WO2012150299A2 - Behandlung von hyperproliferativen erkrankungen des urogenitaltraktes - Google Patents

Behandlung von hyperproliferativen erkrankungen des urogenitaltraktes Download PDF

Info

Publication number
WO2012150299A2
WO2012150299A2 PCT/EP2012/058123 EP2012058123W WO2012150299A2 WO 2012150299 A2 WO2012150299 A2 WO 2012150299A2 EP 2012058123 W EP2012058123 W EP 2012058123W WO 2012150299 A2 WO2012150299 A2 WO 2012150299A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sirna
sirna molecule
genitourinary tract
cells
use according
Prior art date
Application number
PCT/EP2012/058123
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2012150299A3 (de
Inventor
Andrea Nolte
Hans-Peter Wendel
Tobias Walker
Arnulf Stenzl
Christian Schwentner
Stefan AUFDERKLAMM
Original Assignee
Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum filed Critical Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum
Publication of WO2012150299A2 publication Critical patent/WO2012150299A2/de
Publication of WO2012150299A3 publication Critical patent/WO2012150299A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to the treatment of a hyperproliferative disease of the genitourinary tract, in particular molecules, devices and methods suitable therefor.
  • the most important hyperproliferative diseases of the genitourinary tract include benign prostatic hyperplasia (BPH), strictures, especially the ureter and the urethra, prostate cancer and the resulting obstructive micturition complaints.
  • BPH benign prostatic hyperplasia
  • strictures especially the ureter and the urethra
  • prostate cancer and the resulting obstructive micturition complaints.
  • transurethral prostate resection The most commonly used therapy in patients with benign prostatic hyperplasia is transurethral prostate resection (TURP). This operation carries risks. In 60% to 90% of all cases there is a retrograde ejaculation, bleeding, infections, urinary incontinence and strictures of the urethra. In addition, 10% of patients will need to be re-operated. In addition to the postoperative complications, surgery is unacceptable for some patients, for example due to old age and other health conditions.
  • Prostate cancer is one of the most common cancers of men. Within the group of men who died of cancer, it is responsible for about 10% of deaths. Local cancer proliferation can lead to occlusion of the urethra. The most frequently used therapy method is also the surgery of a so-called prostatectomy or radiotherapy. This results in the same problems described above for benign prostatic hyperplasia. In the prior art further possibilities for the treatment of hyperproliferative diseases of the urogenital tract are described, such as. As the minimally invasive applicable splinting of the ureter, the urinary diversion via the skin, the ureter implantation or a replacement of the ureter by autologous tissue.
  • Urogenitalstents in the genitourinary tract which should prevent the closure of the urinary tract.
  • One of these stents is sold under the name Memokath® by PNN Medical, Kvistgärd, Denmark. This stent expands under heat.
  • the urogenital stents currently used in the prior art do not bring the desired success. For every fourth patient, the stent must be removed, as it may lead to migration of the stent or infection of the genitourinary tract.
  • WO 2004/069991 and DE 103 06 083 describe antisense oligonucleotides intended to inhibit the expression of survivin.
  • siRNA molecules against the c-myc gene of the mouse the polymerase of the hepatitis B virus, the thex-1 gene of the mouse, the adar-1 gene of the mouse and discloses the Avian influenza virus NP gene. It is proposed to treat melanoma and hepatitis B by combining a siRNA molecule against a "target gene" and an siRNA molecule against a negative regulator of RNAi.
  • the object of the present invention to provide a new therapeutic approach can be treated with the hyperproliferative diseases of the genitourinary tract.
  • new substances, uses and methods are to be provided which are used in the context of this therapeutic approach.
  • siRNA molecule for coating a device which can be introduced into the genitourinary tract for the treatment of a hyperproliferative disease.
  • a method of making a pharmaceutical composition comprising the steps of: (1) providing a siRNA molecule for treating a hyperproliferative disease, and (2) formulating the siRNA molecule into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the object on which the invention is based is furthermore achieved by a method for producing a device that can be introduced into the genitourinary tract, comprising the following steps: (1) providing a siRNA molecule for the treatment of a hyperproliferative disease of the genitourinary tract, and (2) / Introducing the siRNA molecule onto / in a coating of the device.
  • the object is achieved by a device having at least one surface coming into contact with tissues and / or fluids of the human or animal body which has an siRNA molecule for the treatment of a hyperproliferative disease of the genitourinary tract.
  • the device is designed for introduction into the genitourinary tract.
  • RNA molecules so-called "small interfering RNA” (siRNA)
  • siRNA small interfering RNA
  • This therapeutic approach has the great advantage that operations of the affected patients can be avoided.
  • the treatment of patients is also significantly cheaper than surgery and is characterized by extremely low side effects.
  • the approach of the invention also allows a treatment that is specifically targeted to the particular patient to be treated and the type of proliferative disease.
  • a treatment that is specifically targeted to the particular patient to be treated and the type of proliferative disease.
  • an siRNA molecule will be used which, depending on the medical complication, purposefully inhibits the proliferation of connective tissue cells, epithelial cells and / or prostate cancer cells. Possibly. can also a mixture of different siRNA molecules are used, which inhibit the expression of various proliferation-inducing genes.
  • SiRNA molecules consist of double-stranded RNA with a length of about 19 to 21 base pairs each.
  • RISC RNA-Induced Silencing Complex
  • the RISC binds in a complementary manner to a target mRNA.
  • the target mRNA is unwound and cleaved.
  • the cleavage products are subsequently degraded by intracellular nucleases.
  • This process also referred to as RNA interference, allows the inhibition of the expression of specific target genes.
  • the production of siRNA molecules is basically described in the prior art. It uses standard molecular biological methods of nucleic acid synthesis.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art. They include, for example, binders, disintegrants, fillers, lubricants and buffers, salts and other substances suitable for the formulation of medicaments; see. Rowe et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition Pharmaceutical Press; or Bauer et al. (1999), breakthrough in pharmaceutical technology, 6th edition,ticianliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH. The content of the present publications is incorporated herein by reference. Especially preferred are pharmaceutically acceptable carriers which are suitable for the formulation of siRNA molecules.
  • the hyperproliferative disease of the genitourinary tract is selected from the group consisting of: Benign prostatic hyperplasia (BPH), ureteral stricture, urethral stricture, obstructive micturition complaints, prostate carcinoma.
  • BPH Benign prostatic hyperplasia
  • ureteral stricture ureteral stricture
  • urethral stricture urethral stricture
  • obstructive micturition complaints prostate carcinoma.
  • siRNA molecule is designed to inhibit the expression of a proliferation-inducing gene in the genitourinary tract.
  • This measure has the advantage that a causal therapy of the hyperproliferative disease takes place. Unlike the surgical removal of proliferating tissue or the mechanical opening of a closed urogenital tract is intervened with the invention at the molecular level in the pathogenesis, thereby permanently preventing hyperproliferation. Consequently, there is also no risk of restenosis frequently observed in the prior art after the primary stenosis has been removed.
  • the proliferation-inducing gene is selected from the group consisting of: serum response factor (SRF), early-region 2 transcription factor-1 (E2F-1), survivin, HIF1, HIF2, PTTG1 (Securin), STAT3, P-gp, Cyclin D1b, VOPP1.
  • This measure has the advantage that the most important genes involved in the development of hyperproliferative diseases of the genitourinary tract are specifically inhibited in their expression.
  • siRNA molecule is part of a coating of the device according to the invention.
  • Coatings suitable for receiving siRNA molecules are well known in the art. These consist for example of polysaccharides such as pululan, gelatin, hydrogels, polyelectrolyte multilayers such as HA Chi, hyaluronic acid, chitosan or PAA RNA poly-amidoamine and RNA, PLGA polylactidcoglycolic acid, etc.
  • This measure has the advantage that the siRNA molecule according to the invention can be selectively introduced into the genitourinary tract via the device and released from the coating into the surrounding tissue or the surrounding fluid. Through the targeted application of the siRNA, the patient is treated exclusively in the urogenital area, so that other tissues remain spared. Side effects are thereby minimized.
