WO2003035083A1 - Medikament zur behandlung einer fibrotischen erkrankung durch rna interferenz - Google Patents

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WO2003035083A1
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gene
medicament
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Roland Kreutzer
Stefan Limmer
Detlef Schuppan
Matthias John
Michael Bauer
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Ribopharma Ag
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Definitions

  • the invention relates to a medicament and a use for the treatment of a fibrotic disease. It also relates to double-stranded ribonucleic acid and its use in the manufacture of a medicament.
  • a fibrotic disease is understood here to be a hierarchy that is characterized by an imbalance between the synthesis of extracellular matrix (ECM) and its degradation.
  • ECM extracellular matrix
  • the imbalance leads to an increased formation and deposition of extracellular matrix or connective tissue.
  • the EZM is formed by cells primarily from collagen, non-collagenic glycoproteins, elastin, proteoglycans and gycosaminoglycans.
  • the fibrotic disease can be, for example, scarring after injury to an internal organ or the skin that goes beyond what is necessary for healing.
  • the excessive formation and deposition of extracellular matrix can lead to malfunctions or failure of the affected organ, for example the lungs, the kidneys or the life.
  • EZM is formed, for example, by mesangial cells and interstitial fibroblasts.
  • the liver it is primarily hepatic stellate cells and portal fibroblasts that are responsible for the formation of the extracellular matrix.
  • the normally dormant hepatic star cells can be activated by damage, for example by toxins or chronic hepatitis. The result is their proliferation and their transdifferentiation in fibroblasts, which produce an excess of extracellular matrix molecules.
  • Attempts to inhibit the synthesis of type I collagen, an essential component of the extracellular matrix, by means of antisense oligonucleotides only led to a slight inhibition of matrix production.
  • An effective molecular biological method for inhibiting matrix production is not yet known.
  • DE 101 00 586 C1 discloses a method for inhibiting the expression of a target gene in a cell, in which an oligoribonucleotide with a double-stranded structure is introduced into the cell. One strand of the double-stranded structure is complementary to the target gene.
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • an effective medicament and a use for the treatment of a fibrotic disease should be provided.
  • a use for the production of such a medicament and an active substance suitable for inhibiting excessive formation of extracellular matrix are to be provided.
  • a medicament which contains a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) which, by means of RNA interference, is suitable for inhibiting the expression of a gene which is involved in the formation of extracellular matrix.
  • dsRNA double-stranded ribonucleic acid
  • a dsRNA is present when the ribonucleic acid consisting of one or two ribonucleic acid strands has a double-stranded structure. Not all nucleotides of the dsRNA need to have canonical Watson-Crick base pairings. In particular, individual non-complementary base pairs hardly or not at all impair the effectiveness. The maximum possible number of base pairs is the number of nucleotides in the shortest strand contained in the dsRNA.
  • the genes involved in the formation of extracellular matrix in the sense of the invention are also those genes which lead to the formation of factors which cause cells to produce extracellular matrix or to transform cells producing extracellular matrix. Such factors are e.g. B. the platelet growth factor (PDGF), the transforming growth factor ß (TGF ß), in particular 'TGFßl, TGFß2 or TGFß3, the connective tissue growth factor (CTGF) or oncostatin M.
  • PDGF platelet growth factor
  • TGF ß transforming growth factor ß
  • CTGF connective tissue growth factor
  • these factors can, for example, hepatic transdifferentiation in the liver Initiate and maintain star cells and portal fibroblasts in a phenotype similar to myofibroblasts. Compared to the original cells, this phenotype shows an increased proliferation rate and matrix synthesis with often simultaneously reduced degradation of extracellular matrix (fibrolysis) by matrix-degrading proteases. These factors can be released by cells of the liver other than the hepatic stellate cells or portal fibroblasts.
  • the gene is a gene which codes for the connective tissue growth factor CTGF (connective tissue growth factor), transforming growth factor ⁇ TGFß (transforming growth factor ⁇ ), in particular TGFß1, TGFß2 or TGFß3, TGF ⁇ receptor type I or Type II, the signal transducers Smad 2, Smad 3 or Smad 4, SARA (smad anchor for receptor activation), PDGF, Oncostatin M, a gene involved in the formation of collagen fibrils, a procollagen, prolyl-4-hydroxylase , Lysyl hydroxylase, lysyl oxidase, N-propeptidase or C-propeptidase.
  • Smad 2, Smad 3, Smad 4 and SARA are involved in the signal transduction triggered by the binding of TGF ß to the TGFß receptor type I or type II.
  • Prolyl 4-hydroxylase, lysyl hydroxylase, lysyl oxidase, N-propeptidase and C-propeptidase are on the bil- fertilization of collagen fibrils from procollagen, a precursor molecule.
  • the N-propeptidase cleaves an N-terminal propeptide from a procollagen and the C-propeptidase cleaves a C-terminal propeptide.
  • the procollagen is one of the pro ollagens of type ⁇ l (I), 2 (I), cl (II), l (III), l (V), ⁇ 2 (V), ⁇ 3 ( V), l (VI), 2 (VI), ⁇ 3 (VI), ⁇ l (XI), 2 (XI) or 3 (XI).
  • the Roman numeral in brackets designates the type of collagen formed from the procollagen.
  • the Arabic number identifies the chain of the procollagen.
  • the fibrotic disease can e.g. are liver fibrosis, fibrosis of the kidneys or lungs, for example after an injury, or scar tissue formation that goes beyond the scar formation required for healing.
  • a strand S1 of the dsRNA preferably has a region which is complementary to the gene, at least in sections, and in particular comprises fewer than 25 successive nucleotides.
  • the “gene” here means the DNA strand of the double-stranded DNA coding for a protein or peptide, which is complementary to a DNA strand which serves as a template for transcription, including all transcribed regions. So the gene is generally the sense strand.
  • the strand S1 can thus be complementary to an RNA transcript formed during the expression of the gene or its processing product, such as e.g. an mRNA.
  • the protein or peptide is one that is involved in the formation of extracellular matrix.
  • the complementary region of the dsRNA can have 19 to 24, preferably 20 to 24, particularly preferably 21 to 23, in particular 22 or 23, nucleotides.
  • a dsRNA with this structure is particularly efficient in inhibiting the gene.
  • the strand S1 of the dsRNA can have less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, in particular 23, nucleotides. The number of these nucleotides is also the number of the maximum possible base pairs in the dsRNA.
  • dsRNA has a single-stranded overhang formed from 1 to 4, in particular 2 or 3, nucleotides.
  • a dsRNA has a better effectiveness in inhibiting the expression of the gene than at least one end of a dsRNA without single-stranded overhangs.
  • One end is a region of the dsRNA in which there is a 5 'and a 3' strand end.
  • a dsRNA consisting only of strand S1 accordingly has a loop structure and only one end.
  • a dsRNA formed from the strand S1 and a strand S2 has two ends. One end is formed in each case by one end of strand S1 and one end of strand S2.
  • the single-stranded overhang is preferably located at the 3 'end of the strand S1-. This localization of the single-stranded overhang leads to a further increase in the efficiency of the medicament.
  • the dsRNA has a single-stranded overhang only at one end, in particular at the end located at the 3 'end of the strand S1.
  • the other end of a double-ended dsRNA is smooth, ie without overhangs. Surprisingly, it has been shown that an overhang at one end of the dsRNA is sufficient to increase the interference effect of the dsRNA, without lowering the stability to the same extent as by two overhangs.
