CN111317820B - 剪接因子prpf31抑制剂用于制备药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了剪接因子PRPF31抑制剂用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗癌症。相对于现有技术，本发明首次发现了剪接因子PRPF31可以作为癌症治疗靶点，通过进一步研究表明，敲低PRPF31或稳定转染shPRPF31显著抑制癌症的生长，并且PRPF31在多数癌组织中表达量高于相对应的正常组织，PRPF31高表达使癌症的预后不良。因此，靶向抑制PRPF31基因和/或蛋白的表达，明显可用于癌症的预防和治疗，具有开发药物的前景。
Description
技术领域
本发明属于癌症治疗新靶点技术领域，具体涉及剪接因子PRPF31抑制剂用于制备药物的用途。
背景内容
近十几年来癌症的发病率、死亡率均呈持续上升态势，已成为严重威胁人类健康的主要公共卫生问题之一。癌症，长期以来因其很难治愈又被称为“绝症”或“不治之症”，许多人往往“谈癌色变”。因为一旦患癌，就意味着要经历手术切除、放疗或化疗的痛苦折磨，而且还难以逾越高死亡率的禁区。2020年全世界的癌症发病人数将从2001年的 1000万增加到1500万，癌症死亡人数将由2001年的600万上升至1000万。随着近年来医疗科技的飞速发展，目前癌症治疗不再是简单粗暴的无差别打击，科学家们寻找到癌细胞和正常细胞之间更多的不同点，医学上称之为“靶点”，进行精准的靶向药物治疗，不断有癌症患者被治愈。多种癌症“靶点”的发现和层出不穷的新靶向药物的研发及投入使用，为肺癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、淋巴瘤、甲状腺癌、黑色素瘤、肾癌、肝癌、胃癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌等多种癌症患者带来了希望。即使如此，癌症的治疗仍是一大难题，所以发现新的癌症的治疗靶点对于癌症的治疗具有重要意义。
剪接是基因转录后重要的修饰过程，主要作用是将不成熟mRNA中的内含子切除，将外显子连接起来。剪接主要发生在细胞核的剪接体，剪接体包含5个小核内核糖核蛋白(U1,U2,U4,U5和U6 snRNP)以及150个以上的蛋白质。在剪接过程中外显子的识别主要是由剪接位点介导，因此剪接过程是多变的，辅助性剪接因子可以推动剪接体通过对剪接位点的识别决定留下还是切除某些外显子，这就是选择性剪接的发生机制。可变剪接(Alternative Splicing,AS)普遍存在于真核多细胞生物，在多种生理过程中发挥着重要功能。剪接因子通过与RNA前体上的序列元件相互作用，在可变剪接调控中发挥核心作用。剪接异常是导致人类遗传疾病的主要原因之一，并被证实与癌症发生、发展、药物耐受等紧密相关。研究发现剪接因子SRSF6调节的选择性剪接可以促进结肠癌细胞的生长(Wan L,etal.Gut 2017；0:1-12)。另有研究发现，在宫颈癌细胞中， PRPF8通过参与线粒体自噬影响细胞的生长。
PRPF31，一种存在于细胞核和剪接小体的pre-mRNA加工因子，是剪接体 U4/U6.U5trisnRNP(small nuclear ribonucleoprotein)亚基的部件，参与可变剪接调控。PRPF31广泛分布于各个组织、器官，通常癌组织表达高于正常组织。前期研究发现， PRPF31突变可导致视网膜色素变性。近期亦有研究发现，PRPF31直接参与果蝇染色体的有丝分裂(Pellacani et al.eLife 2018；7:e40325)。目前没有关于通过抑制PRPF31治疗癌症的任何报道。
发明内容
发明目的：为解决上述问题，本发明提供了剪接因子PRPF31抑制剂在预防和治疗癌症方面的应用，为开发治疗癌症的药物提供依据。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明技术方案如下：
一方面，本发明提供了剪接因子PRPF31抑制剂用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗癌症。
所述剪接因子PRPF31包括正常的剪接因子PRPF31或其突变体(序列中有一小部分发生了变异、缺失或者增加等)，正常剪接因子PRPF31的氨基酸序列如下NCBI ReferenceSequence:NP_056444.3所示：
NCBI Reference Sequence:NP_056444.3
