CN110279704B - 阿霉素联合用药物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿霉素联合用药物，包含阿霉素和FEN1蛋白抑制剂，以及药学上可接受的载体。本发明还公开了上述联合用药物用于制备治疗癌症，特别是结肠癌的药物的应用。本发明通过实验证明，将阿霉素与FEN1抑制剂SC13联合使用，可以显着增强Doxorubicin的治疗效果，联合使用后显著抑制结肠癌细胞的增殖，诱导DNA损伤和细胞凋亡；更重要的是，联合使用增强了小鼠模型中的抗肿瘤效果，降低了Doxorubicin的使用剂量及毒副作用。由此可见，阿霉素联合FEN1蛋白抑制剂在结肠癌的预防和治疗中具有药用前景。

Description

阿霉素联合用药物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术，特别是涉及一种阿霉素联合用药物，以及该联合用药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
目前，结肠癌在全世界的发病率和死亡率都很高，手术切除仍然是目前结肠癌最有效的手段，化疗是治疗中重要的辅助治疗之一。阿霉素(Doxorubicin，或称Adriamycin)，自发现以来一直是癌症化疗中最成功的药物之一。它是一种蒽环类抗生素，通过诱导DNA损伤促进肿瘤细胞的死亡。Doxorubicin已被证明可插入DNA，使DNA复制和转录过程异常，导致双链DNA断裂(DSB)。但是Doxorubicin对人体具有毒副作用，极大地限制了其在临床治疗中的应用。
DNA片段核酸内切酶1FEN1是一种金属核酸酶，具有结构特异性，与其他的限制性内切酶不同，所识别的底物与序列无关，只识别特定的DNA结构。除了核酸内切酶(FEN)活性外，还有核酸外切酶(EXO)活性和缺口核酸内切酶(GEN)活性，FEN1因为自身的这三种活性，使得它在许多个DNA代谢途径中扮演极其重要角色，比如DNA片段的降解、端粒稳定性的维持，长片段碱基切除修复(LP-BER)以及后随链中引物的去除等等。FEN1通过参与DNA复制和修复，在维持基因组的稳定性和完整性中发挥关键作用。FEN1在多种肿瘤细胞中存在异常的高表达。
Doxorubicin是一种主要的结肠癌抗癌药物，已在临床治疗中使用多年，但由于癌细胞的耐药性，其治疗效果有限。长时间的阿霉素治疗通常会导致癌细胞对治疗的抵抗，并且会产生严重的心脏毒性。在过去的几十年中，研究人员一直在研究如何克服化疗耐受性和耐药性。其他抗肿瘤药物如紫杉醇、喜树碱、顺铂等等，以及放射治疗也同样存在不同程度的副作用。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本申请提供了一种阿霉素联合用药物，以及该联合用药物在制备治疗癌症，特别是结肠癌药物中的应用。
技术方案：本发明所述的一种阿霉素联合用药物，包含阿霉素和FEN1蛋白抑制剂，以及药学上可接受的载体。
优选的，所述FEN1蛋白抑制剂为SC13。SC13的制备方法详见专利201710023851.1。
所述阿霉素联合用药物用于制备治疗癌症的药物的应用也在本申请的保护范围内。
进一步的，所述阿霉素联合用药物优选用于制备治疗结肠癌的药物。
有益效果：本发明通过实验证明，将阿霉素与FEN1抑制剂SC13联合使用，可以显著增强Doxorubicin的治疗效果，联合使用后显著抑制结肠癌细胞的增殖，诱导DNA损伤和细胞凋亡；更重要的是，联合使用增强了小鼠模型中的抗肿瘤效果，降低了Doxorubicin的使用剂量及毒副作用。由此可见，阿霉素联合FEN1蛋白抑制剂在结肠癌的预防和治疗中具有药用前景。
附图说明
图1是FEN1在结肠癌细胞中高表达；
图2是CCK8检测不同化疗药物联合SC13对细胞增殖的影响，药物浓度梯度处理细胞时均为加药48h后CCK8检测：A.检测单独使用camptothecin或camptothecin与SC13联用对SW480增殖的影响；B.检测单独使用paclitaxel或paclitaxel与SC13联用对SW480增殖的影响；C.检测单独使用carboplatin或carboplatin与SC13联用对SW480增殖的影响；D.检测单独使用5-FU或5-FU与SC13联用对SW480增殖的影响；E.检测单独使用doxorubicin或doxorubicin与SC13联用对SW480、NCM460增殖的影响；F.检测5天时间细胞分别加入溶剂、SC13、doxorubicin或药物联合时对SW480增殖的影响；G.检测单独使用doxorubicin或doxorubicin与SC13联用对HCT-8增殖的影响。H.检测5天时间细胞分别加入溶剂、SC13、doxorubicin或药物联合时对HCT-8增殖的影响；