  • a dsRNA with only one overhang has proven to be sufficiently stable and particularly effective both in various cell culture media and in blood, serum and cells.
  • the inhibition of expression is particularly effective if the overhang is at the 3 'end of the strand S1.
  • the dsRNA preferably has a strand S2, ie it is formed from two separate individual strands.
  • the drug is particularly effective if the strand S1 (antisense strand) is 23 nucleotides in length, the strand S2 is 21 nucleotides in length and the 3 'end of the strand
  • the 51 has a single-stranded overhang formed from two nucleotides.
  • the end of the dsRNA located at the 5 'end of the strand S1 is smooth.
  • the strand S1 can be complementary to the primary or processed RNA transcript of the gene.
  • the dsRNA preferably consists of the strand
  • Such a dsRNA is particularly effective in inhibiting the expression of the gene which codes for procollagen of type I (I) or CTGF and is involved in the formation of extracellular matrix.
  • the medicament can have a preparation which is suitable for inhalation, oral ingestion, infusion or injection, in particular for intravenous or intraperitoneal infusion or injection or for infusion or injection directly into a tissue affected by the fibrotic disease.
  • a preparation suitable for inhalation, infusion or injection can consist, in particular, exclusively of a physiologically compatible solvent, preferably a physiological saline solution or a physiologically compatible buffer, in particular a phosphate-buffered saline solution, and the dsRNA. It has surprisingly been found that a dsRNA which is only dissolved and administered in such a buffer or solvent is taken up by the cells expressing the gene.
  • the expression of the gene and thus the disease is thereby inhibited without the dsRNA having to be packaged in a special vehicle.
  • the dsRNA can be in the drug in a solution, especially a physical logically compatible buffer or a physiological saline solution, enclosed by a micellar structure, preferably a liposome, a capsid, a capsoid or a polymeric nano- or microcapsule or bound to a polymeric nano- or microcapsule.
  • the physiologically compatible buffer can be a phosphate-buffered saline solution.
  • a micellar structure, a capsid, a capsoid or a polymeric nano- or microcapsule can facilitate the uptake of the dsRNA into the cells expressing the gene.
  • the polymeric nano- or microcapsule consists of at least one biodegradable polymer, for example polybutyl cyanoacrylate.
  • the polymeric nano- or microcapsule can transport and release dsRNA contained in or bound
  • the dsRNA can be combined with an agent which enables a targeted uptake of the dsRNA in cells of an organ affected by the fibrotic disease, in particular the liver, the kidney, the lungs or the skin.
  • the dsRNA can be bound to the agent or, as in the case of the liposomes or the nano- or microcapsules, for example, can be surrounded by it.
  • Molecules can be embedded in the iposomes or the nano- or microcapsules, which enable targeted uptake, a so-called targeting.
  • the agent is preferably an agent which mediates binding to the collagen type VI receptor or the PDGF ⁇ receptor, in particular of hepatic star cells or myofibroblasts.
  • the hepatic star cells or myofibroblasts can be activated.
  • the cyclic peptide C * GRGDSPC * according to sequence No. 25 of the attached sequence listing is particularly well suited for the collagen type VI receptor.
  • C * stands for cysteine residues which, through a disulfide bond, bring about the ring closure of the peptide.
  • the medicament is preferably present in at least one administration unit which contains the dsRNA in an amount. maintains a dosage of at most 5 mg, in particular at most 2.5 mg, preferably at most 200 ⁇ g, particularly preferably at most 100 ⁇ g, preferably at most 50 ⁇ g, in particular at most 25 ⁇ g, per kg of body weight and day. Indeed, it has surprisingly been shown that the dsRNA, even in this dosage administered per day, has an excellent effectiveness in inhibiting the expression of the gene and is antifibrotic.
  • the administration unit can be designed for a single administration or intake per day. Then the entire daily dose is contained in one administration unit.
  • the dsRNA is contained therein in a correspondingly smaller amount which enables the daily dose to be reached.
  • the administration unit can also be designed for a single administration or ingestion for several days, e.g. B. by releasing the dsRNA over several days.
  • the administration unit then contains a corresponding multiple of the daily dose.
  • the dsRNA is contained in the administration unit in an amount sufficient to inhibit the expression of a gene which is involved in the formation of extracellular matrix.
  • the medication can also be designed so that several units of the medication together contain the sufficient amount in total. The sufficient amount can also depend on the pharmaceutical formulation of the administration unit. To determine a sufficient amount, the dsRNA can be administered in increasing amounts or doses. Thereafter, a known sample can be taken from a tissue taken from the tissue affected by the fibrotic disease
  • Methods are determined whether the expression of said gene has been inhibited at this amount.
  • the methods can e.g. are molecular biological, biochemical or immunological methods.
  • a double-stranded ribonucleic acid for the manufacture of a medicament intended for the treatment of a fibrotic disease
  • the dsRNA being suitable by RNA interference for inhibiting the expression of a gene involved in the formation of extracellular matrix.
  • the invention provides for the use of a double-stranded ribonucleic acid for the treatment of a fibrotic disease, the dsRNA being suitable by RNA interference for inhibiting the expression of a gene which is involved in the formation of extracellular matrix.
  • a double-stranded ribonucleic acid is provided, which is suitable as an active ingredient by RNA interference to inhibit the expression of a gene involved in the formation of extracellular matrix in a fibrotic disease.
  • FIG. 3 shows the relative CTGF transcript levels of CFSC-2G cells as a function of the amount of CTGF-specific dsRNA and used for the treatment
  • Fig. 4 shows the relative CTGF transcript levels of hepatic star cells isolated from rats in dependence from treatment with a CTGF-specific dsRNA.
  • HCV s5 / as5 the strand S1 of which is complementary to a sequence from the genome of the hepatitis C virus (HCV):
  • PCAl + 2 the strand S1 of which is complementary to a sequence from the human procollagen ⁇ l (I) gene and the procollagen l (I) gene from Rattus norvegicus which is 100% homologous in this area:
  • RD cells These are cells from a human embryonic rhabdomyosarcoma cell line. The cell line is available under number CCL136 from American Type Culture Collection (ATCC), PO Box 1549, Manassas, VA 20108, USA.
  • - CFSC-2G cells These are cells from a hepatic rat star cell line, which was developed by Dr. Marcos Rojkind (Liver Research Center, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York City, New York, USA). The isolation of the CFSC stem cells is described in: Laboratory Investigation 65 (1991), 644-53. The isolation and characterization of the subclone CFSC-2G is described in: Patricia Greenwel et al., Laboratory Investigation 69 (1993), 210-26.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FKS heat-inactivated fetal calf serum
  • penicillin 100 IU / ml penicillin
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml streptomycin
  • a transient transfection of the RD cells with dsRNA was achieved by lipofection with DNA-loaded liposomes from cationic lipids.
  • a Lipofectamine Plus reagent kit from Invitrogen was used. Inside is a lipofectamine and a plus reagent. The transfection was carried out four times in parallel according to the manufacturer's instructions. For a transfection, approximately 70,000 RD cells / hole were sown in a sterile 12-hole plate. Twenty-four hours later, 5 .mu.l of a 20 .mu.mol / l of the respective dsRNA-containing aqueous solution were diluted in 100 .mu.l DMEM for every two holes of a 12-hole plate.
  • dsRNA was introduced into the cells using oligofectamines from Invitrogen.
