溶液由包括以下步骤的方法制得：将质粒溶解于TE缓冲液中，即得；所述质粒溶液中质粒的浓度为1.2mg/mL。
优选地，所述质粒为转染质粒。例如，所述转染质粒为pEGFP质粒。所述转染质粒为整合有外源基因的质粒或直接提取得到的质粒。
优选地，TE缓冲液的pH为8.0。
优选地，所述待转染细胞为CHO-EGFP细胞、HEK293细胞、SW480细胞或Hela细胞。
附图说明
图1为采用荧光显微镜观察实施例6得到的转染后的CHO-EGPF细胞的照片；
图2为采用荧光显微镜观察实施例7得到的转染后的HEK293细胞的照片；
图3为采用荧光显微镜观察实施例8得到的转染后的SW480细胞的照片；
图4为采用荧光显微镜观察实施例9得到的转染后的Hela细胞的照片；
图5为采用荧光显微镜观察对比例6得到的转染后的CHO-EGPF细胞的照片；
图6为采用荧光显微镜观察对比例7得到的转染后的CHO-EGPF细胞的照片；
图7为采用荧光显微镜观察对比例8得到的转染后的CHO-EGPF细胞的照片；
图8为采用荧光显微镜观察对比例9得到的转染后的CHO-EGPF细胞的照片；
图9为采用荧光显微镜观察对比例10得到的转染后的CHO-EGPF细胞的照片；
图10为对比例9得到的含有转染后的CHO-EGPF细胞的培养基中的细胞密度的示意图；
图11为实施例6得到的含有转染后的CHO-EGPF细胞的培养基中的细胞密度的示意图；
图12为采用在4℃下放置24h的实施例1的瞬时转染试剂进行细胞转染实验后通过荧光显微镜观察得到的转染后的CHO-EGPF细胞的照片；
图13为采用反复冻融处理的实施例1的瞬时转染试剂进行细胞转染实验后通过荧光显微镜观察得到的转染后的CHO-EGPF细胞的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步说明。
本发明实施例6、对比例7-12中，所用的pEGFP质粒由质粒小提试剂盒提取得到，所用的DMEM培养基为Gbico DMEM高糖培养基，所用的pEGFP质粒溶液由包括以下步骤的方法制备得到：将提取得到的pEGFP质粒溶解于100μLTE(pH＝8.0)缓冲液中，得到pEGFP质粒溶液。通过琼脂糖凝胶电泳分析得到pEGFP质粒溶液的浓度为1.2mg/mL，通过紫外分光光度计测试提取的pEGFP质粒的纯度(A260/A280＝1.817)。所用的质粒小提试剂盒由北京索莱宝生物技术有限公司生产。
一、本发明的瞬时转染试剂的具体实施例如下：
实施例1
本实施例的瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液；聚乙烯亚胺盐酸盐溶液的浓度为1mg/mL，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；氯化钠溶液的浓度为5mol/L；氯化镁溶液的浓度为1mol/L。
本实施例的瞬时转染试剂在使用时，聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液的体积比为4:7.5:0.6。
本实施例的聚乙烯亚胺盐酸盐溶液由包括以下步骤的方法制得：
(1)将1g PEI MAX 40K分散于含有900mL水的1L玻璃烧杯中，然后使用涂覆有PTFE涂层的搅拌棒进行搅拌，至PEI MAX 40K完全溶解。
(2)使用25mL塑料移液管将浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液逐滴添加到1L玻璃烧杯中，直到烧杯中溶液的pH值为7.0。
(3)将1L玻璃烧杯中的溶液倾倒入1L量筒中，然后向1L量筒中加水，至量筒中溶液的体积为1L。
(4)使用真空膜对量筒中的溶液进行过滤除菌，得到聚乙烯亚胺盐酸盐溶液。
制备的聚乙烯亚胺盐酸盐溶液可以储存在4℃的环境中备用，也可以放入-20℃的环境中长期保存。
本实施例的氯化钠溶液由包括以下步骤的方法制得：
(1)将29.2g NaCl加入92mL蒸馏水中，采用60℃水浴进行加热，同时进行搅拌至NaCl溶解，得到浓溶液，然后将浓溶液冷却至室温，再将浓溶液的体积定容至100mL，得到稀溶液。
(2)使用真空膜对稀溶液进行过滤除菌，得到氯化钠溶液。
制备的氯化钠溶液可以储存在4℃的环境中备用，也可以放入-20℃的环境中长期保存。
本实施例的氯化镁溶液由包括以下步骤的方法制得：
将9.52g MgCl2加入92mL蒸馏水中，搅拌至MgCl2溶解，然后将所得溶液的体积定容至100mL，再使用真空膜对定容后的溶液进行过滤除菌，得到氯化镁溶液。
制备的氯化镁溶液可以储存在4℃的环境中备用，也可以放入-20℃的环境中长期保存。
实施例2
