KR102666000B1

KR102666000B1 - cFLIP siRNA를 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 또는 감작용 조성물

Info

Publication number: KR102666000B1
Application number: KR1020160097516A
Authority: KR
Inventors: 신영기; 김태은; 홍성열; 송경; 정헌순; 김주석; 이상윤
Original assignee: 서울대학교 산학협력단; 에이비온 주식회사
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2024-05-14
Also published as: US20230241176A1; US20210299225A1; JP6853921B2; EP3492107A1; CN109890425A; WO2018021892A1; EP3492107A4; EP3492107B1; EP4012030A1; KR20180013587A; CN109890425B; JP2019530731A; US11464832B2; ES2941669T3

Abstract

본 발명은 cFLIP siRNA를 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 또는 감작용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 (a) cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및 (b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌-발린 서열(GNITV)을 포함하거나, 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물과 cFLIP siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세포 감작용 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 조성물은 인터페론 베타에 저항성을 나타내는 암 또는 인터페론 베타에 저항성을 갖게 된 암에서 cFLIP 단백질의 발현 수준을 낮춤으로써 세포사멸을 촉진하고 효과적으로 감작시켜 치료하는 새로운 기작의 항암제 또는 항암 보조제를 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

cFLIP siRNA를 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 또는 감작용 조성물{Compositions for treating or sensitizing interferon beta-resistant cancer comprising cFLIP siRNA}

본 발명은 cFLIP siRNA를 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 또는 감작용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 (a) cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및 (b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌-발린 서열(GNITV)을 포함하거나, 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물과 cFLIP siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세포 감작용 조성물에 대한 것이다.

인터페론(IFN)은 사이토카인의 일종으로서 항바이러스 활성을 나타내고, 세포 증식을 억제하며, 자연 면역 반응을 조절하는 기능을 갖는데, 이 중 타입-1 인터페론에 속하는 인터페론-베타(interferon beta, IFNβ 또는 IFN-β)는 5개의 알파 헬릭스를 가지고 있는 구형 단백질로서, 크기는 22kDa이며 당쇄를 제거하면 18kDa이 된다(Arduini et al., Protein Science, 8:1867-1877, 1999).

인터페론 베타의 임상 적용에 관한 연구는 다양하고 활발하게 진행 중에 있다. 다발성 경화증, 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 또는 항성장 활성, 림프구 세포 독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 대식세포의 활성화 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T 세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성 등의 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 장애 및 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염, 류마티스성 관절염 등에 치료 등의 효과가 있다는 보고가 있다(Pilling et al., European Journal of Immunology, 29:1041-1050, 1999; Young et al., Neurology 51:682-689, 1998; Cirelli et al, Clin Immunother 3:27-87, 1995).

특히 타입-1 인터페론의 항암 활성에 대하여 1988년도에 미국 식약처에서 만성 골수 백혈병, 흑색종, 신세포암 같은 다양한 암종에 치료제로 허가를 받았으나 부작용과 무반응(non-response), 내성 발생 등의 이유로 최근에는 항암제로써 사용은 줄어든 상태이다. 최근까지도 인터페론 베타는 많은 연구를 통해 항암 효과가 검증되고 있으며, 인터페론 알파에 비하여 우수한 항암 효능을 나타내는 것이 확인된 바 있다. 하지만 아직까지 항암 치료제로서 허가를 받지는 못하고 있다. 따라서, 기존의 인터페론 베타의 부작용을 극복하고, 무엇보다도 인터페론 베타의 항암 효과를 최대한 활용할 수 있도록 인터페론 저항성 암의 항암 치료에 대한 민감성을 높이는 감작제의 개발이 시급한 상황이다.

이에 본 발명자들은 암세포에서 cFLIP의 발현 수준을 억제함으로써 암세포를 감작시키고 인터페론 베타의 항암 효과를 제고할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

(a) cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및

(b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌-발린 서열(GNITV)을 포함하거나, 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및

(b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌-발린 서열(GNITV)을 포함하거나, 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

(a) cFLIP 유전자의 mRNA 에 상보적으로 결합하는 siRNA ; 및

(b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신- 아스파라진 - 이소류신 -트레오닌-발린 서열( GNITV )을 포함하거나, 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 인터페론 베타(interferon β, IFNβ 또는 IFN-β)에 반응하여 세포사멸이 일어나는 암세포와 그렇지 않은 IFNβ 저항성 암세포에 IFNβ 변이체인 카비페론(carbiferon)을 처리하고 세포사멸과 death receptor 신호전달에 관련된 단백질 발현 양상을 비교한 결과, IFNβ 저항성 암세포에서 IFNβ의 처리에 의하여 cFLIP의 발현율이 상승하는 것을 발견하였다. 나아가 IFNβ 저항성 암세포에서 siRNA를 이용하여 cFLIP의 발현을 억제하면, carbiferon에 반응하여 IFNβ 저항성 암세포에서 세포사멸에 중요한 caspase-8 등이 활성화되고 세포 생존률이 크게 감소하는 등, carbiferon의 암세포 사멸 효과가 발휘되는 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 cFLIP siRNA를 유효성분으로 포함하는 IFNβ 저항성 암세포를 IFNβ에 반응하여 세포사멸이 일어나도록 하는 감작용 조성물을 제공한다. 더불어 IFNβ 또는 그 변이체와 cFLIP siRNA를 병용 투여하여 IFNβ 저항성 암 질환에 치료 효과를 갖는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 ‘폴리뉴클레오티드(polynucleotide)’ 또는 ‘핵산’은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 ‘상보적(complementary)'이라고 한다.

상기 'mRNA(messenger RNA 또는 전령 RNA)'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜(ribosome)으로 전달하여 폴리펩티드 합성(단백질 번역, translation)의 청사진 역할을 하는 RNA이다. 유전자를 주형(template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사(transcription) 과정을 통하여 합성된다.

또한 ‘단백질’은 ‘폴리펩타이드(polypeptide)’ 또는 ‘펩타이드(peptide)’와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인; V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.

본 명세서에 표기되는 ‘(아미노산 일문자)(아미노산 위치)(아미노산 일문자)’는 천연형 단백질(wild-type protein, 본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 단백질)의 해당 아미노산 위치에서 선행 표기된 아미노산이 후행 표기된 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 예를 들면, R27T은 정상형 단백질의 27번에 해당하는 아르기닌이 트레오닌으로 치환된다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 ‘발현(expression)’이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.

상기 ‘cFLIP(cellular FLICE-like inhibitory protein)'은 CASH, FLIP, MRIT, CLARP, FLAME, Casper, FLAME1, FLAME-1, I-FLICE, CASP8AP1 등의 명칭으로도 알려져 있는 유전자로, 공식 명칭은 'CASP8 and FADD like apoptosis regulator(CFLAR)'이다. cFLIP은 caspase-8과 구조적으로 유사하지만 단백질 분해 활성은 없으며, 전형적인 death receptor에 의한 세포사멸과 pattern recognition receptor에 의한 세포사멸을 조절한다.

