-
Die Erfindung betrifft einen beschichteten Ballonkatheter zur Applikation von pharmazeutisch wirksamen Mitteln auf Blutgefäßwände.
-
Die Arteriosklerose der Koronararterien ist eine vor allem in den entwickelten Ländern häufig auftretende Herzerkrankung mit schweren gesundheitlichen Folgen bis hin zum Tode. Ablagerungen an den Wandungen der Koronararterien führen zu einer Verengung und damit zu einer Limitierung der Sauerstoffversorgung des Herzmuskels. Angina pektoris mit dadurch ausgelösten Brustschmerzen sowie Herzinfarkte sind die Folge.
-
Neben einer medikamentösen Behandlung der Mangeldurchblutung sind invasive Behandlungsmethoden indiziert. In Bypass-Operationen werden sklerotisch verengte Herzkranzgefäße durch körpereigene „frische” Gefäße ersetzt und damit die Durchblutung wieder hergestellt. Ein weiterer Ansatz ist die Angioplastie, bei der das verengte Koronargefäß aufgeweitet wird. In der Regel erfolgt dies durch Aufblasen eines Ballonkatheters, wodurch das Gefäßlumen erweitert werden soll – häufig in Kombination mit der Implantierung eines Stents.
-
Bei der Angioplastie und insbesondere Implantierung von Stents, aber auch als Folge von chirurgischen Eingriffen, kommt es häufig zur Bildung von Restenosen, die binnen kurzer Zeit zu einer erneuten Gefäßverengung führen. Zur Verhinderung solcher Restenosen werden die Gefäßwände an gefährdeten Stellen häufig mit proliferationshemmenden Medikamenten beaufschlagt, etwa Rapamycin oder Paclitaxel. Es handelt sich dabei um Medikamente (Immunsuppressiva bzw. Cytostatika), die ursprünglich zur Behandlung von Krebserkrankungen entwickelt wurden.
-
Endothelzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Arteriosklerose und bei der nach Behandlungen auftretenden Restenose. Zur Verhinderung insbesondere der Restenose gilt es daher, das Wachstum der subendothelialen Glattmuskelzellen der Gefäßwand zu verhindern oder zu begrenzen. Da das Gefäßsystem insgesamt sehr große Oberflächen ausbildet, gilt es, die Verabreichung von wachstumsbegrenzenden Medikamenten lokal zu begrenzen.
-
Bei der lokalen Applikation von Immunsupressiva wie Rapamycin und Cytostatika wie Paclitaxel wird der Wirkstoff in einer geeigneten Matrix über einen beschichteten Ballon oder Stent auf die Oberfläche des hier zu behandelnden Gefäßbereichs aufgebracht. Eine solche Applikation setzt aber voraus, dass der Wirkstoff lokal zumindest für eine gewisse Zeit verfügbar bleibt und nicht durch vorbeiströmendes Blut abgeschwemmt wird. Dies ist bei den oben genannten Substanzen aufgrund ihrer geringen Löslichkeit weithin gegeben.
-
Stenotische Veränderungen von arteriellen Gefäßen stehen im engen Zusammenhang mit der Schädigung von Endothelzellen arterieller Gefäße. Eine Verletzung oder Entzündung der Gefäßwände führt zu einer Endothelaktivierung, die ihrerseits eine gesteigerte Produktion von Adhäsionsmolekülen zur Folge hat. Die Adhäsionsmoleküle ihrerseits vermitteln eine transendotheliale Migration von Leukozyten, welche die Integrität des Endothels beeinträchtigen. Eines dieser Adhäsionsmoleküle ist E-Selektin, das sich auf humanen primären Endothelzellen findet. Selektine sind Kalziumabhängige Transmembranglykoproteine, die eine Schlüsselrolle bei Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in der frühen Phase der Arterogenese spielen. Weitere Beispiele für Adhäsionsmoleküle sind ICAM-1 (CD54) und VCAM-1 (CD106), siehe
WO 2006/077112 A2 .