M S L AD E L L AD L E E A A E E E E G G S Y G E E E E E P A I E D V QE E T Q L D L S G D S V K T I A K L W D S K M F A E I M M K I E E Y I S K Q AK A S E V M G P V E A A P E Y R V I V D A N N L T V E I E N E L N I I H K F IR D K Y S K R F P E L E S L V P N AL D Y I R T V K E L G N S L D K C K N N EN L Q Q I L T N AT I M V V S V T AS T T Q G Q Q L S E E E L E R L E E AC D MAL E L N AS K H R I Y E Y V E S R M S F I AP N L S I I I G AS T AAK I M G VAG G L T N L S K M P AC N I M L L G AQ R K T L S G F S S T S V L P H T G Y IY H S D I V Q S L P P D L R R K AAR L V AAK C T L A AR V D S F H E S T E G KV G Y E L K D E I E R K F D K W Q E P P P V K Q V K P L P AP L D G Q R K K RG G R R Y R KM K E R L G L T E I R K Q AN R M S F G E I E E D AY Q E D L G FS L G H L G K S G S G R V R Q T Q V N E AT K AR I S K T L Q R T L Q K Q S V VY G G K S T I R D R S S G T AS S V AF T P L Q G L E I V N P Q AAE KK V AE ANQ K Y F S S M AE F L K V K G E K S G L M S T
本发明首先发现剪接因子PRPF31可以作为癌症治疗靶点，因此，抑制该靶点的物质可以用于治疗癌症，本发明所述剪接因子PRPF31抑制剂为抑制PRPF31活性或表达的物质。
本发明所述剪接因子PRPF31抑制剂可以通过以下手段抑制PRPF31蛋白表达或抑制PRPF31活性/功能，从而用于预防和/或治疗癌症：
靶向PRPF31 mRNA促进其降解的siRNA和/或shRNA；
靶向PRPF31 mRNA的3’非编码区(3’UTRs)或5’非编码区(5’UTRs)，抑制其蛋白翻译的miRNA；
通过基因敲除(Knockout)技术敲除PRPF31；
通过调控DNA修饰(包括但不局限于DNA启动子区域甲基化)和/或组蛋白修饰 (包括但不局限于组蛋白去乙酰化)，从而抑制PRPF31基因转录；
通过抑制转录因子与PRPF31启动子和/或增强子结合，从而抑制PRPF31转录；
靶向PRPF31蛋白，抑制其发挥功能的阻断剂、拮抗剂或抑制剂；
抑制PRPF31基因或蛋白表达的抑制剂；
PRPF31的中和抗体、封闭抗体或阻断肽；
等，但是并不局限于上述手段。
作为进一步选择：
所述PRPF31抑制剂包括单不限于小分子有机物、小分子无机物、抗PRPF31抗体、能与PRPF31特异性结合并抑制其活性的核酸片段或多肽。
所述PRPF31抑制剂还包括抑制剂前体。
例如，所述PRPF31抑制剂可以选自人工合成的小干扰核糖核酸(siRNA)或短发夹核糖核酸(shRNA)。
所述癌症包括所有种类的癌症，例如非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、骨肉瘤或肝癌等。
所述PRPF31抑制剂能够抑制癌症的生长，并且有利于癌症的预后，从而预防、改善或治疗癌症。
另一方面，本发明还提供了包含剪接因子PRPF31抑制剂的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗癌症。
所述组合物包括PRPF31抑制剂(较佳地，为治疗有效量的抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。
所述药学上可接受的载体或赋形剂，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等。
所述的组合物的形式为药物、饮食补充剂或保健品组合物。
所述PRPF31抑制剂作用的靶器官或组织为哺乳动物或人体内表达PRPF31的器官组织。
本发明所述PRPF31抑制剂在预防或治疗癌症时，可以单独使用，也可以与其他药物配合同时使用，或者与其他药物一起制成复方制剂使用，都可以达到预防或治疗癌症的目的。
本发明所述抑制PRPF31可以抑制多种癌症的生长。表明PRPF31抑制剂可用于癌症的治疗，具有开发药物的前景。
有益效果：相对于现有技术，本发明首次发现了剪接因子PRPF31可以作为癌症治疗靶点，通过进一步研究表明，敲低PRPF31和稳定转染shPRPF31不利于癌症的生长，并且PRPF31在各种正常组织和癌组织中的分布以及高表达不利于癌症的预后。因此，PRPF31抑制剂明显可用于癌症的预防和治疗，具有开发药物的前景。