本实施例的瞬时转染试剂由聚乙烯亚胺盐酸盐、氯化钠、氯化镁和水组成；聚乙烯亚胺盐酸盐、氯化钠和氯化镁的质量比为4:2191.5:57.126；聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX40K，聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为0.33mg/mL，所述瞬时转染试剂的pH为7.0。
实施例3
本实施例的瞬时转染试剂包括溶液A和溶液B；溶液A为聚乙烯亚胺盐酸盐溶液，浓度为1mg/mL，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；溶液B为氯化钠和氯化镁的混合溶液，氯化钠的浓度为4.63mol/L，氯化镁的浓度为0.074mol/L。
本实施例的瞬时转染试剂在使用时，溶液A和溶液B的体积比为4:8.1。
实施例4
本实施例的瞬时转染试剂包括溶液A和溶液B；溶液A为氯化钠溶液，浓度为5mol/L；溶液B为聚乙烯亚胺盐酸盐和氯化镁的混合溶液，聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为0.87mg/mL，氯化镁的浓度为0.13mol/L，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K。
本实施例的瞬时转染试剂在使用时，溶液A和溶液B的体积比为7.5:4.6。
实施例5
本实施例的瞬时转染试剂包括溶液A和溶液B；溶液A为氯化镁溶液，浓度为1mol/L；溶液B为聚乙烯亚胺盐酸盐和氯化钠的混合溶液，聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为0.35mg/mL，氯化钠的浓度为3.26mol/L，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K。
本实施例的瞬时转染试剂在使用时，溶液A和溶液B的体积比为0.6:11.5。
对比例1
本对比例的瞬时转染试剂为聚乙烯亚胺盐酸盐溶液，浓度为1mg/mL，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K。
对比例2
本对比例的瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液和氯化钙溶液；聚乙烯亚胺盐酸盐溶液的浓度为1mg/mL，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；氯化钙溶液的浓度为1mol/L。
本对比例的瞬时转染试剂在使用时，聚乙烯亚胺盐酸盐溶液和氯化钙溶液的体积比为4:0.6。
对比例3
本对比例的瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液和氯化镁溶液；聚乙烯亚胺盐酸盐溶液的浓度为1mg/mL，pH为7.0，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；氯化镁溶液的浓度为1mol/L。
本对比例的瞬时转染试剂在使用时，聚乙烯亚胺盐酸盐溶液和氯化镁溶液的体积比为4:0.6。
对比例4
本对比例的瞬时转染试剂为Lipo2000(购自赛默飞公司)。
对比例5
本对比例的瞬时转染试剂包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液和氯化钠溶液；聚乙烯亚胺盐酸盐溶液的浓度为1mg/mL，pH为7.0；氯化钠溶液的浓度为4.63mol/L。
本对比例的瞬时转染试剂在使用时，聚乙烯亚胺盐酸盐溶液和氯化钠溶液的体积比为4:7.5。
二、本发明的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用的具体实施例如下：
实施例6
本实施例的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用，包括以下步骤：
(1)将1μg pEGFP质粒溶液溶解于50mLDMEM培养基中，得到含有质粒的DMEM培养基。
(2)将瞬时转染试剂溶解于50mLDMEM培养基中，得到含有瞬时转染试剂的DMEM培养基。瞬时转染试剂为实施例1的瞬时转染试剂，瞬时转染试剂与DMEM培养基的体积比为12.1:50000。
(3)将步骤(2)制备的含有质粒的DMEM培养基和步骤(3)制备的含有瞬时转染试剂的DMEM培养基混匀，室温下静置20min，得到转染复合物。
