Survivin, das zur Genfamilie der
Inhibitoren der Apoptose (IAP) gehört, ist ein erst kürzlich entdecktes Verbindungsglied
("interface-molecule") zwischen Zellzyklusprogression
und Apoptosekontrolle. Es handelt sich um ein 142 Aminosäuren langes
Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 16,5 kDa. Das Gen ist
auf dem langen Arm des Chromosoms 17 (17g25) lokalisiert (Ambrosini
et al., 1997; Adida et al. 1998). Survivin wird normalerweise während der
embryonalen und fötalen
Entwicklung, aber nur in äußerst geringem
Maße in adulten Geweben
exprimiert, wobei es bei ersteren zur Gewebshomöostase und Differenzierung
beiträgt
(Adida et al. 1998). Interessanterweise wird Survivin vor allem
während
der G2/M-Phase exprimiert. Es wird diskutiert, dass eine Überexpression
von Survivin in Tumorzellen den Apoptose-Kontrollpunkt in der G2/M-Phase außer Kraft
setzen kann und eine Progression transformierter Zellen durch die
Mitose erlaubt (Li et al. 1998). Survivin ist in zahl-reichen bösartigen
Tumoren, wie Lungen-, Kolon-, Magen-, Mamma-, Pankreas-, Prostata-, Blasen-Karzinom,
großzelligen
Non-Hodgkin Lymphomen, Melanomen und in Neuroblastomen überexprimiert und
spielt bei der Genesis und insbesondere bei der Progression dieser
Tumoren eine wesentliche Rolle (Übersicht
bei Altieri et al. 1999). Für
einzelne Tumoren konnten Zusammenhänge zwischen der Survivinexpression
und dem Krankheitsverlauf bzw. der Prognose aufgezeigt werden. So
korreliert in Neuroblastomen die Survivinexpression mit einer zunehmend
disseminierenden Erkrankung (Adida et al. 1998). Bei kolorektalen
Tumoren ist der immunhistochemische Nachweis einer Survivin-Proteinexpression
in den Tumorzellen mit einer verringerten Apoptoserate und einem
verkürzten
5-Jahres-Überleben
assoziiert (Kawasaki et al. 1998). Beim Blasenkarzinom weisen Grad
I Tumoren mit nicht nachweisbarer Survivin-Proteinexpression ein
rezidivfreies Intervall von 35,5 Monaten auf, währenddessen Tumoren mit detektierbarem
Survivin-Protein nur 10,5 Monaten rezidivfrei bleiben, das heißt, die
Survivinexpression besitzt einen prädiktiven Wert für das Rezidivauftreten
beim Blasenkarzinom (Swana et al. 1999). Beim Glioblastom ist die
Survivinexpression mit einer verringerten Apoptosefähigkeit
und einem signifikant schlechteren Überleben der Patienten assoziiert
(Chakravarti et al. 2002). Außerdem
konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Survivin-mRNA-Expression
mit einer schlechteren Prognose für Weichteilsarkom-Patienten
(WTS) gekoppelt ist (Kappler et al. 2001; Würl et al. 2002).
Sehr interessant sind erste Versuche
mit Survivin-Antisense-Oligonukleotiden
(AS-ON), die Apoptose in unterschiedlichen Tumorzelllinien induzieren
(Chen et al. 2000; Olie et al. 2000). Zusätzlich konnte gezeigt werden,
dass die Transfektion unterschiedlicher Survivin-Splicevarianten in HepG2-Zellen das
Zellüberleben bzw.
eine Apoptoseinduktion nach Methotrexatgabe beeinflusst (Mahotka
et al. 1999). In einer weiteren Studie wurde dokumentiert, dass
der Behandlungserfolg bzw. das Ansprechen auf eine Chemotherapie
bei Patienten mit Ösophagus-Krebs
mit niedriger Survivin-mRNA-Expression besser ist als bei Patienten
mit einer hohen Expression (Kato et al. 2001). Weiterhin wurde in
der Zelllinie A549 nachgewiesen, dass durch Survivin-AS-ON Apoptose
bzw. eine erhöhte
Sensitivität
gegenüber
dem Chemotherapeutikum Etoposid induziert werden kann (Olie et al.