본 발명에서의 cFLIP 유전자는 인간에서 유래한 것으로서, 염색체 상 2q33-34에 위치한다. 인간의 cFLIP 유전자에는 다양한 아형(isoform) 단백질을 암호화하는 전사 변이체(transcript variant)가 존재하며, 아형으로는 대표적으로 cFLIP_L, cFLIP_R, cFLIP_S 등 세 가지가 존재한다. 본 발명에서의 cFLIP은 바람직하게는 cFLIP_L과 cFLIP_S을 의미한다. cFLIP_L은 N-말단에 2개의 DED 도메인(death effector domain)과 C-말단에 caspase 유사 도메인(caspase-like domain)이 있는 약 55kDa의 단백질이고, cFLIP_S는 caspase 유사 도메인 없이 두 개의 DED 도메인만 있는 약 27kDa의 단백질이다.

본 발명에 따른 cFLIP 유전자의 mRNA는 보다 구체적으로는 cFLIP_L 또는 cFLIP_S를 암호화하는 것으로서, 서열번호 7 또는 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 ‘siRNA(small interfering RNA 또는 short interfering RNA 또는 silencing RNA)'는 세포 안에 인위적으로 도입되어 특정 유전자의 mRNA의 분해를 유도하여 단백질 번역(translation)이 나지 않도록 하여 유전자 발현을 억제하는 RNA 간섭(RNA interference) 현상을 일으키는 짧은 이중가닥의 RNA로, 표적 mRNA의 특정 부위에 상보적인 20 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 세포 내에서 siRNA의 이중 가닥 중 표적 mRNA에 상보적인 가닥(antisense strand)이 RISC(RNA-induced silencing complex) 단백질 복합체와 결합하여 표적 mRNA에 결합하고, RISC 복합체 안의 argonaute 단백질이 표적 mRNA를 절단하여 분해시키거나, 단백질 번역에 중요한 단백질과 리보솜이 mRNA와 결합하는 것을 억제하는 등의 기작으로 특정 유전자의 발현을 억제한다.

따라서 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 cFLIP siRNA는 cFLIP 유전자의 mRNA 상의 특정한 염기서열과 서로 상보적으로 결합하여 결과적으로 cFLIP mRNA를 분해시킴으로써 cFLIP 유전자의 발현 수준을 낮출 수 있는 20 내지 25bp의 짧은 RNA를 의미하는 것이다. 상기 cFLIP siRNA는 구체적으로는 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 11 또는 서열번호 12로 이루어진 것일 수 있다. 본 발명에 따른 cFLIP siRNA의 cFLIP mRNA 상의 표적 부위는 도 5에 도시된 바와 같다. 본 발명의 약학적 조성물에서 cFLIP siRNA는 인터페론 베타 저항성 암세포에서 세포사멸 또는 death receptor 관련 신호전달계를 활성화하여 항암제, 가장 바람직하게는 인터페론 베타 또는 그 변이체의 항암 작용에 민감하게 반응할 수 있는 감작제(sensitizer)로 작용하게 된다.

본 발명에 따른 siRNA는 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성 향상, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 변형(modification)을 가한 것일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 OH기가 -CH₃(메틸), -OCH₃(methoxy), -NH₂, -F, -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다.

본 발명의 약학적 조성물의 다른 유효성분은 항암 활성을 갖는 인간의 인터페론 베타 변이체로서, 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌-발린 서열(GNITV)을 포함하거나, 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌(R27T) 또는 세린(R27S)으로 치환된 변이체이다. 상기 인간의 인터페론 베타 변이체는 인간의 천연형 인터페론 베타에 하나 이상의 N-연결형 당쇄가 추가되도록 한 것으로서,

천연형 인터페론 베타 폴리펩티드의 C-말단에 GNITV 서열이 부가되어 그 위치의 아스파라진에 N-연결형 당쇄화가 일어나도록 하거나;

R27T 또는 R27S의 아미노산 치환을 도입하여 해당 부위의 아미노산 서열인 25 내지 28번째 아미노산 서열이 아스파라진-글라이신-트레오닌/세린-류신(NG(T/S)L)으로 변경됨으로써 그 위치의 아스파라진에 N-연결형 당쇄화가 일어나도록 한 것이다.

상기 인터페론 변이체는 천연형과 비교하여 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 활성, 면역 조절 기능, 생체 내 반감기 및 안정성 등이 향상된 것으로, 대한민국 등록특허 10-0781666호와 PCT 출원 PCT/KR2016/002129호에 보다 상세하게 기재되어 있다.

구체적으로, 상기 인간 인터페론 베타 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 2 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 인터페론 베타 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 기능적 동등물이란 상기 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 상기 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서 ‘실질적으로 동질의 생리 활성’이란 서열번호 2 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 N-연결형 당쇄(N-linked glycosylation)를 보유함으로써 야생형(wild type, WT) 인간 인터페론 베타와 비교하여 동등하거나 그 이상의 활성을 가지는 것을 의미한다.

인간 인터페론 베타의 활성으로서는 다발성경화증에 대한 경감, 완화 또는 치료 활성, 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 활성, 항성장 활성, 항증식 활성, 림프구 세포독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T 세포의 효과 증가 활성, 대식세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성, 암 예방 또는 치료 활성, 자가 면역 장애 예방 또는 치료 활성, 바이러스감염 예방 또는 치료 활성, HIV와 관련된 질병의 예방 또는 치료 활성, C형 간염 예방 또는 치료 활성, 류마티스성 관절염 예방 또는 치료 활성 등 매우 다양한 예시를 들 수 있다. 본 발명의 목적상 인간 인터페론 베타의 활성이란 특히 암세포의 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하는 항암 활성을 의미한다.

인터페론 베타는 다양한 기작으로 암세포의 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하여 항암 활성을 갖는다. 인터페론 베타는 종양 세포의 혈관신생 작용에 대한 저해작용을 함으로써 종양세포의 성장을 억제하거나, 인터페론-베타는 종양이 존재하는 부위의 주변 환경에서 선천성 또는 후천성 면역반응을 유도함으로써 종양세포의 사멸을 유도해 항암 효과를 나타낼 수 있다. 나아가 인터페론 베타는 암세포에 직접 작용하여 세포 외부 자극에 반응하는 외재적 사멸 수용체 신호전달계(extrinsic death receptor pathway)와 내재적 미토콘드리아 신호전달계(intrinsinc mitochondrial pathway) 등 주요 세포사멸 관련 신호 전달을 조절한다(Parker B et al., Nat . Rev . Cancer., 16:131-144, 2016).

상기 기능적 동등물은 서열번호 2 내지 서열번호 6 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 인터페론 베타 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리 활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 상기 서열번호로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드의 생리 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조 변경이 이에 포함된다.