-
siRNA (small enterfering RNAs) sind kurze doppelsträngige RNA-Moleküle mit in der Regel 21 bis 23 Nukleotiden, die geeignet sind, die Translation einer ZielmRNA zu blockieren. Sie können spezifische Gene methylieren und dadurch abschalten.
-
Aus der
DE 10 2005 003 788 A1 und der
WO 2006/077112 A2 sind siRNA-Moleküle bekannt, die geeignet sind die Expression von Adhäsionsmolekülen zu blockieren, darunter auch die Expression von E-Selektin. E-Selektin, auch als CD62E bekannt, ist ein Zelladhäsionsmolekül, das ausschließlich aus von Zytokinen aktivierten Endothelzellen exprimiert wird. Es spielt eine wichtige Rolle bei Entzündungen.
-
In der
WO 2006/077112 werden weitere Oligonukleotide (Sinn und Gegensinn) unter den Codebezeichnungen SEQ No. 1 bis SEQ No. 44 beschrieben, die geeignet sind, die Expression von Adhäsionsmolekülen (ICAM-1, VCAM-1, E-Selektin) zu unterdrücken. Diese siRNAs sind aber nicht ohne Weiteres für die lokale Applikation zur Unterdrückung von Stenosen geeignet.
-
Angesichts dessen liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Applikationsform für siRNA-Moleküle bereitzustellen, mit der diese Moleküle lokal appliziert werden, um die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen zu inhibieren.
-
Diese Aufgabe wird mit einem beschichteten Ballonkatheter der eingangs genannten Art gelöst, der eine Beschichtung mit siRNA-Molekülen aufweist, die geeignet sind, die unkontrollierte Expression von Adhäsionsmolekülen zu inhibieren, wobei die siRNA-Molekülen als Polyethyleniminkomplex vorliegen und in eine Gelatinematrix eingebettet sind.
-
Bei dem Ballon handelt es sich um einen üblichen Dilatationsballon, der erfindungsgemäß beschichtet ist.
-
Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäße Formulierung für die im pharmazeutischen Sinne wirkenden siRNA-Moleküle unter den Applikationsbedingungen gut auf der Ballonoberfläche haftet, mit dieser gegen die Gefäßwand an der gewünschten Stelle expandiert werden kann und von der Ballonoberfläche so auf die Gefäßwand transferiert werden kann, dass die siRNA-Moleküle in die anstehenden Endothelzellen eintreten können. Parallel dazu kann über den Ballonkatheter ein Stent platziert werden.
-
siRNA-Moleküle sind in der Lage, mit Polyethylenimin (PEI), einem synthetischen kationischen Polymer, Komplexe zu bilden, in denen eines oder mehrere der Oligonukleotide an die Polymerkette gebunden sind. Diese Komplexe werden über ihr Stickstoff/Phosphor-Verhältnis (N/P-Verhältnis) charakterisiert. Durch die Komplexierung verlieren die siRNA-Moleküle nichts von ihrer Knock-Out-Wirkung auf das Ziel-Gen, etwa das SELE-Gen, sind aber über die komplexe Struktur gut in die Gelatinematrix einbettbar und gegen das Abschwemmen durch vorbeifließendes Blut geschützt. Aus der Gelatinematrix und dem Komplex heraus übt die siRNA ihre Wirkung („silencing”) mit hoher Effizienz aus.
-
Bei den siRNA-Molekülen handelt es sich um solche, die geeignet sind, die Expression von Adhäsionsmolekülen von humanen primären Endothelzellen zu inhibieren. Insbesondere handelt es sich dabei um die Inhibierung der Expression von E-Selektin. Eine solche Inhibierung wird insbesondere mit siRNA-Molekülen der Nukleotidsequenzen siSELE-1 und siSELE-2 erreicht:
siSELE-1: 5'-GGU UGA AUG CAC CAC UCA AdTdT-3' (sense)
siSELE-2: 5'-UUG AGU GGU GCA UUC AAC CdTdG-3' (antisense)
-
Diese Sequenzen siSELE-1 und siSELE-2 werden nachfolgend auch als siSELE bezeichnet. Davon abgeleitete Sequenzen mit gleichen Eigenschaften, die also geeignet sind, die Expression von E-Selektin zu inhibieren, werden ebenfalls erfasst.
