CN101755048A - 用于递送核酸的peg-pei共聚物 - Google Patents

用于递送核酸的peg-pei共聚物 Download PDF

Info

Publication number
CN101755048A
CN101755048A CN200880023048A CN200880023048A CN101755048A CN 101755048 A CN101755048 A CN 101755048A CN 200880023048 A CN200880023048 A CN 200880023048A CN 200880023048 A CN200880023048 A CN 200880023048A CN 101755048 A CN101755048 A CN 101755048A
Authority
CN
China
Prior art keywords
crosslinked cation
sirna
cell
cation polymer
water
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880023048A
Other languages
English (en)
Inventor
俞磊
赵刚
马念春
赵昕
刘健
田中康进
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nitto Denko Corp
Original Assignee
Nitto Denko Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nitto Denko Corp filed Critical Nitto Denko Corp
Publication of CN101755048A publication Critical patent/CN101755048A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Electromagnetism (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

描述了用于siRNA递送的组合物，其包含水溶性可降解的交联阳离子聚合物，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物含有水溶性聚乙二醇组分、阳离子聚乙烯亚胺组分和可降解单元组分。该组合物可用于递送siRNA至细胞内，特别是癌细胞内。该组合物可以应用于诸如多孔板的固体表面以使siRNA的递送可以在固体表面上进行。

