CN116212029A - 降低rcan1含量或活性的物质在预防和治疗衰老以及骨关节炎中的应用 - Google Patents

降低rcan1含量或活性的物质在预防和治疗衰老以及骨关节炎中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了降低RCAN1含量或活性物质在预防和治疗衰老以及骨关节炎中的应用。本发明发现敲降RCAN1基因可以延缓衰老并降低衰老相关促炎症因子，且敲降RCAN1基因可延缓骨关节炎的发展。因此，本发明为开发延缓衰老或骨关节炎的预防和治疗药物提供了新的思路，另外本发明的发现尤其适用于老年人的骨关节炎预防或治疗领域。

Description

降低RCAN1含量或活性的物质在预防和治疗衰老以及骨关节 炎中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的说是降低RCAN1含量或活性的物质在预防和治疗衰老以及骨性关节炎中的应用。
背景技术
细胞衰老是驱动机体衰老的基本机制之一。细胞衰老是指细胞在执行生命活动过程中，随着慢性应激的累积，细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。衰老细胞会分泌大量炎症及癌基因相关因子，被称为衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)，SASP包括促炎细胞因子(如IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-8)，生长因子(如HGF、TGF-β和GM-CSF)，趋化因子(如CXCL-1/3和CXCL-10)和基质重塑酶(如金属蛋白酶)等，SASP的产生会恶化组织微环境。衰老组织或器官中积累一定的衰老细胞(Senescent Cells，SNCs)，积累的衰老细胞失去细胞原有正常的生理功能，进而影响器官组织功能，可能导致或加剧衰老相关疾病。利用药物或者基因治疗手段延缓细胞衰老、清除衰老细胞或其分泌的SASP，可以延缓机体衰老或衰老相关的退行性改变。
现有清除衰老细胞的药物如BCL2抑制剂具有一定细胞毒性，同时具有引起中性粒细胞减少症和血小板减少症的副作用。针对p53-MDM2结合药物由于不是特异识别衰老细胞，会作用于正常细胞引起副作用。另外，部分靶向衰老基因的基因治疗在延缓细胞衰老的同时会引起衰老细胞重新增殖，由于衰老细胞累积了大量的DNA损伤，且基因组相对不稳定，因此衰老重新增殖后有形成肿瘤的潜在风险。因此，有必要探索和开发更为安全可靠的延缓细胞衰老的药物或疗法。
骨关节炎(OA)是一种衰老相关的退行性关节疾病，其严重影响病人的晚年生活。骨关节炎表现为关节软骨逐渐丧失、骨骼生长扭曲、关节炎症和关节疼痛等；治疗方式有通过NSAIDS(非甾体抗炎药)、注射皮质类固醇进行对症治疗，晚期使用机械人工关节置换受影响的关节等。目前，仍缺少早期可改善或逆转骨关节炎的疗法。
发明内容
为了开发更为安全可靠的延缓衰老的药物或疗法，本发明的目的在于提供一种衰老相关的靶标以及针对该靶标的预防或治疗方法，此外，本发明的靶标与骨关节炎相关，也可同时作为骨关节炎预防或治疗的靶点。
根据上述技术问题和目的，本发明提供了如下任一应用：
1.降低RCAN1含量或活性的物质在制备预防和\或治疗衰老产品中的应用。
2.抑制RCAN1基因表达或敲除RCAN1基因的物质在制备预防和\或治疗衰老产品中的应用。
3.降低RCAN1含量或活性的物质在制备预防和\或治疗骨关节炎产品中的应用。
4.抑制RCAN1基因表达或敲除RCAN1基因的物质在制备预防和\或治疗骨关节炎产品中的应用。
上述应用中，所述物质包括靶向RCAN1基因的CRISPR/Cas9敲除系统、siRNA、RCAN1抑制剂，这些物质可以单独使用也可以两个或多个进行组合使用，其中CRISPR/Cas9敲除系统通过敲除RCAN1降低RCAN1的含量；siRNA通过干扰基因表达抑制RCAN1表达；RCAN1抑制剂可以抑制RCAN1基因表达，降低RCAN1基因的mRNA含量或降低RCAN1的蛋白表达。所述产品可以是药品、保健品、研究用试剂等。
上述应用中，所述物质能降低衰老相关的促炎症因子水平，所述促炎症因子包括IL1B、IL6和IL1a。
优选地，所述物质能用于同时预防和\或治疗衰老和骨关节炎产品的制备。
进一步地，所述衰老包括动物细胞、组织、器官或个体的衰老。在本发明的一个实施例中，衰老细胞为人间充质干细胞。
具体地，所述骨关节炎包括半月板损伤导致的骨关节炎。