-
Weitere siRNA-Moleküle, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind die in der
WO 2006/077112 A2 genannten – siehe Tabelle 1. Auf die Offenbarung der
WO 2006/077112 A2 wird vollinhaltlich Bezug genommen.
-
Für die Transfektion der siRNAs an die Zellen wird vorzugsweise ein synthetisches kationisches Polyethylenimin verwandt. Dieses ist, aufgrund seiner hohen kationischen Ladungsdichte, fähig, nicht-kovalente Komplexe mit negativ geladenen Nukleinsäuren auszubilden. Unter physiologischen Bedingungen sind diese Komplexe in der Lage, ihre Nukleinsäurefracht an das Endothel abzugeben, wo es die gewünschte Wirkung entfaltet.
-
Das erfindungsgemäß zum Einsatz kommende Polyethylenimin ist vorzugsweise ein verzweigtes Polyethylenimin mit einem Molekulargewicht von < 50 kD und vorzugsweise < 30 kD.
-
Bei dem Polyethylenimin kann es sich um ein Polyethylenimin niedrigen Molekulargewichts handeln, etwa einem Molekulargewicht von 500 bis 1.000 D, oder aber um ein solches mit hohem Molekulargewicht, insbesondere im Bereich von 20 bis 30 kD. Bei Polyethyleniminkomplexen mit LMW-PEI (low molecular weight polyethylenimin) beträgt das Verhältnis N/P vorzugsweise weniger als 14 und insbesondere 3 bis 14. Das N/P-Verhältnis bezeichnet das Verhältnis der N-Atome im PEI zu den Phosphoratomen der siRNA.
-
Ist der Polyethyleniminkomplex ein HMW-PEI (high molecular weight polyethylenimin) liegt das N/P-Verhältnis vorzugsweise im Bereich von 1 bis 8.
-
Die erfindungsgemäß auf den Ballonkatheter aufgebracht Beschichtung aus Komplex enthält die siRNA in einer Menge von 4 bis 40 μg, vorzugsweise von 8 bis 20 μg in 1 ml 0,1% Gelatine.
-
Bei der Auswahl der Gelatine hat sich Rindergelatine vom (Typ B) als besonders geeignet erwiesen. Gelatine von anderen Tierarten erwiesen sich als weniger gut geeignet.
-
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
-
PEI-siRNA-Komplex-Herstellung
-
Komplexe aus PEI und siRNA wurden durch Verdünnen der siRNAs und PEI – getrennt voneinander – in 150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,4 über 10 min erhalten. Es wurden N/P-Verhältnisse von 3, 6 und 8 eingestellt, basierend auf der Annahme, dass 1 μg siRNA 3 mMol Phosphat und 1 μl 10 mM PEI-Lösung 10 mMol Aminstickstoff enthalten. Nach 10 min wurden die siRNA- und PEI-Lösung intensiv vermischt und weitere 10 min inkubiert. Danach wurde die Mischung zu 500 μl zu 0,1% Gelatinelösung pro Eintiefung einer Mikrotiterplatte mit 12 Eintiefungen gegeben und zur Verwendung als Beschichtung getrocknet, oder für die allgemeine Transfektion verwandt.
-
Als verzweigtes Polyethylenimin wurde ein LMW-PEI von 800 D der Firma Sigma-Aldrich und ein HMW-PEI von 25 kD, ebenfalls von der Sigma-Aldrich verwandt. Die Gelatine war eine Rindergelatine vom Typ B der Firma Flucker.