附图说明
图1是非小细胞肺癌NCI-H460细胞分别转染不同浓度的NC或者siPRPF31，24h 收细胞后PRPF31表达的Westren Blot检测图；
图2是转染shNC或者shPRPF31的非小细胞肺癌NCI-H460中，Luciferase酶表达的荧光分光光度计检测图；
图3是非小细胞肺癌NCI-H460细胞稳定转染shNC或者shPRPF31，收细胞后 PRPF31表达的Westren Blot检测图；
图4是非小细胞肺癌NCI-H460细胞分别转染不同浓度的NC或者siPRPF31， 24h之后消化细胞铺板的克隆形成能力图；
图5是非小细胞肺癌NCI-1299细胞分别转染NC，siPRPF31或者只加转染试剂， 24h之后消化细胞铺板的克隆形成能力图；
图6是多种癌细胞分别转染不同浓度的shNC或者shPRPF31，36h之后消化细胞铺板的克隆形成能力图；
图7是PRPF31在多种癌组织和相应正常组织中的表达量比较图；
图8是多种癌组织中PRPF31高表达与患者预后关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例
一、试验方法
1.siPRPF31、shPRPF31敲低验证以及构建shPRFF31稳定株
1.1siPRPF31敲低验证。简述如下，人工分别合成siPRPF31独立的3条序列，序列分别为：siPRPF31#1:GCTACGAACTGAAGGATGA；siPRPF31#2: GCCAAGCTATGGGATAGTA；siPRPF31#3:CAAGCAAGCCAAAGCTTCA。取对数生长期的非小细胞肺癌NCI-H460细胞，0.25％胰蛋白酶消化，弃消化液，用完全培养基轻轻吹打混匀，计数，调整细胞密度至5～7.5×105cells/mL，2mL接种于6孔培养板中，于第二日分别转染NC或siPRPF31混合物100nM，150nM，200nM，转染24h后收细胞，利用免疫印迹的方法检测PRPF31是否敲低成功。
1.2shPRPF31稳定株的构建。简述如下，人工构建含有luciferase的shPRPF31两条(抗嘌呤霉素)，序列分别为：shPRPF31#1:GCTACGAACTGAAGGATGA；shPRPF31#2:GCCAAGCTATGGGATAGTA。取对数生长期的非小细胞肺癌NCI-H460细胞，0.25％胰蛋白酶消化，弃消化液，用完全培养基轻轻吹打混匀，计数，调整细胞密度至5～7.5×105 cells/mL，2mL接种于6孔培养板中，筛选出NCI-H460抗嘌呤霉素的最佳浓度。用相同的方法将NCI-H460细胞密度调整至1～1.25×105cells/mL，接种于48孔板，贴壁后 (12h)转染shNC或者shPRPF31，36h后将培养基换成含有相应最佳浓度的嘌呤霉素的筛选培养基，维持此条件继续培养或传代扩增，建立稳定敲低PRPF31的细胞株，然后利用免疫印迹的方法检测PRPF31是否稳定敲低。
1.3shPRPF31成功转染NCI-H460细胞的测试。简述如下，用上述相同的方法将NCI-H460细胞密度调整至1～1.25×105cells/mL，接种于48孔板，贴壁后(12h)转染shNC或者shPRPF31，36h后取出一部分，使用luciferase检测试剂盒，参照说明书，应用荧光分光光度计于560nM波长处检测吸光度。
2.敲低PRPF31不利于非小细胞肺癌NCI-H460以及NCI-H1299的生长
2.1敲低PRPF31不利于非小细胞肺癌NCI-H460的生长。简述如下，取对数生长期的非小细胞肺癌NCI-H460细胞，0.25％胰蛋白酶消化，弃消化液，用完全培养基轻轻吹打混匀，计数，调整细胞密度至5～7.5×105cells/mL，2mL接种于6孔培养板中，于第二日分别转染NC或siPRPF31混合物100nM，150nM，200nM，转染24h后消化细胞，计数，调整细胞密度至1×103cells/mL，2mL接种于6孔板中，生长2周，使用结晶紫染色观察细胞的克隆形成能力。
2.2敲低PRPF31不利于非小细胞肺癌NCI-H1299的生长。简述如下，取对数生长期的非小细胞肺癌NCI-H460细胞，0.25％胰蛋白酶消化，弃消化液，用完全培养基轻轻吹打混匀，计数，调整细胞密度至2.5～5×105cells/mL，2mL接种于6孔培养板中，于第二日分别转染NC，siPRPF31或者单独使用转染试剂，转染24h后消化细胞，计数，调整细胞密度至1×103cells/mL，2mL接种于6孔板中，生长2周，使用结晶紫染色观察细胞的克隆形成能力。
3.稳定转染shPRPF31不利于多种癌症的生长
3.1筛选不同癌细胞的最佳嘌呤霉素浓度。简述如下，
A.6孔培养板内以合适的细胞密度铺板，以备梯度实验，细胞孵育过夜；
B.配制适量含不同浓度Puromycin的新鲜培养基(0、0.5、1、2、4、8μg/mL)；
C.将6孔培养板中旧培养基替换为筛选培养基，继续孵育细胞；