(4)将转染复合物加入到预先铺好CHO-EGPF细胞的培养基中，加入后轻轻摇动培养板，使转染复合物与含有CHO-EGPF细胞的培养基混匀，混匀后放置到培养箱中继续培养。培养12h后换新鲜培养基继续培养(为转染后的细胞提供营养物质，以便观察细胞形态)36h。
实施例7
本实施例的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用与实施例6的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用的区别仅在于，步骤(4)中所用的细胞为HEK293细胞。
实施例8
本实施例的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用与实施例6的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用的区别仅在于，步骤(4)中所用的细胞为SW480细胞。
实施例9
本实施例的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用与实施例6的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用的区别仅在于，步骤(4)中所用的细胞为Hela细胞。
对比例6
本对比例的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用与实施例6的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用的区别仅在于，步骤(2)中所用的瞬时转染试剂为对比例1的瞬时转染试剂，瞬时转染试剂与DMEM培养基的体积比为4:50000。
对比例7
本对比例的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用与实施例6的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用的区别仅在于，步骤(2)中所用的瞬时转染试剂为对比例2的瞬时转染试剂，瞬时转染试剂与DMEM培养基的体积比为4.6:50000。
对比例8
本对比例的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用与实施例6的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用的区别仅在于，步骤(2)中所用的瞬时转染试剂为对比例3的瞬时转染试剂，瞬时转染试剂中的聚乙烯亚胺盐酸盐溶液与DMEM培养基的体积比为4.6:50000。
对比例9
本对比例的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用与实施例6的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用的区别仅在于，步骤(2)中所用的瞬时转染试剂为对比例4的瞬时转染试剂，瞬时转染试剂与DMEM培养基的体积比为1:50000。
对比例10
本对比例的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用与实施例6的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用的区别仅在于，步骤(2)中所用的瞬时转染试剂为对比例5的瞬时转染试剂，瞬时转染试剂与DMEM培养基的体积比为11.5:50000。
实验例1
采用荧光显微镜分别观察实施例6、对比例6-10得到的转染后的CHO-EGPF细胞以及实施例7得到的转染后的HEK293细胞、实施例8得到的转染后的SW480细胞和实施例9得到的转染后的Hela细胞的形态，结果如图1-9所示。由图1-9可知，实施例1和对比例4的瞬时转染试剂具有较高的转染效率。
通过全自动生化分析仪(瑞士罗氏)测试实施例6和对比例9得到的含有转染后的CHO-EGPF细胞的培养基中的细胞密度，结果如图10和11所示，结果表明，实施例6得到的含有转染后的CHO-EGPF细胞的培养基中的细胞生长良好(图11)，细胞密度达到90％以上，高于对比例9得到的含有转染后的CHO-EGPF细胞的培养基中的细胞密度(图10)，说明与对比例4的瞬时转染试剂相比，实施例1的瞬时转染试剂对细胞的毒性更小。
综上，与对比例1-3和对比例5的瞬时转染试剂相比，实施例1的瞬时转染试剂具有更高的转染效率，虽然实施例1的瞬时转染试剂的转染效率和对比例4的瞬时转染试剂的转染效率相差不大，但是实施例1的瞬时转染试剂具有更低的毒性，并且实施例1的瞬时转染试剂具有更低的价格。
实验例2