  • the device is a nanoparticle (NP).
  • a nanoparticle (NP) is a structure with a diameter of about 20 to 200 nm, usually from cationic lipids such as DOTAP, cationic polymers such as polyethyleneimine, poly-L-lysine, or polysaccharides such as cellulose, dextrans, hyaluronic acids , Alginic acid, dextrose, chitosan etc. in complex with the siRNA.
  • Nanoparticles are stable, biocompatible structures that can be made into powders that, when dissolved in water, produce the nanoparticles in their original form.
  • the polysaccharides can be provided with various fatty acids to make them lipophilic.
  • the behavior of the nanoparticles in the body of the patient can be purposefully changed.
  • a hydrogel-like surface has proven to be particularly biocompatible.
  • the siRNA molecules can be covalently attached to the polysaccharide chain.
  • the nanoparticles are particularly well received by cells, including those of the genitourinary tract, so that the siRNA molecules can advantageously reach their site of action in a targeted manner.
  • the device is a urogenital stent.
  • the urogenital stents used in the prior art such as the "Memokath" cause a mechanical opening of the Ureteral or urethral stricture or the narrowed urogenital tract. However, they do not causally prevent tissue proliferation, resulting in frequent cell migration or ingrowth.
  • the urogenital stent according to the invention provides effective remedy here.
  • the siRNA molecules which are for example part of a coating of the stent, prevent a further proliferation of tissue in the urogenital area. In this way, the ureter or the urethra can remain permanently consistent.
  • a further subject of the present invention relates to a device comprising at least one surface coming into contact with tissues and / or fluids of the human or animal body, preferably a nanoparticle (NP) or a urogenital stent which contains a siRNA molecule, preferably one of the use according to the invention or of the method according to the invention for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of a hyperproliferative disease of the genitourinary tract.
  • NP nanoparticle
  • a urogenital stent which contains a siRNA molecule
  • Fig. 1 shows the relative expression of SRF mRNA in human prostate fibroblasts as a function of the concentration of the transfected siRNA.
  • Fig. 2 shows the development of the cell number of the transfected prostate fibroblasts over a period of 16 days.
  • Fig. 3 shows the senescence of the transfected prostate fibroblasts via a
  • Fig. 4 shows the number of prostate fibroblasts after the first, second and third transfection with siRNA.
  • Fig. 5 shows the senescence of the prostate fibroblasts after the first, second and third transfection with siRNA.
  • Fig. 6 shows the relative expression of SRF mRNA after the first (A),
  • FIG. 7 shows the relative expression of the E2F1 mRNA (A) and survivin mRNA in the cancer cell line JL-1 after transfection with siRNA according to the invention.
  • Figure 9 shows the relative expression of E2F1 mRNA (A) and survivin mRNA
  • FIG. 10 shows the number of LXF-289 cells after transfection with siRNA according to the invention.
  • FIG. 11 shows the number of A549 cells after transfection with siRNA according to the invention.
  • FIG. 12 shows the number of SK-MES cells after transfection with siRNA according to the invention.
  • Fig. 13 shows the number of NCI-H460 cells after transfection with siRNA according to the invention.
  • the invention was exemplarily tested on three siRNA molecules directed against serum response factor (SRF), early region 2 transcription factor-1 (E2F-1), and against survivin.
  • SRF serum response factor
  • E2F-1 early region 2 transcription factor-1
  • survivin survivin
  • Antisense 5 '- ACG AAG GUC CUG ACA CGU CUU - 3' (SEQ ID NO: 4)
  • HIF1 a-siRNA 5 '- UGU AGA GAU GCG GUG GUC CUU - 3' (SEQ ID NO. 6) HIF1 a-siRNA:
  • Antisense 5'-CCC ACA CAU AUC CAC CUC U-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Antisense 5'-CAA CAA UAA CGA GGA AUC U-3 '(SEQ ID NO: 8) Inhibition of SRF expression in human prostate fibroblasts
  • Human prostate fibroblasts were cultured in 12-well cell culture plates 24 hours prior to transfection. The transfection was carried out with the transfectant interferon (Polyplus) in the amount provided by the manufacturer in the absence of serum for 2 hours. Various concentrations of SRF siRNA (SEQ ID NOs: 1 and 2) and a control siRNA (scrambled, scr-siRNA; negative control) were tested. The detection of the knockdown was carried out by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). For the qRT-PCR, the mRNA of the cells was first isolated with the aid of an RNA isolation kit from Biorat. Subsequently, 200 ng of the mRNA were transcribed into cDNA using the cDNA kit from Biorad.
  • qRT-PCR quantitative real-time PCR
  • the qRT-PCR was carried out with the iCycler (Biorad) based on the fluorescent dye SYBR Green (Biorad). The evaluation was carried out with the program Genex (Biorad). The budget gene used was GAPDH. The expression of non-transfected cells was normalized to one. Based on this, the relative expression was calculated.
  • the x-axis shows the approaches with control siRNA (SCR) and functional siRNA (SRF) at different concentrations compared to untreated ones
  • Fibroblasts It shows that the SRF mRNA is reduced starting from an siRNA concentration of 1 nM. For siRNA concentrations between 25 and 50 nM reduces SRF mRNA expression by more than 60%.
  • the cell count was examined by means of the cell counter CASY.
  • the cells were replaced on days 0, 2, 3, 9, 13 and 16 after transfection with trypsin / EDTA (Promocell).
  • trypsin / EDTA Promocell
  • TNS Promocell
  • 20 ml of the cell suspension were added to 10 ml of CASYton and measured in CASY.
  • the CASY is able to determine the integrity of the plasma membrane of a cell by means of an electric field. The CASY can distinguish vital cells from dead cells and count them. In this experiment, the number of vital cells was determined.
  • ⁇ -galactosidase assays are capable of quantifying senescent cells by blue staining.
  • senescent cells form a blue dye by enzymatic reaction.
  • the cells were on days 0, 2, 6, 9, 13 and 16 after transfection with 2% paraformaldehyde and 0.2% glutaraldehyde for 10 min. fixed at room temperature. Subsequently, the cells were washed with PBS.
  • the cells were stained with staining buffer (50 mM citric acid, 137 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 5 mM potassium iron (II) cyanide, 5 mM potassium iron (III) cyanide, 1 mg / ml X-gal) overnight at 37 ° C.
  • staining buffer 50 mM citric acid, 137 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 5 mM potassium iron (II) cyanide, 5 mM potassium iron (III) cyanide, 1 mg / ml X-gal
  • BrdU is a chemical that is structurally similar to thymidine. Proliferation requires doubling the DNA in the nucleus. When a cell proliferates, it incorporates the BrdU into its newly synthesized DNA. The cells can then be stained with a specific fluorescently labeled anti-BrdU antibody, and the proliferating cells can be detected by flow cytometry. be telt.
  • the BrdU assay was performed 3 days after transfection. Here, the cells were incubated 24 hours before with 10 ⁇ BrdU to allow incorporation of the BrdU in the DNA. The following day, the cells were detached and incubated with the anti-BrdU antibody by intracellular staining. The proliferating cells were determined by the flow cytometer. The proliferating cells were calculated as a percentage of all cells analyzed in the flow cytometer.
  • Table 1 Proliferation of prostate fibroblasts in% determined by BrdU assay.
  • the cells were transfected with 25 nM and 100 nM E2F1 siRNA, 25 nM and 100 nM survivin siRNA and as control with 25 nM scr-siRNA and then analyzed the expression of E2F1 and survivin.
  • the procedure was as described above for the expression of SRF and prostate fibroblasts.
  • Survivin expression (B) showed a knockdown of both the survivin siRNA concentration of 25 mM (second bar from the left) and the survivin siRNA concentration of 100 mM (third bar from the left) over 80%.
  • E2F1 expression and survivin expression were determined after transfection of the cancer cell line LXF-289 with 25 nM and OO nM E2F1 siRNA, 25 and 100 nM survivin siRNA and as control with 25 nM scrsiRNA.
  • the inventors then have three other cancer cell lines called A549, SK-MES and NCI-H460 . examined.
  • the cell lines were grown one day prior to transfection with approximately 20,000 cells per well of a 12-well plate. The following day, the cells were transfected with 50 nM of HIFI a or HIF2a siRNA, respectively. Three days after transfection, cells were counted by a cell counter (CASY).
  • the inventors have recognized that by using siRNA molecules hyperproliferative diseases of the genitourinary tract can be targeted. This is exemplified by five different siRNA molecules directed against five different proliferation-inducing genes and three different cell types.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung des Urogenitalstraktes, insbesondere hierfür geeignete Moleküle, Vorrichtungen und Verfahren.