图3是细胞影像和克隆形成实验检测在SW480细胞中SC13联合doxorubicin对细胞增殖的影响：A.药物处理细胞48h的细胞影像；B.不同药物处理下的细胞克隆形成能力：6孔板的每孔接种500个细胞，第二天细胞贴壁后加药，药物处理48h后换上不含药物的新鲜培养基继续培养；C.克隆形成的定量图；
图4是免疫荧光检测药物处理对SW480细胞增殖活性的影响：A.Ki67检测SC13、doxorubicin单独处理细胞或药物联用对细胞增殖的影响，SC13浓度为20μM，doxorubicin浓度为0.2μM，加药处理24h后检测，图示标尺为20μm；B.EdU检测SC13、doxorubicin单独使用或药物联用对细胞新生DNA合成的影响，SC13浓度为20μM，doxorubicin浓度为0.2μM，加药处理24h后检测，图示标尺为20μm；
图5是检测不同药物处理后细胞周期相关蛋白表达量：A.SC13浓度为20μM，doxorubicin浓度为0.2μM，加药处理24h后提蛋白Western Blot检测蛋白表达量，以Vinculin作为蛋白表达量的内参；B.免疫荧光检测不同药物处理的CDK6表达量变化，图示标尺为20μm；C.免疫荧光检测不同药物处理下的Cyclin D1表达量变化，图示标尺为20μm；
图6是检测不同药物处理下的DNA损伤情况：SC13浓度为20μM，doxorubicin浓度为0.2μM，加药处理24h后检测；A.Western Blot检测不同药物处理下的γH2AX的表达量，以Tubulin作为蛋白表达量的内参；B.免疫荧光检测不同药物处理下γH2AX的表达量，图示标尺为20μm，C.γH2AX foci点的统计图；D.免疫荧光检测不同药物处理下53BP1的表达量，图示标尺为20μm；E.53BP1 foci点的统计图；F.不同药物处理下的染色体畸形和断裂情况；G.染色体断裂的统计图；
图7是检测不同药物处理下的SW480细胞凋亡情况：A.FACS检测单独SC13、doxorubicin处理细胞或药物联合使用时细胞凋亡情况；B.细胞凋亡率的统计；C.WesternBlot检测不同药物组处理下细胞中几种典型凋亡蛋白的表达量，以GAPDH的蛋白表达量作为内参；D.免疫荧光染色检测细胞中Cleaved-caspase3在不同药物处理下的表达情况，图示标尺为20μm；
图8是裸鼠成瘤实验研究doxorubicin与SC13联合使用在动物体内的抗肿瘤作用：A.不同药物处理下裸鼠肿瘤体积的增长情况；B.药物处理结束后剖下的肿瘤组织照片；C.药物处理结束后剖下的肿瘤组织称重记录；D.不同药物处理组肿瘤石蜡切片的HE、Ki67、γH2AX、53BP1、Cleaved-caspase3、TUNEL染色，图示标尺为250μm；
图9是检测不同药物处理后对细胞同源重组修复的影响及相关蛋白表达量变化，SC13浓度为20μM，doxorubicin浓度为0.2μM，加药处理24h后检测；A.在U2OS细胞中检测不同药物处理下的同源重组修复能力；B.在SW480细胞中检测不同药物处理下的Rad51和BRCA1蛋白表达量，以Vinculin的蛋白表达量作为内参；C.免疫组化检测不同药物处理下SW480肿瘤组织切片的BRCA1表达量，图示标尺为250μm；D.在HCT-8细胞中检测不同药物处理下的Rad51和BRCA1蛋白表达量，以Vinculin的蛋白表达量作为内参；
图10是在SW480和HCT-8中分别敲降BRCA1后检测细胞对SC13的敏感性；A.WesternBlot检测在SW480细胞中慢病毒敲降BRCA1的敲降效率，以Vinculin的蛋白表达量作为内参；B.野生型SW480细胞和敲降BRCA1的SW480细胞加入SC13后对细胞增殖的影响，加药48h后CCK8检测；C.Western Blot检测在HCT-8细胞中慢病毒敲降BRCA1的敲降效率，以Vinculin的蛋白表达量作为内参；D.野生型HCT-8细胞和敲降BRCA1的HCT-8细胞加入SC13后对细胞增殖的影响，加药48h后CCK8检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。本发明使用针对于FEN1蛋白的小分子抑制剂SC13以及化疗药物Doxorubicin，以下所述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本实施例中主要说明SC13能够增强结肠癌细胞对化疗药物Doxorubicin的敏感性，为临床癌症治疗提供新型的药物联合使用的范例。