2000). Ebenso wird in unterschiedlichen Melanom-Zelllinien durch
das Chemotherapeutikum Cisplatin Apoptose induziert, wenn sie die
phosphorylierungsdefekte Survivin-Mutante (Thr34 zu Ala) aufweisen (Grossmann
et al. 2001). Diese Untersuchungen zeigen, dass Survivin die Induktion
von Apoptose bzw. die Sensitivität
gegenüber
verschiedenen Chemotherapeutika beeinflussen kann. Weiterhin ist
bekannt, dass bestimmte Antisense-Konstrukte die Survivin-Expression
hemmen können
(WO 01/057059 Al).
Im Stand der Technik zeigen erste
Ergebnisse, dass in Pankreaskarzinom-Zelllinien eine reziproke Korrelation
zwischen einer erhöhten
Survivin-mRNA-Expression und der Strahlensensitivität besteht,
das heißt,
dass Zelllinien mit erhöhtem
Survivin mRNA-Gehalt strahlenresistenter sind (Asanuma et al. 2000).
Außerdem
deuten neueste Untersuchungen darauf hin, dass Survivin durch den
Tumorsuppressor p53 negativreguliert wird und in die p53-abhängige Apoptose
involviert ist (Mirza et al. 2002).
Nachteilhaft bei den bisherigen Offenbarungen
ist, dass dem Fachmann keine effektiven und konkreten Therapieansätze vorliegen,
die in Organismen, vor allem höheren
Organismen, wie beispielsweise Säugetieren,
insbesondere dem Menschen, angewendet werden könnten. Zahlreiche bisherige
Offenbarungen beschreiben sehr große Konstrukte, die mit dem
Survivin-Gen interagieren. Mit derartigen großen Konstrukten sind in bestimmten
Zellsuspensionen bzw. anderen Kulturen Effekte erzielbar. In höheren Organismen
jedoch, die über
eine effektive Immunabwehr sowie über zahlreiche enzymatische
Regelmechanismen verfügen,
werden derartige mit Survivin interagierende große Konstrukte bzw. Substanzen
immunologisch angegriffen, zerstört
oder nachteilig modifiziert, bevor sie mit dem eigentlichen Zielmolekül wechselwirken
und so eine spezifische Wirkung im Organismus entfalten können. Zusätzlich ist
die Stabilität
relativ großer
Konstrukte bzw. Substanzen bei einer Anwendung beim Menschen beschränkt. Zudem
ist die Zugänglichkeit
und zielortspezifische Verbringung der Konstrukte und Substanzen
im Körper
limitiert. Derartige negative Nebeneffekte sind nicht vorhersagbar,
schwer kontrollierbar und stellen demzufolge im Rahmen einer Behandlung
beim Menschen, z.B. gegen eine bösartige
Tumorerkrankung, ein relativ hohes Sicherheitsrisiko dar.
Aufgabe der Erfindung war es daher,
alternative Moleküle
bereitzustellen, die mit spezifischen Sekundärstruktur-Erkennungsmolekülen der mRNA des Survivin-Gens
einfach, sicher und effektiv wechselwirken.
Die Erfindung löst dieses technische Problem
durch die Bereitstellung von Erkennungsmolekülen, die gegen die mRNA des
Survivin-Genes (Datenbankeintrag NM_001168) und/oder deren Gen-
und Transkriptvarianten gerichtet sind, wobei die Erkennungsmoleküle mit mRNA-Ziel-Motiven
des Survivin-Gens
in einem Sequenzbereich von 20 bis 1500 spezifisch interagieren.
Die Zahlen repräsentieren – auch in
folgenden Anschnitten – die
entsprechenden Nukleotidpositionen innerhalb der Survivin-mRNA (Gesamtlänge 1619
Nukleotide).
Die Erfindung betrifft also die überraschende
Lehre, dass mit den erfindungsgemäßen Erkennungsmolekülen eine
hochspezifische und sehr effiziente Wechselwirkung mit der Survivin-mRNA
möglich
ist. Der Fachmann kann durch die Offenbarung der erfindungsgemäßen Lehre
spezifische Erkennungsmoleküle
wie Antisense-Konstrukte, Ribozyme, DNAzyme oder siRNA-Konstrukte
generieren, die mit dem Ziel-Sequenzbereich
so wechselwirken, dass die Survivin-Expression gehemmt, vermindert und/oder
inhibiert wird. Neben diesen Nukleinsäurekonstrukten stellen Antikörper bzw.
andere zur Zielsequenz Affinität/Bindungsspezifität /Wechselwirkungsfähigkeit
aufweisende Substanzen wie Affiline, Lektine oder Aptamere weitere
Beispiele für bevorzugte
Erkennungsmoleküle
dar.