또한 본 발명에 따른 인간 인터페론 베타 변이체는 항체 또는 항체의 단편과 결합된 융합 단백질인 것일 수 있다. 인터페론 베타는 다양한 조직과 세포에서 발현되므로, 인터페론 베타의 항증식 활성과 세포사멸 활성이 암세포에 집중될 수 있도록 암세포 특이적으로 발현되는 단백질 또는 고분자 물질, 즉 종양성 항원을 특이적으로 인식하는 항체와 결합한 인터페론 베타 변이체는 암 표적 치료제로서 부작용은 낮추고 더욱 우수한 치료 효과를 기대할 수 있다. 구체적으로는 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 종양성 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개된 면역 반응을 이끌어내는 종양 세포에 의해 생산되는 단백질이다. 종양 항원은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 글리오마-관련된 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 생식샘자극호르몬, 알파태아단백질(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사효소, RU1, RU2(AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립선-특이적 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 서바이빈(survivin) 및 텔로머라제, 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다.

본 발명에서 지칭된 종양성 항원의 유형은 또한 종양-특이적 항원(TSA) 또는 종양-관련된 항원(TAA)일 수 있다. TSA는 종양 세포에 대해 고유하고 신체의 다른 세포 상에서 발생하지 않는다. TAA 관련된 항원은 종양 세포에 대해 고유하지 않고 대신에 또한 항원에 대한 면역원성 내성 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포 상에서 발현된다. 종양에 대한 항원의 발현은 면역 시스템이 항원에 대해 반응하게 하는 조건 하에서 발생할 수 있다. TAA는 면역 시스템이 비성숙하고 반응할 수 없는 경우 태아 발달 동안 정상 세포 상에서 발현되는 항원일 수 있거나 정상 세포 상에서 매우 낮은 수준으로 정상적으로 존재하지만 종양 세포 상에서 훨씬 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있다.

TSA 또는 TAA 항원의 포괄적인 예시는 다음과 같다: MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 티로시나제, TRP-1, TRP-2와 같은 분화 항원 및 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15와 같은 종양-특이적 다중계통 항원; CEA와 같은 과발현된 배아 항원; 과발현된 종양유전자 및 p53, Ras, HER-2/neu와 같은 돌연변이된 종양-억제 유전자; 염색체 전위로부터 초래된 고유 종양 항원; 예를 들면 BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; 및 바이러스 항원, 예를 들면 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7. 다른 큰, 단백질-기반 항원에는 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-태아단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합성 단백질＼사이클로필린 C-관련된 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS.

상기 종양성 항원을 특이적으로 인식하는 항체로는 예를 들어, HuM195 (예를 들어, Kossman et al., Clin. Cancer Res ., 5:2748-2755, 1999), CMA-676 (예를 들어, Sievers et al., Blood , 93:3678-3684, 1999), AT13/5 (예를 들어, Ellis et al., J. Immunol . 155:925-937, 1995), HB7, 트라스투주맙(예를 들어, HERCEPTIN; Fornier et al., Oncology ( Huntingt ), 13:647-58, 1999), TAB-250(Rosenblum et al., Clin . Cancer Res., 5:865-874, 1999), BACH-250, TA1(Maier et al., Cancer Res., 51:5361-5369, 1991) 및 미국 특허 제5,772,997호; 제5,770,195호에 기술된 mAb(mAb 4D5; ATCC CRL10463); 및 미국 특허 제5,677,171호에 기술된 mAb, Mc5(예를 들어, Peterson et al., Cancer Res., 57:1103-1108, 1997; Ozzello et al., Breast Cancer Res . Treat ., 25:265-276, 1993), hCTMO1(예를 들어, Van YM et al., Cancer Res ., 56:5179-5185, 1996) CC49(예를 들어, Pavlinkova et al., Clin . Cancer Res ., 5:2613-2619, 1999), B72.3(예를 들어, Divgi et al., Nucl . Med . Biol., 21:9-15, 1994), 마우스 모노클로날 항-HM1.24 IgG2a/κ, 인간화된 항-HM1.24 IgG1/κ항체(예를 들어, Ono et al., Mol . Immuno., 36:387-395, 1999), 리툭시맙(rituximab), 이브리투모맙티욱세탄(ibritumomabtiuxetan) 및 토시투모맙(tositumomab), AME-133v(Applied Molecular Evolution), 오크렐리주맙(Ocrelizumab; Roche), 오파투무맙(Ofatumumab; Genmab), TRU-015(Trubion) 및 IMMU-106(Immunomedics) 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서의 항체는 인간 항체, 키메라 항체 및/또는 인간화 항체일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 키메라 항체는 뮤린 면역글로불린의 가변 영역과 인간 면역글로불린의 보존 영역으로 구성되는 항체를 의미한다. 이러한 변형은 단순히 인간 항체의 보존 영역을 뮤린 보존 영역으로 치환시키는 것으로 구성되며, 이에 따라 약학적 용도에 대해 허용가능하도록 충분히 낮은 면역원성을 가질 수 있는 인간/뮤린 키메라를 생성한다.

상기 인간화 항체란 비-인간 상보성결정영역(CDR)을 갖는 항체의 서열을 변형시킴으로써 인간 항체 생식세포(germline)로부터 유래된 아미노산 서열로 (부분적으로 또는 전체적으로) 구성된 항체를 의미한다. 항체의 가변영역 및 CDR의 인간화는 당업계에 잘 알려져 있는 기법에 의해 수행된다. 이러한 항체는 Fc 의존적 이펙터 기능을 위해 필요하지만 항체에 대한 면역 반응을 훨씬 덜 유발시킬 것 같은 인간 보존 영역을 보유한다. 일례로서, 가변 영역의 프레임워크 영역은, 비-인간 CDR을 실질적으로 온전하게 남겨놓거나 또는 심지어 CDR을 인간 게놈으로부터 유래된 서열로 대체한 상응 인간 프레임워크 영역에 의해 치환된다(예컨대, 특허출원 US 2006/25885 참조). 전체(fully) 인간 항체는 인간 면역 시스템에 상응하도록 면역 시스템이 변형된 유전개질 마우스에서 생산된다. 인간화 항체는 또한 인간 프레임워크, 비-인간 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 존재하는 임의의 보존 영역이 인간 면역글로불린 보존 영역과 실질적으로 동일한, 즉 약 85% 또는 90% 이상이 동일한, 바람직하게는 95% 이상이 동일한, 항체를 나타낸다. 따라서, 인간화 항체의 모든 부분(아마도 CDR은 제외하고)은 하나 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다.

본 발명에서의 항체 단편은 항체 대응물(counterpart)과 동일한 항원과 반응할 수 있는 항체 단편을 나타낸다. 이러한 단편은 통상의 기술자에 의해 간단하게 동정될 수 있으며, 여기에는 일례로서 Fab 단편(예컨대, 파파인 소화에 의한 단편), Fab' 단편(예컨대, 펩신 소화 및 부분적 환원에 의한 단편), F(ab')2 단편(예컨대, 펩신 소화에 의한 단편), Facb(예컨대, 플라스민 소화에 의한 단편), Fd(예컨대, 펩신 소화, 부분적 환원 및 재응집에 의한 단편), 및 scFv(단쇄 Fv; 예컨대, 분자생물학 기법에 의한 단편) 단편이 포함된다. 상기 단편은 당업계에 알려져 있거나 및/또는 본원에 개시되어 있는 바와 같이, 효소 분할, 합성 또는 재조합 기법에 의해 생산될 수 있다.