细胞来源：HCT8、SW480和NCM460细胞均来自美国模式培养物集存库(ATCC)。
本研究中用到的细胞有人结肠癌SW480细胞和HCT-8细胞，这两种细胞用DMEM培养基培养。另外还用到人的正常肠上皮细胞NCM460，用1640培养基培养。细胞培养基均购买于Gibco公司，用于培养细胞前加入10％胎牛血清和1％的青霉素与链霉素。
药物来源：阿霉素Dxorubicin购自selleck公司；FEN1抑制剂SC13制备方法详见专利201710023851.1。
FEN1抑制剂SC13粉末用DMSO配成20mM初浓度，从Selleck公司购买的阿霉素粉末用生理盐水配成20mM初浓度。使用时加到培养基中的SC13固定浓度为20uM，阿霉素使用浓度梯度(0.1uM，0.2uM，0.5uM，1uM)，找到联合效果最好的阿霉素浓度0.5uM与SC13(20uM)联合使用，做1～5天的时间梯度曲线。
实施例1：FEN1在两种结肠癌细胞以及正常肠上皮细胞的表达情况
选取人的结肠癌细胞SW480、HCT-8以及人的正常肠上皮细胞NCM460，分别培养SW480、HCT-8、NCM460细胞，待细胞长势良好时收样提取蛋白，用Western blot的方法检测三种细胞中FEN1的表达量，以Vinculin作为蛋白表达量的内参。结果如图1，我们发现结肠癌SW480、HCT-8细胞的FEN1蛋白水平均比正常肠上皮细胞NCM460要高，这提示我们FEN1与结肠癌的发生发展有关。
实施例2：几种不同化疗药物分别与SC13联合使用时对细胞的杀伤能力
将FEN1抑制剂SC13分别加入SW480和HCT-8细胞中，但并没有发现SC13单独使用时对结肠癌细胞的生长有明显抑制作用(如图2、图3、图4所示)。
在结肠癌SW480细胞中用一系列化疗药物分别与SC13联合使用，CCK8检测不同化疗药物联合SC13对细胞增殖的影响。药物浓度梯度处理细胞时均为加药48h后CCK8检测。
结果如图2所示，其中，A为单独使用camptothecin或camptothecin与SC13联用对SW480增殖的影响。B为单独使用paclitaxel或paclitaxel与SC13联用对SW480增殖的影响。C为单独使用carboplatin或carboplatin与SC13联用对SW480增殖的影响。D为单独使用5-FU或5-FU与SC13联用对SW480增殖的影响。由此可见，SC13对camptothecin(图2A)、paclitaxel(图2B)、carboplatin(图2C)、5-FU(图2D)均没有很明显的增敏作用。
当我们用SC13联合doxorubicin时发现，doxorubicin与SC13联合使用对SW480细胞的杀伤能力明显比同等浓度下单独使用doxorubicin要强，这表明在SW480细胞中SC13对doxorubicin有很强的药物增敏作用(图2E)。接着我们在正常肠上皮细胞NCM460中同样做了药物联合处理，发现在NCM460细胞中SC13对doxorubicin的增敏作用要比在SW480细胞中要弱(图2E，NCM460细胞的两条曲线差值要明显小于SW480细胞的曲线差值)，这表明将SC13与doxorubicin联用对正常细胞的毒性较小。前面的实验均为加药后48h检测，为了验证药物处理较长时间的作用，我们对SC13、doxorubicin单独处理SW480细胞或药物联合均做了5天时间的记录，结果同样发现单独的低浓度doxorubicin处理细胞5天后仍有50％以上的存活率，而药物联合时第二天便已杀死大部分细胞，5天时间细胞基本全部死亡(图2F)。另外我们检测到，在另一种结肠癌细胞HCT-8中，SC13同样对doxorubicin具有很明显的化疗增敏作用(图2G，图2H)。
实施例3
(1)Doxorubicin与SC13联合使用对SW480细胞的生长抑制作用