Description

用于递送核酸的PEG-PEI共聚物
相关申请
本申请要求2007年9月14日提交的美国临时申请60/972,686和2007年6月5日提交的美国临时申请60/942,127的优先权。这两个申请在此引入本文作为参考。
序列表
本申请与电子版的序列表一起提交。该序列表以名称为NDTCO-068PR2-序列表.TXT的文件形式提交，该文件于2007年9月14日生成，大小为2Kb。该序列表的电子版中的信息在此整体引入本文作为参考。
发明背景
技术领域
本文所述的实施方案涉及将siRNA递送至细胞内的组合物和方法。更具体地说，本文所述的实施方案涉及涂有水溶性可降解的交联阳离子聚合物的将siRNA递送至细胞内的板。
相关技术描述
可利用许多技术将质粒DNA编码的siRNA递送至细胞内。例如，阳离子聚合物已用作基因载体，该阳离子聚合物包括聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、PAMAM树枝状聚合物和聚甲基丙烯酸(2-二甲氨基)乙酯(pDMAEMA)。遗憾的是，使用PLL时转染率尤其差，并且高分子量的PLL表现出对细胞明显的毒性。在一些情况下，PEI提供了有效的基因转移而不需要分解内体试剂(endosomolytic)或靶向剂(参见BoussifO.，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.Aug.1，1995，92(16)7297-301)。已研究了一系列的聚酰胺-胺树枝状聚合物作为基因递送系统(参见Eichman J.D.，et al.，Pharm.Sci.Technol.Today 2000July；3(7)：232-245)。遗憾的是，已报道了高分子量的PEI和已发现能够提供良好的转染效率的树枝状聚合物对细胞有毒。已报道用可降解的阳离子聚合物制备的质粒DNA载体将质粒转移至哺乳动物细胞内，并具有降低的细胞毒性。(参见Lim Y.B.，et al.，J.Am.Chem.Soc，123(10)，2460-2461，2001)。
发明内容
本文所述的实施方案涉及用于siRNA递送的组合物。在实施方案中，用于siRNA递送的该组合物可以包含水溶性可降解的交联阳离子聚合物，该阳离子聚合物可包括(a)重复的聚乙二醇(PEG)主链单元；(b)重复的阳离子聚乙烯亚胺(PEI)主链单元和(c)重复的含有侧链脂质基团的可降解主链单元。
本文所述的实施方案涉及制备本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物的方法。在一些实施方案中，水溶性可降解的交联阳离子聚合物可以通过如下方法合成：将含有乙亚胺重复单元的第一反应物溶解在有机溶剂中以形成溶解的或部分溶解的高分子反应物；将该溶解的或部分溶解的高分子反应物与可降解单体反应物反应以形成可降解的交联聚合物，其中该可降解单体反应物含有脂质基团；将该可降解的交联聚合物与第三反应物反应，其中该第三反应物含有重复的聚乙二醇单元。
本文所述的实施方案涉及递送siRNA至细胞内的方法，该方法包括如下步骤：将本文所述的任何一种水溶性可降解的交联阳离子聚合物与siRNA混合以形成混合物；并将该混合物与一个或多个细胞接触。更优选地，siRNA具有19-27个碱基对。在优选的实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。更优选的是该哺乳动物细胞为癌细胞。
本文所述的实施方案涉及治疗或降低心血管疾病风险的方法，该方法可包括将与本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物复合的、与脂蛋白基因片段的编码区的至少一部分相对应的siRNA对需要的个体给药。
本文所述的实施方案涉及用siRNA转染真核细胞的装置，该装置包括至少部分地固定有含有转染试剂的组合物的固体表面，其中所述转染试剂选自水溶性可降解的交联阳离子聚合物、阳离子聚合物、脂质聚合物、聚乙二醇化阳离子聚合物、聚乙二醇化脂质聚合物、阳离子脂质、聚乙二醇化阳离子脂质和阳离子可降解聚乙二醇化脂质聚合物。
本文所述的实施方案涉及测定siRNA是否能够进入真核细胞的方法。该方法可包括一个或多个如下的步骤：(a)提供本文所述的装置；(b)将siRNA加入该装置中以使siRNA与转染试剂相互作用；(c)将该真核细菌以充足的密度并在适于将siRNA引入细胞内的条件下接种到所述装置上；(d)检测siRNA是否已经进入该细胞中。
本文所述的实施方案涉及用于将siRNA引入真核细胞中的方法，该方法可包括如下步骤：(a)提供至少部分地涂有本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物的固体表面；(b)将待被引入至真核细胞内的siRNA加入至细胞表面上；以及(c)将该细胞以充足的密度并在适于将siRNA引入细胞内的条件下接种到固体表面上。
附图简要说明
图1显示合成一部分的水溶性可降解的交联阳离子聚合物的方法。
图2显示siRNA转染后，在HeLa细胞内绿色荧光蛋白的活性百分率。在这个实验中所使用的水溶性可降解的交联阳离子聚合物如下：聚合物2(可降解单元∶PEI∶PEG(12∶1∶2))、聚合物3(可降解单元∶PEI∶PEG(16∶1∶2))、聚合物4(可降解单元∶PEI∶PEG(17∶1∶2))和聚合物5(可降解单元∶PEI∶PEG(20∶1∶2))。对照为PEI1200、CytopureTM、Lipofectamine 2000TM和可降解单元∶PEI(5∶1)，所有均为摩尔比。聚合物与siRNA的比例为2∶1。
图3显示siRNA转染后，在B16F0细胞内绿色荧光蛋白的活性百分率。该水溶性可降解的交联阳离子聚合物、对照和聚合物/siRNA的比例如图2的图例所述。
图4显示在用siRNA转染后，HeLa细胞的细胞存活百分率。该水溶性可降解的交联阳离子聚合物、对照和聚合物/siRNA的比例如图2的图例所述。
图5显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制HeLa细胞的绿色荧光(GFP)活性(％)的柱状图。聚合物与siRNA的比例为5∶1。结果显示与其它已知的质粒递送剂CytopureTM相比，聚合物1和Lipofectamine 2000TM提供了更好的siRNA涂布递送以抑制基因表达。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。
图6显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine 2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制HeLa细胞的细胞存活力(％)的柱状图。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。聚合物与siRNA的比例为5∶1。结果表明在此测定中聚合物1与L2K不显示细胞毒性。
图7显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine 2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制HeLa细胞的绿色荧光(GFP)活性(％)的柱状图。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。聚合物与siRNA的比例为10∶1。结果显示与质粒递送剂CytopureTM相比，聚合物1和L2K提供了相当的siRNA涂布递送以抑制基因表达。
图8显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine 2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制HeLa细胞的细胞存活力(％)的柱状图。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。聚合物与siRNA的比例为10∶1。结果表明在此测定中聚合物1与L2K不显示细胞毒性。
图9显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine 2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制B16F0细胞的绿色荧光(GFP)活性(％)的柱状图。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。聚合物与siRNA的比例为2.5∶1。结果显示与质粒递送剂CytopureTM相比，聚合物1和L2K提供了更好的siRNA涂布递送以抑制基因表达。
图10显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine 2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制B16F0细胞的细胞存活力(％)的柱状图。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。聚合物与siRNA的比例为2.5∶1。结果表明在此测定中聚合物1与L2K没有显示细胞毒性。
图11显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine 2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制B16F0细胞的绿色荧光(GFP)活性(％)的柱状图。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。聚合物与siRNA的比例为5∶1。结果显示与质粒递送剂CytopureTM相比，聚合物1和L2K提供了更好的siRNA涂布递送以抑制基因表达。
图12显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine 2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制B16F0细胞的细胞存活力(％)的柱状图。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。聚合物与siRNA的比例为5∶1。结果表明在此测定中聚合物1与L2K没有显示细胞毒性。
图13显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine 2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制B16F0细胞的绿色荧光(GFP)活性(％)的柱状图。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。聚合物与siRNA的比例为10∶1。结果显示与质粒递送剂CytopureTM相比，聚合物1和L2K提供了更好的siRNA涂布递送以抑制基因表达。
图14显示使用起始材料聚乙烯亚胺-1200道尔顿(支化的PEI-1.2K，阴性对照)、质粒递送试剂CytopureTM(阴性对照)、Lipofectamine 2000TM(L2K)以及聚合物1，绘制B16F0细胞的细胞存活力(％)的柱状图。聚合物1为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为5∶1∶2。聚合物与siRNA的比例为10∶1。结果表明在此测定中聚合物1与L2K没有显示细胞毒性。
图15显示在HepG2细胞培养中，转染试剂聚合物6/siApo-B复合物的量的增加对apo-B表达的抑制。聚合物6为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为16.5∶1∶2。所述的对照处理仅包括聚合物6和siApo-B(5μg)。
图16显示在5％的葡萄糖溶液中，应用RiboGreenTM综合测定通过荧光测定转染试剂/siRNA复合物的稳定性。转染试剂为聚合物2以及siRNA为抗Apo-B。聚合物2如图2的图例中所述。
图17显示在裸鼠中使用聚合物6作为转染试剂，抗Apo-B对apo-B表达的抑制作用。聚合物6为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为16.5∶1∶2。对照包括PBS(A)、siApo-B(1mg/kg)(B)、聚合物6(5mg/kg)(C)以及比例为5∶1的聚合物与随机siRNA、在操作后48小时给予1mg/kg siApo-B(F)。治疗包括操作后48小时给予1.0mg/kg抗Apo-B siRNA(D)以及操作后2周给予2.5mg/kg抗Apo-B siRNA(E)。聚合物与siRNA的比例为5/1。
图18显示在裸鼠中改变转染试剂(聚合物6)与siRNA(抗Apo-B)的比例对Apo-B的抑制的影响。聚合物6为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为16.5∶1∶2。对照为PBS(A)。治疗为聚合物6+siApo-B，其重量比为5∶1(B)、7.5∶1(C)和10∶1(D)。在所有的治疗(B-D)中，均给予1mg/kg siApo-B。
图19显示将转染试剂聚合物6∶siRNA(抗Apo-B)复合物注射到裸鼠的尾静脉后，对Apo-B mRNA表达的抑制的时间过程。聚合物6为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为16.5∶1∶2。对照为PBS(A)。治疗为操作后48小时，聚合物6+siApo-B，给予1mg/kg siApo-B(B)；操作后一周，聚合物6+siApo-B，给予2.5mg/kgsiApo-B(C)；操作后两周，聚合物6+siApo-B，给予2.5mg/kg siApo-B(D)。在所有的治疗(B-D)中，聚合物与siRNA的重量比为5∶1。
图20显示将转染试剂聚合物6∶siRNA(抗Apo-B)复合物注射到C57BL/6小鼠的尾静脉后，对Apo-B mRNA表达的抑制的时间过程。聚合物6为水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比为16.5∶1∶2。对照包括PBS(A)和siapo-B(1mg/kg)。治疗包括聚合物6+siapo-B(重量比5∶1，1mg/kg的siapo-B)-48小时(C)，聚合物6+siapo-B(重量比5∶1，1mg/kg的siapo-B)-一周(D)，聚合物6+siapo-B(重量比5∶1，1mg/kg的siapo-B)-两周(E)，聚合物6+siapo-B(重量比5∶1，1mg/kg的siapo-B)-三周(F)。
所述附图旨在示例性说明本文所述的某些实施方案，并非旨在限制本发明。
优选实施方案的详细描述
本文所述的实施方案涉及将siRNA递送至一个或多个细胞内。该siRNA的递送可以在溶液中进行，优选在水溶液中或者更优选在诸如转染装置的固体表面上进行。在优选的实施方案中，本文所述的方法包括作为转染试剂的水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其在将siRNA转移至细胞内方面是非常有效的。
本文所述的实施方案涉及水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其在聚合物主链上可包括一个或者多个含有侧链脂质基团的可降解单元、一个或者多个阳离子聚乙烯亚胺(PEI)单元以及一个或者多个聚乙二醇(PEG)单元。
在一些实施方案中，重复的聚乙二醇主链单元可具有约50道尔顿-约5000道尔顿的分子量。在实施方案中，重复的聚乙二醇主链单元可具有约400道尔顿-约600道尔顿的分子量。
在一些实施方案中，重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元可具有约200道尔顿-约25000道尔顿的分子量。在实施方案中，重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元可具有约600道尔顿-约2000道尔顿的分子量。
在优选的实施方案中，重复的可降解主链单元可以是通式(I)重复单元：
Figure G2008800230487D00081
在通式(I)中，A1可以不存在或者为任选取代的取代基，该取代基选自：烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和-(CH2)n1-D-(CH2)n2-；其中n1和n2可以各自独立地为0或者1-10的整数；以及D可以为任选取代的取代基，该取代基选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和杂环基；A2可以不存在、可以为氧原子或者-N(RN)，其中RN为H或者C1-6烷基；R1可以为电子对、氢、或者任选取代的取代基，该取代基选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、芳基、杂芳基和杂环基，其中如果R1为氢或者为任选取代的取代基，所述取代基选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、芳基、杂芳基和杂环基，那么与R1连接的氮原子具有相关联的正电荷；R2可以选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C5-C50芳基、C5-C50杂芳基、-(CH2)p1-E-(CH2)p2-和甾醇；其中p1和p2可以各自独立地为0或者1-40的整数；E可以为任选取代的取代基，该取代基选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和杂环基。在实施方案中，R2可以为C4-C30烷基、C4-C30烯基、C4-C30炔基或甾醇。在优选的实施方案中，R2可以为C8-C24烷基、C8-C24烯基、C8-C24炔基或甾醇。虽然不被理论所约束，但是认为通式(I)中的酯基给予水溶性可降解的交联阳离子聚合物改进的生物降解性。
在一些实施方案中，R2可以为脂质基团。在一些实施方案中，R2可以选自油基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、十七烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基和二十四烷基。在实施方案中，R2可以为油基。在一些实施方案中，R2可以为甾醇。在实施方案中，所述甾醇可以为胆甾醇部分。