本发明的RCAN1亦称DSCR1、唐氏综合综关键区基因1和钙调磷酸酶调节因子1，在本申请中可互换使用；该基因的编号为NCBI Entrez Gene:1827。本发明中RCAN1、Rcan1、rcan1可互换使用，均指RCAN1基因。
本发明的优势在于：
(1)本发明提供了预防和/或治疗衰老和骨关节炎的新靶标。
(2)本发明公开的RCAN1为内源性调节因子，降低其含量或活性或者抑制其表达对正常细胞的毒副作用小，且不会诱导衰老细胞重新增殖可避免衰老细胞增殖后形成肿瘤的潜在风险。
(3)本发明公开的RCAN1既是衰老靶标也是骨关节炎靶标，尤其适用于开发预防和/或治疗老年患者的骨关节炎产品。
附图说明
图1为本发明的实施例5中RCAN1在正常和衰老(或骨关节炎)组织或细胞中的表达情况。*表示存在显著差异，p<0.05；**表示存在极显著差异，p<0.01。
1A为正常人(norm)与骨关节炎病人(OA)关节中RCAN1表达水平对比图。
1B为正常人(Normal)与骨关节炎病人(OA)关节滑膜组织中p53、IL1A和RCAN1共定位表达对比图，Bar值为10μm。
1C为小鼠骨关节炎模型(DMM)与正常对照(Sham)的关节软骨的番红O法(SafraninO)染色结果；关节软骨(Articular cartilage)、滑膜(Synovium)、以及软骨下骨(Subchondral bone)中RCAN1表达情况；以及滑膜的SA-β-Gal(即图中SA-b-Gal)检测结果；Bar值为20μm。
1D为利用多柔比星诱导体外培养的人间充质干细胞衰老过程中RCAN1表达随诱导时间的变化情况图。
1E为衰老细胞与增殖细胞(未衰老细胞)中SA-β-Gal(即图中SA-b-Gal和SA-β-gal)，Ki67和RCAN1阳性细胞比率。
图2为本发明的实施例6中通过CRISPR/Cas9敲除RCAN1的人间质干细胞并通过柔多比星诱导衰老后的细胞衰老以及相关基因表达情况。sgNTC代表感染sgNTC病毒的细胞组，sgRCNA1(包括sgRCAN1-1、sgRCAN1-2)为感染sg RCAN1-human慢病毒的细胞组，hESC-MSCs为第4代人间充质前体细胞。*表示存在显著差异，p<0.05；**表示存在极显著差异，p<0.01。
2A为SA-β-Gal(即图中SA-b-Gal和SA-β-gal)和Dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)检测结果。
2B为促炎症因子IL1A表达情况。
2C为促炎症因子IL1B、IL16、IL8和CXCL1表达情况。
图3为本发明的实施例7中人滑膜干细胞通过柔多比星诱导衰老后通过siRNA敲降RCAN1后衰老以及相关基因表达情况。NC、si01、si03分别代表：转染非靶向性siRNA序列组(Non-targeting control)、转染靶向RCAN1的01号siRNA序列组(AntiRCAN1-si01)、转染靶向RCAN1的03号siRNA序列组(AntiRCAN1-si03)。
3A为促炎症因子IL1A细胞表面蛋白水平。*表示存在显著差异，p<0.05。
3B为促炎症因子IL1B、IL16和IL8表达情况。*表示与衰老细胞转染非靶向性siRNA序列组比较存在显著差异，p<0.05。
3C为SA-β-Gal检测结果。*表示存在显著差异，p<0.05；Bar值为20μm。
3D为敲降RCAN1组细胞与非靶向对照组细胞转录组测序的通路分析结果。
图4为本发明的实施例8中在小鼠DMM模型中通过siRNA靶向Rcan1后对骨关节炎进展的影响，其中：
4A为标记了Cy3荧光的siRNA在关节腔内定位情况。
4B为为小鼠骨关节炎模型(DMM)中采用非靶向siRNA(siRNA-Ctrl)与靶向Rcan1的siRNA(siRNA-Rcan1)治疗后的关节软骨的番红O法(Safranin O)染色结果。
4C为针对软骨组织的国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis ResearchSociety International，OARSI)分级标准的评分结果。*表示存在显著差异，p<0.05。
4D为滑膜炎症(synovial inflammation)的评分结果。*表示存在显著差异，p<0.05。
4E为对照组(siRNA-Ctrl)与抑制Rcan1治疗组(siRNA-Rcan1)关节软骨、软骨下骨和滑膜组织中RCAN1表达水平对比图。