Derartige Erkennungsmoleküle können in
vivo und in vitro angewendet werden, um beispielsweise in spezifischer
effizienter Weise die Ziel-mRNA von Survivin intrazellulär temporär anzugreifen
und so die onkogene Funktion einer tumorassoziierten abnormen Survivin-Expression
zu inhibieren. Die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle sind
somit zum Beispiel in einem diagnostischen oder therapeutischen
Verfahren verwendbar bzw. können
in einem Kit eingesetzt werden. Ein weiteres derartiges Verfahren
kann beispielsweise eine additive Therapie für den Menschen darstellen,
um humane Tumore lokal und/oder systemisch zu behandeln, z.B. mit
anderen Nukleinsäure-basierten
Konstrukten, Immuntherapeutika, Chemotherapeutika, Bestrahlung sowie
anderen Verfahren zur Tumorbehandlung.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
interagieren diese Erkennungsmoleküle spezifisch mit dem Zielsequenzbereich
von 30 bis 1350.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung Erkennungsmoleküle, die mit dem Zielsequenzbereich
von 30 bis 70, 90–114,
von 250 bis 310, von 490 bis 560, von 705 bis 770 und/oder von 1080
bis 1160 und 1290 bis 1360 spezifisch interagieren.
In einer ganz besonderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung Erkennungsmoleküle, die mit dem Sequenzbereich von
33 – 52,
41 – 60,
49 – 68,
92 – 114,
261 – 280,
264 – 283,
278 – 297,
282 – 301,
283 – 305,
2,86 – 305,
501 – 520,
504 – 523,
516 – 535,
519 – 538,
526 – 545,
532 – 551,
716 – 735,
719 – 738,
724 – 743,
740 – 759,
743 – 762,
1101 – 1120,
1103 – 1122,
1104 – 1123,
1126 – 1145,
1128 – 1147,
1302 – 1321, 1304 – 1323,
1317 – 1336,
1325 – 1344
und/oder 1327 – 1346
spezifisch interagieren.
Ganz besonders bevorzugt interagieren
die Erkennungsmoleküle
mit dem Zielsequenzbereich von 92 – 114, 261 – 280, 264 – 283, 283 – 305, 286 – 305, 504– 523, 532 – 551 und/oder 743 – 762 der
mRNA des Survivin-Gens.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform
der Erfindung ist der Sequenzbereich und/oder das Erkennungsmolekül durch
Addition, Amplifikation, Inversion, Missense-Mutation, Nonsense-Mutation,
Punktmutation, Deletion und/oder Substitution verändert.
Bevorzugt ist auch, dass Teile der
genannten Zielsequenzen mit Veränderungen
innerhalb oder mit veränderten
Randbereichen oder unterschiedlichen Derivatisierungen / Modifizierungen
/ Fusionen / Komplexierungen eingesetzt werden.
Diese Modifikationen und Sequenzveränderungen
können
beispielsweise bei den Erkennungsmolekülen dazu führen, dass sie mit einer höheren Avidität oder Spezifität an das
Target binden. Es kann jedoch selbstverständlich auch vorgesehen sein,
dass die Erkennungsmoleküle
mit geringerer Spezifität
oder Avidität binden.
Bei den Mutationen im Sequenzbereich
des Survivin-Gens und seiner Transkriptvarianten kann es sich im
Sinne der Erfindung zum Beispiel um vererbbare oder nicht vererbbare
Veränderungen
handeln. Zu den Mutationen können
beispielsweise auch Mutationen im Zusammenhang mit einer Gen- und/oder
Chromosomenmutationen zählen,
die mit Veränderungen
des Survivin-Gens und seiner Transkriptvarianten assoziiert sind.
Derartige Genalterationen können
dadurch entstehen, dass Teile des Chromosoms verloren gehen, verdoppelt
werden, in umgekehrter Orientierung vorliegen oder auf andere Chromosomen übertragen
werden. Selbstverständlich
ist es auch möglich,
dass die Mutation nur ein oder wenige benachbarte Basenpaare betrifft, wie
dies beispielsweise bei der Punktmutation der Fall ist. Geht beispielsweise
ein Basenpaar in Form einer Deletion verloren oder wird ein Basenpaar
zusätzlich,
wie bei der Insertion, eingeschoben, so verschiebt sich das Leseraster
des betroffenen Gens, was mit einer Veränderung der Triplettkodierung
bzw. zum vorzeitigen Kettenabbruch (Kodierung eines neuen Stoppkodons)
führt.