Description

Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen des Urogenitaltraktes
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung des Urogenitaltraktes, insbesondere hierfür geeignete Moleküle, Vorrichtungen und Verfahren.
[0002] Zu den wichtigsten hyperproliferativen Erkrankungen des Urogenitaltraktes gehören die benigne Prostatahyperplasie (BPH), Strikturen, insbesondere des Harnleiters und der Harnröhre, das Prostatakarzinom und daraus resultierende obstruktive Miktionsbeschwerden.
[0003] Bei der benignen Prostatahyperplasie kommt es durch die Proliferation von Bindegewebs- und Epithelzellen zu einer Vergrößerung der Prostata und einem Verlust der Durchgängigkeit der Harnröhre. Gegenwärtig leiden 50 % der Männer über 50 Jahren an einer vergrößerten Prostata.
[0004] Die am häufigsten angewandte Therapie bei Patienten mit benigner Prostatahyperplasie ist die transurethrale Prostataresektion (TURP). Diese Operation birgt Risiken. In 60 % bis 90 % aller Fälle kommt es zu einer retrograden Ejakulation, Nachblutungen, Infektionen, Harninkontinenz und Strikturen der Harnröhre. Ferner müssen 10 % der Patienten einer erneuten Operation unterzogen werden. Zu den postoperativen Komplikationen kommt hinzu, dass eine Operation für einige Patienten nicht akzeptabel ist, bspw. wegen des hohen Alters und anderer gesundheitlicher Einschränkungen.
[0005] Das Prostatakarzinom gehört zu den häufigsten Krebserkrankungen des Mannes. Innerhalb der Gruppe der an Krebs verstorbenen Männer ist es für etwa 10 % der Todesfälle verantwortlich. Die lokale Krebsproliferation kann zu einem Verschluss der Harnröhre führen. Die am häufigsten eingesetzte Therapiemethode besteht ebenfalls in dem operativen Eingriff einer sog. Prostatektomie oder einer Strahlentherapie. Daraus resultieren die gleichen Probleme, die weiter oben für die benigne Prostatahyperplasie beschrieben sind. [0006] Im Stand der Technik werden weitere Möglichkeiten zur Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen des Urogenitaltraktes beschrieben, wie bspw. die als minimal-invasiv geltende Schienung der Harnleiter, die Harnableitung über die Haut, die Harnleiterimplantation oder ein Ersatz des Harnleiters durch autologes Gewebe.
[0007] Als alternativer Ansatz gilt die Einbringung von sog. Urogenitalstents in den Urogenitaltrakt, was den Verschluss der Harnwege verhindern soll. Einer dieser Stents wird unter der Bezeichnung Memokath® von der Firma PNN Medical, Kvistgärd, Dänemark, vertrieben. Dieser Stent expandiert unter Hitzeeinwirkung. Die im Stand der Technik derzeit eingesetzten Urogenitalstents bringen jedoch nicht den gewünschten Erfolg. Bei jedem vierten Patienten muss der Stent wieder entfernt werden, da es zu einer Migration des Stents oder zu einer Infektion des Urogenitaltraktes kommt.
[0008] In der WO 2004/069991 und der DE 103 06 083 werden Gegensinn- Oligonucleotide beschrieben, die die Expression von Survivin inhibieren sollen.
[0009] In der US 2008/0081791 werden siRNA-Moleküle gegen das c-myc-Gen der Maus, die Polymerase des Hepatitis-B-Virus, das thex-1 -Gen der Maus, das adar-1 - Gen der Maus und das Avian-lnfulenza-Virus-NP-Gen offenbart. Es wird vorgeschlagen, Melanome und Hepatitis B durch die kombinierte Verabreichung eines siRNA-Moleküls gegen ein "Zielgen" und eines siRNA-Moleküls gegen einen negativen Regulator der RNAi zu behandeln.
[0010] Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen therapeutischen Ansatz bereitzustellen, mit dem hyperproliferative Erkrankungen des Urogenitaltraktes behandelt werden können. Insbesondere sollen neue Substanzen, Verwendungen und Verfahren bereitgestellt werden, die im Rahmen dieses therapeutischen Ansatzes zum Einsatz kommen.
[0011] Diese Aufgabe wird durch die Verwendung eines siRNA-Moleküls zur Beschichtung einer in den Urogenitaltrakt einbringbaren Vorrichtung zur Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung gelöst. [0012] Offenbart wird außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gelöst, das folgende Schritte aufweist: (1 ) Bereitstellen eines siRNA-Moleküls zur Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung, und (2) Formulieren des siRNA-Moleküls in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
[0013] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird ferner durch ein Verfahren zur Herstellung einer in den Urogenitaltrakt einbringbaren Vorrichtung gelöst, das folgende Schritte aufweist: (1 ) Bereitstellen eines siRNA-Moleküls zur Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung des Urogenitaltraktes, und (2) Auf-/Einbringen des siRNA- Moleküls auf/in eine Beschichtung der Vorrichtung.
[0014] Schließlich wird die Aufgabe durch eine Vorrichtung gelöst, die zumindest eine mit Geweben und/oder Flüssigkeiten des menschlichen oder tierischen Körpers in Kontakt kommende Oberfläche aufweist, welche ein siRNA-Molekül zur Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung des Urogenitaltraktes aufweist. Vorzugsweise ist die Vorrichtung zur Einbringung in den Urogenitaltrakt ausgebildet.
[0015] Die Erfinder haben erkannt, dass durch den Einsatz von kurzen dop- pelsträngigen RNA-Molekülen, sog. "small interfering RNA" (siRNA), zielgerichtet solche Gene in ihrer Expression gehemmt werden können, die für Erkrankungen des Urogenitaltraktes aufgrund von Hyperproliferation verantwortlich bzw. mitverantwortlich sind.