通式(I)中与R1连接的氮原子可具有电子对、与其键合的氢或者任选取代的取代基，该取代基选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、芳基、杂芳基和杂环基。本领域的技术人员理解当该氮原子具有电子对时，上述的通式(I)重复单元在低pH值下是阳离子型的；当R1是氢或者任选取代的取代基时，所述取代基选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、芳基、杂芳基和杂环基，该氮原子具有相关联的正电荷。
在实施方案中，重复的可降解主链单元可具有如下结构：
Figure G2008800230487D00091
在优选的实施方案中，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约1mole％-约95mole％的重复的可降解主链单元。更优选地，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约30mole％-约90mole％的重复的可降解主链单元。还更优选地，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约50mole％-约86mole％的重复的可降解主链单元。
在优选的实施方案中，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约1mole％-约35mole％的重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元。更优选地，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约1mole％-约20mole％的重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元。还更优选地，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约5mole％-约15mole％的重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元。
在优选的实施方案中，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约1mole％-约80mole％的重复的聚乙二醇主链单元。更优选地，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约1mole％-约50mole％的重复的聚乙二醇主链单元。还更优选地，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约5mole％-约30mole％的重复的聚乙二醇主链单元。且更优选地，基于水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，该水溶性可降解的交联阳离子聚合物包括约8mole％-约30mole％的重复的聚乙二醇主链单元。
水溶性可降解的交联阳离子聚合物的示例性部分表示如下：
Figure G2008800230487D00111
通式(Ia)
在实施方案中，水溶性可降解的交联阳离子聚合物可包括在该聚合物主链上的具有约1200道尔顿分子量的一个或多个支化的PEI单元；在该聚合物主链上的一个或者多个通式(I)可降解单元；在该聚合物主链上的具有454道尔顿分子量的一个或多个支化的聚乙二醇单元。
可有效地将递送质粒DNA至细胞内的聚合物未必也能有效地将siRNA递送至细胞内。它们的递送的不相关因素涉及它们分子大小的差异：siRNA通常具有约21-23个碱基对(bp)，而质粒DNA具有7,000-9,000bp。参见Kim et al.J.Control Release 2007(出版中)。可以有效地递送诸如质粒DNA的大型环状大分子的载体完全不适用于短的线性片段，例如siRNA。
除非另外定义，本文使用的所有科技术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文提及的所有专利、申请、公布的申请及其它出版物都将其全部内容引入作为参考。在本文中的术语有多种定义的情况下，除非另有说明，以本部分中的定义为主。
本文中所用的“Cm-Cn”，其中“m”和“n”为整数，是指烷基、烯基或炔基中的碳原子数，或者是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基或杂脂环基的环中的碳原子数。也就是说，烷基、烯基、炔基、环烷基的环、环烯基的环、环炔基的环、芳基的环、杂芳基的环或杂脂环基的环能够含有从“m”到“n”个碳原子，m和n包括在内。因此，例如，“C1-C4烷基”指的是具有从1-4个碳原子的所有烷基基团，即CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。如果关于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基或杂脂环基中“m”和“n”没有被指定，则可以认为具有这些定义中所述的最宽的范围。
本文所用的“烷基”是指包含完全饱和(无双键或三键)的烃基团的直链或支链烃链。烷基可以含有1至50个碳原子(每当出现在本文中时，诸如“1至50”的数值范围是指在给定范围内的每一整数；例如，“1至50个碳原子”意为烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等等直至并包括50个碳原子组成，尽管本定义也包括没有指定数值范围的术语“烷基”的情况)。烷基也可以是具有1至30个碳原子的中等大小的烷基。烷基也可以是具有1至5个碳原子的低级烷基。可以将化合物的烷基指定为“C1-C4烷基”或类似的指定。仅以实例的方式，“C1-C4烷基”表明在烷基链中有一至四个碳原子，即，烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
烷基可以被取代或不被取代。被取代时，取代基是一个或多个各自独立地选自如下的基团：烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、被保护的羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、酯、巯基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸基、硫氰基(thiocyanato)、异硫氰基(isothiocyanato)、硝基、甲硅烷基、亚氧硫基、亚硫酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲烷磺酰基、三卤代甲烷磺酰氨基或包括单取代和双取代的氨基在内的氨基、及上述基团的被保护的衍生物。
本文中所用的“烯基”是指在直链或支链的烃链上含有一个或多个双键的烃基基团。烯基基团可以不被取代或者被取代。当被取代时，除非另有说明，取代基可以选自与上文公开的关于烷基取代的相同的基团。
本文中所用的“炔基”是指在直链或支链的烃链上含有一个或多个三键的烃基基团。炔基基团可以不被取代或者被取代。当被取代时，除非另有说明，取代基可以选自与上文公开的关于烷基取代的相同的基团。
本文所用的“杂烷基”是指本文所述的烷基基团，其中该烷基基团主链中的一个或多个碳原子被诸如氮、硫和/或氧的杂原子所替换。
本文所用的“杂烯基”是指本文所述的烯基基团，其中该烯基基团主链中的一个或多个碳原子被诸如氮、硫和/或氧的杂原子所替换。
本文所用的“杂炔基”是指本文所述的炔基基团，其中该炔基基团主链中的一个或多个碳原子被诸如氮、硫和/或氧等的杂原子所替换。
本文所用的“芳基”是指具有完全离域的π电子体系的碳环(全碳)单环或多环芳香环体系。芳基的实例包括但不限于苯、萘和薁。芳基的环可以具有5-50个碳原子。芳基可以被取代或不被取代。被取代时，氢原子被取代基置换，所述取代基是独立地选自如下的一个或多个基团：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、被保护的羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、酯、巯基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸基、硫氰基、异硫氰基、硝基、甲硅烷基、亚氧硫基、亚硫酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲烷磺酰基、三卤代甲烷磺酰氨基和包括单取代和双取代的氨基在内的氨基，及上述基团的被保护的衍生物，除非另外指明取代基。
本文中所用的“杂芳基”是指单环或者多环的芳香环体系(具有完全离域的π电子系统的环体系)，其含有一个或多个杂原子、即除碳以外的元素，该杂原子包括但不限于氮、氧和硫。杂芳基基团的环具有5-50个原子。该杂芳基可以被取代或不被取代。杂芳基环的实例包括但不限于呋喃、呋咱、噻吩、苯并噻吩、酞嗪、吡咯、噁唑、苯并噁唑、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、噻唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、苯并噻唑、咪唑、苯并咪唑、吲哚、吲唑、吡唑、苯并吡唑、异噁唑、苯并异噁唑、异噻唑、三唑、苯并三唑、噻二唑、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、嘌呤、蝶啶、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、噌啉和三嗪。杂芳基基团可以被取代或不被取代。当被取代时，氢原子被取代基置换，该取代基为独立地选自如下的一个或者多个基团：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、被保护的羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、酯、巯基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸基、硫氰基、异硫氰基、硝基、甲硅烷基、亚氧硫基、亚硫酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲烷磺酰基、三卤代甲烷磺酰氨基和包括单取代和双取代的氨基在内的氨基，及上述基团的被保护的衍生物。
本文中所用的“环烷基”是指完全饱和的(无双键)单环或多环烃环体系。当其由两个或两个以上的环组成时，所述环可以以稠合、桥接或螺接的方式连接在一起。环烷基基团可以从C3至C10变化，在其它实施方案中，其可以从C3至C8变化。环烷基基团可以不被取代或者被取代。典型的环烷基基团包括但决不仅限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等等。如果被取代，除非另有说明，则取代基可以是烷基或者选自上文指明的关于烷基取代的那些取代基。
本文中所用的“环烯基”是指在环中含有一个或多个双键的环烃基基团，但是如果存在大于一个的双键，则所述双键在环中不能形成完全离域的π电子体系(否则该基团就是本文中所定义的芳基)。当其由两个或两个以上的环组成时，所述环可以以稠合、桥接或螺接的方式连接在一起。环烯基基团可以不被取代或者被取代，当被取代时，除非另有说明，取代基可以是烷基或者选自上文公开的关于烷基取代的那些取代基。
本文中所用的“环炔基”是指在环中含有一个或多个三键的环烃基基团。当其由两个或两个以上的环组成时，所述环可以以稠合、桥接或螺接的方式连接在一起。环炔基基团可以不被取代或者被取代，当被取代时，除非另有说明，取代基可以是烷基或者选自上文公开的关于烷基取代的那些取代基。
本文中所用的“杂脂环”或“杂脂环基”是指由碳原子和1-5个杂原子组成的稳定的3-18元环，该杂原子选自氮、氧和硫。该“杂脂环”或“杂脂环基”可以是单环、双环、三环或四环体系，可以以稠合、桥接或螺接的方式连接在一起；“杂脂环”或“杂脂环基”中的氮、碳和硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选被季铵化；所述环可以含有一个或多个双键，前提是该双键不能形成遍及所有环的完全离域的π电子体系。杂脂环基基团可以不被取代或被取代。当被取代时，取代基可以是独立地选自如下基团的一个或者多个基团：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、被保护的羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、酯、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸基、硫氰基、异硫氰基、硝基、甲硅烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲烷磺酰基、三卤代甲烷磺酰氨基和包括单取代和双取代的氨基在内的氨基，及上述基团的被保护的衍生物。这样的“杂脂环”或“杂脂环基”的实例包括但不限于氮杂卓基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、1，3-二氧芑、1，3-二噁烷、1，4-二噁烷、1，2-二氧戊环基、1，3-二氧戊环基、1，4-二氧戊环基、1，3-氧硫杂环己烷、1，4-氧硫杂环己二烯、1，3-氧硫杂环戊烷、1，3-二硫杂环戊二烯、1，3-二硫戊环、1，4-氧硫杂环己烷、四氢-1，4-噻嗪、2H-1，2-噁嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二酮哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、三噁烷、六氢-1，3，5-三嗪、咪唑啉基、咪唑烷、异噁唑啉、异噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷、吗啉基、环氧乙烷基、哌啶基、N-氧化物、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮、pyrrolidione、4-哌啶酮基、吡唑啉、吡唑烷基、2-氧代吡咯烷基、四氢吡喃、4H-吡喃、四氢噻喃、硫代吗啉基、硫代吗啉基亚砜、硫代吗啉基砜以及它们的苯并稠合类似物(例如，苯并咪唑啉酮、四氢喹啉、3，4-亚甲二氧基苯基)。
每当基团被描述为“任选取代”时，该基团可以不被取代或被一个或多个所指明的取代基取代。同样地，当基团被描述为“不被取代或被取代”时，如果被取代，则取代基可以选自一个或多个所指明的取代基。
除非另有说明，当取代基被认为“任选取代”或“取代”时，意为该取代基为可以被一个或多个基团取代的基团，所述的一个或多个基团分别独立地选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、被保护的羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、酯、巯基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸基、硫氰基、异硫氰基、硝基、甲硅烷基、亚氧硫基、亚硫酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲烷磺酰基、三卤代甲烷磺酰氨基和包括单取代和双取代的氨基在内的氨基，及上述基团的被保护的衍生物。可以形成上述取代基的保护性衍生物的保护基是本领域技术人员已知的，并可以在参考书中找到，例如Greene and Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)，3rd Ed.，John Wiley&Sons，New York，NY，1999，在此将其整体内容引入本文中作为参考。
应当理解，在具有一个或多个手性中心的本文所述的任何化合物中，如果未明确指明绝对立体化学，则每一中心可以独立地为R-构型或S-构型或其混合物。因此，本文提供的化合物可以为对映纯或者为立体异构混合物。另外，应当理解，在本文所述的任何化合物中，当其具有一个或多个产生能够被定义为E或Z的几何异构体的双键时，每一双键可以独立地为E或Z或其混合物。同样，还旨在包括所有的互变形式。
本文所用的术语“脂质”是指脂肪和类似脂肪的化合物。示例性脂质包括脂肪酸和甾醇。脂肪酸是长链的一元羧酸。脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。脂质的特点是基本上不溶于水，在水中具有小于约0.01％(基于重量)的溶解性。本文所使用的术语“脂质基团”是指直接与其它基团相连接的脂质或者其部分。例如，脂质基团可以通过脂肪酸上的官能团(如羧酸基团)与所述单体上的适当的官能团之间的化学反应来与其它化合物(如单体)相连接。
本文中使用的术语“交联”是指已经通过诸如共价键等化学键横向连接在一起的聚合物链。本文所用的术语“交联”意为包括各种不同的交联度，如轻度交联，中度交联和高度交联。
本文所述的实施方案涉及本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物的合成。Lyrn等人已描述了采用二丙烯酸酯作为阳离子化合物之间的连接分子来合成可生物降解的阳离子聚合物的方法(参见Lynn，et al.J.Am.Chem.Soc.2001，123，8155-8156)，在此将其整体内容引入本文作为参考。在一些实施方案中，水溶性可降解的交联阳离子聚合物可以通过如下步骤合成：将含有乙亚胺重复单元的第一反应物溶解在有机溶剂中形成溶解或部分溶解的高分子反应物；将该溶解或部分溶解的高分子反应物与可降解单体反应物反应以形成可降解交联聚合物，其中该可降解单体反应物含有脂质基团；将该可降解交联聚合物与第三反应物反应，其中该第三反应物含有重复的聚乙二醇单元。例如，含有通式(I)的重复的可降解主链单元的水溶性可降解的交联阳离子聚合物可以通过如下所示的一种方法合成。如方案A所示，通式(II)化合物可以与PEI反应以形成可降解的交联阳离子聚合物，该聚合物包含一个或多个通式(III)部分。
方案A
Figure G2008800230487D00171