4F为对照组(siRNA-Ctrl)与抑制Rcan1治疗组(siRNA-Rcan1)关节软骨组织中Col2、Col10、Mmp13和Adamts5表达水平对比图，其中sham代表假手术组。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，可通过现有技术加以实现。实施例中用到的实验仪器和物料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1通过lentiCRISPRv2敲除RCAN1基因
(1)针对RCAN1的sgRNA序列如下：
sg RCAN1-huamn-F1：5′-CACCGTCGCGTGCCAGTTCAGCTG-3′；
sg RCAN1-human-R1：5′-AAACCAGCTGAACTGGCACGCGAC-3′；
sg RCAN1-huamn-F2：5′-CACCGAGCTGAACTGGCACGCGACG-3′；
sg RCAN1-human-R2：5′-AAACCGTCGCGTGCCAGTTCAGCTC-3′；
(2)在公司(sigma)合成上述靶向RCAN1基因的寡核苷酸序列，sg RCAN1-huamn-F1与sg RCAN1-human-R1退火得到sg RCAN1-human-1，用T4连接酶(NEB)连接到用FastDigest_Esp3I(NEB)酶切lenti-CRISPRv2(Addgene产品，#52961)得到的载体骨架上，将得到的序列正确的重组载体记为重组载体sgRCAN1-human-1。lenti-CRISPRv2载体骨架中含有Cas9内切酶编码基因并能表达Cas9内切酶，还含有用于引导Cas9到基因组特定位点的外源DNA片段插入位点以及gRNA骨架的编码DNA。重组载体sg RCAN1-human-1能编码导向RCAN1基因的sgRNA。
(3)按照上述方法，sg RCAN1-huamn-F2与sg RCAN1-human-R2退火得到sg RCAN1-human-2，用T4连接酶(NEB)连接到用FastDigest_Esp3I(NEB)酶切过后的lenti-CRISPRv2(Addgene产品，#52961)载体骨架上，将得到的序列正确的重组载体记为重组载体sgRCAN1-human-2。重组载体sg RCAN1-human-2能编码导向RCAN1基因的sgRNA。
(4)按照上述方法，sgNTC-F1与sgNTC-R1退火得到sgNTC，用T4连接酶(NEB)连接到用FastDigest_Esp3I(NEB)酶切lenti-CRISPRv2(Addgene产品，#52961)得到的载体骨架上，得到的序列正确的重组载体即为对照载体。
sgNTC-F1：5′-CACCGACGGAGGCTAAGCGTCGCAA-3′；
sgNTC-R1：5′-AAACTTGCGACGCTTAGCCTCCGTC-3′。
(5)采用Lipo3000转染试剂盒(ThermoFisher)，将慢病毒质粒sg RCAN1-human、慢病毒包装载体psPAX2和pMD2G共转染293T细胞(配比为：1个10cm dish 293T细胞：9μg慢病毒质粒sg RCAN1-human、6μg psPAX2和3μg pMD2G)，培养8小时。
更换为新鲜的293T细胞培养基，继续培养48-54小时。
收集上清，采用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。
4℃、19400rpm离心2小时，弃上清，用培养基重悬，即为含有sg RCAN1-human重组慢病毒的病毒液，简称sg RCAN1-human病毒液。
(6)将慢病毒质粒sg RCAN1-human替换为对照载体，其他步骤均不变，得到对照病毒液，记为sgNTC病毒液。
(7)sgRCAN1-human慢病毒感染间充质前体细胞：以第4代的hESC-MSCs间充质前体细胞为供试细胞，分别感染sgNTC和两种sg RCAN1-human病毒。具体方法为：2μL sgRCAN1-human慢病毒(或sgNTC病毒)和2μL Polybrene加到接种有第4代的hESC-MSCs间充质前体细胞的培养孔(6孔板的一个孔)中。次日换液，之后正常培养，传代。
(8)感染sgNTC或sg RCAN1-human慢病毒后，将所得细胞连续传代至3-4代。收集细胞，进行RCAN1蛋白敲低效率检测，并进行细胞衰老标志物SA-β-gal染色，检测IL6、细胞增殖分子标志物(Ki67)以及衰老相关基因(Il1B、IL6、IL8、CXCL1)的mRNA水平。