通过前期的筛选，在96孔板中接种细胞通过CCK8的方法我们找到了doxorubicin与SC13联合使用这样一组非常有效的药物联合方案。我们在6孔板中培养SW480细胞，每孔接种量相同，单独加SC13、doxorubicin处理细胞或两种药物联合使用。细胞影像结果显示单独使用SC13对细胞没有明显杀伤，但是在同等doxorubicin浓度下，加入SC13后对细胞的杀伤作用明显强于单独使用doxorubicin(图3A)。克隆形成实验进一步验证了SC13与doxorubicin联合使用对细胞的生长和形成克隆的能力产生了极其明显的抑制作用(图3B)。图3C是克隆形成的统计结果。
(2)Doxorubicin与SC13联合使用对SW480细胞的增殖活性和新生DNA合成能力的影响
前面我们通过CCK8、克隆形成实验发现了doxorubicin与SC13联合使用对结肠癌细胞有很强的细胞杀伤作用，我们猜测这是因为药物处理后细胞增殖受到了显著抑制。首先我们用免疫荧光的方法检测了细胞增殖标记物Ki67，发现单独doxorubicin处理细胞时荧光强度降低，细胞增殖受到抑制。而药物联合使用时Ki67的荧光强度降低的更为明显，对细胞增殖的抑制作用更强(图4A)。另一种细胞增殖标记物EdU染色结果显示，doxorubicin与SC13联合使用时明显抑制SW480细胞新生DNA的合成，进而对细胞增殖产生很强的抑制作用(图4B)。
(3)Doxorubicin与SC13联合使用对SW480细胞周期的阻滞
Doxorubicin与SC13联用时细胞增殖受到抑制则表明细胞周期可能被阻滞。接下来我们检测了一系列细胞周期相关蛋白在不同药物处理下的表达量变化情况。结果发现，doxorubicin与SC13联合使用时CDK4、CDK6、Cyclin D1的表达量明显下降，究其原因发现是因为CDK的抑制因子p21蛋白表达量在药物联用时显著上升，最终结果导致Rb的磷酸化水平下降，细胞周期发生阻滞作用(图5)。
(4)Doxorubicin与SC13联合使用对SW480细胞DNA损伤的影响
首先通过Western Blot检测了DNA双链断裂损伤标记物γH2AX在不同药物处理情况下的蛋白表达量变化情况，结果发现，doxorubicin处理细胞后γH2AX的表达量有所上升，而在doxorubicin和SC13联合处理细胞时γH2AX的表达量发生了更加显著的上升(图6A)。接着我们用免疫荧光的方法验证了γH2AX以及另一种DNA损伤标记物53BP1均在药物联合使用时荧光强度显著增强，说明药物联合使用时DNA损伤程度明显加剧(图6B，图6C，图6D，图6E)。核型分析结果显示doxorubicin与SC13联合使用时染色体会产生更多的畸形和断裂(图6F)。图6G是对染色体畸变情况的统计分析。
(5)2.2.6 Doxorubicin与SC13联合使用对SW480细胞凋亡的影响
通过前面的研究我们得知，doxorubicin与SC13联合使用造成SW480细胞增殖受抑制、细胞周期发生阻滞、DNA损伤程度加剧，我们猜测细胞增殖的抑制是因为细胞发生了凋亡现象。首先我们采用流式细胞术的方法检测SW480细胞在不同药物处理下的细胞凋亡程度，结果发现两种药物单独处理SW480细胞时并没有发生明显凋亡现象，而SC13与doxorubicin联合使用时细胞发生了显著的凋亡现象(图7A，图7B)。通过检测几种典型的细胞凋亡蛋白发现，药物联合使用时，caspase3的裂解程度明显升高，促凋亡蛋白Bax的表达量明显上升，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显下降(图7C)。图7D免疫荧光的结果进一步证明联合用药时Cleaved-caspase3的表达显著上升。
实施例4：Doxorubicin与SC13联合使用在动物水平的抗肿瘤作用