在方案中，A1、A2、R1和R2具有本文所述的关于通式(I)的相同含义。
在方案A中示例性说明的反应可以通过将PEI与通式(II)化合物在诸如乙醇、甲醇或三氯甲烷等互溶剂中混合并搅拌；优选在室温下搅拌数个小时。采用本领域技术人员公知的技术回收所得聚合物。例如，可以蒸发溶剂来回收所得聚合物。本发明不受理论约束，但是认为PEI与通式(II)化合物之间的反应涉及PEI的一个或多个胺与通式(II)化合物的双键之间的Michael反应(参见J.March，Advanced Organic Chemistry(高等有机化学)3rd Ed.，pp.711-712(1985))。方案A中所示的通式(II)化合物可以以美国专利申请公开No.2006/0258751中所述的方式制备，将包括所有附图在内的该专利申请公开在此引入本文作为参考。
所述PEI可以是线性的或支化的。重复的PEI主链单元可以具有通式(IV)、(V)、(VI)、(VII)和/或(VIII)的结构。
可以使用不同分子量的PEI。当PEI为支化时，重复的PEI主链单元的分子量优选为约200道尔顿-25,000道尔顿，更优选为400道尔顿-5,000道尔顿，还更优选约600道尔顿-2,000道尔顿。当PEI为线性时，重复的PEI主链单元的分子量优选为约200道尔顿-25,000道尔顿。在实施方案中，线性的重复的PEI主链单元可具有约400道尔顿-约1,200道尔顿的分子量。
可以使用可降解单元与PEI的多种摩尔比来制备水溶性可降解的交联阳离子聚合物。在一些实施方案中，可降解单体反应物(如通式(II)化合物)与PEI的摩尔比可以为约0.1∶1-约50∶1。在实施方案中，可降解单体反应物与PEI的摩尔比可以为约1∶1-约30∶1。在一些实施方案中，可降解单体反应物与PEI的摩尔比可以为约5∶1-约25∶1。
然后，通式(III)部分可以与PEG或诸如mPEG(甲氧基聚(乙二醇))的其衍生物反应，以形成水溶性可降解的交联阳离子聚合物。在一些实施方案中，反应在室温下进行。所述反应产物可以通过包括色谱技术在内的本领域技术人员公知的任何方法分离。在实施方案中，所述反应产物可以通过沉淀和随后的离心法来获得。
可以使用不同分子量的PEG及其衍生物。在一些实施方案中，重复的聚乙二醇主链单元可具有约50道尔顿-约5,000道尔顿的分子量。在实施方案中，重复的聚乙二醇主链单元可具有约400道尔顿-约600道尔顿的分子量。
PEG与PEI的摩尔比可以变化。在一些实施方案中，PEG与PEI的摩尔比可以为约0.1∶1-约12∶1。在一些实施方案中，PEG与PEI的摩尔比可以为约1∶1-约10∶1。在一些实施方案中，PEG与PEI的摩尔比可以为约1∶1-约4∶1。
当R1是氢，或者任选取代的取代基时，所述取代基选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、芳基、杂芳基和杂环基时，通式(II)化合物能够通过本领域技术人员公知的方法制备。一种方法在方案B中表示如下。
方案B
Figure G2008800230487D00191
在方案B中，本文所述的A1、A2、R1和R2与本文所述的A1、A2、R1和R2相同，LG是适当的离去基团，如卤素。
水溶性可降解的交联阳离子聚合物的重均分子量可以变化。在一些实施方案中，重均分子量可以为约500道尔顿-约1,000,000道尔顿。在实施方案中，重均分子量可以为约2,000道尔顿-约200,000道尔顿。分子量可以通过本领域技术人员公知的方法测定，例如，通过采用PEG标准的尺寸排阻色谱法或者琼脂糖凝胶电泳法。
多种的含有本文所述的重复主链单元(如通式(I)、PEI和PEG)的水溶性可降解的交联阳离子聚合物可以通过改变PEI的分子量和结构、PEG分子量和结构、通式(II)化合物中R1和R2基团的大小和类型、A1和/或A2基团，和/或通式(II)与PEI和PEG的摩尔比来制备。另外，可以使用不同的二丙烯酸酯和其衍生物的混合物和/或不同的PEI的混合物和/或不同的PEG的混合物。在实施方案中，本文所述的关于合成水溶性可降解的交联阳离子聚合物的方法可以用于合成包括本文所示的通式(Ia)部分的聚合物。
水溶性可降解的交联阳离子聚合物优选是可生物降解的。可降解机理的非限制实例包括但不限于水解、酶裂解、还原、光裂解和/或声波降解。本发明并不受理论限制，但是认为细胞内通式(I)的可降解单元的降解通过酶裂解和/或酯键的水解进行。
本文所述的实施方案涉及应用本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物来递送RNA至细胞内的方法。优选地，所述RNA为短干扰RNA(siRNA)。RNA，以及更具体地，siRNA，包括具有5-50个碱基对的RNA，优选地具有10-35个碱基对且更优选地具有19-27个碱基对。RNA也可以包括混合的RNA/DNA分子或者混合的蛋白/RNA分子。核酸的递送可以在水溶液或者固相支持体上进行。
优选的实施方案涉及与常规的转染检测相比，更简单、方便、以及有效的转染装置和方法。根据本文描述的方法，通过将诸如水溶性可降解的交联阳离子聚合物的转染试剂固定到细胞培养装置的固体表面上来制造转染装置。在这个优选的实施方案中，无需将核酸与转染试剂进行预混合。这除去了常规的转染方法所要求的关键的耗时步骤。与常规方法所需要的2至5个小时或更长的时间相比，研究者仅需要约40分钟就可以完成对10个样品的全部转染过程。这对于一次测试数百个样品的高通量转染检测尤为有利。
在优选实施方案中，用于涂布本文所述的转染装置的转染试剂包括但不限于水溶性可降解的交联阳离子聚合物、阳离子聚合物、脂质聚合物、阳离子聚乙二醇化聚合物、聚乙二醇化脂质聚合物、阳离子脂质和聚乙二醇化阳离子脂质。阳离子聚合物的实例包括但不限于CytoPureTM(Qbio基因)、聚赖氨酸和聚精氨酸。脂质聚合物试剂的实例包括但不限于jetPEITM(Qbio基因)。聚乙二醇化阳离子聚合物的实例包括但不限于PEI-PEG共聚物(Zhong，et al.(2005)Biomacromolecules vol.6：3440-3448，在此引入本文作为参考)、PEG-接枝的阳离子聚合物(参见美国专利No.6,586,254，在此引入本文作为参考)以及本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物。阳离子脂质试剂的实例包括但不限于DOTAP(1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷)、LipofectamineTM(Invitrogen)和siPORTTM(Ambion)。聚乙二醇化阳离子脂质的实例包括但不限于PEG-脂质复合物(Martin-Herranz，et al.(February 2004)Biophysical Journal vol.86：1160-1168，在此引入本文作为参考)。在表1中描述了用于涂布转染装置的其它阳离子聚合物。在一些实施方案中，所述的转染试剂是阳离子聚乙二醇化聚合物。在实施方案中，所述的阳离子聚乙二醇化聚合物可以是如本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物。
表1
优选实施方案中阳离子化合物和低聚物的结构
Figure G2008800230487D00211
Figure G2008800230487D00221
优选的实施方案涉及将阳离子聚乙二醇化聚合物转染试剂，例如本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物，涂布至转染装置上，该转染装置非常易于贮存，这提供了用于siRNA递送的简单方法，该方法不需要将siRNA/转染试剂混合的步骤。本文描述的转染方法可在短时间内完成，例如约40分钟，并且提供了用于转染的高通量方法，其中可一次转染大量的样品。
本文所述的用于基因抑制的方法和装置的实施方案克服了在上文所述的常规转染检测中遇到的常见问题。所述的阳离子聚乙二醇化聚合物转染试剂可以被简单地涂布在细胞培养装置的表面上，这易于商品化并大量生产。消费者，例如研究人员，仅需要在转染前将诸如所关注的siRNA等核酸直接加入到细胞培养装置的表面。然后无需更换培养基，将细胞接种在该细胞培养装置的表面上并孵育，以及分析该细胞。在转染操作期间不必更换培养基。本文所述的方法通过减少所涉及的步骤数目，极大地减少了出错的风险，因而提供了该系统的一致性和准确性。
在优选的实施方案中，将转染试剂固定在载玻片或多孔板的表面上。然而，也可以使用任何形状的固相支持体或半固相支持体，包括但不限于板、过滤器和柱填充材料，如任何形状和大小的珠、纤维和小球等。
可以使用任何合适的表面，该表面能够用于将含有siRNA的混合物固定在其表面上。在一些实施方案中，可以使用半固相支持体，如膜(如硝酸纤维素、甲基纤维素、PTFE或纤维素)以及尼龙膜和纸支持体。
用于支持体的固体或半固体材料可以是金属、非金属、聚合物或塑料、弹性体或生物衍生材料。优选的金属为金、不锈钢、铝、镍钛合金、钴铬合金(cobalt chrome)或钛。优选的非金属材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅或陶瓷。
优选的塑料聚合物和弹性体材料包括但不限于聚苯乙烯、聚缩醛、聚氨酯、聚酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚醚酮、聚苯醚、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、丙烯腈一丁二烯一苯乙烯、聚醚酰亚胺、聚偏1，1-二氟乙烯及其共聚物和组合。所述材料可以选自聚硅氧烷、氟化聚硅氧烷、乙丙橡胶、含氟弹性体以及其组合。所述材料可选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚已内酯、聚对二氧环己酮、聚碳酸亚丙基酯及其共聚物。
在一些实施方案中，可以使用生物衍生材料，如蛋白质、凝胶、琼脂、胶原蛋白、弹性蛋白、甲壳质、珊瑚、透明质酸、骨及其组合。
在一些实施方案中，固相或半固相支持体可包括组织(如皮肤、内皮组织、骨头、软骨)或者矿物质(如羟磷灰石、石墨)。
根据优选的实施方案，所述表面可以是载玻片(玻璃或聚-L-赖氨酸涂布的载玻片)或者多孔板的孔。在一些实施方案中，固体或半固体表面可以是可植入的装置，如支架。
通过使用这装置，仅需要将siRNA加入到所述表面并使转染试剂与siRNA形成复合物。该反应在大约30分钟内发生。然后将细胞接种到所述表面，并在合适的用于将siRNA引入细胞内的条件下进行孵育。这些步骤可以手动进行、通过自动化系统进行、或者通过一些步骤由手动执行，其它步骤自动执行的联合方式进行。
对于载玻片，如涂有聚-L-赖氨酸的载玻片(如Sigma，Inc.)，将转染试剂固定在表面上并干燥，然后引入所关注的核酸，如双链siRNA。将该载玻片在室温下孵育30分钟，以在转染装置的表面上形成siRNA/转染试剂复合物。该siRNA/转染试剂复合物形成用于高通量微阵列的基质，该微阵列可用于同时研究成百上千种核酸。在可选择的实施方案中，该转染试剂或者药物递送试剂能够被固定到转染装置表面上离散的、限定的区域内，以形成转染试剂或药物递送试剂的微阵列。在这个实施方案中，待被引入到细胞内的诸如核酸的分子连同转染试剂或递送试剂一起被分散在转染装置的表面上。这种方法用于从数千种化合物中筛选转染试剂或其它递送试剂。这种筛选方法的结果能够通过计算机分析来检验。
在另一个实施方案中，多孔板的一个或多个孔可以涂有阳离子聚乙二醇化聚合物转染试剂。通常用于转染和药物筛选的板为96孔板和384孔板。阳离子聚乙二醇化聚合物转染剂可以被均匀地涂在板的底部。然后通过例如多道移液器或者自动化仪器，将数百种诸如siRNA的生物分子加入到孔内。然后使用酶标仪来测定转染的结果。这是非常方便的分析转染细胞的方法，因为在大多数生物医学实验室中普遍使用酶标仪。涂有阳离子聚乙二醇化聚合物转染试剂的多孔板可以广泛用于大多数实验室中以研究基因调节、基因功能、分子疗法和信号转导、以及药物筛选。另外，如果将不同种类的阳离子聚乙二醇化聚合物转染试剂涂布多孔板的不同孔，该板可用于相对有效地筛选许多阳离子聚乙二醇化聚合物转染试剂。最近，已经开发了1536和3456孔板，它们也可以根据本文所述的方法使用。
所述的转染试剂或递送试剂优选为能够将诸如核酸的生物分子，优选siRNA，引入细胞内的阳离子聚乙二醇化聚合物转染试剂。优选的实施方案使用可降解阳离子聚乙二醇化聚合物，如本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物。
在合适的条件下，将siRNA加入到转染装置中以形成生物分子/递送试剂复合物，该转染装置涂有转染试剂或递送试剂，如水溶性可降解的交联阳离子聚合物。所述的生物分子优选地溶于不含有胎牛血清和抗生素的细胞培养基中，例如Dulbecco′s Modified Eagles Medium(DMEM)。如果所述的转染试或递送试剂被均匀地固定在载玻片上，则所述的生物分子能够被点样至该载玻片上的不连续区域上。或者，可以将转染试剂或递送试剂点样到载玻片上的不连续区域上，简单地加入siRNA以覆盖转染装置的整个表面。如果所述的转染试剂或者递送试剂被固定在多孔板的底部，则通过多道移液器、自动化装置或者其它方法将siRNA简单地加入至不同孔内。将所得产物(涂有转染试剂或者递送试剂和siRNA的转染装置)在室温下孵育5分钟-3小时，优选10-90分钟，更优选20-30分钟以形成所述的siRNA/转染试剂(或递送试剂)复合物。在某些情况下，例如，将不同种类的生物分子点样到载玻片的不连续区域上，除去siRNA溶液以产生带有siRNA的表面，该siRNA存在于与转染试剂的复合物中。在其它情况下，将siRNA溶液保留在表面上。随后，将在合适的培养基中的细胞以适当的密度接种至所述表面上。将所得产物(带有siRNA和接种的细胞的表面)维持在导致生物分子进入接种的细胞的条件下。
根据本文所述的方法，适用的细胞包括原核生物、酵母或高等真核细胞，包括植物和动物细胞，特别是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞为癌细胞。在一些优选的实施方案中，使用为癌症的模型体系的细胞系，包括但不限于乳腺癌(MCF-7，MDA-MB-438细胞系)、U87成胶质细胞瘤细胞系、B16F0细胞(黑素瘤)、HeLa细胞(子宫颈癌)、A549细胞(肺癌)以及大鼠肿瘤细胞系GH3和9L。在最优选的实施方案中，B16F0细胞(黑素瘤)或HeLa细胞(子宫颈癌)用作测试系统。在优选的实施方案中，siRNA递送试剂用来测试作为治疗方法的siRNA对癌症的有效性。
将真核细胞，如哺乳动物细胞(例如，人、猴、犬、猫、牛或鼠类细胞)、细菌、昆虫或植物细胞等以充足的密度和在适当条件下接种到涂有转染试剂或递送试剂和生物分子的转染装置上，所述条件适合该生物分子向真核细胞内的引入/进入以及该生物分子与细胞组分的相互作用。在具体实施方案中，所述细胞可以选自造血细胞、神经元细胞、胰腺细胞、肝细胞、软骨细胞、骨细胞或肌细胞。所述细胞可以是完全分化的细胞或祖细胞/干细胞。
在优选实施方案中，将真核细胞在含有10％热灭活的胎牛血清(FBS)和L谷氨酰胺和青霉素/链霉素(pen/strep)的Dulbecco’s ModifiedEagles Medium(DMEM)中培养。本领域技术人员应当认识到某些细胞应该在特定培养基中培养，因为某些细胞需要特定的营养，例如生长因子和氨基酸。细胞的最佳密度取决于细胞类型和实验目的。例如，70-80％融合的细胞群优选用于基因转染，但是用于寡核苷酸递送的最佳条件是30-50％融合的细胞。例如，如果将5×104个293细胞/孔接种到96孔板上，那么在细胞接种后18-24小时细胞可达到90％的融合。对于HeLa 705细胞，在96孔板上仅需要1×104个细胞/孔就可以达到相似的融合百分比。
在将细胞接种到含有siRNA/递送试剂的表面后，就在用于该细胞类型的最佳条件下孵育该细胞(例如37℃，5-10％CO2)。培养时间取决于实验目的。通常，就基因转染实验而言，将细胞孵育24至48小时以使细胞表达靶基因。在对细胞内siRNA的胞内运输的分析中，可能需要数分钟至数小时的孵育并且可以在确定的时间点观察细胞。
可以通过不同的方法分析siRNA递送的结果。就基因转染和反义核酸递送而言，可以通过诸如绿色萤光蛋白(GFP)基因、荧光素酶基因或β-半乳糖苷酶基因等报道基因的表达来检测靶基因表达水平。例如，GFP信号可以在显微镜下直接观察，荧光素酶的活性可以通过照度计来检测，以及由β-半乳糖苷酶催化的蓝色产物可以在显微镜下观察或通过酶标仪测定。本发明的实施不限于这些实例。本领域技术人员熟知这些报道基因如何起作用以及如何将它们引入基因递送系统。可以通过不同方法确定根据本文所述方法递送的核酸及其产物、蛋白、肽或其它生物分子以及由这些生物分子调节的靶标，所述方法例如检测免疫荧光或酶免疫细胞化学、放射自显影或原位杂交。如果使用免疫荧光来检测编码蛋白的表达，则使用结合靶蛋白的荧光标记的抗体(例如在适合抗体与蛋白结合的条件下加入到载玻片上)。然后通过检测荧光信号来鉴别含有该蛋白的细胞。如果所递送的分子可以调节基因表达，那么靶基因的表达水平还可以通过诸如放射自显影、原位杂交和原位PCR等方法测定。然而，鉴定方法取决于递送的生物分子的性质、它们的表达产物、由其调节的靶标和/或由生物分子的递送产生的终产物。
递送方法可以包括将聚合物分散至诸如培养皿、载玻片或多孔板的表面上。然后可以将细胞和siRNA以任意顺序加入并孵育一段时间，该时间有效地将siRNA递送至细胞内。
递送增强剂
在一些实施方案中，组合物可包含递送增强剂。一般认为RNAi或siRNA生物分子转运至细胞内时存在三种屏障。它们是细胞膜、内体膜以及所述生物分子从屏障中的释放。
就DNA和RNA而言，核酸-载体复合物必须先通过细胞膜。当这一过程通过胞吞作用完成时，所述核酸-载体复合物随后被内化。该载体连同核酸-负载物通过形成口袋来被细胞膜包裹，该口袋随后脱落。结果得到细胞内体，该细胞内体为包裹核酸负载物和载体的大型膜结合结构。然后该核酸-载体复合物必须自内体膜逃逸至细胞质中，并在细胞质中避免酶降解。所述的核酸负载物必须与载体分离。通常，被设计用来克服上述的一个或多个屏障的任何物质均可认为是递送增强剂。
通常，递送增强剂分成两类：病毒载体系统和非病毒载体系统。如上所述由于人类病毒已进化出克服屏障以转运至细胞核内的方法，所以病毒或病毒成分可被用于将核酸转运至细胞内。用作递送增强剂的病毒成分的另一个实例是血凝素肽(HA肽)。该病毒肽通过破坏内体促进生物分子向细胞内的转移。在内体的酸性pH值下，该蛋白引起生物分子和载体向细胞液中的释放。