Bei der Substitutionsmutation im Sinne der Erfindung wird beispielsweise
eine Base gegen eine andere ausgetauscht, wobei die daraus resultierenden
Konsequenzen unterschiedlich sein können:
- (a)
Es kann beispielsweise ein Kodon in ein synonymes Kodon umgewandelt
werden,
- (b) oder die Mutation verändert
die Kodonspezifität
und führt
damit zum Einbau anderer Aminosäuren
bzw.
- (c) durch die Mutation wird die Translation an einer bestimmten
Stelle beendet, wobei die gebildeten Survivin-Fragmente inaktiv
oder aktiv sein können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist das Erkennungsmolekül
ein Nukleinsäurekonstrukt,
ein Chelator, ein Lektin und/oder ein Antikörper. Nukleinsäurekonstrukte
im Sinne der Erfindung können alle
Strukturen sein, die im Wesentlichen auf Nukleinsäuren basieren
oder deren aktives Zentrum im Wesentlichen auf Nukleinsäuren basiert.
Es kann selbstverständlich
möglich
sein, dass ein Teil des Erkennungsmoleküls/Konstruktes aus Lipiden,
Kohlenhydraten oder Proteinen bzw. Peptiden besteht – beispielsweise
in Form einer Nanokapsel – und
dieses Konstrukt einen Bereich umfasst, der Nukleinsäuren enthält, die
insbesondere mit dem Sequenzbereich von 33 – 52, 41 – 60, 49 – 68, 92 – 114, 261 – 280, 264 – 283, 278 – 297, 282 – 301, 283 – 305, 286 – 305, 501 – 520, 504 – 523, 516 – 535, 519 – 538, 526 – 545, 532 – 551, 716 – 735, 719 – 738, 724 – 743, 740 – 759, 743 – 762, 1101 – 1120,
1103 – 1122,
1104 – 1123,
1126 – 1145,
1128 – 1147,
1302 – 1321,
1304 – 1323,
1317 – 1336,
1325 – 1344
und/oder 1327 – 1346
der Survivin-mRNA
interagieren können. Dem
Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten
bekannt, derartige Konstrukte bereitzustellen. Ein Chelator im Sinne
der Erfindung ist eine Sammelbezeichnung für im Wesentlichen zyklische
Verbindungen, bei denen Metalle, Gruppierungen mit einsamen Elektronenpaaren
oder mit Elektronenlücken
und Wasserstoff an der Ringbildung beteiligt sind und die weiterhin
in der Lage sind, insbesondere mit dem Sequenzbereich von 33 – 52, 41 – 60, 49 – 68, 92 – 114, 261 – 280, 264 – 283, 278 – 297, 282 – 301, 283 – 305, 286 – 305, 501 – 520, 504 – 523, 516 – 535, 519 – 538, 526 – 545, 532 – 551, 716 – 735, 719 – 738, 724 – 743, 740 – 759, 743 – 762, 1101 – 1120,
1103 – 1122,
1104 – 1123,
1126 – 1145,
1128 – 1147,
1302 – 1321,
1304 – 1323,
1317 – 1336, 1325 – 1344 und/oder
1327 – 1346
spezifisch zu interagieren. Die Koordinationsverbindungen der Metalle,
die im Sinne der Erfindung als Metallchelatoren bezeichnet werden
können,
sind besonders vorteilhaft. Es sind Verbindungen, in denen ein einzelner
Ligand mehr als eine Koordinationsstelle an einem Zentralatom besetzt, das
heißt
mindestens zweizellig ist. In diesem Falle werden normalerweise
gestreckte Verbindungen durch Komplexbildung über ein Metallatom oder -ion
zu Ringen geschlossen, wobei diese Ringe in der Lage sind, spezifisch
mit dem Sequenzbereich von 33 – 52,
41 – 60,
49 – 68,
92 – 114,
261 – 280,
264 – 283,
278 – 297, 282 – 301, 283 – 305, 286 – 305, 501 – 520, 504 – 523, 516 – 535, 519 – 538, 526 – 545, 532 – 551, 716 – 735, 719 – 738, 724 – 743, 740 – 759, 743 – 762, 1101 – 1120,
1103 – 1122,
1104 – 1123,
1126 – 1145,
1128 – 1147, 1302 – 1321,
1304 – 1323,
1317 – 1336,
1325 – 1344
und/oder 1327 – 1346
zu interagieren. Ein Lektin im Sinne der Erfindung ist insbesondere
ein Phytohämagglutinen,
häufig
ein Pflanzenprotein, das aufgrund seiner hohen Affinität zu bestimmten
Komponenten an der Oberfläche
bestimmter Nukleinsäurestrukturen
spezifisch binden und agglutinieren kann. Insbesondere wechselwirken
Lektine mit Zuckerstrukturen, die mit spezifischen Sequenzbereichen
einer Nukleinsäure
assoziiert sein können.