为了测试实施例1的瞬时转染试剂在不同温度下储存后的转染效果，采用在4℃下放置24h的实施例1的瞬时转染试剂和反复冻融处理的实施例1的瞬时转染试剂按照实施例6的方法进行细胞转染实验，然后采用荧光显微镜观察得到的转染后的CHO-EGPF细胞的形态，结果如图12和13所示。结果表明，实施例1的瞬时转染试剂在-20℃下经低温冻存及反复冻融后均能保持较高的活性，具有较长的保质期。反复冻融处理的方法包括以下步骤：首先将实施例1的瞬时转染试剂放入-20℃的环境中使瞬时转染试剂冷冻，再取出解冻，然后重复冷冻和解冻操作5次。

Claims (6)

1.一种瞬时转染试剂，其特征在于，包括聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液；聚乙烯亚胺盐酸盐溶液的浓度为0.8～1.2mg/mL，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；氯化钠溶液的浓度为4.8～5.3mol/L；氯化镁溶液的浓度为0.8～1.2mol/L；使用时，所述聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液和氯化镁溶液的体积比为4:7.5:0.6。
2.一种瞬时转染试剂，其特征在于，包括溶液A和溶液B；
所述溶液A为聚乙烯亚胺盐酸盐溶液，浓度为0.9～1.1mg/mL，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；溶液B为氯化钠和氯化镁的混合溶液，氯化钠的浓度为4.5～5.5mol/L，氯化镁的浓度为0.05～0.1mol/L；
或所述溶液A为氯化钠溶液，浓度为4.5～5.5mol/L；溶液B为聚乙烯亚胺盐酸盐和氯化镁的混合溶液，聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为0.8～1.1mg/mL，氯化镁的浓度为0.1～0.2mol/L，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；
或所述溶液A为氯化镁溶液，浓度为1mol/L；溶液B为聚乙烯亚胺盐酸盐和氯化钠的混合溶液，聚乙烯亚胺盐酸盐的浓度为0.35mg/mL，氯化钠的浓度为3.26mol/L，pH为6.9～7.1，聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K；
当溶液A为聚乙烯亚胺盐酸盐溶液时，使用时，所述溶液A和溶液B的体积比为4:8.1；当溶液A为氯化钠溶液时，使用时，所述溶液A和溶液B的体积比为7.5:4.6；当溶液A为氯化镁溶液时，使用时，所述溶液A和溶液B的体积比为0.6:11.5。
3.一种瞬时转染试剂，其特征在于，主要由聚乙烯亚胺盐酸盐、氯化钠、氯化镁和水组成；所述聚乙烯亚胺盐酸盐、氯化钠和氯化镁的质量比为4:2191.5:57.126；所述聚乙烯亚胺盐酸盐为PEI MAX 40K，聚乙烯亚胺盐酸盐在瞬时转染试剂中的浓度为0.33mg/mL，所述瞬时转染试剂的pH为6.9～7.1。
4.如权利要求1-3中任一项所述的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将质粒、瞬时转染试剂和DMEM培养基混匀，静置后得到转染复合物；
(2)然后将转染复合物与含有待转染细胞的DMEM培养基混合进行培养。
5.如权利要求4所述的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用，其特征在于，所述静置的时间为5～20min。
6.如权利要求4或5所述的瞬时转染试剂在细胞转染中的应用，其特征在于，所述瞬时转染试剂为权利要求1或2所述的瞬时转染试剂；步骤(1)中，所述混匀包括以下步骤：按照每1μg质粒溶液对应采用的DMEM培养基的体积为50mL的比例取质粒与DMEM培养基混合得到含有质粒的DMEM培养基；按照聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液、氯化镁溶液和DMEM培养基的体积比为4:7.5:0.6:50000的比例取聚乙烯亚胺盐酸盐溶液、氯化钠溶液、氯化镁溶液和DMEM培养基混合得到含有瞬时转染试剂的DMEM培养基；再将含有质粒的DMEM培养基和含有瞬时转染试剂的DMEM培养基混合均匀；所述质粒溶液由包括以下步骤的方法制得：将质粒溶解于TE缓冲液中，即得；所述质粒溶液中质粒的浓度为1.2mg/mL。
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