[0016] Dieser therapeutische Ansatz hat den großen Vorteil, dass Operationen der betroffenen Patienten vermieden werden können. Die Behandlung der Patienten ist ferner deutlich kostengünstiger als ein operativer Eingriff und zeichnet sich durch äußerst geringe Nebenwirkungen aus.
[0017] Der erfindungsgemäße Ansatz ermöglicht ferner eine Behandlung, die spezifisch auf den jeweils zu behandelnden Patienten und die Art der proliferativen Erkrankung ausgerichtet ist. So wird bspw. ein solches siRNA-Molekül zum Einsatz kommen, welches, je nach medizinischer Komplikation, zielgerichtet die Proliferation von Bindegewebszellen, Epithelzellen und/oder Prostatakrebszellen inhibiert. Ggf. kann auch ein Gemisch verschiedenster siRNA-Moleküle eingesetzt werden, die die Expression verschiedener proliferationsinduzierenden Genen inhibieren.
[0018] siRNA-Moleküle bestehen aus doppelsträngiger RNA mit einer Länge von jeweils etwa 19 bis 21 Basenpaaren. Im Zytoplasma einer Zelle liegen diese in einem als "RISC" bezeichneten Proteinkomplex ("RNA-Induced Silencing Complex") vor. Mit Hilfe der inkorporierten RNA-Fragmente bindet der RISC komplementär an eine Ziel- mRNA. In der Folge wird die Ziel-mRNA entwunden und gespalten. Die Spaltprodukte werden anschließend durch intrazelluläre Nukleasen abgebaut. Dieser Vorgang, der auch als RNA-Interferenz bezeichnet wird, ermöglicht die Inhibition der Expression von spezifischen Zielgenen. Die Herstellung von siRNA-Molekülen ist grundsätzlich im Stand der Technik beschrieben. Sie bedient sich üblicher molekularbiologischer Methoden der Nukleinsäuresynthese.
[0019] Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Sie umfassen bspw. Bindemittel, Sprengmittel, Füllmittel, Gleitmittel sowie Puffer, Salze und sonstige zur Formulierung von Arzneimitteln geeignete Substanzen; vgl. Rowe et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition Pharmaceutical Press; oder Bauer et al. (1999), Lehrbruch der pharmazeutischen Technologie, 6. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH. Der Inhalt der vorliegenden Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Besonders bevorzugt sind pharmazeutisch akzeptable Träger, die zur Formulierung von siRNA- Molekülen geeignet sind.
[0020] Dabei ist es ferner bevorzugt, wenn die hyperproliferative Erkrankung des Urogenitaltraktes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Benigne Prostatahyperplasie (BPH), Harnleiterstriktur, Harnröhrenstriktur, obstruktive Miktionsbeschwer- den, Prostatakarzinom.
[0021] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Erfindung weitergebildet wird, um so die wichtigsten hyperproliferativen Erkrankungen des Urogenitaltraktes behandeln zu können. Diese Erkrankungen werden bislang hauptsächlich durch operative Eingriffe therapiert, die die eingangs erwähnten Probleme mit sich bringen. Hier schafft die erfindungsgemäße Lösung Abhilfe, da ein operativer Eingriff nicht erforderlich ist.
[0022] Ferner ist es bevorzugt, wenn das siRNA-Molekül ausgestaltet ist, um im Urogenitaltrakt die Expression eines proliferationsinduzierenden Gens zu inhibieren.
[0023] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine ursächliche Therapie der hyperproliferativen Erkrankung erfolgt. Anders als die operative Entfernung proliferierenden Gewebes oder die mechanische Eröffnung eines verschlossenen Urogenitaltraktes wird mit der Erfindung auf molekularer Ebene in die Pathogenese eingegriffen und dadurch dauerhaft die Hyperproliferation verhindert. Folglich besteht auch nicht die im Stand der Technik häufig beobachtete Gefahr einer Restenose, nachdem die primäre Stenose entfernt wurde.
[0024] Nach einer erfindungsgemäßen Weiterentwicklung ist das proliferation- sinduzierende Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Serum-Response-Faktor (SRF), Early-Region-2-Transkriptionsfaktor-1 (E2F-1 ), Survivin, HIF1 , HIF2, PTTG1 (Securin), STAT3, P-gp, Cyclin D1 b, VOPP1.
[0025] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die wichtigsten an der Entstehung von hyperproliferativen Erkrankungen des Urogenitaltraktes beteiligten Gene gezielt in ihrer Expression inhibiert werden.
[0026] Erfindungsgemäß ist das siRNA-Molekül Bestandteil einer Beschichtung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist.
[0027] Beschichtungen, die zur Aufnahme von siRNA-Molekülen geeignet sind, sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Diese bestehen bspw. aus Polysacchariden wie Pululan, Gelatine, Hydrogelen, Polyelektrolytmultischichten wie HA Chi, Hyaluronsäu- re, Chitosan oder PAA RNA Poly-Amidoamin und RNA, PLGA Polylactidcoglykolidsäure usw. [0028] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße siRNA- Molekül über die Vorrichtung gezielt in den Urogenitaltrakt einbringbar und aus der Beschichtung in das umgebende Gewebe bzw. die umgebende Flüssigkeit freigesetzt werden kann. Durch die gezielte Applikation der siRNA erfolgt eine Behandlung des Patienten ausschließlich im Urogenitalbereich, so dass andere Gewebe verschon bleiben. Nebenwirkungen werden dadurch minimiert.
[0029] Nach einer erfindungsgemäßen Weiterentwicklung handelt es sich bei der Vorrichtung um einen Nanopartikel (NP).