Ein Antikörper
im Sinne der Erfindung bindet die genannten Zielbereiche des Survivin-Gens
spezifisch. Die Antikörper
können
auch modifizierte Antikörper sein
(zum Beispiel Oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper). Der
in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Antikörper umfasst
sowohl intakte Moleküle
als auch Fragmente, die bestimmte Determinanten des Targetbereiches
binden. Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit des Antikörpers zur
selektiven Bindung teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente
wie folgt definiert sind:
- (1) Fab, das Fragment,
das ein monovalentes Antigenbindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich
mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain
erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil einer schweren
Kette erhalten werden;
- (2) das Fab'-Fragment
eines Antikörper-Moleküls lässt sich
mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion
gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren
Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden
zwei Fab'-Fragmente
erhalten;
- (3) F(ab')2, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung
eines ganzen Antikörpers
mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F(ab')2 ist
eine Dimer von zwei Fab'-Fragmenten, die durch
zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
- (4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen
Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren
Kette enthält
und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und
- (5) Einzelketten-Antikörper
(„SCA"), definiert als
gentechnisch verändertes
Molekül,
das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich
der schweren Kette enthält,
die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem fusionierten
Einzelketten-Molekül
verbunden sind.
Der in der vorliegenden Erfindung
verwendete Begriff Epitop bedeutet einen bestimmten Zielbereich des
Survivin-Gens, insbesondere von 33 – 52, 41 – 60, 49 – 68, 92 – 114, 261 – 280, 264 – 283, 278 – 297, 282 – 301, 283 – 305, 286 – 305, 501 – 520, 504 – 523, 516 – 535, 519 – 538, 526 – 545, 532 – 551, 716 – 735, 719 – 738, 724 – 743, 740 – 759, 743 – 762, 1101 – 1120,
1103 – 1122,
1104 – 1123,
1126 – 1145,
1128 – 1147, 1302 – 1321,
1304 – 1323,
1317 – 1336,
1325 – 1344
und/oder 1327 – 1346,
der so ausgebildet ist, dass ein Antikörper in der Lage ist, mit diesem
spezifisch zu interagieren.
Neben Antikörpern können andere zur Zielsequenz
Affinität
/ Bindungsspezifität
/ Wechselwirkungsfähigkeit
aufweisende Substanzen wie Affiline, Lektine, Aptamere oder andere
Moleküle
mit Bindungsaffinität zum
Zielsequenzbereich als Erkennungsmolekül zum Einsatz kommen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Nukleinsäurekonstrukt
ein Antisense-Oligonukleotid (AS-ON), ein DNAzym, ein Ribozym, eine
Peptid-Nukleinsäure
(PNA), eine sogenannte „locked nucleic
acid" (LNA) und/oder
eine siRNA.
Zum Einsatz kommen zum Beispiel Oligonukleotide
(ON), Peptid-Nukleinsäuren
(PNAs), Ribozyme oder DNAzyme. Die AS-Wirkung beruht auf der sequenzspezifischen
Hybridisierung der Konstrukte durch Watson-Crick-Basenpaarung mit der für das zu
reprimierende Protein kodierenden Ziel-mRNA, was über verschiedene
Mechanismen zu einer Reduktion/Inhibierung der Proteinsynthese führt (Tab.l).
ADDIN
Tab.