-
Kultivierung von Endothelzellen auf Beschichtung mit immobilisierte siRNA
-
Nach Trocknen der Beschichtungen wurden humane Endothelzellen (ECs) in einer Menge von wenigstens 100.000 Zellen pro Eintiefung (Well) einer Mikrotiterplatte mit 12 Eintiefungen (Wells) eingesät. Als Medium wurde EnGS-Zellkulturmedium (VascuLifeTM) mit Zusätzen, Serum und Antibiotika verwandt. Nach vier Stunden wurde das Medium gegen frisches Medium ausgetauscht. In allen Experimenten wurde die Expression des E-Selektin-Rezeptorproteins mittels Durchflusszytometrie 48 h nach der Einsaat gemessen.
-
Konventionelle Transfektion von Endothelzellen
-
Einen Tag vor der Transfektion wurden ICs in die Eintiefungen (Wells) einer Microtiterplatte auf EnGS-Zellkulturmedium (VascuLifeTM) eingesät. Nach 70%iger Abdeckung (Konfluenz) wurden die Zellen mit μg siRNA in Form des PEI-Komplexes mit einem N/P-Verhältnisses von 8 in 50 μl 150 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,4, transfiziert.
-
Dabei wurden 50 μl Komplex auf 350 μl EnGS Basismedium, frei von Zusätzen oder Medium, pippetiert und Zellen in einer Microtiterplatte zugesetzt. Nach zwei Stunden wurde das Medium gegen EnGS-Zellkulturmedium ausgetauscht.
-
Einfluss von Serum auf die siRNA-Abgabe
-
ICs wurden 12 Stunden auf EnGS kompletten Zellkulturmedium (mit Zusätzen und Serum) auf Beschichtungen kultiviert. Die Beschichtungen enthielten siRNA-PEI-Komplex mit einem N/P-Verhältnis von 8 und 2, 4 oder 6 μg siRNA pro Eintiefung. Nach einer Kultivierungsdauer von 12 Stunden hafteten die ICs an der Oberfläche der Beschichtung. ... der Zellen wurde für 4 h das Kulturmedium gegen EnGS-Zellkulturmedium ohne Serum und Zusätze ausgetauscht, danach auf das ursprüngliche Kulturmedium zurückgegangen.
-
Wirkung der Beschichtungskomponenten in Lösung
-
siRNA-PEI-Komplexe mit einem N/P-Verhältnis von 8 und 2, 4 und 6 μg siSELE pro Eintiefung einer Microtiterplatte wurden hergestellt und zu Gelatine gegeben. Die Hälfte der Lösung wurde als Beschichtung zur Abgabe von siRNA an ICs verwandt, die andere Hälfte wurde mit 1 ml EnGS-Zellkulturmedium mit Zusätzen und Serum gemischt und auf freie ECs in Lösung gegeben. Nach vierstündiger Kultivierung wurde das Medium mit EnGS-Zellkulturmedium mit Zusätzen und Serum aufgefrischt.
-
Optimierung der siRNA-Abgabe durch verschiedene Beschichtungsweisen
-
PEI-siRNA-Komplexe wurden mit N/P-Verhältnissen von 3, 6 und 8 mit jeweils 10, 12 und 14 μg siSELE, 4, 6 und 8 μg siSELE und 2, 4 und 6 μg siSELE hergestellt. Diese Lösungen wurden jeweils zu 500 μl 0,1% Gelatine in jeder Eintiefung einer Microtiterplatte gegeben. Die Zellen wurden 48 h auf den Beschichtungen kultiviert und die E-Selektin-Expression mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
-
Durchflusszytometrie
-
48 Stunden nach der Transfektion mittels Beschichtung oder allgemeiner Transfektion wurden die ICs mit 2,5 ng/ml TNF-α (Immunotools) stimuliert, um die E-Selektinexpression zu induzieren. Die Zellen wurden 1 h bei 4°C mit einem PE-Cy5-markierten E-Selektin-Antikörper (Becton Dickenson GmbH) in 0,5% FCS gefärbt. Nach dem Waschen und der Ablösung der Zellen wurden sie mit 2,5 Paraformaldehyd in PBS fixiert. Durchflusszytometrische Analysen (5.000 Zellen/pro Messung) wurden in einem FACSscanTM (Becton Dickenson GmbH) vorgenommen und mit der CellQuestPro-Software dergleichen Firma bewertet. Die geometrischen Mittelwerte wurden für die weiteren Analysen verwandt.