实施例2SiRNA敲降RCAN1
(1)在广州锐博生物技术有限公司合成siRNA序列。针对人的RCAN1的siRNA序列如下；
AntiRCAN1-si01:5′-GGACGTATGACAAGGACAT-3′(货号：siB13516183302)
AntiRCAN1-si03:5′-GTGGTCCATGTATGTGAGA-3′(货号：siG000001827A)
(2)非靶向的对照siRNA序列如下；
Non-targeting control:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′(货号：siN0000001-1-5)
(3)消化细胞：首先将生长状态良好的细胞用胰酶进行消化，离心；
(4)细胞计数：去掉上清，加入lmL新鲜培养基重悬，吸取20μL加到细胞计数板中，于细胞计数仪count star中进行细胞计数；
(5)重新铺板：按5X104/孔的密度将细胞均匀种在12孔板上，过夜培养；
(6)多柔比星诱衰：弃去老培养基加入含有多柔比星的培养基，培养24h；
(7)换液：24h后更换为不含ps的新鲜培养基；
(8)转染：首先将100μL opti-MEM(减血清培养基,Gibico,#31985070)与2.5μL50nM siRNA；100μL opti-MEM和lipo2000(ThermoFisher)，混合后常温分别孵育5min；混匀将二者1:1混匀，随后常温静置20min；分别吸取200μL试剂加入到对应的孔板中进行转染，8-12小时；更换新鲜完全培养基。
(9)收样：再转然后24-48小时之内收RNA；qPCR：检测衰老相关基因(IL1B、IL6、IL8)表达水平。
(10)衰老细胞SA-β-gal(senescence-associatedβ-galactosidase)检测。
(11)取一部分细胞用TRIZOL(gibco，15596018)提RNA后送公司(晶能)建库，进行转录组RNA-seq测序。
实施例3细胞衰老SA-β-gal检测
步骤1：以1×105/孔的密度将间充质前体细胞接种到明胶(sigma)包被的6孔板的一个孔中，第2天进行染色。
步骤2：步骤1完成后用固定液【2％甲醛(体积百分比，v/v)+0.2％戊二醛(体积百分比，v/v)+97.8％PBS(体积百分比，v/v)】固定细胞3～5分钟，用PBS洗2遍。
步骤3：步骤2完成后每孔加入2mL染色液(40mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液、5mM K4[Fe(CN)6]、5mM K3[Fe(CN)6]、150mM NaCl、2mM MgCl2、1mg/mL X-gal)，在37℃细菌培养箱避光孵育过夜。
步骤4：步骤3完成后用PBS洗2遍后，倒置显微镜下观察，拍照。
实施例4小鼠骨性关节炎造模及给药
(1)siRNA序列
在广州锐博生物技术有限公司合成胆固醇和甲基化修饰、以及菁染料3(Cy3)修饰的siRNA序列。针对小鼠Rcan1的siRNA序列siRNA-Rcan1：5′-TGCTCAGACTTTACACATA-3′(货号siG171116021722)；非靶向对照序列siRNA-Ctrl：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′(siN0000005)。
(2)DMM造模
手术操作过程如下：腹腔注射0.8％戊巴比妥钠麻醉小鼠(C57BL/6，雄性，2月龄，10pil/g体重)，剃毛，用脱毛膏去掉短毛，擦碘伏；用蹑子和剪刀在小鼠膝关节处纵向剪开皮肤，在体视镜下用手术刀沿韧带内侧切开韧带和肌肉，侧翻开骨宾韧带，暴露膝关节；用显微剪剪掉内侧半月板，避免划伤关节软骨；分层依次缝合关节腔、肌肉和皮肤；将小鼠置于加热毯上待其苏醒。
(3)给药
小鼠手术2周后，分别对左腿直接注射control siRNA(非靶向对照序列siRNA-Ctrl)，右腿注射anti-Rcan1 siRNA(针对小鼠Rcan1的siRNA序列siRNA-Rcan1)，每周重复注射一次。分别在注射8w和12w时处死小鼠，收集关节样本，并进行后续处理。
(4)样本处理及检测
关节取样：将小鼠整个关节剪下，用眼科剪去除肌肉组织，尽量剔除干净；
固定：将关节浸泡于4％多聚甲醛中避光放置超过24小时，流水冲洗过夜，将固定液完全冲洗干净；
脱钙：将关节放于脱钙液中脱钙3周，期间换脱钙液2-3次，此时股骨胫骨变软，可用剪刀剪切判断脱钙程度。流水冲洗过夜，将脱钙液完全冲洗干净；