1 AS-Effekte und ihre Wirkungsmechanismen ss – "single stranded" (Einzelstrang)
Die Entwicklung von Antisense-Oligonukleotiden
(AS-ON) als therapeutische Substanzen stellt neben verschiedenen
anderen Anwendungsfeldern insbesondere auch ein neues erfolgversprechendes
Therapiekonzept für
onkologische Erkrankungen dar. Während
es bei der konventionellen Chemotherapie zu einer unspezifischen
Hemmung der Zellproliferation kommt, können mit der Antisense-Therapie
ganz gezielt solche mRNAs inaktiviert werden, die die molekulare
Grundlage für
das entartete, deregulierte Wachstum und die Tumorprogression darstellen
sowie für
die Inhibierung der körpereigenen
Immmunabwehr verantwortlich sein können.
AS-ON unterscheiden sich von anderen
Therapeutika, wie Antikörpern,
Toxinen oder Immuntoxinen dahingehend, dass es sich um relativ kleine
Moleküle
mit einem Molekulargewicht von üblicherweise
etwa 5 kDa handelt. Die geringe Größe der AS-ON ermöglicht eine
gute Gewebepenetration. Außerdem
ist bekannt, dass Tumorblutgefäße im Gegensatz
zu Blutgefäßen normaler
Gewebe für
Substanzen in einem Größenbereich
zwischen 4–10
kDa durchlässig
sind. Das bedeutet, dass therapeutische AS-ON Tumorblutgefäße besser
penetrieren können.
Ein weiterer Vorteil dieser Substanzen, zum Beispiel gegenüber Antikörpern, die
nur gegen extrazelluläre
Proteine wirksam sind, besteht darin, dass mittels Antisense-Technik über die
jeweilige Ziel-mRNA zusätzlich
zu den membranständigen
sowohl zytoplasmatische als auch kernlokalisierte Proteine angegriffen
werden können.
Bei Verwendung der Phosphothioat-Oligonukleotide
(PS-ON) treten neben den o.g. targetspezifischen AS-Effekten vorteilhafterweise
zusätzlich
so genannte "non-antisense"-Effekte auf, die insbesondere zu einer unspezifischen
Hemmung des Zellwachstums führen.
Diese Effekte sind stark von der Oligosequenz bzw. von bestimmten
Sequenzmotiven abhängig
und treten auf Grund der starken polyanionischen Ladung der PS-ON auf,
welche eine Bindung der PS-ON an lebenswichtige Proteine zur Folge
haben kann. Die erwähnten
Effekte könnten
von partiell phospothioat-modifizierten AS-ON oder durch weitere
Modifikationen, z.B. den Einbau von Ribonukleotiden anstatt Desoxyribonukleotiden, überwunden
werden. Eine endständige
Modifizierung von ON-Konstrukten
(bevorzugt 2 bis 5 Bindungen vom 3'- und 5'-Nukleinsäureterminus)
bietet insbesondere eine verbesserte Stabilität bei einer Applikation in
vivo und im extra- und intrazellären
Milieu der Zielzellen, wie insbesondere dem Schutz vor Abbau durch
Exonukleasen. Ein positiver Effekt bei der Verwendung der PS-ON ist
deren immunstimulatorische Wirkung, die bei einigen Tumoranwendungen
einen möglichen
Therapieerfolg unterstützen
kann.
Zur Erhöhung der Stabilität und Spezifität von AS-ON
und zur Verminderung der „non-AS"-Effekte können weitere
chemische Modifikationen zum Einsatz kommen, z.B. Einbau von 2'-O-Methylribonukleotiden,
Methylphosphonat-Segmenten, „locked
nucleic acids" (Methylenbrücke zwischen
2'- Sauerstoff und 4'-Kohlenstoff der
Ribose), Austausch des Cytosins durch 5'-Methylcytosin und/oder eine 2'-5'-Tetraadenylat-Modifizierung.
Dabei kann es sich sowohl um partiell
modifizierte oder vollständig
via dieser chemischen Modifikation veränderte ON-Konstrukte handeln.
Ribozyme sind als katalytisch aktive
RNA-Moleküle
in der Lage, zelluläre
RNA-Strukturen als Substrate zu erkennen und sequenzspezifisch an
einer Phosphordiesterbindung der spezifischen Sequenz NUX zu spalten.
Die Erkennung erfolgt über
RS-Arme, die aufgrund komplementärer
Sequenzen eine Hybridisierung mit der Ziel-mRNA ermöglichen.