[0030] Ein Nanopartikel (NP) ist eine Struktur mit einem Durchmesser von ca. 20 bis 200 nm, die üblicherweise aus kationischen Lipiden wie DOTAP, kationischen Polymeren wie Polyethylenimin, Poly-L-Lysin, oder Polysacchariden, wie Zellulose, Dextrane, Hyaluronsäuren, Alginsäure, Dextrose, Chitosan etc. im Komplex mit der siRNA gebildet werden. Nanopartikel sind stabile, biokompatible Strukturen, die zu Pulver verarbeitet werden können, das, in Wasser aufgelöst, die Nanopartikel in ihrer ursprünglichen Form hervorbringt. Die Polysaccharide können mit verschiedenen Fettsäuren versehen werden, um diese lipophil zu machen. Durch die jeweilige Wahl des Polysaccharides kann das Verhalten der Nanopartikel im Körper des Patienten zielgerichtet verändert werden. So hat sich eine hydrogelartige Oberfläche als besonders biokompatibel erwiesen. Die siRNA-Moleküle lassen sich kovalent an die Polysaccharidkette binden. Die Nanopartikel werden besonders gut von Zellen, einschließlich solcher des Urogenitaltraktes, aufgenommen, so dass die siRNA-Moleküle auf vorteilhafte Art und Weise zielgerichtet an ihren Wirkort gelangen.
[0031] Nach einer erfindungsgemäßen Weiterentwicklung handelt es sich bei der Vorrichtung um einen Urogenitalstent.
[0032] Durch diese Maßnahme wird eine im Stand der Technik grundsätzlich bekannte und vielversprechende, jedoch im Bereich der Urogenitalerkrankungen bislang nicht eingesetzte Methode weiterentwickelt. Die im Stand der Technik verwendeten Urogenitalstents, wie bspw. der "Memokath", bewirken ein mechanisches Eröffnen der Harnleiter- bzw. Harnröhrenstriktur bzw. des verengten Urogenitaltraktes. Sie verhindern jedoch nicht ursächlich die Gewebeproliferation, so dass es häufig zu einer Migration oder einem Einwachsen von Zellen kommt. Der erfindungsgemäße Urogenitalstent schafft hier wirksam Abhilfe. So verhindern die siRNA-Moleküle, die bspw. Bestandteil einer Be- schichtung des Stents sind, dass es zu einer weiteren Proliferation von Gewebe im Urogenitalbereich kommt. Auf diese Art kann der Harnleiter bzw. die Harnröhre dauerhaft durchgängig bleiben.
[0033] Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung aufweisend zumindest eine mit Geweben und/oder Flüssigkeiten des menschlichen oder tierischen Körpers in Kontakt kommende Oberfläche, vorzugsweise ein Nanopartikel (NP) oder ein Urogenitalstent, welche ein siRNA- Molekül, vorzugsweise ein solches der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, zur Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung des Urogenitaltraktes aufweist.
[0034] Die Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der erfindungsgemäßen Verwendung und des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für die erfindungsgemäße Vorrichtung entsprechend.
[0035] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
[0036] Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Dabei wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen, in denen Folgendes dargestellt ist: Fig. 1 zeigt die relative Expression von SRF-mRNA in humanen Prostatafibroblasten in Abhängigkeit der Konzentration der transfizierten siRNA.
Fig. 2 zeigt die Entwicklung der Zellzahl der transfizierten Prostatafibroblasten über einen Zeitraum von 16 Tagen.
Fig. 3 zeigt die Seneszenz der transfizierten Prostatafibroblasten über einen
Zeitraum von 16 Tagen nach der Transfektion.
Fig. 4 zeigt die Anzahl der Prostatafibroblasten nach der ersten, zweiten und dritten Transfektion mit siRNA.
Fig. 5 zeigt die Seneszenz der Prostatafibroblasten nach der ersten, zweiten und dritten Transfektion mit siRNA.
Fig. 6 zeigt die relative Expression von SRF-mRNA nach der ersten (A),
zweiten (B) und dritten (C) Transfektion mit siRNA.
Fig. 7 zeigt die relative Expression der E2F1 -mRNA (A) und Survivin-mRNA in der Krebszelllinie JL-1 nach Transfektion mit erfindungsgemäßer siRNA.
Fig. 8 zeigt die Anzahl der JL-1 -Zellen nach Transfektion mit erfindungsgemäßer siRNA.
Fig. 9 zeigt die relative Expression der E2F1 -mRNA (A) und Survivin-mRNA
(B) in der Krebszelllinie LXF-289 nach Transfektion mit erfindungsgemäßer siRNA.
Fig. 10 zeigt die Anzahl der LXF-289-Zellen nach Transfektion mit erfindungsgemäßer siRNA. Fig. 1 1 zeigt die Anzahl der A549-Zellen nach Transfektion mit erfindungsgemäßer siRNA.
Fig. 12 zeigt die Anzahl der SK-MES-Zellen nach Transfektion mit erfindungsgemäßer siRNA.
Fig. 13 zeigt die Anzahl der NCI-H460-Zellen nach Transfektion mit erfindungsgemäßer siRNA.
Ausführungsbeispiele
1 . siRNA-Moleküle
Die Erfindung wurde beispielhaft an drei siRNA-Molekülen getestet, die gegen den Serum-Response-Faktor (SRF), den Early-Region-2-Transkriptionsfaktor-1 (E2F- 1 ), und gegen Survivin gerichtet waren. Die siRNA-Moleküle wiesen die nachfolgenden Sequenzen auf.
SRF-siRNA:
Sinn: 5'- GAU GGA GUU CAU CGA CAA CAA - 3' (SEQ ID Nr. 1 )
Gegensinn: 5' - GUU GUC GAU GAA CUC CAU CUU - 3' (SEQ ID Nr. 2)
E2F1 -siRNA:
Sinn: 5' - GAC GUG UCA GGA CCU UCG UAA - 3' (SEQ ID Nr. 3)
Gegensinn: 5' - ACG AAG GUC CUG ACA CGU CUU - 3' (SEQ ID Nr. 4)
Survivin-siRNA:
Sinn: 5' - GGA CCA CCG CAU CUC UAC AAA - 3' (SEQ ID Nr. 5)
Gegensinn: 5' - UGU AGA GAU GCG GUG GUC CUU - 3' (SEQ ID Nr. 6) HIF1 a-siRNA:
Sinn: 5' - AGA GGU GGA UAU GUG UGG G - 3' (SEQ ID Nr. 7)
Gegensinn: 5' - CCC ACA CAU AUC CAC CUC U - 3' (SEQ ID Nr. 8)