본 명세서에서‘치료’는 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명에서 치료 대상인 질환은 인터페론 베타 저항성 암 질환이다.

상기 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물은 인터페론의 항암 작용에 반응하지 않는 암 질환이라면 그 종류에 제한되지 않으나, 구체적으로는 유방암, 위암, 난소암, 폐암, 결장암, 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 자궁경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 경구암, 중피종, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 자궁암, 전립선암, 대장암, 췌장암, 신장암, 피부암, 기저세포암, 흑색종, 편평세포암종, 구강편평세포암종, 대장직장암, 교모세포종, 자궁내막암 및 악성뇌교종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 한 암 질환일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 항암제 또는 암세포 감작을 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여 경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양, 즉 인터페론 베타 저항성 암을 감작시키고, 인간 인터페론 베타 또는 그 변이체와 병용 투여되었을 때 항암 효과를 나타내기에 충분한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.01 내지 1000㎎/㎏의 범위로 투여될 수 있으며 바람직하게는, 약 1 내지 100mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다.

투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우, 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화할 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피투여제의 경우, 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나, 항암 또는 인터페론 베타 저항성 암의 감작 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.

또한 본 발명은 cFLIP 유전자의 mRNA 에 상보적으로 결합하는 siRNA 를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용 조성물을 제공한다.

상기 인터페론 베타 저항성 암세포의 감작용 조성물이란, 인터페론 베타의 자극에 반응하지 않는 암세포의 세포사멸에 대한 민감성(sensitivity)을 증가시켜, 인터페론 베타 또는 그 변이체의 항암 치료 효과가 나타날 수 있도록 하는 조성물을 의미한다. 본 발명자들이 발현한 cFLIP 유전자의 발현을 억제하는 siRNA가 인터페론 베타 저항성 암세포에 대하여 감작 작용을 하는 기작은 전술한 바와 같다.

상기 cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 인간의 cFLIP 유전자의 발현을 효과적으로 억제하여 다양한 cFLIP의 아형 단백질(isoform)이 모두 발현되지 않도록 하기 위한 것이다. 구체적으로는 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 감작용 조성물은 항암제와 동시에 투여될 수도 있고, 순차적으로 투여될 수도 있다. 즉, 본 발명에 따른 감작용 조성물은 항암제와 시간 차를 두고 별도로 항암제보다 먼저 또는 나중에 투여될 수 있다. 투여 방법과 투여 경로에 대하여서는 본 발명의 약학적 조성물에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 목적상, 상기 항암제란 인간 인터페론 베타 또는 그 변이체를 의미하는 것으로서, 가장 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 6으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인터페론 베타 변이체이다. 또한 상기 인간 인터페론 베타 변이체는 암 환자에 주입되었을 때 체내에서 암세포 조직에 선택적으로 집중될 수 있도록 암세포 특이적 마커에 결합하는 항체 또는 그 단편과 융합된 형태의 단백질일 수도 있다. 항체 또는 그 단편과 결합한 융합 단백질 형태의 인터페론 베타 변이체는 구체적으로는 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 감작용 조성물은 인터페론 저항성 암세포의 감작 효과에 최적화된 제형으로 제조되며, 인간 인터페론 베타 변이체와 동일한 제형일 수도 있고, 경우에 따라 다른 제형으로 제조될 수도 있다.

본 발명의 감작용 조성물을 적용할 수 있는 암 질환은 인터페론 베타 저항성 암 질환이라면 그 종류에 제한되지 않으며, 구체적인 암 질환의 종류는 본 발명의 약학적 조성물에서 설명한 바와 같다.

따라서 본 발명은 cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA와 인터페론 베타 변이체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물과 cFLIP siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암세포 감작용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 인터페론 베타에 저항성 또는 내성을 나타내어 인터페론 베타에 반응하지 않는 암세포에서 cFLIP의 발현 수준을 낮춤으로써 암세포의 세포사멸을 촉진하는 효과가 있다.

도 1은 IFNβ 반응성 암세포인 OVCAR-3 세포주에서 카비페론(carbiferon)의 효과를 확인한 실험 결과를 보여준다.
도 1의 A는 carbiferon의 농도와 처리 시간에 따른 세포생존률(cell viability; 상단의 바 그래프)과 현미경 세포 사진(하단 패널)을 나타낸다. 도 1의 B는 carbiferon(100ng/ml)이 death receptor 관련 유전자의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하는 qPCR 결과이다. 도 1의 C는 carbiferon(100ng/ml)이 death receptor 관련 유전자의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다

도 2는 IFNβ 무반응성 암세포인 HeLa 세포주에서 carbiferon의 효과를 확인한 실험 결과를 보여준다.
도 2의 A는 carbiferon의 농도와 처리 시간에 따른 세포생존률(cell viability; 상단의 바 그래프)과 현미경 세포 사진(하단 패널)을 나타낸다. 도 2의 B는 carbiferon(100ng/ml)이 death receptor 관련 유전자의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하는 qPCR 결과이다. 도 2의 C는 carbiferon(100ng/ml)이 death receptor 관련 유전자의 발현 수준에 미치는 영향을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다
도 3은 IFNβ 반응성 또는 무반응성 암세포에서의 carbiferon(100ng/ml)에 의한 cFLIP의 발현 수준의 변화를 확인하는 실험 결과를 보여준다.
도 3의 A는 OVCAR-3 세포주, 도 3의 B는 HeLa 세포주에서의 웨스턴 블롯 결과이다.

도 4는 HeLa 세포주에서 cFLIP 유전자 발현 억제가 carbiferon의 항암 효과에 미치는 영향을 확인하는 실험 결과를 보여준다.
도 4의 A는 4가지 염기 서열의 siRNA가 혼합된 cFLIP siRNA(총 10nM)의 처리가 세포생존률에 미치는 영향을 나타낸다. 도 4의 B는 상기 혼합 cFLIP siRNA가 caspase-8의 수준에 미치는 영향을 확인하는 웨스턴 블롯 결과이다.

도 5는 cFLIP 유전자의 발현을 억제하기 위한 siRNA 디자인을 보여준다.
도 5의 A는 cFLIP long form(cFLIP_L)과 short form(cFLIP_s)의 발현을 모두 억제하기 위한 siRNA 표적 부위를 나타내는 모식도이다. 도 5의 B는 해당 siRNA의 염기 서열이다.

도 6은 HeLa 세포주에서 cFLIP siRNA의 발현 저해능을 확인하는 실험 결과를 보여준다.
도 6의 A는 각각의 siRNA(10nM)로 48시간 동안 처리한 후 확인한 cFLIP 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 6의 B는 각각의 siRNA(20nM)로 48시간 동안 처리한 후 cFLIP mRNA 수준을 확인하는 qPCR 결과이다. 파란색 점선으로 표시한 siRNA는 1차로 선별된 siRNA를 나타낸다. NC는 음성대조군 siRNA(negative control siRNA)를 의미한다.