我们通过体外实验证明了在细胞水平上，低浓度doxorubicin与SC13联合使用对SW480细胞和HCT-8细胞具有明显的肿瘤杀伤作用。但是仅有体外细胞水平的实验不足以证明doxorubicin与SC13联用对体内肿瘤组织的作用，因此还需要体内动物水平的实验来研究是否这种药物联用组合在动物体内依然有效。我们大量培养SW480细胞，通过皮下注入约5周大的裸鼠体内，每只裸鼠皮下约注射300万个细胞，注射体积为100μL。约10天左右肿瘤体积达到50mm3左右，这时将裸鼠随机分为4组，分别腹腔注射药物溶剂、SC13、doxorubicin或同时注入SC13和doxorubicin的混合药物。每次SC13的注射量为2mg/kg，doxorubicin的注射量为5mg/kg。每次的药物注射体积为100μL单药或200μL两种药物的混合。每隔一天注射一次药物，一共注射7次，同时每隔两天记录一次肿瘤体积。图8A的结果显示随着注射药物天数的增加，溶剂组的裸鼠肿瘤体积增长的最快，其次是SC13组，再是doxorubicin组，而两种药物联合组经过33天的测量，肿瘤体积几乎没有增长，说明药物联合处理对裸鼠体内的肿瘤具有很好的抑制作用。待药物处理33天时，我们把每组每只裸鼠的肿瘤组织切下并按组按大小排好，可以清楚的看到药物联合组对肿瘤的抑制作用非常明显(图8B)。切下的肿瘤称重，结果显示药物联合组的肿瘤重量明显要轻于其它组(图8C)。肿瘤的石蜡组织切片染色显示药物联用的肿瘤组织中Ki67的表达量明显下降，Cleaved-caspase3明显上升，DNA损伤标记γH2AX、53BP1荧光强度明显增强，TUNEL荧光强度明显增强，凋亡率增加(图8D)。这些与体外的细胞实验结果一致。
实施例5：Doxorubicin与SC13联合使用造成合成致死作用的机制研究
(1)单独doxorubicin以及doxorubicin联合SC13对同源重组修复的影响
以上的实验结果表明，doxorubicin与SC13联合使用无论是在体外还是体内，都具有很强的肿瘤抑制作用。但是为什么SC13以及低浓度的doxorubicin单独使用对肿瘤细胞并没有明显的杀伤作用，而药物联用时对细胞杀伤作用明显呢？我们带着这一疑问，进行了接下来的探究。前面已经介绍到，FEN1在长片段碱基切除修复中发挥着至关重要的作用，FEN1抑制剂SC13通过抑制FEN1的FEN活性会直接抑制碱基切除修复(BER)过程。而结肠癌细胞SW480和HCT-8细胞均为DNA修复无缺陷的细胞。在这两种细胞中单独使用SC13来抑制BER途径时，仅仅造成细胞中DNA单链断裂损伤(SSBs)不能及时修复，而DNA双链断裂损伤(DSBs)仍然能够被修复，所以单独的SC13不足以杀伤这两种细胞。而有低浓度doxorubicin存在时再加入SC13，SC13便表现出很强的药物增敏作用，对细胞的杀伤作用明显比单独使用同等浓度的doxorubicin要强。我们猜测是因为doxorubicin抑制了双链断裂修复途径，因此在加入SC13同时抑制单链断裂修复时，细胞的DNA修复功能严重受阻，便发生了明显的合成致死作用。同源重组修复(HRR)是双链断裂损伤修复的重要途径，我们使用单细胞免疫荧光分析法，通过流式细胞仪检测HRR的修复效率，发现细胞经过doxorubicin处理后，HRR的修复效率显著下降，证明了细胞中加入doxorubicin处理一段时间后，HRR途径受到抑制(图9A)。接着我们在SW480细胞中检测了同源重组修复途径中的两种重要蛋白BRCA1和Rad51的变化，发现SC13与doxorubicin联合使用时，Rad51表达量下降。而单独使用doxorubicin时，BRCA1表达量就发生显著下降(图9B)。我们在裸鼠肿瘤切片上做了免疫组化染色检测BRCA1，同样发现在体内，doxorubicin单独使用时BRCA1表达量会显著下降(图9C)。在HCT-8细胞中Rad51和BRCA1的变化与SW480细胞一致(图9D)。
(2)敲降BRCA1后检测细胞对SC13的敏感性
我们通过慢病毒RNAi干扰在SW480(图10A)和HCT-8(图10C)中敲降BRCA1来模拟HRR途径的缺陷。结果发现，原本对SC13不敏感的SW480(图10B)和HCT-8(图10D)在敲降BRCA1之后，对SC13变得较为敏感。这一结果进一步证明了FEN1与BRCA1同时不能发挥正常功能时细胞会发生合成致死作用，结合前面的实验结果同时也可以说明doxorubicin与SC13联合使用的抗肿瘤作用的原因之一便是BER和HRR通路同时被抑制。

Claims (2)

1.阿霉素联合用药在制备预防和治疗结肠癌的药物中的应用；所述阿霉素联合用药包含阿霉素和FEN1蛋白抑制剂，以及药学上可接受的载体；所述FEN1蛋白抑制剂为SC13。
2.FEN1抑制剂SC13联合化疗药物阿霉素在制备预防和治疗结肠癌药物中的应用。
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