非病毒递送增强剂可以是基于聚合物的或基于脂质的。通常它们是用于平衡核酸的负电荷的聚阳离子。诸如PEI等支链形式的聚阳离子和星型树枝状聚合物可以介导内体释放(Boussif等人，(1995)Proc.Natl.Acas.Sci.USA vol.92：7297-7301)。PEI是含末端胺和内胺的高支化聚合物，在pH值为6.9时末端胺可电离，在pH值为3.9时内胺可电离。由于该结构，PEI可以产生小泡pH值的变化，该变化导致小泡膨胀，最终从内体的俘获中释放。
增强递送的另一种方法是在载体上设计配体。该配体必须在所靶向的用于递送负载物的细胞上具有受体。然后通过受体识别引发生物分子向细胞内的递送。当该配体与其特异性细胞受体结合时，激发胞吞作用。用于不同细胞类型以增强生物分子转运的配体的实例是半乳糖、转铁蛋白、糖蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白、腺病毒纤维、疟原虫环子孢子蛋白、表皮生长因子、人乳头瘤病毒衣壳、成纤细胞生长因子以及叶酸。在叶酸受体的情况下，通过称为摄液作用的过程来内化结合的配体，其中受体与配体结合，周围的膜从细胞表面伸出将其包围，然后该内化的物质穿过液胞膜进入细胞质(Gottschalk等(1994)Gene Ther1：185-191)。
多种试剂可用来破坏内体。除了上述的HA-蛋白外，缺陷病毒颗粒也可用作水解内体的试剂(Cotten等(July 1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.89：6094-6098页)。非病毒试剂是两亲的或基于脂质的。
介导内体破裂、减少降解或同时绕过该过程的试剂可增强诸如DNA等生物分子释放至细胞的细胞质内。增高内体pH值的氯喹被用于通过抑制溶酶体的水解酶来减少细胞内吞物质的降解(Wagner等(1990)Proc Natl Acad Sci USA vol.87：3410-3414)。诸如PEI等支链聚阳离子和星型树枝状聚合物也促进上述内体的释放。
为了完全绕过内体降解，使用诸如白喉毒素和假单胞菌外毒素等毒素的亚基作为嵌合蛋白的成分，该嵌合蛋白可被并入基因/基因载体复合物中(Uherek等人(1998)J Biol.Chem.Vol.273：8835-8841)。这些成分促进核酸通过内体膜穿梭并通过内质网返回。
使用方法
本文所公开的一个实施方案涉及治疗癌症的方法，该方法包括使用本文所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物来将siRNA递送至哺乳动物的癌细胞内以用于治疗癌症。示例性的癌症包括子宫颈癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、白血病、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌或非霍奇金淋巴瘤。
在实施方案中，siRNA作为疾病治疗被给药。在优选的实施方案中，将与在疾病状态下表达或过度表达的基因的编码区的全部或部分相对应的siRNA对需要治疗的病人给药。在优选的实施方案中，与编码在心血管疾病或糖尿病中升高的蛋白质的基因的全部或部分相对应的siRNA对个体给药，以使基因产物的水平达到或接近于正常和/或健康范围。在优选的实施方案中，以与本文所述的转染试剂形成的复合物的形式，将对应于载脂蛋白-B(Apo-B)的siRNA给药。与载脂蛋白-B(Apo-B)的编码区相对应的siRNA的给药可以降低患心血管疾病、心肌梗死和/或卒中等疾病的风险。
本文中所用的“个体”是指动物，其为治疗、观察或实验的对象。“动物”包括冷血、温血脊椎动物和无脊椎动物，例如鱼类、贝类和爬行动物等，特别是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、犬、猫、绵羊、山羊、牛、马、诸如猴子、黑猩猩和大猩猩等灵长类动物，尤其是人。
本文中所用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“治疗的(therapeutic)”或“治疗(therapy)”并不一定意味着疾病或疾病状态的完全治愈或者根除。疾病或疾病状态的任何不期望的迹象或症状在任何程度上的任何缓解均可被认为是治疗(treatment)和/或治疗(therapy)。另外，治疗(treatment)可以包括可使患者的整体健康感觉或外表恶化的行为。
所述术语“治疗有效量”用于表示引起所示的生物或医学反应的活性化合物或药物试剂的量。这种反应发生在组织、系统、动物或人中并包括所治疗的疾病症状的减轻。
本文所述的组合物和药物组合物的确切的制剂、给药途径和剂量能够由个体医师根据患者情况进行选择。(参见例如，Fingl et al.1975，“ThePharmacological Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础)”中，其整体内容在此引入作为参考)。通常，向患者给予的组合物的剂量范围能够是约0.5至1000mg/kg患者体重，或1-500mg/kg患者体重，或10-500mg/kg患者体重，或50-100mg/kg患者体重。根据患者的需要，剂量可以是单一剂量或者是一天或更多天的过程中给予的一系列的二次剂量或多次剂量。当人体剂量未被确立时，合适的人体剂量能够由ED50值或ID50值推测，或由得自于体外或体内研究的其它合适的值来推测，由动物的毒性研究和有效性研究来限定。
虽然确切的剂量将基于各个药物(drug-by-drug basis)来确定，但在大多数情况下，能够对剂量进行某些概括。用于成人患者的日剂量方案可以是，例如，每种成分的0.1mg至2000mg、优选1mg至500mg、例如5mg至200mg的口服剂量，或者每种成分的静脉内剂量、皮下剂量或肌内剂量为0.01mg至100mg、优选0.1mg至60mg、例如1mg至40mg的药物组合物中的每种成分或按照其游离碱计算的药物可接受的盐，组合物每天给药1至4次。或者，本文公开的组合物可优选地以每种成分高达400mg每天的剂量通过持续静脉内输注给药。因此，通常每种成分口服给药的总的日剂量为1-2000mg以及通常肠胃外给药的总的日剂量为0.1-400mg。在某些实施方案中，给予化合物一段持续治疗期，例如一周或更多，或者数月或数年。
可个别地调整剂量和间隔以提供足以维持调节作用的活性部分的血浆水平，或提供最低有效浓度(MEC)。MEC对于每种化合物是不同的，但能够由体外数据估计。达到MEC所必需的剂量将取决于个体特征和给药途径。然而，HPLC测定或生物测定能够用于确定血浆浓度。
还能够使用MEC值确定给药间隔。应当使用以下方案给予组合物：该方案在10％-90％的时间，优选在30％-90％的时间且最优选在50％-90％的时间内将血浆水平保持在MEC以上。
给予的组合物的量可取决于被治疗的个体、个体的体重、痛苦的严重性、给药方式和处方医师的判断。
实施例
所有的化学药品，甲醇、二氯甲烷(DCM)、聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯(PEG)和其它试剂均购自Sigma-Aldrich化学公司。聚乙烯亚胺购自PolyScience，Inc.。通式(II)的可降解单体反应物根据美国专利申请No.11/216,986(美国公开No.2006/0258751)中报道的通用方法合成，在此将其引入本文作为参考。
HeLa人宫颈腺癌细胞和B16F0小鼠皮肤黑素瘤细胞购自ATCC并在具有10％FBS的DMEM培养基中培养。
通过将GFP表达载体转染进细胞内生成GFP-表达稳定细胞系并利用潮霉素B(用于HeLa-GFP)或新霉素(用于B16F0-GFP)进行挑选。
实施例1
水溶性可降解的交联阳离子聚合物的合成：
合成的示意略图如图1所示。将PEI(30mg)溶于甲醇(3ml)中。将通式(II)的可降解单体反应物(36mg)的DCM(二氯甲烷)(6ml)溶液加入到PEI溶液中。搅拌该混合物4小时。将mPEG(23mg)的DCM(2ml)溶液添加到该混合物中。添加后，再搅拌混合物4小时。通过加入2M的在乙醚中的盐酸，将反应混合物淬灭。形成白色的沉淀物，通过离心法分离，并且用乙醚洗涤。在高真空中干燥后获得水溶性可降解的交联阳离子聚合物产物(65mg，74％产率)。该产物用1H-NMR确认。
实施例2
水溶性可降解的交联阳离子聚合物的合成：
合成的示意略图如图1所示。将PEI(15mg)溶于甲醇(3ml)中。将通式(II)的可降解单体反应物(71mg)的DCM(6ml)溶液加入到PEI溶液中。搅拌该混合物4小时。将mPEG(11mg)的DCM(2ml)溶液加入到该混合物中。添加后，再搅拌混合物4小时。通过加入2M的在乙醚中的盐酸，将反应混合物淬灭。形成白色的沉淀物，通过离心法分离，并且用乙醚洗涤。在高真空中干燥后获得水溶性可降解的交联阳离子聚合物产物(65mg，74％产率)。该产物用1H-NMR确认。
实施例3
水溶性可降解的交联阳离子聚合物的合成：聚合物1
将支化的PEI(MW＝1200道尔顿，0.960g，0.80mmol)在二氯甲烷∶甲醇(1∶2，8ml)混合物中的溶液加入到通式(II)的可降解单体反应物(1.91g，4.0mmol)在二氯甲烷∶甲醇(1∶2，40ml)中的溶液。添加前，用二氯甲烷∶甲醇(1∶2，0.5ml×4次)洗涤装有通式(II)的可降解单体反应物的烧瓶。添加结束后，反应混合物在室温下搅拌2小时。
然后加入mPEG(MW＝454道尔顿，0.726g，1.6mmol)在二氯甲烷∶甲醇(1∶2，3ml)中的溶液。在添加之前，用二氯甲烷∶甲醇(1∶2，0.5ml×4次)洗涤装有mPEG的烧瓶。然后再将反应混合物搅拌一小时。
Figure G2008800230487D00331
然后将反应在冰水中冷却10分钟，随后在搅拌的同时，将反应用2M盐酸乙醚溶液淬灭。将悬浮液置于八个50ml的圆锥形的离心管中并用另外的冰乙醚(-20℃)稀释。将离心管中的悬浮液离心。轻轻倒出液体，并且用更多的乙醚洗涤白色固体产物并离心两次。真空干燥产物，获得3.97克(90％)。该产物，聚合物1(可降解脂质单元∶PEI∶PEG(5∶1∶2)用1H-NMR表征。
实施例4
siRNA转染：
在转染前一天，将表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞以1×104个细胞每孔的密度接种到96孔板。将siRNA(1.0μg)溶液溶解在蒸馏水中，并用OptiMEM(Invitrogen)进一步稀释到30μl。这些实验中所用的siRNA是抗GFP(CGAGAAGCGCGAUCACAUGUU(SEQ ID NO：1)。选定的水溶性可降解的交联阳离子聚合物[聚合物2(可降解单元∶PEI∶PEG(12∶1∶2))、聚合物3(可降解单元∶PEI∶PEG(16∶1∶2))、聚合物4(可降解单元∶PEI∶PEG(17∶1∶2))、聚合物5(可降解单元∶PEI∶PEG(20∶1∶2))和对照[PEI1200、CytopureTM、Lipofectamine 2000TM、可降解单元∶PEI(5∶1)，均为摩尔比]通过将递送试剂溶解在适量的dH2O中而制成浓度为5mg/ml。在实验期间，根据该实验确定的化合物与siRNA的比例，将递送试剂溶液用OptiMEM进一步稀释至终容积为30μl。将稀释的siRNA溶液和递送试剂溶液混合并在室温下孵育15min。将siRNA和递送试剂的混合物(15μl)加入到预接种的细胞的每个孔中，混合，并在具有5％CO2的37℃培养箱中孵育。48小时以后，评估转染率和细胞存活力。
实施例5
转染率的评估：
大约48小时以后，通过在荧光显微镜下测量GFP的表达来评估转染。使用紫外可见酶标仪在485-528nm检测GFP的吸收。在HeLa细胞中绿色荧光蛋白的活性百分率的结果如图2所示。在B16F0细胞中绿色荧光蛋白的活性百分率的结果如图3所示。结果显示与对照[PEI1200、CytopureTM、可降解单元∶PEI(5∶1)]相比，水溶性可降解的交联阳离子聚合物更有效地抑制(或沉默)绿色荧光蛋白的表达。
实施例6
细胞存活力测定：
通过将250mg固体3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(鎓)溴化物(MTT)溶解在50ml的Dubecco PBS中来制备MTT溶液并在4℃下贮存。转染48小时后，在细胞的每个孔中加入MTT溶液(10μl，浓度为5mg/ml)并在37℃下孵育2-4小时直至可以观察到紫色晶体生长。然后加入增溶溶液(100μl)并在37℃下孵育一整夜。用在690nm的吸光度作参照，在波长570nm检测吸光度。细胞存活力测定的结果如图4所示。
实施例7
平板涂布：
将PEI-1.2K、CytopureTM、L2K和聚合物1分别溶解在H2O中，形成5mg/ml的储备溶液。将不同的化合物以30μl终容积中0.625μg、1.25μg、2.50μg和5.0μg每孔的量涂布至96孔板上。将干燥的平板密封在铝箔中待用。
实施例8
转染：
将1.0μg siRNA(抗GFP)用OptiMEM(Invitrogen)稀释至30μl并加入到涂布的孔中，在室温下孵育25分钟。然后以100μl培养基中1.5×104个细胞每孔的量将细胞(表达GFP)接种到相应的孔中，并在具有5％CO2的37℃培养箱中孵育。
实施例9
检测：
转染48小时后，在显微镜下观察GFP的表达。采用紫外可见酶标仪在485-528nm检测GFP的吸光度。结果如图5、7、9、11和13所示，对于HeLa细胞而言，聚合物∶siRNA的比例为5∶1和10∶1，对于B16F0细胞而言聚合物∶siRNA的比例为2.5∶1、5∶1和10∶1。在所有情况下，与阳性对照(LipofectamineTM)相比，使用聚合物1的转染更好(HeLa细胞5∶1；B16F0，所有测试比例)或者相当(HeLa细胞，10∶1)。
实施例10
细胞存活力测定：
转染48小时后，将10μl的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑(鎓)溴化物(MTT，在PBS中浓度为5mg/ml)溶液加入到细胞的每个孔中，并将细胞在37℃下孵育2-4小时直至可以观察到紫色晶体生长。然后在每个孔中加入100μl增溶溶液并且将每个孔在37℃下孵育一整夜。用690nm的吸光度作参照，在波长570nm检测吸光度。结果如图6、8、10、12和14所示，对于HeLa细胞而言，聚合物∶siRNA的比例为5∶1和10∶1，对于B16F0细胞而言，聚合物∶siRNA的比例为2.5∶1、5∶1和10∶1。在用于两种细胞类型的所有测试比例下，聚合物1没有显示出细胞毒性。
实施例11
在HepG2细胞中siRNA对载脂蛋白-B蛋白的抑制
载脂蛋白-B(Apo-B)为低密度脂蛋白的主要载脂蛋白，是患心脏病风险的标志物。Apo-B表达的抑制可以降低患心脏病的风险。
如实施例1-3所述合成聚合物6。聚合物6是水溶性可降解的交联阳离子聚合物，其中可降解单元∶PEI∶PEG的摩尔比是16.5∶1∶2。可降解单元和PEI与实施例3中所述的相同。在图15和图17-20的实验中，聚合物6用作转染试剂。
如上文的实施例4所述，将1μg、2.5μg或5μg的siRNA(抗Apo-B，Dharmacon合成，具有有义序列：5′-GUCAUCACACUGAAUACCAAUUU-3′(SEQ ID NO：2)和反义序列：5′-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACUU-3′)(SEQ ID NO：3))(抗Apo-B)用与用作转染试剂的聚乙二醇化聚合物6复合的OptiMEM(Invitrogen)稀释至30μl。转染试剂∶siRNA的比例为2∶1。将混合物加入到含有HepG2细胞的96孔板内，该HepG2细胞以在100μl培养基中1.5×104个细胞每孔的量接种到孔中并在具有5％CO2的37℃培养箱中孵育。对照处理为(1)没有siRNA和聚合物(空白)、(2)仅有抗Apo-B(只有siapoB：5μg)、和(3)仅有转染试剂(只有聚合物6)。
孵育48小时后，通过定量RT-PCR，采用用于Apo-B mRNA的引物来测定mRNA表达，正向是5′-TTTGCCCTCAACCTACCAAC-3′(SEQ IDNO：4)以及反向为5′-TGCGATCTTGTTGGCTACTG-3′(SEQ ID NO：5)。图15显示在HepG2细胞培养中，siRNA对Apo-B mRNA表达的影响。相对于空白来表示表达。正如预期的，仅有siApo-B和仅有转染试剂(聚合物6)在HepG2细胞中对Apo-B的表达没有任何影响。当转染试剂/siRNA复合物的量增加时，在HepG2细胞中Apo-B mRNA水平的抑制降低，这表明阳离子聚乙二醇化聚合物转染试剂在将抗Apo-B递送至哺乳动物细胞内以体外抑制Apo-B方面是有效的。
实施例12
在5％葡萄糖中转染试剂/siRNA复合物的稳定性
图16表示与RiboGreenTM(Invitrogen)结合后，通过荧光来显示的转染试剂/siRNA复合物的稳定性。结果表明随着转染试剂(聚合物2)与siRNA的比例增加，荧光减少。
实施例13
在nu/nu小鼠中抗siRNA的作用
在转染试剂聚合物6和siRNA(抗Apo-B)之间以5∶1的比例形成复合物，制备按照上文的实施例11中所述。将该复合物皮下注射至小鼠的尾静脉。结果如图17所示。
参见图17，操作后48小时给予1.0mg/kg抗Apo-B siRNA和操作后2周给予2.5mg/kg抗Apo-B siRNA均有效地抑制了在nu/nu小鼠中Apo-B mRNA的表达。
在单独实验中，转染试剂(聚合物6)与抗Apo-B siRNA的比例从5∶1变化到10∶1。注射量保持在1.0mg/kg。尽管所有的比例均抑制Apo-BmRNA的表达，但在5∶1和7.5∶1的比例时观察到最强的抑制作用(图18)。
如图19所示，注射量为2.5mg/kg时，阳离子聚乙二醇化聚合物注射到小鼠中的抑制作用可持续至少两周。
实施例14
在C57BL/6小鼠中抗siRNA的作用
图20显示将1.0mg/kg的与转染试剂聚合物6复合的抗Apo-B siRNA注射至一般用途的小鼠品系(C57BL/6)中。相对于实施例13中的nu/nu小鼠，当注射量增加至1.0mg/kg，观察到了更强的Apo-B mRNA表达的抑制作用。观察到抑制作用持续了2周。在三周时，Apo-B表达水平回复到对照水平(图20)。
本领域技术人员会理解，能够进行多种不同的修改而不偏离本发明的精神。因此，应当清楚地理解，本发明的形式仅是示例性的而非旨在限制本发明的范围。