도 7은 HeLa 세포주에서 1차 선별된 siRNA의 효과를 확인하는 실험 결과를 보여준다.
도 7의 A는 해당 siRNA(10nM) 단독으로 처리한 경우의 세포생존률을 나타낸다. 도 7의 B는 해당 siRNA(10nM)와 carbiferon(100ng/ml)을 함께 처리한 경우의 세포생존률을 나타낸다. 파란색 점선으로 표시한 siRNA는 2차로 선별된 siRNA를 나타낸다. NC는 음성대조군 siRNA(negative control siRNA)를 의미한다.

도 8은 다양한 암세포주에서 2차로 선별된 siRNA(10nM) 단독 또는 항암제와 병용투여가 세포생존률에 미치는 영향을 확인하는 실험 결과를 보여준다.
도 8의 A는 난소암세포인 SK-OV-3 세포주, 도 8의 B는 위암세포인 SNU-216 세포주, 도 8의 C는 위암세포인 NCI-N87 세포주에서의 결과이다. NC는 음성대조군 siRNA(negative control siRNA)를 의미한다. ACFP는 항체-사이토카인 융합 단백질(antibody-cytokine fusion protein)을 의미한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

암세포의 IFN β 저항성에 따른 carbiferon 의 차별적 효과

IFNβ에 반응하는 암세포와 IFNβ에 반응하지 않는 저항성 암세포에서 카비페론(carbiferon)의 항암 효과를 비교하였다(도 1, 도 2).

Carbiferon의 세포독성을 확인하기 위하여 96-well plate의 각 well에 1×10⁴개의 OVCAR-3 세포 또는 5×10³개의 HeLa 세포를 분주한 뒤 24시간 동안 37.5℃, 5% CO₂ 환경에서 배양하였다. 24시간 이후 세포 배양액을 제거하고 carbiferon을 10~1000ng/ml 농도로 처리한 뒤 24시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 이 후 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 뒤 WST 시약을 1:10으로 희석하여 각 well당 100μl씩 처리한 뒤 2시간 동안 37.5℃, 5% CO₂ 환경에서 방치한 뒤 430nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

유전자 발현의 측정을 위하여 OVCAR-3 또는 HeLa 세포에 carbiferon을 100ng/ml 농도로 처리한 뒤 뒤, 24시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 이 후 배양액을 제거하고 PBS 워시를 3회 진행한 뒤 세포를 수거한 뒤 Trizol을 활용하여 RNA를 추출한 뒤 이를 기반으로 cDNA를 합성하였으며 합성된 cDNA를 templat로 하여 Taqman probe를 활용한 qPCR을 진행하였다. 실험에 사용된 프라이머 염기서열은 표 1에 나타낸 바와 같다.

카비페론 처리에 의한 death receptor signaling molecule의 발현 양상을 검증하기 위하여 OVCAR-3 또는 HeLa 세포주에 100ng/ml의 carbiferon을 처리한 뒤 상기와 같은 방법으로 배양하고, 세포 배양액을 PBS로 3회 세척한 뒤, 프로티아제 저해제와 포스파테이즈 저해제가 포함된 RIPA 버퍼 100μl를 처리하여 30분 동안 ice 상에 두어 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 1.5ml 튜브에 담아 13000rpm, 4℃ 조건으로 원심분리하여 상층액(용해물)만 수거한 뒤 새로운 튜브에 모았다. BCA 정량법을 이용하여 용해물의 단백질 농도를 정량한 뒤 30μg의 용해물을 채취하여 5×sample buffer와 섞고, 100℃에서 10분간 끓여주어 단백질이 충분히 변성되도록 유도하였다. 준비된 샘플을 마커(Marker)와 함께 10% SDS-PAGE 겔에 loading하고 70 voltage로 30분, 120 voltage로 1시간 동안 내려주었다. 이후 겔을 조심스럽게 분리하여 3M 페이퍼 위에 두고 그 위에 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막을 둔 뒤 다시 3M 페이퍼를 덮어주고 1×transfer 버퍼에 담가 100 voltage로 90분간 단백질 transfer를 진행하였다. 5%의 BSA가 포함된 Tris-buffered saline-Tween 20(TBS-T, 0.1% Tween20)에 막을 1시간 30분 동안 블락킹 한 뒤 각 항체를 TBS-T에 1:1000으로 희석하여 준비하였다. 막을 항체 희석물에 담가 상온에서 2시간 동안 흔들어주며 반응시켰다. 이 과정이 끝나면 10분 동안 3번씩 TBS-T로 닦아주고 상온에서 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP)가 결합된 이차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응하였다. 다시 한번 세척 과정을 수행한 후, 밴드를 ECL 시약(enhanced chemiluminescence reagent, Intron)을 처리한 뒤 필름에 현상하였다. 도 1의 C, 도 2의 C,그리고 도 3에서 레인 1은 콘트롤, 레인 2는 24시간, 레인 3은 48시간, 레인 4는 72시간의 carbiferon 100ng/ml 처리군이다.

IFNβ에 반응하는 암세포인 OVCAR-3 세포주에 IFNβ의 변이체인 carbiferon을 1, 10, 100, 또는 1000ng/ml의 농도로 처리하고 24 내지 72시간 동안 배양한 뒤 세포생존률을 확인한 결과, OVCAR-3 세포는 carbiferon 농도의존적으로, 그리고 배양시간이 길수록 세포생존률이 크게 감소하는 것으로 관찰되었다(도 1의 A). 또한 세포사멸에 중요한 death receptor 신호 전달에 관여하는 DR4, DR5, FASL, FAS, TNF-α, TRAIL의 발현 수준을 qPCR(도 1의 B)과 웨스턴 블롯(도 1의 C)으로 확인한 결과, 그 수준이 크게 증가하였다.

이와 대조적으로, IFNβ에 반응하지 않는 저항성 암세포인 HeLa 세포주에서 동일한 방법으로 배양하여 carbiferon의 효과를 확인한 결과, 가장 높은 농도에서도 세포생존률은 크게 변함이 없었으나(도 2의 A), death receptor 신호 전달 관련 유전자들은 HeLa 세포주에서도 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 2의 B, 도 2의 C).

한편, IFNβ 반응성 OVCAR-3와 IFNβ 무반응성 HeLa 세포주에서 세포사멸을 억제하는 단백질인 cFLIP의 발현을 확인한 결과, carbiferon(100ng/ml)으로 자극한 HeLa 세포주에서만 cFLIP 단백질이 증가하는 것으로 나타났다(도 3). 이는 cFLIP 단백질 발현을 억제하는 것이 IFNβ 무반응성 암 질환을 치료하기 위한 감작제로 이용될 수 있는 가능성을 제시하는 것이다.