  • CFSG-2G or hepatic star cells isolated from rats were used in one
  • Density of 20,000 cells / hole sown in a sterile 12-hole plate Twenty-four hours after sowing, 4 ⁇ l oligofectamines were diluted in 11 ⁇ l DMEM per batch and incubated for 10 min at room temperature. Furthermore, 5 ⁇ l of an aqueous solution containing 20 ⁇ mol / 1 dsRNA were diluted in 185 ⁇ l DMEM for each batch (2 holes of a 12-hole plate). 15 ⁇ l of the prediluted oligofectamine was added to the. diluted dsRNA pipetted, mixed and incubated for 20 min at room temperature. Finally, 1050 ⁇ l DMEM were added to the batches.
  • 600 ⁇ l of the resulting mixture were added to the cells after the cells were washed twice with 1 ml of DMEM per well. After 4 hours of incubation in the incubator, 1 ml of cell culture medium was added to each well and incubated in the incubator for 44 hours.
  • RNA 100-1000 ng
  • 100 pmol oligo-dT primer and 50 pmol random primer were used as primers.
  • 0.5 ⁇ l oligo dT primer (100 pmol) and 1 ⁇ l random primer (50 pmol) were incubated at 70 ° C. for 10 min and then briefly stored on ice.
  • Quantified quantities Quantified quantities. Detection was carried out using a probe labeled with the fluorophore 6'-FAM (carboxyfluorescein) at the 5 'end and the quenching molecule TAMRA (carboxy-tetra-methyl-rhodamine) at the 3' end.
  • the fluorophore is excited with light. It transfers the excitation energy to the 3'-sided extinguishing molecule in close proximity.
  • the 5 '-3' exonuclease activity of the Taq DNA polymerase leads to the hydrolysis of the probe and thus to the spatial separation of the fluorophore from the quenching molecule.
  • the fluorescence of 6'-FAM is quenched less and less.
  • the quantification is carried out using a standard curve prepared with known transcript amounts or a dilution series of a reference cDNA. Furthermore, the transcript level of the household gene ß2-microglobulin was determined and used for normalization. ß2-microglobulin is a constituent protein expressed in a constant amount. The amount of procollagen ⁇ 1 (1) or CTGF cDNA was determined as a ratio to the amount of ⁇ 2-microglobulin cDNA and represented graphically in FIGS. 1 to 4 as a relative transcript level.
  • the following primers and TaqMa ⁇ probes were used to determine the transcript levels of procollagen ⁇ l (I) and CTGF using real-time RT-PCR in rat cells:
  • Figures 1 to 4 show the effects of the dsRNA.
  • all cells were transfected with 100 nmol / 1 dsRNA.
  • 0 to 100 nmol / 1 of the specific dsRNA directed against procollagen ⁇ l (I) or CTGF were supplemented with the unspecific dsRNA HCV s5 / as5 to a concentration of 100 nmol / 1 and transfected into cells.
  • the transcript level measured with 0 nmol / 1 specific dsRNA was arbitrarily defined as a 100% value.
  • the results for RD cells which have been transfected with increasing concentrations of dsRNA directed against procollagen 0.1 (1) are shown in FIG. 1.
  • the effect of the dsRNA depends on the concentration.
  • the procollagen ⁇ l (I) transcript level could be reduced to 20% by 100 nmol / 1 dsRNA PCA1 + 2.
  • the expression of ⁇ 2-microglobulin was not changed by the dsRNA. This shows the specificity of the dsRNA used.
  • FIG. 2 shows the relative transcript levels of the CTGF gene as a function of the concentration of the dsRNA CTG1 + 2 used for transfection.
  • the dsRNA used 100 nmol / 1 dsRNA CTGl + 2 reduce the transcript level to 10%, while 50 nmol dsRNA reduces the transcript level to 32% of the cells treated with non-specific dsRNA HCV s5 / as5.
  • the expression of ⁇ 2-microglobulin is not changed.
  • Fig. 3 shows the relative transcript levels of the CTGF gene in CFSC-2G cells 48 hours after transfection.
  • FIG. 4 shows the relative transcript levels of the CTGF gene in hepatic star cells or myofibroblasts isolated from rats.
  • the cells were cultured on plastic for 7 days. As a result, they were already activated. 48 hours after transfection with 100 nmol / 1 dsRNA there was an approximately 50% reduction in transcription.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Medikament zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung, wobei das Medikament eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält, welche durch RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression eines an der Bildung von Extrazellulärer Matrix beteiligten Gens geeignet ist.

Description

MEDIKAMENT ZUR BEHANDLUNG EINER FIBROTISCHEN ERKRANKUNG DURCH RNA INTERFERENZ
Die Erfindung betrifft ein Medikament und eine Verwendung zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung. Sie betrifft weiterhin eine doppelstrangige Ribonukleinsäure und deren Verwendung zur Herstellung eines Medikaments.
Unter einer fibrotischen Erkrankung wird hier ein rankheits- bild verstanden, das gekennzeichnet ist durch ein Ungleichgewicht zwischen der Synthese Extrazellulärer Matrix (EZM) und deren Abbau. Das Ungleichgewicht führt dabei zu einer vermehrten Bildung und Ablagerung von Extrazellulärer Matrix bzw. Bindegewebe. Die EZM wird von Zellen vor allem aus Kol- lagenen, nicht kollagenen Glykoproteinen, Elastin, Proteogly- kanen und Gykosaminoglykanen gebildet. Die fibrotische Erkrankung kann beispielsweise eine Narbenbildung nach Verletzung eines inneren Organs oder der Haut sein, die über das Maß hinausgeht, das für eine Heilung erforderlich ist. Die übermäßige Bildung und Ablagerung Extrazellulärer Matrix kann zu Funktionsstörungen oder Versagen des betroffenen Organs, beispielsweise der Lunge, der Niere oder der- Lebe , führen. ■ In der Niere wird EZM z.B. von Mesangialzellen und intersti- tiellen Fibroblasten gebildet. In der Leber sind es vor allem hepatische Sternzellen und portale Fibroblasten, welche für die Bildung der Extrazellulären Matrix verantwortlich sind. Die normalerweise ruhenden hepatischen Sternzellen können durch eine Schädigung, beispielsweise durch Toxine oder eine chronische Hepatitis, aktiviert werden. Die Folge ist deren Proliferation und deren Transdifferenzierung in Fibroblasten, welche einen Überschuss an Extrazellulären Matrixmolekülen produzieren. Versuche, die Synthese von Kollagen Typ I, einem wesentlichen Bestandteil der Extrazellulären Matrix, durch Antisinn-Oligonukleotide zu inhibieren, führten nur zu einer geringen Hemmung der Matrixproduktion. Ein wirkungsvolles molekularbiologisches Verfahren zur Hemmung der Matrixproduktion ist bisher nicht bekannt. Aus der DE 101 00 586 Cl ist ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle bekannt, bei dem ein Oligoribonukleotid mit doppelsträngiger Struktur in die Zelle eingeführt wird. Ein Strang der doppelsträngigen Struktur ist dabei komplementär zum Zielgen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein wirksames Medikament und eine Verwendung zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung bereitgestellt werden. Weiterhin" soll eine Verwendung zur Herstellung eines solchen Medikaments und ein zur Hemmung übermäßiger Bildung Extrazellulärer Matrix geeigneter Wirkstoff bereitgestellt werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 21, 22 und 43 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 20, 23 bis 42 und 44 bis 61.