Claims (65)

1.用于siRNA递送的组合物，所述组合物包含水溶性可降解的交联阳离子聚合物，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含：
(a)重复的聚乙二醇(PEG)主链单元，
(b)重复的阳离子聚乙烯亚胺(PEI)主链单元，和
(c)重复的含有侧链脂质基团的可降解主链单元。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重复的聚乙二醇主链单元具有约50道尔顿-约5,000道尔顿的分子量。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重复的聚乙二醇主链单元具有约400道尔顿-约600道尔顿的分子量。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元具有约200-约25,000道尔顿的分子量。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元具有约600道尔顿-约2,000道尔顿的分子量。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的组合物，其中所述重复的可降解主链单元为通式(I)重复单元：
Figure F2008800230487C00011
其中：
A1不存在或者为任选取代的选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和-(CH2)n1-D-(CH2)n2-的取代基；
其中n1和n2各自独立地为0或1-10的整数；以及
D为任选取代的选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基；
A2为不存在、氧原子或-N(RN)，其中RN为H或C1-6烷基；
R1为电子对、氢或任选取代的选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基，
其中如果R1为氢或为任选取代的选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基，则与R1连接的氮原子具有正电荷；以及
R2选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C5-C50芳基、C5-C50杂芳基、-(CH2)p1-E-(CH2)p2-和甾醇；
其中p1和p2各自独立地为0或1-40的整数；以及
E为任选取代的选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中R2选自油基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、十七烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基和甾醇。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中R2为油基。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述重复的可降解主链单元为：
Figure F2008800230487C00031
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述重复的PEI主链单元具有约1200道尔顿的分子量。
11.根据权利要求9-10中任一权利要求所述的组合物，其中所述重复的PEI主链单元为支化的PEI单元。
12.根据权利要求9-11中任一权利要求所述的组合物，其中所述重复的PEG主链单元具有约454道尔顿的分子量。
13.根据权利要求1-12中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约1mole％-约95mole％的所述重复的可降解主链单元。
14.根据权利要求1-12中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约30mole％-约90mole％的重复的可降解主链单元。
15.根据权利要求1-12中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约50mole％-约86mole％的重复的可降解主链单元。
16.根据权利要求1-15中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约1mole％-约35mole％的所述重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元。
17.根据权利要求1-15中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约1mole％-约20mole％的所述重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元。
18.根据权利要求1-15中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约5mole％-约15mole％的所述重复的阳离子聚乙烯亚胺主链单元。
19.根据权利要求1-18中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约1mole％-约80mole％的所述重复的聚乙二醇主链单元。
20.根据权利要求1-18中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约1mole％-约50mole％的所述重复的聚乙二醇主链单元。
21.根据权利要求1-18中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约5mole％-约30mole％的所述重复的聚乙二醇主链单元。
22.根据权利要求1-18中任一权利要求所述的组合物，其中基于在所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物中重复单元的总摩尔数，所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含约8mole％-约30mole％的所述重复的聚乙二醇主链单元。
23.制备权利要求1所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物的方法，所述方法包括：
将包含乙烯亚胺重复单元的第一反应物溶解在有机溶剂中以形成溶解的或部分溶解的高分子反应物；
将所述溶解的或部分溶解的高分子反应物与可降解单体反应物反应以形成可降解交联聚合物，其中所述可降解单体反应物包含脂质基团；以及
将所述可降解交联聚合物与第三反应物反应，其中所述第三反应物包含重复的聚乙二醇单元。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一反应物为聚乙烯亚胺。
25.根据权利要求23-24中的任一权利要求所述的方法，其中所述可降解单体反应物为通式(II)化合物：
Figure F2008800230487C00061
其中：
A1不存在或为任选取代的选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基和-(CH2)n1-D-(CH2)n2-的取代基；
其中n1和n2各自独立地为0或1-10的整数；
D为任选取代的选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基；
A2为不存在、氧原子或-N(RN)，其中RN为H或C1-6烷基；
R1为电子对、氢或任选取代的选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基，
其中如果R1为氢或为任选取代的选自烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基，则与R1连接的氮原子具有正电荷；以及
R2选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C5-C50芳基、C5-C50杂芳基、-(CH2)p1-E-(CH2)p2-和甾醇；
其中p1和p2各自独立地为0或1-40的整数；以及
E为任选取代的选自环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和杂环基的取代基。
26.根据权利要求25所述的方法，其中R2选自油基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、十七烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基和甾醇。
27.根据权利要求25所述的方法，其中R2为油基。
28.根据权利要求23-27中任一权利要求所述的方法，其中所述第三反应物为聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述通式(II)化合物和所述PEI分别以约0.1∶1-约50∶1的摩尔比存在。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述通式(II)化合物和所述PEI分别以约1∶1-约30∶1的摩尔比存在。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述通式(II)化合物和所述PEI分别以约5∶1-约25∶1的摩尔比存在。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述PEG和所述PEI分别以约0.1∶1-约12∶1的摩尔比存在。
33.根据权利要求28所述的方法，其中所述PEG和所述PEI分别以约1∶1-约10∶1的摩尔比存在。
34.根据权利要求28所述的方法，其中所述PEG和所述PEI分别以约1∶1-约4∶1的摩尔比存在。
35.递送短干扰RNA(siRNA)至细胞内的方法，所述方法包括：
将权利要求1-22中任一权利要求所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物与所述siRNA混合以形成混合物；和
将一个或多个细胞与所述混合物接触。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述siRNA具有19-27个碱基对。
37.根据权利要求35-36中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为癌细胞。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述siRNA为与脂蛋白基因片段的编码区的至少一部分相对应的siRNA。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述脂蛋白为载脂蛋白-B。
41.治疗或降低心血管疾病风险的方法，所述方法包括将治疗有效量的、与权利要求1-22中任一权利要求所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物复合的siRNA对需要所述方法的个体给药，所述siRNA与脂蛋白基因片段的编码区域的至少一部分相对应。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述脂蛋白为载脂蛋白-B。
43.用siRNA转染真核细胞的方法，所述装置包含至少部分地固定有含转染试剂的组合物的固体表面，其中所述转染试剂选自水溶性可降解的交联阳离子聚合物、阳离子聚合物、脂质聚合物、聚乙二醇化阳离子聚合物、聚乙二醇化脂质聚合物、阳离子脂质、聚乙二醇化阳离子脂质和阳离子可降解聚乙二醇化脂质聚合物。
44.根据权利要求43所述的装置，其中所述固体表面为培养皿底部、多孔板、连续表面、珠、纤维或小球。
45.根据权利要求43所述的装置，其中所述固体表面为聚苯乙烯树脂、环氧树脂、天然树脂、玻璃或金属。
46.根据权利要求43所述的装置，其中通过将所述转染试剂均匀地分散在所述固体表面上或者通过手工或自动化机械装置将所述转染试剂点样在所述固体表面上，将所述转染试剂固定在表面上。
47.根据权利要求43所述的装置，其中所述转染试剂为水溶性可降解的交联阳离子聚合物。
48.根据权利要求47所述的装置，其中所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含：
(a)重复的聚乙二醇(PEG)主链单元，
(b)重复的阳离子聚乙烯亚胺(PEI)主链单元，和
(c)重复的含有侧链脂质基团的可降解主链单元。
49.根据权利要求48所述的装置，其中所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物包含具有约1200道尔顿分子量的重复的PEI主链单元、具有约454道尔顿分子量的重复的PEG主链单元以及重复的可降解主链单元，所述重复的可降解主链单元为：
50.根据权利要求48-49中任一权利要求所述的装置，其中所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物的分子量为约500道尔顿-约1,000,000道尔顿。
51.根据权利要求48-49中任一权利要求所述的装置，其中所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物的分子量为约2,000道尔顿-约200,000道尔顿。
52.测定siRNA是否能够进入真核细胞内的方法，所述方法包括：
(a)提供权利要求43所述的装置；
(b)将所述siRNA加入所述装置中以使所述siRNA与所述转染试剂相互作用；
(c)将所述真核细菌以充足的密度和在适当条件下接种到所述装置上，所述条件适于将所述siRNA引入所述细胞中；以及
(d)检测所述siRNA是否已经进入所述细胞中。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为分裂细胞或未分裂细胞。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为转化细胞或原代细胞。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为体细胞或干细胞。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述真核细胞为植物细胞或昆虫细胞。
58.用于将siRNA引入真核细胞的方法，所述方法包括：
(a)提供至少部分地涂有权利要求1-22中任一权利要求所述的水溶性可降解的交联阳离子聚合物的固体表面；
(b)将待被引入至所述真核细胞内的所述siRNA加入至所述细胞表面上；以及
(c)将细胞以充足的密度和在适当条件下接种到所述固体表面上，所述条件适于将siRNA引入所述真核细胞内。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述固体表面选自烧瓶、培养皿、多孔板、载玻片和植入式装置。
60.根据权利要求58所述的装置，其中通过将所述转染试剂均匀地分散在所述固体表面上或者通过手工或自动化机械装置将所述转染试剂点样在所述固体表面上，将所述水溶性可降解的交联阳离子聚合物固定在所述表面上。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述真核细胞为哺乳动物细胞。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为分裂细胞或未分裂细胞。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为转化细胞或原代细胞。
64.根据权利要求61所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为体细胞或干细胞。
65.根据权利要求58所述的方法，其中所述真核细胞为植物细胞或昆虫细胞。
CN200880023048A 2007-06-05 2008-06-02 用于递送核酸的peg-pei共聚物 Pending CN101755048A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94212707P 2007-06-05 2007-06-05
US60/942,127 2007-06-05
US97268607P 2007-09-14 2007-09-14
US60/972,686 2007-09-14
PCT/US2008/065564 WO2008151150A2 (en) 2007-06-05 2008-06-02 Peg-pei copolymers for nucleic acid delivery