制作石蜡切片并进行后续SO染色以及rcan1，col2a，mmp13，adamts5，col10等免疫组化染色。
通过OARSI评分，阳性细胞定量等评估小鼠OA进展。
实施例5CAN1在衰老细胞中特异性上调表达水平
我们观察到在OA病人关节中，RCAN1表达水平高于正常人(图1A)。我们获取了人体正常和OA的滑膜组织，将p53和IL1A等衰老细胞标记物与RCAN1进行共定位，发现RCAN1在p53和IL1A阳性细胞中表达上调(图1B)。在小鼠OA模型中，我们发现在OA关节的软骨、滑膜以及软骨下骨中RCAN1阳性细胞数量显著高于正常对照(图1C)。随后，在体外培养的人间充质干细胞上，我们利用多柔比星诱导细胞衰老，观察到RCAN1随着细胞衰老的进展，表达逐渐加强(图1D-E)。这说明RCAN1在衰老细胞中特异性上调，且RCAN1阳性的衰老细胞在OA疾病过程中发生累积。
实施例6通过CRISPR/Cas9敲除RCAN1延缓细胞衰老
通过lentiCRISPRv2系统我们构建了RCAN1敲除的人间充质干细胞，通过多柔比星诱导衰老，发现敲除RCAN1可显著抑制经典衰老细胞标记：SA-β-gal阳性细胞染色，但是细胞数量并未显著增多(图2A)。进一步检测衰老细胞SASP相关基因水平，我们发现敲除RCAN1的衰老细胞表达促炎症因子IL1B和IL6水平降低，且经典促炎症SASP上游基因IL1a在细胞表面的定位显著下调(图2B和C)。这说明RCAN1调控了衰老细胞的促炎症SASP分泌，可作为潜在治疗靶点。
实施例7通过siRNA敲降RCAN1延缓细胞衰老调控细胞代谢
我们设计了针对人RCAN1的RNAi序列，同样在多柔比星诱导的衰老细胞中敲降RCAN1。同样地，我们发现抑制RCAN1可以降低SA-β-gal阳性细胞数量，细胞DNA损伤，以及促炎症因子水平(图3A-C)。通过高通量转录组测序，我们发现抑制RCAN1后，IL1信号和衰老相关通路被抑制，而与促进衰老相关代谢物的降解代谢增强以及细胞应答被抑制(图3D)。说明RNAi可以作为抑制RCAN1的手段，明确其具有抑制衰老细胞促炎症SASP分泌的功能。
实施例8在小鼠DMM模型中用siRNA抑制Rcan1水平可延缓OA发展
在小鼠DMM构建的OA模型中，siRNA可以有效递送到关节腔内，并且显著抑制Rcan1水平(图4A、4E)。治疗2个月后，较非靶向siRNA组，靶向Rcan1组小鼠关节软骨细胞外基质染色显著增强，细胞基质降解减弱，软骨下骨硬化以及滑膜炎症显著缓解(图4B-D)。同时，OA导致的关节腔软骨基质降解酶mmp13和Adamts5增加，在靶向Rcan1组小鼠关节中被明显缓解(图4F)。说明siRNA可以作为体内靶向抑制Rcan1的有效手段，且降低Rcan1水平可以延缓OA进展。
以上实施例给出的实施例仅为了清晰地阐述本发明，不能限制本发明的保护范围。凡是按本发明提出的技术思想在本发明技术方案的基础上所做的改动，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.降低RCAN1含量或活性的物质在制备预防和\或治疗衰老产品中的应用。
2.抑制RCAN1基因表达或敲除RCAN1基因的物质在制备预防和\或治疗衰老产品中的应用。
3.降低RCAN1含量或活性的物质在制备预防和\或治疗骨关节炎产品中的应用。
4.抑制RCAN1基因表达或敲除RCAN1基因的物质在制备预防和\或治疗骨关节炎产品中的应用。
5.根据权利要求1-4之一所述的应用，其特征在于，所述物质包括靶向RCAN1基因的CRISPR/Cas9敲除系统、siRNA、RCAN1抑制剂或者其中两种至多种的组合。
6.根据权利要求1-4之一所述的应用，其特征在于，所述物质能降低促炎症因子水平。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述促炎症因子包括IL1B、IL6和IL1a。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品能同时用于预防和\或治疗骨关节炎。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述衰老包括动物细胞、组织、器官或个体的衰老。
10.根据权利要求3或4或8所述的应用，其特征在于，所述骨关节炎包括半月板损伤导致的骨关节炎。
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