-
Ergebnisse
-
Die Ergebnisse sind in den beiliegenden Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:
-
1 den Einfluss des Herups auf die Transfektionseffizienz der Beschichtung;
-
2 einen Vergleich der Transfektionseffizienz von Endothelzellen mit einer erfindungsgemäßen Beschichtung im Vergleich zu den im Medium gelösten Beschichtungskomponenten;
-
3 die Freisetzung der siRNA aus Beschichtungen über die Zeit;
-
4 das Ausmaß der Inhibierung für LNW-PEI-siRNA-Komplexe mit verschiedenen N/P-Verhältnissen bei konventioneller Transfektion und
-
5 die Ergebnisse für HMW-PEI-siRNA-Komplexe mit verschiedenen N/P-Verhältnissen bei konventioneller Transfektion.
-
Aus 1 ergibt sich eine hohe Transfektionseffizienz für in Gelatine immobilisierten PEI-siRNA-Komplexe, in Gegenwart wie in Abwesenheit von Serum. Als Referenz dient die E-Selektinexpression nach Applikation von TNF-α, deren Wert auf 100 gesetzt wurde. Beste Ergebnisse wurden mit 6 μg siRNA (siSELE) in 500 μl 0,1% Gelatine bei einem N/P-Verhältnis von 8 des PEI-Komplexes.
-
scrRNA ist eine Vergleichs-RNA.
-
2 vergleicht die Transfektionseffzienz von an Gelatine immobilisierte Komplex im Vergleich zu einer Lösung, die die Komplexkomponenten gelöst enthält. Die Transfektion der Endothelzellen mit der immobilisierten siRNA (siSELE) ist wesentlich effizienter, tatsächlich zeigt die gelöste siRNA keine nennenswerte Reduktion der E-Selektin-Expression.
-
3 zeigt in einem Diagramm die Freisetzung der im Komplex gebundenen siRNA aus der Gelatinematrix. Der größte Teil der siRNA ist bereits nach 30 min aus der Matrix freigesetzt und in die Zielzellen gelangt. Der silencing-Effekt hält danach länger als 1 Woche an.
-
4 zeigt das Ergebnis der Transfektion von Endothelzellen mit LMW-PEI-siRNA (1 μg siRNA). Auf der X-Achse sind die unterschiedlichen N/P-Verhältnisse von 1 bis 20 aufgetragen, die Y-Achse zeigt die E-Selektin-Rezeptor-Ausbildung in Prozent, wobei die Stimulation von Zellen mit TNF-α auf 100% gesetzt wurde. Hohe N/P-Verhältnisse ergeben eine sehr gute Wirksamkeit. Allerdings treten ab einem Verhältnis von N/P = 14 toxische Effekte auf, wie sich aus der Morphologie der Endothelzellen ergibt (siehe oberer Teil der Abbildung). Das Epithel verliert seine typische Pflasterstruktur.
-
5 zeigt die gleichen Ergebnisse der Untersuchungen mit HMW-PEI-siRNA-Komplexen mit sehr guten Ergebnissen für ein N/P-Verhältnis von 1 und 3. Toxische Effekte ergaben sich ab N/P = B. Tab .1
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- WO 2006/077112 A2 [0007, 0009, 0018, 0018]
- DE 102005003788 A1 [0009]
- WO 2006/077112 [0010]