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101755048A true CN101755048A (zh) 2010-06-23

Family

ID=39952451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880023048A Pending CN101755048A (zh) 2007-06-05 2008-06-02 用于递送核酸的peg-pei共聚物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20080312174A1 (zh)
EP (1) EP2164968A2 (zh)
JP (1) JP2010530013A (zh)
KR (1) KR20100017956A (zh)
CN (1) CN101755048A (zh)
CA (1) CA2688491A1 (zh)
WO (1) WO2008151150A2 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102329810A (zh) * 2011-08-19 2012-01-25 黄开红 一种siRNA输送载体及其应用
CN102337298A (zh) * 2011-08-19 2012-02-01 黄开红 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用
WO2012068870A1 (zh) * 2010-11-22 2012-05-31 苏州瑞博生物技术有限公司 三元复合物和含有三元复合物的液体及制备方法与应用
WO2019014924A1 (zh) * 2017-07-21 2019-01-24 中国科学院深圳先进技术研究院 一种病毒转染增效剂和基于点击化学的病毒转染应用
CN109620968A (zh) * 2017-10-09 2019-04-16 华东师范大学 一种用于基因治疗或转染的组合物及其制备方法和用途
CN109983127A (zh) * 2016-10-05 2019-07-05 先正达参股股份有限公司 基因沉默的改善或与基因沉默有关的改善
CN112370532A (zh) * 2012-10-08 2021-02-19 生物技术传送科技有限责任公司 作为转染试剂的羧化多胺衍生物
CN114450326A (zh) * 2019-06-24 2022-05-06 普罗美加公司 用于将生物分子递送到细胞中的改性聚胺聚合物
CN114901316A (zh) * 2019-08-05 2022-08-12 宝利普拉斯生物转染公司 包含接枝到阳离子聚合物上的三唑化合物的用于将核酸分子转染到细胞中的组合物及其应用

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7358223B2 (en) * 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
HUE056941T2 (hu) 2004-12-22 2022-04-28 Nitto Denko Corp Gyógyszerhordozó és gyógyszerhordozó kit fibrózis gátlására
US20120269886A1 (en) 2004-12-22 2012-10-25 Nitto Denko Corporation Therapeutic agent for pulmonary fibrosis
US9572886B2 (en) 2005-12-22 2017-02-21 Nitto Denko Corporation Agent for treating myelofibrosis
TWI407971B (zh) 2007-03-30 2013-09-11 Nitto Denko Corp Cancer cells and tumor-related fibroblasts
US7960336B2 (en) 2007-08-03 2011-06-14 Pharmain Corporation Composition for long-acting peptide analogs
US8563527B2 (en) 2007-08-20 2013-10-22 Pharmain Corporation Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same
JP2010539245A (ja) 2007-09-14 2010-12-16 日東電工株式会社 薬物担体
US20090156459A1 (en) * 2007-11-16 2009-06-18 Pharmain Corporation Cationic-Core Carrier Compositions for Delivery of Therapeutic Agents, Methods of Making and Using the Same
JP5317105B2 (ja) * 2009-01-13 2013-10-16 国立大学法人 筑波大学 四級化アミノ基を有する架橋ポリマー由来のポリマー微粒子と核酸の複合体
DE102009006606A1 (de) * 2009-01-29 2010-08-05 Philipps-Universität Marburg Nicht-virales Transfektionsmittel
JP2011155914A (ja) * 2010-02-01 2011-08-18 Osaka Univ 脂質異常症治療薬剤としての化学修飾ｓｉＲＮＡ
US8772205B2 (en) 2010-04-30 2014-07-08 Halliburton Energy Services, Inc. Water-soluble degradable synthetic vinyl polymers and related methods
AU2011247059B9 (en) * 2010-04-30 2014-01-09 Halliburton Energy Services, Inc. Water-soluble degradable synthetic vinyl polymers and related methods
US9334338B2 (en) 2010-04-30 2016-05-10 Halliburton Energy Services, Inc. Water-soluble degradable synthetic vinyl polymers and related methods
KR101231170B1 (ko) * 2010-10-01 2013-02-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 하이브리드 실리카 나노입자
DE102010047588A1 (de) * 2010-10-07 2012-04-12 Qualimed Innovative Medizinprodukte Gmbh Beschichteter Ballonkatheter
KR101685646B1 (ko) * 2010-12-29 2016-12-13 한화케미칼 주식회사 홍합 접착단백질 모방을 통한 나노입자를 수계 매질에 분산시키는 생체적합성 분산 안정화제
KR101786905B1 (ko) 2011-06-21 2017-10-19 닛토덴코 가부시키가이샤 아포토시스 유도제
CA2861402C (en) 2012-01-30 2021-10-12 Guy Casy Stabilized aqueous antibody compositions
US9518207B2 (en) 2012-06-29 2016-12-13 Halliburton Energy Services, Inc. Methods to prevent formation damage from friction reducers
JP6340162B2 (ja) 2012-12-20 2018-06-06 日東電工株式会社 アポトーシス誘導剤
JP6076076B2 (ja) 2012-12-21 2017-02-08 日東電工株式会社 組織再生促進剤
ES2899211T3 (es) 2014-06-17 2022-03-10 Nitto Denko Corp Inhibidores de GST-pi y RB1CC1 para su uso en el tratamiento de cáncer
EP4163322A1 (en) * 2015-04-02 2023-04-12 The Regents Of The University Of Michigan Hyperbranched polymers and polyplexes and dna or rna delivery systems including the same
EP3225257A1 (en) 2016-03-30 2017-10-04 Université de Strasbourg Amphiphilic monomers based nanovectors and their use for sirna delivery
JP2021531266A (ja) * 2018-07-12 2021-11-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 免疫応答を調節可能な金属含有製剤のための組成物および方法
US12071489B2 (en) 2020-05-12 2024-08-27 Cornell University Methods of converting biomass nucleic acids and converted biomass nucleic acid products and uses thereof
EP3984527A1 (en) 2020-10-13 2022-04-20 Ludwig-Maximilians-Universität München Nano-in-micro encapsulated sirna dry powder, method for producing the same and use of a powder formulation as a pharmaceutical dosage form, in particular for pulmonary delivery
KR102299170B1 (ko) * 2021-01-13 2021-09-07 영남대학교 산학협력단 유전자 전달능을 갖는 폴리에틸렌이민-콜산 이온결합 화합물 및 이의 용도