Erfindungsgemäß ist ein Medikament vorgesehen, welches eine doppelstrangige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält, welche durch RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression eines an der Bildung von Extrazellulärer Matrix beteiligten Gens geeignet ist.
Eine dsRNA liegt vor, wenn die aus einem oder zwei Ribonukleinsäure-Strängen bestehende Ribonukleinsäure eine doppelstrangige Struktur aufweist. Nicht alle Nukleotide der dsRNA müssen kanonische Watson-Crick-Basenpaarungen aufweisen. Insbesondere einzelne nicht komplementäre Basenpaare beeinträchtigen die Wirksamkeit kaum oder gar nicht. Die maximal mögliche Zahl der Basenpaare ist die Zahl der Nukleotide in dem kürzesten in der dsRNA enthaltenen Strang.
Versuche zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung mittels Antisinn-Oligonukleotiden ließen einen molekularbiologischen Ansatz wenig aussichtsreich erscheinen. Überraschenderweise hat sich jedoch gezeigt, dass es mittels doppelsträngiger Ribonukleinsäure möglich ist, die Neubildung von Bindegewebe bzw. EZM effektiv zu hemmen. Die an der Bildung von Extrazel- lulärer Matrix beteiligten Gene im Sinne der Erfindung sind auch solche Gene, welche zur Bildung von Faktoren führen, welche Zellen dazu veranlassen, Extrazelluläre Matrix zu produzieren oder in Extrazelluläre Matrix produzierende Zellen zu transformieren. Solche Faktoren sind z. B. der Plätt- chen-Wachstums-Faktor (PDGF) , der transformierende Wachstumsfaktor ß (TGF ß) , insbesondere' TGFßl, TGFß2 oder TGFß3, der Bindegewebewachstumsfaktor (CTGF) oder Oncostatin M. Diese Faktoren können z.B. in der Leber eine Transdifferenzierung hepatischer Sternzellen und portaler Fibroblasten in eine dem Myofibroblasten ähnlichen Phänotyp initiieren und aufrechterhalten. Dieser Phänotyp weist gegenüber den Ursprungszellen eine gesteigerte Proliferationsrate und Matrixsynthese bei häufig gleichzeitig reduziertem Abbau Extrazellulärer Matrix (Fibrolyse) durch matrixabbauenende Proteasen auf. Die Aus- schüttung dieser Faktoren kann dabei durch andere Zellen der Leber als die hepatischen Sternzellen oder portalen Fibrobla- sten erfolgen.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung ist das Gen ein Gen, welches kodiert für den Bindegewebewachstumsfaktor CTGF (con- nective tissue growth factor) , transformierenden Wachstums- faktor ß TGFß (transforming growth factor ß) , insbesondere TGFßl, TGFß2 oder TGFß3, TGF ß-Rezeptor Typ I oder Typ II, die Signaltransduktoren Smad 2, Smad 3 oder Smad 4, SARA (smad anchor for receptor activation) , PDGF, Oncostatin M, ein an der- Bildung von Kollagen-Fibrillen beteiligtes Gen, ein Prokollagen, Prolyl-4-Hydroxylase, Lysyl-Hydroxylase, Ly- syl-Oxidase, N-Propeptidase oder C-Propeptidase. Smad 2 , Smad 3 , Smad 4 und SARA sind an der durch Bindung von TGF ß an den TGFß-Rezeptor Typ I oder Typ II ausgelösten Signaltransdukti- on beteiligt. Prolyl-4-Hydroxylase, Lysyl-Hydroxylase, Lysyl- Oxidase, N-Propeptidase und C-Propeptidase sind an der Bil- düng von Kollagen-Fibrillen aus Prokollagen, einem Vorläufermolekül, beteiligt. Die N-Propeptidase spaltet dabei von einem Prokollagen ein N-terminales Propeptid und die C- Propeptidase ein C-terminales Propeptid ab.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn es sich bei dem Prokollagen um eines der Pro ollagene vom Typ αl(I), 2(I), c.l(II), l(III), l(V), α2 (V) , α3 (V) , l(VI), 2(VI), α3(VI), αl(XI), 2(XI) oder 3(XI) handelt. Dabei bezeichnet die in Klammer gesetzte römische Ziffer jeweils den Typ des aus dem Prokollagen gebildeten Kollagens. Die arabische Ziffer kennzeichnet jeweils die Kette des Prokollagens.
Bei der fibrotischen Erkrankung kann es sich z.B. um eine Le- berfibrose, eine Fibröse der Niere oder der Lunge, beispielsweise nach einer Verletzung, oder eine über die für eine Heilung erforderlich Narbenbildung hinausgehende Bildung von Narbengewebe handeln.
Vorzugsweise weist ein Strang Sl der dsRNA einen zu dem Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden-, Bereich auf. Unter dem "Gen" wird hier der DNA-Strang der doppelsträngigen für ein Protein oder Peptid kodierenden DNA verstanden, welcher komplementär zu einem bei der Transkription als Matrize dienenden DNA-Strang einschließlich aller transkribierten Bereiche ist. Bei dem Gen handelt es sich also im Allgemeinen um den Sinn-Strang. Der Strang Sl kann somit komplementär zu einem bei der Expression des Gens gebil- deten RNA-Transkript oder dessen Prozessierungsprodukt, wie z.B. einer mRNA, sein. Das Protein oder Peptid ist dabei ein solches, welches an der Bildung von Extrazellulärer Matrix beteiligt ist.
Der komplementäre Bereich der dsRNA kann 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweisen. Eine dsRNA mit dieser Struktur ist besonders effizient in der Inhibition des Gens. Der Strang Sl der dsRNA kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweisen. Die Zahl dieser Nukleotide ist zugleich die Zahl der in der dsRNA maximal möglichen Basenpaare.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf- weist. Eine solche dsRNA weist gegenüber einer dsRNA ohne einzelsträngige Überhänge an mindestens einem Ende eine bessere Wirksamkeit bei der Hemmung der Expression des Gens auf. Ein Ende ist dabei ein Bereich der dsRNA, in welchem ein 5 ' - und ein 3 ' -Strangende vorliegen. Eine nur aus dem Strang Sl bestehende dsRNA weist demnach eine Schleifenstruktur und nur ein Ende auf. Eine aus dem Strang Sl und einem Strang S2 gebildete dsRNA weist zwei Enden auf. Ein Ende wird dabei jeweils von einem auf dem Strang Sl und einem auf dem Strang S2 liegenden Strangende gebildet.
Vorzugsweise befindet sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl-.. Diese Lokalisation des einzelsträngigen Überhangs führt zu einer weiteren Steigerung der Effizienz des Medikaments. In einem Ausführungsbeispiel weist die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang auf. Das andere Ende ist bei einer zwei Enden aufweisenden dsRNA glatt, d.h. ohne Überhänge, ausgebildet. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass zur Verstärkung der Interferenz- Wirkung der dsRNA ein Überhang an einem Ende der dsRNA ausreichend ist, ohne dabei die Stabilität in einem solchen Maße zu erniedrigen wie durch zwei Überhänge. Eine dsRNA mit nur einem Überhang hat sich sowohl in verschiedenen Zellkulturmedien als auch in Blut, Serum und Zellen als hinreichend be- ständig und besonders Wirksam erwiesen. Die Hemmung der Expression ist besonders effektiv, wenn sich der Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet. Vorzugsweise weist die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 auf, d.h. sie ist aus zwei separaten Einzelsträngen gebildet. Besonders wirksam ist das Medikament, wenn der Strang Sl (Antisinn-Strang) eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs
51 einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. Das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA ist dabei glatt ausgebildet. Der Strang Sl kann zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Gens komplementär sein. Vorzugsweise besteht die dsRNA aus dem Sträng
52 mit der Sequenz Nr. 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz Nr. 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz Nr. 5 und dem Strang Sl mit der Sequenz Nr. 6 gemäß dem anliegenden Sequenzproto- koll . Eine solche dsRNA ist in der Hemmung der Expression des für Prokollagen vom Typ l(I) oder CTGF kodierenden an der Bildung Extrazellulärer Matrix beteiligten Gens besonders wirksam.