D.约2～3天更换新鲜的筛选培养基，每日监测细胞，观察存活细胞比例。Puromycin的最佳作用时间一般在1～3天之间。最佳抗生素使用浓度指从抗生素筛选开始1～3天内杀死所有细胞的最低筛选浓度。
3.2稳定转染shPRPF31的癌细胞的克隆形成能力。简述如下，
Day 0：在48孔培养板内以合适的细胞密度铺板，孵育过夜；
Day 1：按照测定的MOI和细胞感染实验方法，感染细胞；
Day 2：病毒感染细胞后36h后消化细胞至密度为1×103cells/mL，铺于6孔培养板中，用含有相应的最佳浓度的Puromycin的筛选培养基培养至14天左右，使用结晶紫染色观察细胞的克隆形成能力。
4.PRPF31在各种正常组织和癌组织中的分布以及高表达PRPF31不利于一些癌症病人的预后。
使用GEPIA数据库在线查询得知。
二、试验结果
1.siPRPF31、shPRPF31敲低以及构建shPRFF31稳定株验证。
非小细胞肺癌NCI-H460转染siPPRF31之后与转染NC相比，PRPF31的表达量明显下降，且最佳敲低浓度为150nM,说明PRPF31敲低成功(图1)。稳定转染 shPRPF31的非小细胞肺癌NCI-H460与相同条件下转染shNC的NCI-H460细胞相比，PRPF31的表达量明显降低，说明构建shPRPF31稳定株成功(图2)。分别感染shNC，shPRPF31，shPRPF31#2的NCI-H460细胞的荧光强度明显强于正常的 NCI-H460细胞，说明NCI-H460转染病毒成功(图3)。
2.敲低PRPF31不利于非小细胞肺癌NCI-H460以及NCI-H1299的生长
转染siPRPF31的NCI-H460的细胞的数目明显少于转染NC的NCI-H460的数目，并且与图1中siPRPF31的转染效率一致。转染siPRPF31的NCI-1299的细胞的数目明显少于转染NC以及转染试剂的NCI-H1299的数目。说明敲低PRPF31不利于非小细胞肺癌NCI-H460以及NCI-H1299的生长(图4和图5)。
3.稳定转染shPRPF31不利于多种癌症的生长
稳定转染shPRPF31的癌细胞，包括:非小细胞肺癌(NCI-H460、NCI-H1299、 A549)，乳腺癌(MDA-MB-231、MCF-7、MDF-MCF-7)，结肠癌(HCT116、HT29、 SW480)，骨肉瘤(HOS、U2-OS)，肝癌(LM3、HepG2)，与相对应的转染shNC 相比，细胞数目明显减少。说明稳定转染shPRPF31不利于多种癌症的生长(图6)。
4.PRPF31在各种正常组织和癌组织中的分布以及高表达PRPF31不利于一些癌症病人的预后。
PRPF31在多数癌组织中表达量高于相对应的正常组织(图7)，提示剪接因子PRPF31可能是癌症生长、发展不可或缺的重要分子。另外，如图8所示，在肾嫌色细胞癌(KICH)、急性髓系白血病(LAML)、脑低级别胶质瘤(LGG)、肝细胞癌(LIHC)、间皮瘤(MESO)、前列腺癌(PRAD)、肉瘤(SARC)、葡萄膜黑色素瘤(UVM)中高表达 PRPF31不利于病人的预后。
Claims (8)
1.剪接因子PRPF31抑制剂用于制备药物的用途，所述药物用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、骨肉瘤或肝癌。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PRPF31抑制剂为抑制PRPF31活性或表达的物质。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PRPF31抑制剂包括小分子有机物、小分子无机物、抗PRPF31抗体、能与PRPF31特异性结合并抑制其活性的核酸片段或多肽。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PRPF31抑制剂包括抑制剂前体。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PRPF31抑制剂选自人工合成的小干扰核糖核酸(siRNA)或短发夹核糖核酸(shRNA)。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PRPF31抑制剂能够抑制癌组织的生长，并且有利于癌症的预后。
7.包含剪接因子PRPF31抑制剂的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、骨肉瘤或肝癌。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述组合物包括PRPF31抑制剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。
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