Gegenüber
AS-ON besitzen Ribozyme den grundsätzlichen Vorteil, dass ein Ribozym-Molekül als echter
Katalysator eine große
Anzahl identischer Substrat-Moleküle umsetzen kann. Daher sind
Ribozyme bereits in wesentlich geringerer Konzentration als ONs
wirksam und führen
darüber
hinaus durch die Substratspaltung zu einem irreversiblen RNA-Abbau
[Sun et . al. ].
Gegenüber einfachen Antisense-ON
besitzen Ribozyme den Vorteil, dass ein Ribozym-Molekül als echter
Katalysator in Multiple-Turnover-Reaktion eine große Anzahl
identischer Substrat-Moleküle
umsetzen kann. Daher sind Ribozyme vorteilhafterweise bereits in
geringerer Konzentration als AS-ODNs wirksam und führen darüber hinaus
durch die Substrat-Spaltung zu einer irreversiblen Inhibierung der
RNA.
Unter den bisher bekannten Ribozymtypen
ist das Hammerhead-Ribozym
(Review: Birikh et al. 1997; Tanner 1999) für derartige Anwendungen besonders
vorteilhaft, weil es als vergleichsweise kleines Molekül (ca. 30 – 50 Nukleotide)
katalytisch aktiv sein kann. Ein sehr wirksames transspaltendes
Hammerhead-Ribozym besteht zum Beispiel aus lediglich 14 konservierten
Nukleotiden in der katalytischen Domäne und zwei variablen Stammsequenzen – vorteilhafterweise
aus jeweils 6 – 8
Nukleotiden –,
die durch Watson-Crick-Basenpaarung – analog der AS-ON – die sequenzspezifische
Erkennung des Substrates realisieren und dieses anschließend durch
Spaltung einer Phosphordiester-Bindung inaktivieren. In dieser Form
lässt sich
vorteilhafterweise gegen jedes beliebige RNA-Molekül, welches
eine potentielle Spaltstelle mit der minimalen Sequenzanforderung
-NUX- (X = beliebiges Nucleotid außer G) besitzt, ein spezifisch
spaltendes Hammerhead-Ribozym konstruieren.
"RNA
interference" (RNAi)
als Methodik der Geninhibition wird vorteilhafterweise durch kleine
synthetisch hergestellte RNA-Oligonukleotide ("small interfering RNAs", siRNA) vermittelt,
die eine selektive Inhibierung der intrazellulären Synthese von Survivin ermöglichen.
Diese siRNA sind spezifische Reagenzien, die mit Vorzug für die Inhibierung
der Genexpression in pro- und eukaryotischen Zellen eingesetzt werden.
RNA-Interferenz wird durch doppelsträngige RNA (dsRNA) ausgelöst und führt zu sequenzspezifischer
Spaltung einzelsträngiger
Ziel-RNA (mRNA) mit entsprechender Sequenzhomologie zur dsRNA. Die
eigentlichen Vermittler des mRNA-Abbaus sind dabei kurze interferierende
dsRNAs (siRNA). Diese entstehen durch zelleigene Enzymsysteme als
Spaltprodukte aus den langen dsRNAs. Diese kurzen RNA-Duplexe (siRNAs)
besitzen eine charakteristische Länge von 21–23 nt mit einem jeweils 2
nt langen Einzelstrangüberhang
am 3'-Terminus beider
Ketten. Die Sequenz dieser siRNA bestimmt nun die Erkennung homologer
mRNA-Bereiche und deren Degradation durch Aktivierung zelleigener
RNasen.
[M8] Hierdurch kann die Proteinsynthese
des reprimierten Zielgens direkt beeinflusst, und so eine Ausschaltung
des Zielproteins induziert werden. Somit blockieren siRNA den Informationsfluss
in der Zelle, durch Inhibierung der Translation des Survivins und
seiner Varianten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Erkennungsmolekül oder die Erkennungsmoleküle immobilisiert.