Das Medikament kann eine Zubereitung aufweisen, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, oder intraperitonealen Infusion oder -Injektion oder zur Infusion oder Injektion direkt in ein von der fibrotischen Erkrankung betroffenes Gewebe, geeignet ist. Eine zur Inhalation, Infusion oder Injektion geeignete Zubereitung kann im einfachsten Fall, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phos- phatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA bestehen. Es hat sich nämlich überraschenderweise herausgestellt, dass eine lediglich in einem solchen Puffer oder Lösungsmittel gelöste und verabreichte dsRNA von den das Gen exprimierenden Zellen aufgenommen wird. Die Expression des Gens und damit die Er- krankung wird dadurch gehemmt, ohne dass die dsRNA dazu in einem besonderen Vehikel verpackt sein muss . Die dsRNA kann in dem Medikament in einer Lösung, insbesondere einem physio- logisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegen. Der physiologisch verträgliche Puffer kann eine phosphatgepufferte Salzlösung sein. Eine micellare Struktur, ein Kapsid, ein Kapsoid oder eine polymere Nano- oder Mikrokapsel kann die Aufnahme der dsRNA in die das Gen expri ierenden Zellen erleichtern. Die polymere Nano- oder Mikrokapsel besteht aus mindestens einem biologisch abbaubaren Polymer, z.B. Polybutylcyanoacrylat . Die polymere Nano- oder Mikrokapsel kann darin enthaltene oder daran gebundene dsRNA im Körper transportieren und freisetzen.
Die dsRNA kann mit einem Mittel kombiniert sein, welches eine gezielte Aufnahme der dsRNA in Zellen eines von der fibrotischen Erkrankung betroffenen Organs, insbesondere der Leber, der Niere, der Lunge oder der Haut, ermöglicht. Kombiniert heißt dabei, dass die dsRNA an das Mittel gebunden oder, wie beispielsweise im Fall der Liposomen oder der Nano- oder Mi- krokapseln, davo umgeben sein kann. In die iposomen oder die Nano- oder Mikrokapseln können dabei Moleküle eingebettet sein, welche die gezielte Aufnahme, ein so genanntes Targe- ting, ermöglichen. Bevorzugt handelt es sich bei dem Mittel um ein Mittel, welches eine Bindung an den Kollagen Typ VI- Rezeptor oder den PDGFß-Rezeptor, insbesondere von hepati- schen Sternzellen oder Myofibroblasten, vermittelt. Die hepa- tischen Sternzellen oder Myofibroblasten können aktiviert sein. Für den Kollagen Typ VI-Rezeptor ist das zyklische Peptid C*GRGDSPC* gemäß Sequenz Nr. 25 des anliegenden Sequenzprotokolls besonders gut geeignet. Dabei steht C* für Cy- steinreste, welche durch eine Disulfidbindung den Ringschluss des Peptids bewirken.
Vorzugsweise liegt das Medikament in mindestens einer Verabreichungseinheit vor, welche die dsRNA in einer Menge ent- hält, die eine Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag er- möglicht. Es hat es sich nämlich erstaunlicherweise gezeigt, dass die dsRNA bereits in dieser pro Tag verabreichten Dosierung eine ausgezeichnete Effektivität in der Hemmung der Expression des Gens aufweist und antifibrotisch wirksam ist. Die Verabreichungseinheit kann für eine einmalige Verabrei- chung bzw. Einnahme pro Tag konzipiert sein. Dann ist die gesamte Tagesdosis in einer Verabreichungseinheit enthalten. Ist die Verabreichungseinheit für eine mehrmalige Verabreichung bzw. Einnahme pro Tag konzipiert, so ist die dsRNA darin in einer entsprechend geringeren das Erreichen der Tages- dosis ermöglichenden Menge enthalten. Die Verabreichungseinheit kann auch für eine einzige Verabreichung bzw. Einnahme für mehrere Tage konzipiert sein, z. B. indem die dsRNA über mehrere Tage freigesetzt wird. Die Verabreichungseinheit enthält dann ein entsprechend Mehrfaches der Tagesdosis. Die dsRNA ist in der Verabreichungseinheit in einer zu der Hemmung der Expression eines an der Bildung von Extrazellulärer - Matrix - beteiligten Gens - ausreichenden Menge enthalten. -Das- Medikament kann auch so konzipiert sein, dass mehrere Einheiten des Medikaments zusammen die ausreichende Menge in der Summe enthalten. Die ausreichende Menge kann auch von der pharmazeutischen Formulierung der Verabreichungseinheit abhängen. Zur Ermittlung einer ausreichenden Menge kann die dsRNA in steigenden Mengen bzw. Dosierungen verabreicht werden. Danach kann an einer aus dem von der fibrotischen Er- krankung betroffenen Gewebe entnommenen Probe mit bekannten
Methoden ermittelt werden, ob bei dieser Menge- eine Hemmung der Expression des genannten Gens eingetreten ist. Bei den Methoden kann es sich z.B. um molekularbiologische, biochemische oder immunologische Methoden handeln.
Erfindungsgemäß ist weiterhin die Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung vorgesehen, wobei die dsRNA durch RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression eines an der Bildung von Extrazellulärer Matrix beteiligten Gens geeignet ist. Weiterhin ist erfindungsgemäß die Ver- wendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung vorgesehen, wobei die dsRNA durch RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression eines an der Bildung von Extrazellulärer Matrix beteiligten Gens geeignet ist. Weiterhin ist eine doppelstrangige Ribonuklein- säure vorgesehen, welche durch RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression eines an der Bildung von Extrazellulärer Matrix bei einer fibrotischen Erkrankung beteiligten Gens als Wirkstoff geeignet ist.
Wegen der weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verwendungen und der erfindungsgemäßen dsRNA wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen bei- spielhaft erläutert. Es zeigen:
Fig. ■!• Die- relativen Prokollagen αl (I) -Transkriptspiegel von RD-Zellen in Abhängigkeit von der zur Behandlung eingesetzten Menge Prokollagen αl(I)- spezifischer dsRNA,
Fig. 2 die relativen CTGF-Transkriptspiegel von RD-Zellen in Abhängigkeit von der zur Behandlung eingesetzten Menge an CTGF-spezifischer dsRNA,
Fig. 3 die relativen CTGF-Transkriptspiegel von CFSC-2G- Zellen in Abhängigkeit von der zur Behandlung eingesetzten Menge CTGF-spezifischer dsRNA und
Fig. 4 die relativen CTGF-Transkriptspiegel von aus Ratten isolierten hepatischen Sternzellen in Abhängigkeit von der Behandlung mit einer CTGF-spezifischen dsRNA.