HIF2a-siRNA:
Sinn: 5' - AGA UUC CUC GUU AUU GUU G- 3' (SEQ ID Nr. 9)
Gegensinn: 5' - CAA CAA UAA CGA GGA AUC U - 3' (SEQ ID Nr. 8) Inhibition der SRF-Expression in humanen Prostatafibroblasten
Humane Prostatafibroblasten wurden 24 Stunden vor der Transfektion in Zellkulturplatten mit 12 Vertiefungen kultiviert. Die Transfektion erfolgte mit dem Trans- fektionsmittel Interferin (Polyplus) in der vom Hersteller vorgesehenen Menge unter Abwesenheit von Serum für 2 Stunden. Es wurden verschiedene Konzentrationen der SRF-siRNA (SEQ ID Nr. 1 und 2) und einer Kontroll-siRNA ("scrambled"; scr-siRNA; Negativkontrolle) getestet. Der Nachweis des Knockdowns erfolgte über quantitative Echtzeit PCR (qRT-PCR). Für die qRT-PCR wurde zunächst die mRNA der Zellen mit Hilfe eines RNA-Isolationskits der Firma Biorat isoliert. Anschließend wurden 200 ng der mRNA mit dem cDNA Kit der Firma Biorad in cDNA umgeschrieben. Die qRT-PCR erfolgte mit dem iCycler (Biorad) auf der Basis des Fluoreszenzfarbstoffes SYBR Green (Biorad). Die Auswertung wurde mit dem Programm Genex (Biorad) durchgeführt. Als Haushaltsgen wurde GAPDH verwendet. Die Expression von nicht-transfizierten Zellen wurde auf eins normiert. Anhand dessen wurde die relative Expression kalkuliert.
Das Ergebnis ist in der Fig. 1 gezeigt.
Die x-Achse zeigt die Ansätze mit Kontroll-siRNA (SCR) und funktioneller siRNA (SRF) bei verschiedenen Konzentrationen, verglichen mit unbehandelten
Fibroblasten. Dabei zeigt sich, dass es zu einer Reduktion der SRF-mRNA ab einer siRNA-Konzentration von 1 nM kommt. Bei siRNA-Konzentrationen zwischen 25 und 50 nM kommt es zu einer Reduktion der SRF-mRNA-Expression von über 60 %.
Nach einer einmaligen Transfektion der Prostatafibroblasten mit SRF- oder scr- siRNA (jeweils 25 nM) und dem Transfektionsmittel Interferin wurde die Zellzahl mittels des Zellzählgeräts CASY untersucht. Hierzu wurden die Zellen an den Tagen 0, 2, 3, 9, 13 und 16 nach der Transfektion mit Trypsin/EDTA (Promocell) abgelöst. Nach Ablösen der Zellen wurde die Reaktion mit TNS (Promocell) abgestoppt. Anschließend wurden 20 ml der Zellsuspension zu 10 ml CASYton gegeben und im CASY gemessen. Das CASY ist in der Lage, mit Hilfe eines elektrischen Feldes die Integrität der Plasmamembran einer Zelle zu ermitteln. Dabei kann das CASY vitale Zellen von toten Zellen unterscheiden und diese zählen. In diesem Experiment wurde die Anzahl der vitalen Zellen bestimmt.
Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt.
Diese zeigt die Anzahl vitaler Zellen pro Milliliter nach Transfektion mit jeweils 25 nM SRF- oder scr-siRNA. Wie aus der Abbildung ersichtlich, ist die Anzahl der vitalen Zellen (linker Balken) am 16. Tag um ca. 50 % niedriger als in dem mit scr- siRNA behandelten Ansatz (mittlerer Balken).
Im nächsten Experiment wurde untersucht, inwiefern sich die Behandlung der Prostatafibroblasten mit erfindungsgemäßer siRNA auf die Seneszenz der Zellen auswirkt. Die Seneszenz beschreibt das Unterbleiben einer Zellproliferation, obwohl die Zellen weiterhin vital sind, d.h. das sog. Altern. Mit Hilfe des
ß-Galactosidase-Assays ist man in der Lage, seneszente Zellen anhand einer Blaufärbung zu quantifizieren. Hierbei bilden seneszente Zellen durch enzymati- sche Reaktion einen blauen Farbstoff. Hierzu wurden die Zellen an den Tagen 0, 2, 6, 9, 13 und 16 nach der Transfektion mit 2 % Paraformaldehyd und 0,2 % Glutardaldehyd für 10 min. bei Raumtemperatur fixiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Daraufhin erfolgte die Färbung der Zellen mit Färbepuffer (50 mM Zitronensäure, 137 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCI, 2 mM MgCI2, 5 mM Kaliumeisen(ll)-Cyanid, 5 mM Kaliumeisen(lll)-Cyanid, 1 mg/ml X-Gal) über Nacht bei 37 °C. Am darauffolgenden Tag konnten die blaugefärbten, seneszenten Zellen ausgezählt werden. Die Menge der seneszenten Zellen wurde auf die Gesamtzellzahl des CASY-Ansatzes relativiert.
Das Ergebnis dieses Experimentes ist in Fig. 3 dargestellt. Dort ist der relative Anteil seneszenter Zellen in Bezug auf die Gesamtzellzahl wiedergegeben. Es zeigt sich, dass am Tage 6. und 9. der Anteil von seneszenten Zellen im Transfek- tionsansatz um das 2,5-fache höher ist als in den Kontrollansätzen.
In weiteren Experimenten sollte untersucht werden, ob sich eine wiederholte Transfektion positiv auf die Proliferationshemmung auswirkt. Dazu wurden die humanen Fibroblasten dreimal mit jeweils 25 mM SRF-siRNA (SEQ ID Nr. 1 und 2) und dem Transfektionsmittel Interferin transfiziert. Die Zellen wurden jeweils 3 Tage nach der erfolgten Transfektion erneut transfiziert. Untersucht wurden erneut die Zellzahl, Seneszenz, Proliferation und SRF-Knockdown.
Die Entwicklung der Zellzahl ist in Fig. 4 dargestellt.
Dabei zeigt sich, dass nach der dritten Transfektion 80 % weniger Zellen vorhanden sind als in den Kontrollansätzen.
Die Auswirkung auf die Seneszenz ist in der Fig. 5 dargestellt. Dabei zeigt sich, dass bis zu 3,5-fach mehr seneszente Zellen in dem Ansatz zu finden sind, der mit der SRF-siRNA transfiziert wurde als in den Kontrollansätzen.