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5811119A (en) * 1987-05-19 1998-09-22 Board Of Regents, The University Of Texas Formulation and use of carotenoids in treatment of cancer
US20040028682A1 (en) * 1989-09-29 2004-02-12 Border Wayne A. Inhibiting transforming growth factor beta to prevent accumulation of extracellular matrix
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6509032B1 (en) * 1991-08-28 2003-01-21 Mcmaster University Cationic amphiphiles
US5283185A (en) * 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
CA2193954A1 (en) * 1994-06-27 1996-01-04 Vu L. Truong Targeted gene delivery system
FR2722506B1 (fr) * 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
US5883158A (en) * 1994-08-12 1999-03-16 Kao Corporation Process for producing improved super absorbent polymer
US5767168A (en) * 1995-03-30 1998-06-16 The Proctor & Gamble Company Biodegradable and/or compostable polymers made from conjugated dienes such as isoprene and 2,3-dimethyl-1, 3-butadiene
US5925379A (en) * 1997-03-27 1999-07-20 Geltex Pharmaceuticals, Inc. Interpenetrating polymer networks for sequestration of bile acids
US5827886A (en) * 1997-05-07 1998-10-27 Thione International, Inc. Composition for relief of arthritis-induced symptoms
WO1998056348A1 (en) * 1997-06-13 1998-12-17 University Of Nebraska Board Of Regents Compositions for delivery of biological agents and methods for the preparation thereof
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
US6290947B1 (en) * 1997-09-19 2001-09-18 Geltex Pharmaceuticals, Inc. Ionic polymers as toxin-binding agents
US6072101A (en) * 1997-11-19 2000-06-06 Amcol International Corporation Multicomponent superabsorbent gel particles
KR100520183B1 (ko) * 1999-08-23 2005-10-10 주식회사 하이닉스반도체 두 개의 이중결합을 가지는 가교제를 단량체로 포함하는 포토레지스트용 공중합체
US20020006664A1 (en) * 1999-09-17 2002-01-17 Sabatini David M. Arrayed transfection method and uses related thereto
US20020041898A1 (en) * 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents
DE10012151A1 (de) * 2000-03-13 2001-09-27 Gsf Forschungszentrum Umwelt Mittel zur Behandlung von Erkrankungen des Tracheo-Brochialtraktes, insbesondere der COPD
US20020012998A1 (en) * 2000-03-29 2002-01-31 Igor Gonda Cationic liposomes
DE60112741T2 (de) * 2000-05-02 2006-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Gamma-selektive retinoide
US6586254B1 (en) * 2000-06-15 2003-07-01 Engelhard Corporation Method and apparatus for accelerated catalyst poisoning and deactivation
US6696038B1 (en) * 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
US20040142474A1 (en) * 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
AU2001294890A1 (en) * 2000-09-25 2002-04-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Pei: dna vector formulations for in vitro and in vivo gene delivery
US6897067B2 (en) * 2000-11-03 2005-05-24 Regents Of The University Of Michigan Surface transfection and expression procedure
NO310176B1 (no) * 2000-11-13 2001-06-05 Wadlund As Sammensetning for hud som inneholder kitosan-konjugert CLA og kitosankonjugert vitamin A eller et <beta>-cyklodekstrin-konjugertvitamin A samt fremgangsmåte for fremstilling og anvendelse avdenne
US20060211642A1 (en) * 2001-05-18 2006-09-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA inteference mediated inhibition of hepatitis C virus (HVC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US6586524B2 (en) * 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
EP1304103B1 (en) * 2001-10-22 2008-12-31 Viroblock SA New non-phospholipid lipid vesicles (npLV) and their use in cosmetic, therapeutic and prophylactic applications
WO2003037385A1 (en) * 2001-10-30 2003-05-08 Nektar Therapeutics Al, Corporation Water-soluble polymer conjugates of retinoic acid
US20030215395A1 (en) * 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
EP1569694B1 (en) * 2002-08-22 2009-11-25 Dionysios Papaioannou Polyamine conjugates with acidic retinoids and preparation thereof
US20040048260A1 (en) * 2002-09-10 2004-03-11 Fu-Hsiung Chang Transfection of nucleic acid
US7071167B2 (en) * 2002-11-13 2006-07-04 L'oreal Use of a combination of components with an inhibitory synergistic effect on calcium channels to prevent or treat wrinkles and fine lines
US20040138154A1 (en) * 2003-01-13 2004-07-15 Lei Yu Solid surface for biomolecule delivery and high-throughput assay
US20070269891A9 (en) * 2003-01-13 2007-11-22 Yasunobu Tanaka Solid surface with immobilized degradable cationic polymer for transfecting eukaryotic cells
US6878374B2 (en) * 2003-02-25 2005-04-12 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals
US7064127B2 (en) * 2003-12-19 2006-06-20 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Treatment of hepatic fibrosis with imatinib mesylate
US7125709B2 (en) * 2004-02-10 2006-10-24 Nitto Denko Corporation Culture device and method for eukaryotic cell transfection
US7358223B2 (en) * 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
WO2006053430A1 (en) * 2004-11-17 2006-05-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of apolipoprotein b
US7964571B2 (en) * 2004-12-09 2011-06-21 Egen, Inc. Combination of immuno gene therapy and chemotherapy for treatment of cancer and hyperproliferative diseases
HUE056941T2 (hu) * 2004-12-22 2022-04-28 Nitto Denko Corp Gyógyszerhordozó és gyógyszerhordozó kit fibrózis gátlására
US20060188559A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 E. T. Browne Drug Co. Topical cosmetic compositions comprising alpha arbutin
US20090011004A1 (en) * 2005-12-30 2009-01-08 Philadelphia Health & Education Corp., D/B/A/ Drexel University Of College Of Medicine Improved carriers for delivery of nucleic acid agents to cells and tissues
US7700541B2 (en) * 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
TWI407971B (zh) * 2007-03-30 2013-09-11 Nitto Denko Corp Cancer cells and tumor-related fibroblasts
JP2010539245A (ja) * 2007-09-14 2010-12-16 日東電工株式会社 薬物担体
CA2732412C (en) * 2008-07-30 2014-12-09 Lei Yu Retinoid-targeted drug carriers

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T.M.ALLEN等: "liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA.》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012068870A1 (zh) * 2010-11-22 2012-05-31 苏州瑞博生物技术有限公司 三元复合物和含有三元复合物的液体及制备方法与应用
CN102329810A (zh) * 2011-08-19 2012-01-25 黄开红 一种siRNA输送载体及其应用
CN102337298A (zh) * 2011-08-19 2012-02-01 黄开红 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用
CN112370532A (zh) * 2012-10-08 2021-02-19 生物技术传送科技有限责任公司 作为转染试剂的羧化多胺衍生物
CN109983127A (zh) * 2016-10-05 2019-07-05 先正达参股股份有限公司 基因沉默的改善或与基因沉默有关的改善
CN109983127B (zh) * 2016-10-05 2023-07-04 先正达参股股份有限公司 基因沉默的改善或与基因沉默有关的改善
WO2019014924A1 (zh) * 2017-07-21 2019-01-24 中国科学院深圳先进技术研究院 一种病毒转染增效剂和基于点击化学的病毒转染应用
CN109620968A (zh) * 2017-10-09 2019-04-16 华东师范大学 一种用于基因治疗或转染的组合物及其制备方法和用途
CN114450326A (zh) * 2019-06-24 2022-05-06 普罗美加公司 用于将生物分子递送到细胞中的改性聚胺聚合物
CN114901316A (zh) * 2019-08-05 2022-08-12 宝利普拉斯生物转染公司 包含接枝到阳离子聚合物上的三唑化合物的用于将核酸分子转染到细胞中的组合物及其应用
CN114901316B (zh) * 2019-08-05 2024-02-13 宝利普拉斯生物转染公司 包含接枝到阳离子聚合物上的三唑化合物的用于将核酸分子转染到细胞中的组合物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008151150A3 (en) 2009-07-30
WO2008151150A2 (en) 2008-12-11
CA2688491A1 (en) 2008-12-11
KR20100017956A (ko) 2010-02-16
EP2164968A2 (en) 2010-03-24
JP2010530013A (ja) 2010-09-02
US20080312174A1 (en) 2008-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101755048A (zh) 用于递送核酸的peg-pei共聚物
Li et al. Bioswitchable delivery of microRNA by framework nucleic acids: application to bone regeneration
CN1738911B (zh) 用于生物分子递送和高通量实验方法的固体表面
Hamm et al. Efficient transfection method for primary cells
Vacik et al. Cell-specific nuclear import of plasmid DNA
Walsh et al. Bioinspired star-shaped poly (l-lysine) polypeptides: efficient polymeric nanocarriers for the delivery of DNA to mesenchymal stem cells
Li et al. Low-weight polyethylenimine cross-linked 2-hydroxypopyl-β-cyclodextrin and folic acid as an efficient and nontoxic siRNA carrier for gene silencing and tumor inhibition by VEGF siRNA
Partridge et al. Gene delivery in bone tissue engineering: progress and prospects using viral and nonviral strategies
Bu et al. Ascorbic acid-PEI carbon dots with osteogenic effects as miR-2861 carriers to effectively enhance bone regeneration
Cheng et al. Platelets and plasma proteins are both required to stimulate collagen gene expression by anterior cruciate ligament cells in three-dimensional culture
Xie et al. A polyethylenimine‐linoleic acid conjugate for antisense oligonucleotide delivery
del Pino et al. Gene silencing mediated by magnetic lipospheres tagged with small interfering RNA
Jang et al. Combined effects of surface morphology and mechanical straining magnitudes on the differentiation of mesenchymal stem cells without using biochemical reagents
CN101124316A (zh) 用于转染真核细胞的固定的可降解阳离子聚合物
JP2010132665A (ja) ｓｉＲＮＡ、両親媒性化合物及びポリカチオンを用いた組成物及び方法
Rahbek et al. Bioresponsive hyperbranched polymers for siRNA and miRNA delivery
Gutsch et al. Biocompatibility and efficacy of oligomaltose-grafted poly (ethylene imine) s (OM-PEIs) for in vivo gene delivery
Park et al. Construction of PLGA nanoparticles coated with polycistronic SOX5, SOX6, and SOX9 genes for chondrogenesis of human mesenchymal stem cells
Wang et al. Efficient down-regulation of CDK4 by novel lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery
Flanagan et al. Competitive electroporation formulation for cell therapy
Meenakshi Sundaram et al. Polymeric Delivery of siRNA against Integrin‐β1 (CD29) to Reduce Attachment and Migration of Breast Cancer Cells
Yin et al. A novel EGFR-targeted gene delivery system based on complexes self-assembled by EGF, DNA, and activated PAMAM dendrimers
Soudah et al. CLIP6-PNA-peptide conjugates: non-endosomal delivery of splice switching oligonucleotides
Tyumentseva et al. Protocol for assessment of the efficiency of CRISPR/Cas RNP delivery to different types of target cells
Boyle et al. Heparin enhances transfection in concert with a trehalose-based polycation with challenging cell types

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20100623