Für die Experimente wurden zur transienten Transfektion die folgenden doppelsträngigen Oligoribonukleotide mit den Sequenzen Nr. 1 bis Nr. 6 gemäß dem Sequenzprotokoll eingesetzt:
HCV s5/as5, deren Strang Sl zu einer Sequenz aus dem Genom des Hepatitis C-Virus (HCV) komplementär ist:
S2 : 5'- acg gcu agc ugu gaa ugg ucc gu-3 ' (Sequenz Nr. 1) Sl: 3 ' -ag ugc cga ucg aca cuu acc agg -5' (Sequenz Nr. 2)
PCAl+2, deren Strang Sl zu einer Sequenz aus dem humanen Prokollagen αl(I)-Gen und dem dazu in diesem Bereich 100 %ig homologen Prokollagen l(I)-Gen aus Rattus norvegicus komplementär ist:
S2 : 5'- caa gag ccu gag cca gca gau cg-3 ' (Sequenz Nr. 3) Sl: 3 ' -ga guu cuc gga cuc ggu cgu cua -5' (Sequenz Nr. 4)
CTG1+2 , deren Strang Sl zu einer Sequenz aus dem humanen CTGF-Gen und dem dazu in diesem Bereich 100 %ig homologen CTGF-Gen aus Rattus norvegicus komplementär ist:
S2 : 5'- ccu gug ccu gcc auu aca acu gu-3' (Sequenz Nr. 5) Sl: 3 ' -cu gga cac gga egg uaa ugu uga -5' (Sequenz Nr. 6)
Für die Experimente wurden folgende Zellen eingesetzt:
RD-Zellen: Dabei handelt es sich um Zellen einer humanen embryonalen Rhabdomyosarkomzelllinie. Die Zelllinie ist unter der Nummer CCL136 bei der American Type Culture Col- lection (ATCC) , P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA zu beziehen. - CFSC-2G-Zellen: Dabei handelt es sich um Zellen einer he- patischen Ratten-Sternzelllinie, welche von Dr. Marcos Ro- jkind (Liver Research Center, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York City, New York, USA) zur Verfügung gestellt worden ist. Die Isolierung der CFSC- Stammzellen ist beschrieben in: Laboratory Investigation 65 (1991), 644-53. Die Isolierung und Charakterisierung des Subklones CFSC-2G ist beschrieben in: Patricia Green- wel et al., Laboratory Investigation 69 (1993), 210-26.
Primäre aus Rattenleber gemäß Knook, D. et al . , Exp. Cell Res. 139 (1982), Seiten 468 bis 471 isolierte hepatische Sternzellen.
Alle Zellen wurden in Dulbecco ' s modifiziertem Eagle ' s Medium (DMEM) mit 862 mg/1 L-Alanyl-L-Glutamin und 4,5 g/1 Glucose der Firma Invitrogen GmbH, Technologiepark Karlsruhe, Emmy- Noether Strasse 10, D-76131 Karlsruhe mit Zusatz von 10 % hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FKS) , 100 IU/ml Peni- cillin und 100 μg/ml Streptomycin (Zellkulturmedium) kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in einem Brutschrank bei 37 °C .in einer feuchten Atmosphäre aus 8 % C02 und- 92 % Luft.-
Eine transiente Transfektion der RD-Zellen mit dsRNA wurde durch Lipofektion mit DNA-beladenen Liposomen aus kationischen Lipiden erreicht. Dazu wurde ein Lipofectamine Plus- Reagenzien-Kit der Firma Invitrogen eingesetzt. Darin ist ein Lipofectamine- und ein Plus-Reagenz enthaltenden. Die Transfektion wurde jeweils vierfach parallel nach Herstelleranga- ben durchgeführt. Für eine Transfektion wurden ca. 70000 RD- Zellen/Loch in einer sterilen 12-Lochplatte ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wurden für jeweils zwei Löcher einer 12-Lochplatte 5 μl einer 20 μmol/1 der jeweiligen dsRNA enthaltenden wässrigen Lösung in 100 μl DMEM verdünnt. Dazu wurden jeweils 10 μl Plus-Reagenz zugegeben, gemischt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 100 μl einer frisch angesetzten 1 : 25-Verdünnung des Lipofectamine- Reagenz in DMEM (entsprechend 240 μg Lipidgemisch/ml) zugegeben, gemischt, und die Entstehung von DNA-beladenen Liposomen durch eine 15-minütige Inkubation bei RT ermöglicht. Danach wurde das Zellkulturmedium von den Zellen abgenommen und die Zellen jeweils zweimal mit 1 ml DMEM pro Loch gewaschen. Alle Transfektionsansätze wurden mit je 1 ml DMEM verdünnt und davon 0,6 ml/Loch auf die Zellen pipettiert (2 Löcher pro Ansatz) . Nach 4-stündiger Inkubation im Brutschrank wurde in jedes Loch 1 ml Zellkulturmedium zugegeben und weitere 44 Stunden inkubiert.
Zur transienten Transfektion von hepatischen Sternzellen und CFSC-2G Zellen wurde dsRNA mittels Oligofectamine der Firma Invitrogen in die Zellen eingebracht. Dazu wurden CFSG-2G oder aus Ratten isolierte hepatische Sternzellen in einer
Dichte von 20000 Zellen/Loch in einer sterilen 12-Lochplatte ausgesät. Vierundzwanzig Stunden nach dem Aussäen wurden pro Ansatz 4 μl Oligofectamine in 11 μl DMEM verdünnt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Weiterhin wurden für jeden An- satz (2 Löcher einer 12-Lochplatte) 5 μl einer 20 μmol/1 dsRNA enthaltenden wässrigen Lösung in 185 μl DMEM verdünnt. Jeweils 15 μl des vorverdünnten Oligofectamins wurde zu der. verdünnten dsRNA pipettiert, gemischt und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden 1050 μl DMEM zu den An- Sätzen zugegeben. Von dem resultierenden Gemisch sind jeweils 600 μl auf die Zellen gegeben worden nachdem die Zellen zweimal mit 1 ml DMEM pro Loch gewaschen worden sind. Nach 4- stündiger Inkubation im Brutschrank wurde in jedes Loch 1 ml Zellkulturmedium zugegeben und 44 Stunden im Brutschrank in- kubiert.
Die Wirkung der dsRNA auf die Transkriptspiegel von an der Bildung von Extrazellulärer Matrix beteiligten Genen wurde bei allen untersuchten Zellen mittels quantitativer PCR be- stimmt. Nach den 44 Stunden im Brutschrank wurden die Zellen dazu aufgeschlossen und die enthaltene RNA mit dem Kit Pe- qGold RNAPure der Firma PEQLAB Biotechnologie GmbH, Carl- Thiersch-Str. 2 b, D-91052 Erlangen, Bestell Nummer 30-1010, gemäß Herstellervorschrift isoliert.