<실시예 2>

cFLIP 발현 억제가 carbiferon의 효과에 미치는 영향

암세포에서 cFLIP 단백질의 발현 억제가 carbiferon의 항암 효과에 미치는 영향을 cFLIP siRNA를 이용하여 확인하였다(도 4).

cFLIP 저해에 의한 carbiferon의 세포 독성능 향상을 검증하기 위하여 HeLa 세포를 24-well plate에 1×10⁴개씩 분주한 뒤 24 시간 동안 37.5℃, 5% CO₂ 환경에서 배양하였다. 24시간 경과 후 세포 배양액을 제거하고, 10nM의 siRNA(Dharmacon, cat# LU-003772-00-0002)를 Dharmafect transfection reagent와 섞어 상온에서 15분간 incubation한 뒤 세포에 처리하였다. 24시간 처리 후 배양액을 제거하고, carbiferon을 100ng/ml농도로 처리한 뒤 48시간 동안 추가 배양하였다. 이 후 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 뒤, 세포생존률을 측정하거나(도 4의 A) 단백질 발현을 확인하였다(도 4의 B).

세포생존률을 측정하기 위하여 WST 시약을 1:10으로 배양액에 섞어 각 well에 처리하고 두 시간 동안 37.5℃, 5% CO₂ 환경에서 반응시킨 뒤 430nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

단백질 발현을 확인하는 웨스턴 블롯을 위하여 프로티아제 저해제와 포스파테이즈 저해제가 포함된 RIPA 버퍼 100μl를 처리하여 30분 동안 ice 상에 두어 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 1.5ml 튜브에 담아 13000rpm, 4℃ 조건으로 원심분리하여 상층액(용해물)만 수거한 뒤 새로운 튜브에 모았다. BCA 정량법을 이용하여 용해물의 단백질 농도를 정량한 뒤 30μg의 용해물을 채취하여 5×sample buffer와 섞고, 100℃에서 10분간 끓여주어 단백질이 충분히 변성되도록 유도하였다. 준비된 샘플을 마커(marker)와 함께 10% SDS-PAGE 겔에 loading하고 70 voltage로 30분, 120 voltage로 1시간 동안 전기영동하였다. 이후 겔을 조심스럽게 분리하여 3M 페이퍼 위에 두고 그 위에 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막을 둔 뒤 다시 3M 페이퍼를 덮어주고 1×transfer 버퍼에 담가 100 voltage로 90분간 단백질 transfer를 진행하였다. 5%의 BSA가 포함된 Tris-buffered saline-Tween 20(TBS-T, 0.1% Tween20)에 막을 1시간 30분 동안 블락킹한 뒤, 각 항체를 TBS-T에 1:1000으로 희석하여 준비하였다. 막을 항체 희석물에 담가 상온에서 2시간 동안 흔들어주며 반응시켰다. 이 과정이 끝나면 10분 동안 3번씩 TBS-T로 닦아주고 상온에서 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP)가 결합된 이차 항체를 첨가하여 1시간 동안 반응하였다. 다시 한 번 세척 과정을 수행한 후, 밴드를 ECL 시약(enhanced chemiluminescence reagent, Intron을 처리한 뒤 필름에 현상하였다. 도 4의 B에서 레인 1은 콘트롤, 레인 2는 carbiferon 단독처리, 레인 3은 siRNA 단독처리, 레인 4는 carbiferon, siRNA의 병행처리군이다.

IFNβ의 돌연변이체인 carbiferon은 암세포에서 death receptor 신호전달계를 활성화시켜서 최종적으로 caspase-3에 의한 세포사멸을 일으킨다. cFLIP 단백질 발현을 억제하기 위하여 시판 중인 4종류의 cFLIP siRNA(Dharmacon, cat# LU-003772-00-0002)를 혼합하여 HeLa 세포에 처리하고, carbiferon 존재 또는 부존재 하에서 세포생존률을 측정하였다(도 4의 A). cFLIP siRNA에 의하여 cFLIP의 long form과 short form이 모두 발현이 거의 완전하게 억제된 것은 western blot으로 확인하였다(도 4의 B, cFLIP L, cFLIP S). 그 결과, carbiferon(100ng/ml) 또는 cFLIP siRNA(10nM)만을 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포생존률의 차이가 거의 없었으나, carbiferon과 cFLIP siRNA를 동시에 처리한 경우에는 세포생존률이 약 50% 정도 감소하였다. 또한 carbiferon과 cFLIP siRNA를 동시에 처리한 경우에만 western blot으로 세포사멸에 중요한 활성화된 cleaved caspase-8의 존재가 확인되었다. 이상의 결과는 IFNβ 무반응성 세포에서 cFLIP siRNA을 이용하여 cFLIP의 발현을 억제함으로써 carbiferon에 의한 세포사멸을 효과적으로 촉진할 수 있음을 보여주는 것이다.

<실시예 3>

IFNβ 저항성 암세포를 감작하기 위한 cFLIP siRNA 선별

IFNβ에 반응하지 않는 암세포에서 IFNβ 또는 carbiferon의 세포사멸 효과를 감작하기 위한 최적의 siRNA를 디자인하고 선별하였다.

cFLIP의 long form과 short form은 세포사멸 관련하여 동일한 기능을 수행하기 때문에 두 형태의 cFLIP의 발현을 모두 억제할 수 있는 siRNA가 가장 바람직하며, 이를 위하여 적절한 cFLIP의 표적 서열의 위치와 서열을 결정하였다(도 5). 먼저 siDirect version 2.0 program을 이용하여 7종의 siRNA를 선별하고, 추가적으로 시판 중인 2종의 siRNA를 포함하였다(Dharmacon).

디자인한 cFLIP siRNA의 cFLIP 저해능을 확인하기 위하여 HeLa 세포를 분주한 뒤 24시간 동안 37.5℃, 5% CO₂ 환경에서 배양하였다. 24시간 이후 세포 배양액을 제거하고 10nM의 siRNA를 Dharmafect transfection reagent와 섞어 상온에서 15분간 incubation한 뒤 세포에 처리하였다. 48시간 처리 후 배양액을 제거하고 앞선 실시예에서와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 6의 A에서 레인 1은 Mock, 레인 2는 음성 컨트롤 siRNA(NC siRNA), 레인 3부터 11까지는 디자인한 cFLIP siRNA의 처리군이다. 또한 20nM의 siRNA로 형질전환하여 같은 방법으로 배양하고 수득한 세포에서 Trizol을 활용하여 RNA를 추출한 뒤 이를 기반으로 cDNA를 합성하였으며 합성된 cDNA를 template로 하여 Taqman probe를 활용한 qPCR을 진행하였다(도 6의 B).

선별한 siRNA는 IFNβ 무반응성 세포인 HeLa 세포주에 48시간 동안 처리한 후, cFLIP long form(cFLIP_L)과 short form(cFLIP_S) 단백질의 수준을 western blot으로 확인하였다(도 6의 A). 분석 대상인 9종의 siRNA을 각각 처리한 세포에서는 모두 cFLIP_L과 cFLIP_S 단백질이 감지되지 않았다. 또한 siRNA를 처리한 세포에서는 qPCR로 측정한 cFLIP mRNA 수준이 대조군과 비교하여 약 50% 이상 감소한 것으로 나타났다(도 6의 B). qPCR과 웨스턴 블롯 결과에 기반하여 cFLIP 발현 저해능이 우수한 것으로 확인된 D-513, 211, 262, 404, 480 등 5종의 siRNA를 1차적으로 선별하였다.