Die Untersuchung der Proliferation wurde mit Hilfe des BrdU-Assays durchgeführt. BrdU ist eine Chemikalie, die dem Thymidin strukturell ähnlich ist. Bei der Proliferation ist die Verdoppelung der DNA im Zellkern nötig. Wenn eine Zelle proliferiert, baut sie das BrdU in ihre neu synthetisierte DNA ein. Die Zellen können anschließend mit einem spezifischen fluoreszenzmarkierten Anti-BrdU-Antikörper gefärbt werden und mittels Durchflusszytometrie können die proliferierenden Zellen ermit- telt werden. Der BrdU-Assay wurde jeweils 3 Tage nach der Transfektion durchgeführt. Hierbei wurden die Zellen 24 Stunden zuvor mit 10 μηη BrdU inkubiert, um einen Einbau des BrdU in die DNA zu ermöglichen. Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen abgelöst und mit Hilfe einer intrazellulären Färbung mit dem Anti- BrdU-Antikörper inkubiert. Die proliferierenden Zellen wurden mit dem Durchfluss- zytometer bestimmt. Die proliferierenden Zellen wurden als prozentualer Anteil an sämtlichen im Durchflusszytometer analysierten Zellen kalkuliert.
Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle 1 dargestellt:
Figure imgf000014_0001
Tab 1 : Proliferation von Prostatafibroblasten in % mittels BrdU-Assay ermittelt.
Es zeigt sich, dass innerhalb eines 24-stündigen Untersuchungszeitraums 25 bis 36 % der Fibroblasten proliferieren. Nur 15 % der mit SRF-siRNA transfizierten Zellen hingegen proliferieren innerhalb dieses Zeitraumes.
In einem weiteren Experiment wurde untersucht, wie stark die relative Expression der SRF-MRNA nach der ersten (A), zweiten (B) und dritten (C) Transfektion mit 25 nM SRF-siRNA oder scr-siRNA inhibiert wird.
Das Ergebnis ist in der Fig. 6 gezeigt.
Dabei zeigt sich, dass es nach allen drei Transfektionen zu einem signifikanten Knockdown der SRF-Expression von ca. 80 % kommt. Transfektion der Krebszelllinie JL-1 mit E2F1 - und Survivin-siRNA Die Erfindung wurde ferner unter Verwendung zwei weiterer siRNA-Moleküle getestet. Ferner wurde anstelle einer Fibroblastenzelllinie die Krebszelllinie JL-1 verwendet.
Dazu wurden die Zellen mit 25 nM und 100 nM E2F1 -siRNA, 25 nM und 100 nM Survivin-siRNA und als Kontrolle mit 25 nM scr-siRNA transfiziert und anschließend die Expression von E2F1 und Survivin analysiert. Dabei wurde so vorgegangen, wie weiter oben für die Expression von SRF und Prostatafibroblasten beschrieben.
Das Ergebnis ist in der Fig. 7 dargestellt.
Dabei zeigt sich in Bezug auf die E2F1 -Expression (A) sowohl bei einer Konzentration von 100 nM E2F1 -siRNA (zweiter Balken von links) als auch 25 nM E2F1 - Expression (dritter Balken von links) ein Knockdown von über 50 %.
In Bezug auf die Survivin-Expression (B) zeigt sich sowohl bei der Survivin-siRNA- Konzentration von 25 mM (zweiter Balken von links) als auch bei der Survivin- siRNA-Konzentration von 100 mM (dritter Balken von links) ein Knockdown von über 80 %.
Anschließend wurde die Entwicklung der Zellzahl drei Tage nach Transfektion mit Survivin- oder E2F1 -siRNA untersucht.
Das Ergebnis ist in der Fig. 8 dargestellt.
Dabei zeigt sich, dass die Zellzahl im Vergleich zu unbehandelten Zellen drei Tage nach Transfektion um ca. 50 % in Survivin- und E2F1 -siRNA behandelten Zellen reduziert ist. Inhibition von E2F1 und Survivin in der Krebszelllinie LXF-289 nach Transfektion mit erfindungsgemäßer siRNA Von den Erfindern wurde anschließend die Krebszelllinie LXF-289 untersucht.
Zunächst wurde das Ausmaß der Inhibition der E2F1 -Expression und Survivin- Expression nach einer Transfektion der Krebszelllinie LXF-289 mit 25 nM undl OO nM E2F1 -siRNA, 25 und 100 nM Survivin-siRNA und als Kontrolle mit 25 nM scr- siRNA bestimmt.
Das Ergebnis in Bezug auf die E2F1 -Expression ist in der Fig. 9a gezeigt.
Dabei zeigt sich, dass die Expression von E2F1 bei beiden Konzentrationen um über 90% reduziert ist.
Das Ergebnis in Bezug auf die Survivin-Expression ist in der Fig. 9b gezeigt.
Dabei zeigt sich, dass die Expression von Survivin durch die Transfektion um ebenfalls ca. 90 % reduziert ist.
Schließlich wurde die Entwicklung der Zellzahl nach der Transfektion mit Survivin- oder E2F1 -siRNA untersucht.
Das Ergebnis ist in der Fig. 10 dargestellt.
Dabei zeigt sich, dass die Zellzahl nach der Transfektion mit Survivin- und E2F1 - siRNA drastisch reduziert ist. Inhibition von HIF1 a und HIF2a in den Krebszelllinien A549, SK-MES und NCI- H460 nach Transfektion mit erfindungsgemäßer siRNA
Die Erfinder haben dann dreit weitere Krebszelllinien mit den Bezeichnungen A549, SK-MES und NCI-H460.untersucht. Die Zelllinien wurden einen Tag vor der Transfektion mit ca. 20.000 Zellen pro Vertriefung einer 12-well Platte angezüchtet. Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen mit 50 nM der HIFI a- bzw. HIF2a-siRNA transfiziert. Drei Tage nach Transfektion wurden die Zellen mittels einem Zellzählgerät (CASY) gezählt.
Das Ergebnis ist in der Fig. 1 1 (A549), Fig. 12 (SK-MES) und Fig. 13 (NCI-H460) gezeigt.
Durch Ausschalten von HIFI a konnte das Wachstum von A549 und NCI-H460 signifikant unterdrückt werden. Durch Ausschalten von HIF2a konnte das Wachstum von SK-MES signifikant unterdrückt werden. Fazit
Die Erfinder haben erkannt, dass unter Verwendung von siRNA-Molekülen hyperproliferative Erkrankungen des Urogenitaltraktes zielgerichtet behandelt werden können. Dies wird beispielhaft anhand von fünf verschiedenen siRNA-Molekülen, die gegen fünf verschiedene proliferationsinduzierende Gene gerichtet sind, und drei verschiedenen Zelltypen demonstriert.