Die Bildung von cDNA erfolgte, indem jeweils gleiche RNA- Mengen (100 - 1000 ng) zur Reversen Transkription mittels Su- perscript II der Firma Invitrogen GmbH, Technologiepark Karlsruhe, Emmy-Noether Strasse 10, D-76131 Karlsruhe, Katalog-Nummer 18064-014 eingesetzt wurden. Als Primer wurden 100 pmol Oligo-dT-Primer und 50 pmol random Primer verwendet. 10 μl RNA (100 - 1000 ng) , 0,5 μl Oligo dT-Primer (100 pmol) und 1 μl random Primer (50 pmol) wurden 10 min bei 70°C inkubiert und dann kurz auf Eis gelagert. Anschließend sind 7 μl Reverse Transkriptase-Mix (4 μl 5 x Puffer; 2 μl 0,1 mol/1 DTT; 1 μl je 10 mmol/1 dNTP) , 1 μl Superscript II und 1 μl des Ribo- nuklease Inhibitors RNAsin® der Firma Promega GmbH, Schild- krötstr. 15, D-68199 Mannheim zugesetzt worden. Das Gemisch ist für 10 min bei 25°C, dann für 1 Stunde bei 42°C und abschließend für 15 min bei 70°C gehalten worden.
Die Wirkung der dsRNA in damit transfizierten Zellen auf die Expression der für Prokollagen αl(I) und CTGF codierenden Gene wurde durch die Bestimmung der Menge des Transkripts (Transkriptspiegel) dieser Gene mittels quantitativer Echtzeit ("realtime") RT-PCR nachgewiesen. Dazu wurde von glei- chen Volumina der gebildeten cDNA im "Light-Cycler" der Firma Röche Diagnostics GmbH gemäß dem "TaqMan" -Verfahren der Firma PerkinElmer, Ferdinand-Porsche-Ring 17, D-63110 Rodgau- Jügesheim, nach Herstellerangaben mittels des LightCycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes -Kits der Firma Röche Diagnostics GmbH spezifische cDNA-
Mengen quantifiziert. Die Detektion erfolgte über eine mit dem Fluorophor 6'-FAM (Carboxyfluorescein) am 5 '-Ende und dem Löschmolekül TAMRA (Carboxy-tetra-methyl-Rhodamin) am 3 '-Ende markierte Sonde. Dabei wird das Fluorophor mit Licht ange- regt. Es überträgt die Anregungsenergie auf das in unmittel- barer Nähe befindliche 3'-seitige Löschmolekül. Während der jeweiligen Extensionsphasen der PCR führt die 5 '-3' Exonu- kleaseaktivität der Taq DNA Polymerase zur Hydrolyse der Sonde und damit zur räumlichen Trennung des Fluorophors vom Löschmolekül. Die Fluoreszenz von 6'-FAM wird immer weniger stark gelöscht. Sie nimmt daher zu und wird quantitativ er- fasst. Die Quantifizierung erfolgt über eine mit bekannten Transkriptmengen oder einer Verdünnungsreihe einer Referenz- cDNA erstellten Standardkurve. Weiterhin wurde der Transkriptspiegel des Haushaltsgens ß2-Mikroglobulin bestimmt und zur Normierung verwendet. ß2-Mikroglobulin ist ein konstitu- tiv in konstanter Menge exprimiertes Protein. Die Menge an Prokollagen α 1(1)- oder CTGF-cDNA wurde als Verhältnis zur Menge von ß2-Mikroglobulin-cDNA bestimmt und graphisch in den Figuren 1 bis 4 als relativer Transkriptspiegel dargestellt.
Zur Bestimmung der Transkriptspiegel von Prokollagen αl(I) und CTGF mittels Echtzeit RT-PCR in Rattenzellen sind folgende Primer und TaqMaη Sonden verwendet worden:
Figure imgf000015_0001
Zur Bestimmung der Transkriptspiegel von Prokollagen 1(1) und CTGF mittels Echtzeit RT-PCR in humanen Zellen sind fol- gende Primer und TaqMan Sonden verwendet worden:
Figure imgf000016_0001
Die Figuren 1 bis 4 zeigen die Wirkungen der dsRNA. Um bei den Experimenten eine konstante Transfektionseffizienz zu gewährleisten wurden alle Zellen jeweils mit 100 nmol/1 dsRNA transfiziert . Dazu wurden 0 bis 100 nmol/1 der spezifischen gegen Prokollagen αl(I) oder CTGF gerichteten dsRNA mit der unspezifischer dsRNA HCV s5/as5 auf eine Konzentration von 100 nmol/1 ergänzt und in Zellen transfiziert . Der mit 0 nmol/1 spezifischer dsRNA gemessene Transkriptspiegel wurde willkürlich als 100% Wert definiert.
Die Ergebnisse für RD-Zellen, welche mit steigenden Konzentrationen gegen Prokollagen 0.1(1) gerichteter dsRNA transfi- ziert worden sind, sind in Fig. 1 dargestellt. Die Wirkung der dsRNA ist konzentrationsabhängig. Der Prokollagen αl(I)- Transkriptspiegel konnte durch 100 nmol/1 dsRNA PCA1+2 auf 20 % reduziert werden. Die Expression von ß2-Mikroglobulin wurde durch die dsRNA nicht verändert. Das zeigt die Spezifität der eingesetzten dsRNA.
Fig. 2 zeigt die relativen Transkriptspiegel des CTGF-Gens in Abhängigkeit von der Konzentration der zur Transfektion eingesetzten dsRNA CTG1+2. Auch hier zeigt sich ein konzentrationsabhängiger Effekt, der eingesetzten dsRNA. 100 nmol/1 dsRNA CTGl+2 reduzieren den Transkriptspiegel auf 10%, während 50 nmol dsRNA den Transkriptspiegel auf 32% der mit unspezifischer dsRNA HCV s5/as5 behandelten Zellen absenkt. Auch hier wird die Expression von ß2-Mikroglobulin nicht verändert . Fig. 3 zeigt die relativen Transkriptspiegel des CTGF-Gens in CFSC-2G-Zellen 48 Stunden nach Transfektion. Auch hier zeigt sich eine konzentrationsabhängige Reduktion der Transkriptspiegel durch die eingesetzte dsRNA.
Fig. 4 zeigt die relativen Transkriptspiegel des CTGF-Gens in aus Ratten isolierten hepatischen Sternzellen bzw. Myofibroblasten. Die Zellen wurde 7 Tage auf Plastik kultiviert. Sie waren dadurch bereits aktiviert. 48 Stunden nach Transfektion mit 100 nmol/1 dsRNA zeigte sich eine etwa 50%ige Reduktion der Transkription.

Claims

Patentansprüche
1. Medikament zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung, wobei das Medikament eine doppelstrangige Ribonukleinsäu- re (dsRNA) enthält, welche durch RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression eines an der Bildung von Extrazellulärer Matrix beteiligten Gens geeignet ist.
2. Medikament nach Anspruch 1, wobei das Gen ein Gen ist, welches kodiert für CTGF, TGFß, TGFß-Rezeptor Typ I oder
■ Typ II, Smad 2, Smad 3, Smad 4, SARA, PDGF, Oncostatin M, ein an der Bildung von Kollagen-Fibrillen beteiligtes Gen, ein Prokollagen, Prolyl-4-Hydroxylase, Lysyl- Hydroxylase, Lysyl-Oxidase, N-Propeptidase oder C- Propeptidase.
3. Medikament nach Anspruch 2, wobei das Prokollagen vom Typ αl(I), α2(I), αl(II), αl (III) , αl (V) , α2 (V) , α3 (V) , αl(VI), α2(VI), 3(VI), αl(XI), 2(XI) oder α3(XI) ist.
4. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die fibrotische Erkrankung eine Leberfibrose, eine Fibröse der Niere oder der Lunge oder eine über die für eine Heilung erforderliche Narbenbildung hinausgehende Bildung von Narbengewebe ist.
5. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zu dem Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist.
6. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
7. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
8. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
9. Medikament nach Anspruch 8, wobei sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet .
10. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo- bei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
11. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo- bei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist .
12. Medikament nach Anspruch 11, wobei der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
13. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA- Transkript des Gens komplementär ist.
14. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo- bei die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz Nr. 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz Nr. 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz Nr. 5 und dem Strang Sl mit der Se- quenz Nr. 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
15. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo- bei das Medikament eine Zubereitung aufweist, die zur
Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion oder zur Infusion oder Injektion direkt in ein von der fibrotischen Erkrankung betroffe- nes Gewebe, geeignet ist.
16. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in dem Medikament in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, von einer micella- ren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
17. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA mit einem Mittel kombiniert ist, welches eine gezielte Aufnahme der dsRNA in Zellen eines von der fibrotischen Erkrankung betroffenen Organs, insbesondere der Leber, der Niere, der Lunge oder der Haut, ermöglicht .
18. Medikament nach Anspruch 17, wobei das Mittel ein eine Bindung an den Kollagen Typ VI-Rezeptor oder den PDGFß- Rezeptor, insbesondere von hepatischen Sternzellen oder Myofibroblasten, vermittelndes Mittel ist.
19. Medikament nach Anspruch 18, wobei das Mittel das zyklische Peptid C*GRGDSPC* ist.
20. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament in mindestens einer Verabreichungs- einheit vorliegt, welche die dsRNA in einer Menge enthält, die eine Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht.
21. Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure
(dsRNA) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung, wobei die dsRNA durch
RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression "eines an der Bildung von Extrazellulärer Matrix beteiligten Gens geeignet ist.
22. Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure
(dsRNA) zur Behandlung einer fibrotischen Erkrankung, wobei die dsRNA durch RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression eines an der Bildung von Extrazellulärer Matrix beteiligten Gens geeignet ist.
23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, wobei das Gen ein Gen ist, welches kodiert für CTGF, TGFß, TGFß-Rezeptor Typ I oder Typ II, Smad 2, Smad 3, Smad 4, SARA, PDGF, Oncostatin M, ein an der Bildung von Kollagen-Fibrillen beteiligtes Gen, ein Prokollagen, Prolyl-4-Hydroxylase, Lysyl-Hydroxylase, Lysyl-Oxidase, N-Propeptidase oder C- Propeptidase .
24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Prokollagen vom Typ αl(I), α2(I), αl(II), αl(III), αl (V) , α2 (V) , α3 (V) , αl(VI), α2(VI), α3(VI), αl(XI), α2(XI) oder α3(XI) ist.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei die fibrotische Erkrankung eine Leberfibröse, eine Fibröse der Niere oder der Lunge oder eine über die für eine
Heilung erforderliche Narbenbildung hinausgehende Bildung von Narbengewebe ist.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist .
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 27, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
29. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 28, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbeson- dere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
30. Verwendung nach Anspruch 29, wobei sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet .
31. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 30, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist .
32. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 31, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist.
33. Verwendung nach Anspruch 32, wobei der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von
21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
34. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 33, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Gens komplementär ist.
35. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 34, wobei die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz Nr. 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz Nr. 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz Nr. 5 und dem Strang Sl mit der Sequenz Nr. 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
36. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 35, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion oder zur Infusion oder Injektion direkt in ein von der fibrotischen Erkrankung betroffenes Gewebe, ge- eignet ist.
37. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 36, wobei die dsRNA in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Koch- Salzlösung, von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt .
38. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 37, wobei die dsRNA oral, mittels Inhalation, Infusion oder Injektion, insbesondere intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion oder Infusion oder Injektion direkt in ein von der fibrotischen Erkrankung betroffenes Gewebe, verabreicht wird.
39. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 38, wobei die dsRNA mit einem Mittel kombiniert ist, welches eine gezielte Aufnahme der dsRNA in Zellen eines von der fibrotischen Erkrankung betroffenen Organs, insbesondere der Leber, der Niere, der Lunge oder der Haut, ermöglicht.
40. Verwendung nach Anspruch 39, wobei das Mittel ein eine Bindung an den Kollagen Typ VI-Rezeptor oder den PDGFß- Rezeptor, insbesondere von hepatischen Sternzellen oder Myofibroblasten, vermittelndes Mittel ist.
41. Verwendung nach Anspruch 40, wobei das Mittel das zyklische Peptid C*GRGDSPC* ist.
42. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 41, wobei die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körperge- wicht und Tag verwendet wird.
43. Doppelstrangige Ribonukleinsäure (dsRNA) , welche durch RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression eines an der Bildung von Extrazellulärer Matrix bei einer fibroti- sehen Erkrankung beteiligten Gens geeignet ist.
44. DsRNA nach Anspruch 43, wobei das Gen ein Gen ist, welches kodiert für CTGF, TGFß, TGFß-Rezeptor Typ I oder Typ II, Smad 2, Smad 3, Smad 4, SARA, PDGF, Oncostatin M, ein an der Bildung von Kollagen-Fibrillen beteiligtes Gen, ein Prokollagen, Prolyl-4-Hydroxylase, Lysyl- Hydroxylase, Lysyl-Oxidase, N-Propeptidase oder C- Propeptidase..
45. DsRNA nach Anspruch 44, wobei das Prokollagen vom Typ αl(I), α2(I), αl(II), αl(III), αl (V) , α2 (V) , α3 (V) , αl(VI), α2(VI), α3(VI), αl(XI), c.2(XI) oder α3 (XI) ist.
46. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 45, wobei die fi- brotische Erkrankung eine Leberfibrose, eine Fibröse der Niere oder der Lunge oder eine unerwünschte Narbenbildung ist.
47. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 46, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zu dem Gen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist.
48. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 47, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
49. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 48, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nu- kleotide aufweist.
50. DsRNA nach einem der..Ansprüche 43 bis 4-9-, wobei, zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Über- hang aufweist.
51. DsRNA nach Anspruch 50, wobei sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet.
52. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 51, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere -dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang auf eist.
53. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 52, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist.
54. DsRNA nach Anspruch 53 , wobei der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf- weist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
55. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 54, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Gens komplementär ist.
56. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 55, wobei die dsRNA aus dem Strang S2 mit der Sequenz Nr. 3 und dem Strang Sl mit der Sequenz Nr. 4 oder dem Strang S2 mit der Sequenz Nr. 5 und dem Strang Sl mit der Sequenz Nr. 6 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
57. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 56, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion oder zur Infusion oder Injektion direkt in ein von der fibrotischen Erkrankung betroffenes Gewebe, geeignet ist.
58. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 57, wobei die dsRNA in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
59. DsRNA nach einem der Ansprüche 43 bis 58, wobei die dsRNA mit einem Mittel kombiniert ist, welches eine gezielte Aufnahme der dsRNA in Zellen eines von der fibro- tischen Erkrankung betroffenen Organs, insbesondere der Leber, der Niere, der Lunge oder der Haut, ermöglicht.
60. DsRNA nach Anspruch 59, wobei das Mittel ein eine Bin- düng an den Kollagen Typ VI-Rezeptor oder den PDGFß-
Rezeptor, insbesondere von hepatisehen Sternzellen oder Myofibroblasten, vermittelndes Mittel ist.
61. DsRNA nach Anspruch 60, wobei das Mittel das zyklische Peptid C*GRGDSPC* ist.
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