1차적으로 선별한 cFLIP siRNA는 HeLa 세포주를 이용하여 carbiferon의 세포사멸 효과에 미치는 영향을 추가적으로 확인하였다. 먼저 각각의 siRNA이 세포사멸에 미치는 영향을 알아보기 위하여 carbiferon 없이 siRNA 단독으로 처리하고 앞선 실시예에서와 같은 방법으로 세포생존률을 측정하였다(도 7의 A). HeLa cell을 플레이트에 접종하고 24시간 경과 후 siRNA(최종 농도 10nM)를 처리하고, 다시 24시간이 경과한 후 WST assay를 실시한 결과, 세포생존률이 감소하는 것으로 나타나, siRNA 단독으로도 세포독성 즉 세포사멸 유도 효과가 있었다.

다음으로, cFLIP siRNA와 carbiferon 병용 처리의 효과를 확인하였다(도 7의 B). HeLa 세포주는 접종 24시간 후 siRNA(최종 농도 10nM)를 처리하고, 다시 24시간 경과 후 carbiferon(100ng/ml)을 처리하여 24시간 뒤의 세포생존률을 측정하였다. siRNA만 단독으로 처리한 경우와 비교하여 carbiferon과 siRNA를 병용처리한 경우 HeLa 세포주의 세포생존률을 낮추는데 동반상승(synergy) 효과가 있는 것으로 관찰되었다. carbiferon과의 병용 처리의 효과를 분석한 siRNA 중 효과가 가장 뛰어난 404 및 480 cFLIP siRNA를 2차로 선별하였다.

< 실시예 4>

다양한 암세포주에서 cFLIP siRNA 와 carbiferon 병용 처리의 효과

최종적으로 선별된 404 및 408 cFLIP siRNA의 IFNβ 무반응성 암세포에 대한 감작 효과를 다양한 암세포주를 이용하여 확인하였다(도 8).

선별한 cFLIP siRNA와 카비페론 혹은 ACFP와의 병행처리에 의한 세포사멸능을 검증하기 위하여 SK-OV-3, SNU-216, NCI-N87 세포를 24-well plate에 1×10⁴개씩 분주한 뒤 24시간 동안 37.5℃, 5% CO₂ 환경에서 배양하였다. ACSF는 허셉틴(herceptin)의 heavy chain 말단에 carbiferon을 융합시킨 융합 단백질이다. 24시간 이후 세포 배양액을 제거하고 10nM의 siRNA를 Dharmafect transfection reagent와 섞어 상온에서 15분간 incubation한 뒤 세포에 처리하였다. 24시간 처리 후 배양액을 제거하고 Carbiferon, ACFP, 허셉틴을 100ng/ml농도로 처리한 뒤 48시간 동안 추가 배양하였다. 이 후 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 뒤 WST 시약을 1:10으로 배양액에 섞어 각 well에 처리한 뒤 2시간 동안 37.5℃, 5% CO₂ 환경에서 반응시킨 뒤 430nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 본 실시예에 사용된 세포주들은 IFNβ에 전혀 반응하지 않거나(SNU-216), IFNβ에 정상적으로 반응하는 세포보다 IFNβ에 대한 민감성이 매우 낮은 것(SK-OV-3, NCI-N87)으로 확인되었다(데이터 미도시).