Claims

Patentansprüche
Verwendung eines siRNA-Moleküls zur Beschichtung einer in den Urogenitaltrakt einbringbaren Vorrichtung zur Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung des Urogenitaltraktes.
Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die hyperproliferative Erkrankung des Urogenitaltraktes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Benigne Prostatahyperplasie (BPH), Harnleiterstriktur, Harnröhrenstriktur, obstruktive Miktionsbeschwerden, Prostatakarzinom.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das siRNA- Molekül ausgestaltet ist, um im Urogenitaltrakt die Expression eines proliferation- sinduzierenden Gens zu inhibieren.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das proliferation- sinduzierende Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Serum- Response-Faktor (SRF), Early-Region-2-Transkriptionsfaktor-1 (E2F-1 ), Survivin, HIF1 , HIF2, PTTG1 (Securin), STAT3, P-gp, Cyclin D1 b, VOPP1.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Nanopartikel (NP) ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Urogenitalstent ist.
Verfahren zur Herstellung einer in den Urogenitaltrakt einbringbaren Vorrichtung, das folgende Schritte aufweist:
(1 ) Bereitstellen eines siRNA-Moleküls zur Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung des Urogenitaltraktes, und (2) Auf-/Einbringen des siRNA-Moleküls auf/in eine Beschichtung der Vorrichtung.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Nanopartikel (NP) ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Urogenitalstent ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das siRNA-Molekül das siRNA-Molekül der Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 ist.
1 1 . Vorrichtung aufweisend zumindest eine mit Geweben und/oder Flüssigkeiten des menschlichen oder tierischen Körpers in Kontakt kommende Oberfläche, welche ein siRNA-Molekül zur Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung des Urogenitaltraktes aufweist, wobei das siRNA-Molekül auf/in eine Beschichtung auf der Oberfläche der Vorrichtung auf-/eingebracht wird.
12. Vorrichtung nach Anspruch 1 1 , das zur Einbringung in den Urogenitaltrakt ausgebildet ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 1 1 oder 12, die ein Nanopartikel (NP) ist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 1 1 oder 12, die ein Urogenitalstent ist.
15. Vorrichtung nach einem Ansprüche 1 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das siRNA-Molekül das siRNA-Molekül der Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 ist.
PCT/EP2012/058123 2011-05-04 2012-05-03 Behandlung von hyperproliferativen erkrankungen des urogenitaltraktes WO2012150299A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102011100581.5 2011-05-04
DE201110100581 DE102011100581A1 (de) 2011-05-04 2011-05-04 Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen des Urogenitaltraktes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2012150299A2 true WO2012150299A2 (de) 2012-11-08
WO2012150299A3 WO2012150299A3 (de) 2012-12-27

Family

ID=46197234

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2012/058123 WO2012150299A2 (de) 2011-05-04 2012-05-03 Behandlung von hyperproliferativen erkrankungen des urogenitaltraktes

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102011100581A1 (de)
WO (1) WO2012150299A2 (de)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004069991A2 (en) 2003-02-10 2004-08-19 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
DE10306083A1 (de) 2003-02-07 2004-09-02 Technische Universität Dresden Erkennungsmoleküle gerichtet gegen ein Survivin-Gen und die Verwendung dieser
US20080081791A1 (en) 2006-07-06 2008-04-03 Weida Huang Methods of using combinations of siRNAs for treating a disease or a disorder, and for enhancing siRNA efficacy in RNAi

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009104051A2 (en) * 2007-12-31 2009-08-27 Lu Patrick Y Combinational therapeutics for treatment of prostate cancer using epoxy encapsulated magnetic particles and rnai medicine
US20120195958A1 (en) * 2009-03-27 2012-08-02 National University Of Ireland, Galway Implantable devices
CA2757694C (en) * 2009-04-15 2020-10-06 Northwestern University Delivery of oligonucleotide-functionalized nanoparticles

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10306083A1 (de) 2003-02-07 2004-09-02 Technische Universität Dresden Erkennungsmoleküle gerichtet gegen ein Survivin-Gen und die Verwendung dieser
WO2004069991A2 (en) 2003-02-10 2004-08-19 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
US20080081791A1 (en) 2006-07-06 2008-04-03 Weida Huang Methods of using combinations of siRNAs for treating a disease or a disorder, and for enhancing siRNA efficacy in RNAi

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAUER ET AL.: "Lehrbruch der pharmazeutischen Technologie", 1999, WISSENSCHAFTLICHE VERLAGSGESELLSCHAFT STUTTGART MBH
ROWE ET AL.: "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2006, PHARMACEUTICAL PRESS

Also Published As

Publication number Publication date
DE102011100581A1 (de) 2012-11-08
WO2012150299A3 (de) 2012-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yu et al. Induction of apoptosis in non-small cell lung cancer by downregulation of MDM2 using pH-responsive PMPC-b-PDPA/siRNA complex nanoparticles
DE102007052114B4 (de) Verfahren zur Modulation der Funktion, des Wachstums oder der Differenzierung einer Zelle
Dong et al. Oriented nanofibrous P (MMD-co-LA)/Deferoxamine nerve scaffold facilitates peripheral nerve regeneration by regulating macrophage phenotype and revascularization
Liu et al. Salidroside promotes peripheral nerve regeneration based on tissue engineering strategy using Schwann cells and PLGA: in vitro and in vivo
US11752219B2 (en) Substrate delivery of embedded liposomes
Zahir-Jouzdani et al. Chitosan and thiolated chitosan: Novel therapeutic approach for preventing corneal haze after chemical injuries
US20210283186A1 (en) Engineered Exosomes for Medical Applications
DE102007008596B4 (de) Biologisch wirksame Moleküle auf Grundlage von PNA und siRNA, Verfahren zu deren zellspezifischen Aktivierung sowie Applikationskit zur Verabreichung
WO2003035083A1 (de) Medikament zur behandlung einer fibrotischen erkrankung durch rna interferenz
Wu et al. Exosomes derived from magnetically actuated bone mesenchymal stem cells promote tendon-bone healing through the miR-21-5p/SMAD7 pathway
DE102009006606A1 (de) Nicht-virales Transfektionsmittel
EP2363494A1 (de) Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems
WO2009036933A9 (de) Herabregulation der genexpression mittels nukleinsäure-beladener virusähnlicher partikel
Phạm et al. miRNA 146a-5p-loaded poly (d, l-lactic-co-glycolic acid) nanoparticles impair pain behaviors by inhibiting multiple inflammatory pathways in microglia
CN111317820B (zh) 剪接因子prpf31抑制剂用于制备药物的用途
Kraja et al. Preliminary study of a novel transfection modality for in vivo si RNA delivery to vocal fold fibroblasts
Salva et al. Inhibition of glomerular mesangial cell proliferation by siPDGF-B-and siPDGFR-β-containing chitosan nanoplexes
EP1899466B1 (de) Sirna-moleküle zur behandlung von blutgefässen
WO2012150299A2 (de) Behandlung von hyperproliferativen erkrankungen des urogenitaltraktes
TWI585205B (zh) ＭicroＲＮＡ－３２８反股組合物與其醫療用途
Mühlbäck et al. Genselektive Therapieansätze bei der Huntington-Krankheit.
Qin et al. Macromolecular carrier with long retention and body-temperature triggered nitric oxide release for corneal alkali burn therapy via leptin-related signaling
EP1841461A1 (de) Iniizierbares mittel zur zielgerichteten behandlung von retinalen ganglienzellen
CN117025592B (zh) 一种靶向jfk的小干扰rna及其用途
Li et al. Tetrahedral DNA‐Based Functional MicroRNA‐21 Delivery System: Application to Corneal Epithelial Wound Healing

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12724586

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12724586

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2