난소암세포인 SK-OV-3 세포주(도 8의 A), 위암세포인 SNU-216 세포주(도 8의 B)와 NCI-N87 세포주에서 cFLIP siRNA(도 8의 C)의 효과를 세포생존률을 측정하여 알아보았다. siRNA를 처리하지 않은 경우, herceptin 단독 보다는 carbiferon 그리고 herceptin과 결합한 융합 단백질 형태인 ACSF가 암세포 생존률을 감소시키는 데 더욱 효과적이었다. 나아가 cFLIP siRNA와 동시에 처리한 경우 ACSF와 carbiferon의 세포사멸 효과는 더욱 증진되는 것으로 나타났다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 조성물은 인터페론 베타에 저항성을 나타내는 암 또는 인터페론 베타에 저항성을 갖게 된 암에서 cFLIP 단백질의 발현 수준을 낮춤으로써 효과적으로 감작시켜 치료하는 새로운 기작의 항암제 또는 항암 보조제를 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Compositions for treating or sensitizing interferon beta-resistant cancer comprising cFLIP siRNA <130> NP16-0075 <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Interferon-beta <400> 1 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Interferon-beta mutant R27T <400> 2 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Interferon-beta mutant R27S <400> 3 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Ser Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 4 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Interferon-beta mutant GNITV <400> 4 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Gly Asn Ile Thr Val 165 170 <210> 5 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Interferon-beta double mutant (GNITV+R27T) <400> 5 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Gly Asn Ile Thr Val 165 170 <210> 6 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Interferon-beta double mutant (GNITV+R27S) <400> 6 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Ser Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Gly Asn Ile Thr Val 165 170 <210> 7 <211> 1443 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human cFLIP L mRNA (CASP8 and FADD like apoptosis regulator (CFLAR), transcript variant 2; NM_001127183.2) <400> 7 atgtctgctg aagtcatcca tcaggttgaa gaagcacttg atacagatga gaaggagatg 60 ctgctctttt tgtgccggga tgttgctata gatgtggttc cacctaatgt cagggacctt 120 ctggatattt tacgggaaag aggtaagctg tctgtcgggg acttggctga actgctctac 180 agagtgaggc gatttgacct gctcaaacgt atcttgaaga tggacagaaa agctgtggag 240 acccacctgc tcaggaaccc tcaccttgtt tcggactata gagtgctgat ggcagagatt 300 ggtgaggatt tggataaatc tgatgtgtcc tcattaattt tcctcatgaa ggattacatg 360 ggccgaggca agataagcaa ggagaagagt ttcttggacc ttgtggttga gttggagaaa 420 ctaaatctgg ttgccccaga tcaactggat ttattagaaa aatgcctaaa gaacatccac 480 agaatagacc tgaagacaaa aatccagaag tacaagcagt ctgttcaagg agcagggaca 540 agttacagga atgttctcca agcagcaatc caaaagagtc tcaaggatcc ttcaaataac 600 ttcaggctcc ataatgggag aagtaaagaa caaagactta aggaacagct tggcgctcaa 660 caagaaccag tgaagaaatc cattcaggaa tcagaagctt ttttgcctca gagcatacct 720 gaagagagat acaagatgaa gagcaagccc ctaggaatct gcctgataat cgattgcatt 780 ggcaatgaga cagagcttct tcgagacacc ttcacttccc tgggctatga agtccagaaa 840 ttcttgcatc tcagtatgca tggtatatcc cagattcttg gccaatttgc ctgtatgccc 900 gagcaccgag actacgacag ctttgtgtgt gtcctggtga gccgaggagg ctcccagagt 960 gtgtatggtg tggatcagac tcactcaggg ctccccctgc atcacatcag gaggatgttc 1020 atgggagatt catgccctta tctagcaggg aagccaaaga tgttttttat tcagaactat 1080 gtggtgtcag agggccagct ggaggacagc agcctcttgg aggtggatgg gccagcgatg 1140 aagaatgtgg aattcaaggc tcagaagcga gggctgtgca cagttcaccg agaagctgac 1200 ttcttctgga gcctgtgtac tgcggacatg tccctgctgg agcagtctca cagctcacca 1260 tccctgtacc tgcagtgcct ctcccagaaa ctgagacaag aaagaaaacg cccactcctg 1320 gatcttcaca ttgaactcaa tggctacatg tatgattgga acagcagagt ttctgccaag 1380 gagaaatatt atgtctggct gcagcacact ctgagaaaga aacttatcct ctcctacaca 1440 taa 1443 <210> 8 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human cFLIP S mRNA (CASP8 and FADD like apoptosis regulator (CFLAR), transcript variant 3; NM_001127184.2) <400> 8 atgtctgctg aagtcatcca tcaggttgaa gaagcacttg atacagatga gaaggagatg 60 ctgctctttt tgtgccggga tgttgctata gatgtggttc cacctaatgt cagggacctt 120 ctggatattt tacgggaaag aggtaagctg tctgtcgggg acttggctga actgctctac 180 agagtgaggc gatttgacct gctcaaacgt atcttgaaga tggacagaaa agctgtggag 240 acccacctgc tcaggaaccc tcaccttgtt tcggactata gagtgctgat ggcagagatt 300 ggtgaggatt tggataaatc tgatgtgtcc tcattaattt tcctcatgaa ggattacatg 360 ggccgaggca agataagcaa ggagaagagt ttcttggacc ttgtggttga gttggagaaa 420 ctaaatctgg ttgccccaga tcaactggat ttattagaaa aatgcctaaa gaacatccac 480 agaatagacc tgaagacaaa aatccagaag tacaagcagt ctgttcaagg agcagggaca 540 agttacagga atgttctcca agcagcaatc caaaagagtc tcaaggatcc ttcaaataac 600 ttcaggatga taacacccta tgcccattgt cctgatctga aaattcttgg aaattgttcc 660 atgtga 666 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cFLIP siRNA 211-Flip <400> 9 cuugaagaug gacagaaaag c 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cFLIP siRNA 262-Flip <400> 10 ccuuguuucg gacuauagag u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cFLIP siRNA 404-Flip <400> 11 guugaguugg agaaacuaaa u 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cFLIP siRNA 480-Flip <400> 12 gaauagaccu gaagacaaaa a 21 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cFLIP siRNA 513-Flip <400> 13 caagcagucu guucaagga 19 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cFLIP siRNA 23-Flip <400> 14 guugaagaag cacuugauac a 21 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cFLIP siRNA 72-Flip <400> 15 gugccgggau guugcuaua 19 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cFLIP siRNA 435-Flip <400> 16 cagaucaacu ggauuuauua g 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cFLIP siRNA 495-Flip <400> 17 caaaaaucca gaaguacaag c 21 <210> 18 <211> 627 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interferon-beta mutant-antibody fusion protein (immunokine 1) <400> 18 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser His Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ala Arg Val Cys Thr Pro Lys Arg Cys Tyr Ser Tyr Asp 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 225 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 245 250 255 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 260 265 270 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 275 280 285 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 290 295 300 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 320 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 325 330 335 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 340 345 350 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 355 360 365 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 375 380 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 420 425 430 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr 450 455 460 Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys 465 470 475 480 Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg 485 490 495 Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln 500 505 510 Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe 515 520 525 Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile 530 535 540 Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys 545 550 555 560 Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys 565 570 575 Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His 580 585 590 Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg 595 600 605 Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr 610 615 620 Leu Arg Asn 625 <210> 19 <211> 386 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interferon-beta mutant-antibody fusion protein (immunokine 2) <400> 19 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Asn 210 215 220 Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu 225 230 235 240 Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met 245 250 255 Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys 260 265 270 Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala 275 280 285 Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val 290 295 300 Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr 305 310 315 320 Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu 325 330 335 Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr 340 345 350 Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val 355 360 365 Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu 370 375 380 Arg Asn 385 <210> 20 <211> 648 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interferon-beta mutant-antibody fusion protein (anti c-Met interferon-beta mutein) <400> 20 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Trp Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 35 40 45 Phe Ser Gly Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser His Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 85 90 95 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Trp Gly Pro Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala 465 470 475 480 Ala Lys Ala Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn 485 490 495 Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr 500 505 510 Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln 515 520 525 Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met 530 535 540 Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly 545 550 555 560 Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln 565 570 575 Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp 580 585 590 Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr 595 600 605 Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala 610 615 620 Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn 625 630 635 640 Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 645 <210> 21 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Interferon-beta mutant-antibody fusion protein (anti ERBB2 interferon-beta mutein) <400> 21 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn 35 40 45 Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala 465 470 475 480 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln 485 490 495 Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly 500 505 510 Thr Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu 515 520 525 Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr 530 535 540 Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser 545 550 555 560 Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn 565 570 575 Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu 580 585 590 Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu 595 600 605 Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr 610 615 620 Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe 625 630 635 640 Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 645 650 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR4 forward primer <400> 22 gggtccacaa gaccttcaag t 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR4 reverse primer <400> 23 tgcagctgag ctaggtacga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 forward primer <400> 24 agacccttgt gctcgttgtc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR5 reverse primer <400> 25 ttgttgggtg atcagagcag 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FASL forward primer <400> 26 cagtccaccc cctgaaaaa 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FASL reverse primer <400> 27 ggaccttgag ttggacttgc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS forward primer <400> 28 atggccaatt ctgccataag 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS reverse primer <400> 29 tgactgtgca gtccctagct t 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a forward primer <400> 30 gacaagcctg tagcccatgt 20 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a reverse primer <400> 31 tctcagctcc acgccatt 18 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trail forward primer <400> 32 cctcagagag tagcagctca ca 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trail reverse primer <400> 33 cagagccttt tcattcttgg a 21

Claims

(a) cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA; 및
(b) 서열번호 1로 표시되는 인간의 천연형 인터페론 베타 아미노산 서열에서 C-말단에 글라이신-아스파라진-이소류신-트레오닌-발린 서열(GNITV)을 포함하거나, 27번째 아르기닌 아미노산이 트레오닌 또는 세린으로 치환된 인간의 인터페론 베타 변이체
를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인간의 인터페론 베타 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 cFLIP 유전자의 mRNA는 서열번호 7 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인터페론 베타 변이체는 항체 또는 항체의 단편과 결합된 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암 질환은 유방암, 위암, 난소암, 폐암, 결장암, 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 자궁경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 중피종, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 자궁암, 전립선암, 대장암, 췌장암, 신장암, 피부암, 기저세포암, 흑색종, 편평세포암종, 구강편평세포암종, 대장직장암, 교모세포종, 자궁내막암 및 악성뇌교종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 암 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
cFLIP 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 저항성 암 질환에 대한 민감성 증진을 위한 감작제(sensitizer)용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 9 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 2 내지 서열번호 6, 및 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인터페론 베타 변이체와 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.