Im Sinne der Erfindung werden. unter Immobilisierung verschiedene
Verfahren und Techniken zum Fixieren der Erkennungsmoleküle auf bestimmten
Trägern
verstanden. Die Immobilisierung kann beispielsweise der Stabilisierung
der Erkennungsmoleküle
dienen, wodurch diese insbesondere bei Lagerung oder bei einmaligem
Batch-Ansatz durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen
in ihrer Aktivität
nicht oder reduziert bzw. nachteilig modifiziert werden. Durch die
Immobilisierung der Erkennungsmoleküle ist ein wiederholter Einsatz
unter technischen oder klinischen Routine-Bedingungen möglich. Weiterhin
kann die Probe mit den Erkennungsmolekülen kontinuierlich umgesetzt
werden. Dies kann insbesondere durch verschiedene Immobilisierungstechniken
erreicht werden, wobei die Bindung der Erkennungsmoleküle an andere Erkennungsmoleküle oder
Moleküle
bzw. an einen Träger
so erfolgt, dass die dreidimensionale Struktur am aktiven Zentrum
der entsprechenden Moleküle,
insbesondere der Erkennungsmoleküle,
nicht verändert
wird. Vorteilhafterweise geht die Spezifität zu den Sequenzbereichen des
Targets und die Spezifität
der eigentlichen Bindungsreaktion durch die Immobilisierung nicht
verloren. Im Sinne der Erfindung können drei grundsätzliche
Methoden zur Immobilisierung verwendet werden:
- (i) Quervernetzung:
Bei der Quervernetzung werden die Erkennungsmoleküle miteinander
fixiert, ohne dass ihre Aktivität
nachteilig beeinflusst wird. Sie sind vorteilhafterweise nicht mehr
löslich.
- (ii) Bindung an einen Träger:
Die Bindung an einen Träger
erfolgt zum Beispiel durch Adsorption, Ionenbindung oder kovalente
Bindung. Dies kann auch innerhalb von mikrobiellen Zellen bzw. Liposomen
oder anderen membranhaltigen geschlossenen bzw. offenen Strukturen
erfolgen. Das Erkennungsmolekül
wird durch die Fixierung vorteilhafterweise nicht in seiner Spezifität/Aktivität beeinflusst.
Es kann mit Vorteil zum Beispiel in der Klinik in Diagnose oder
Therapie trägergebunden
mehrfach oder kontinuierlich eingesetzt werden.
- (iii) Einschluss: Der Einschluss erfolgt im Sinne der Erfindung
insbesondere an eine semipermeable Membran in Form von Gelen, Fibrillen
oder Fasern. Gekapselte Erkennungsmoleküle, wie zum Beispiel Antisense-Konstrukte,
sind durch eine semipermeable Membran so durch die umgebende Probenlösung getrennt,
dass sie vorteilhafterweise noch mit dem Sequenzbereich von 33 – 52, 41 – 60, 49 – 68, 92 – 114, 261 – 280, 264 – 283, 278 – 297, 282 – 301, 283 – 305, 286 – 305, 501 – 520, 504 – 523, 516 – 535, 519 – 538, 526 – 545, 532 – 551, 716 – 735, 719 – 738, 724 – 743, 740 – 759, 743 – 762, 1101 – 1120,
1103 – 1122,
1104 – 1123,
1126 – 1145, 1128 – 1147,
1302 – 1321,
1304 – 1323,
1317 – 1336,
1325 – 1344
und/oder 1327 – 1346
interagieren können.
Für
die Immobilisierung stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, wie
beispielsweise die Adsorption an einen inerten oder elektrisch geladenen
anorganischen oder organischen Träger. Solche Träger können beispielsweise
poröse
Gele, Aluminiumoxid, Betonid, Agarose, Stärke, Nylon oder Polyacrylamid
sein. Die Immobilisierung erfolgt hierbei durch physikalische/chemische
Bindungskräfte,
oft unter Beteiligung von hydrophoben Wechselwirkungen und ionischen
Bindungen. Derartige Methoden sind vorteilhafterweise einfach zu handhaben
und sie beeinflussen die Konformation der Erkennungsmoleküle nicht
oder nur in geringem Umfange. Durch elektrostatische Bindungskräfte zwischen
den geladenen Gruppen der Erkennungsmoleküle und dem Träger kann
die Bindung vorteilhafterweise verbessert werden, zum Beispiel durch
die Verwendung von Ionenaustauschern. Ein weiteres Verfahren ist
die kovalente Bindung an Trägermaterialien.
Geeignete Gruppen in Erkennungsmolekülen sind Carboxy-, Hydroxy-
und Sulfidgruppen. Aromatische Gruppen bieten die Möglichkeit
für Diazo-Kopplungen.
Die Oberfläche
von mikroskopischen porösen
Glaspartikeln kann durch Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit
Erkennungsmolekülen
umgesetzt werden. Mit Polyacrylamid-Harzen können zahlreiche Erkennungsmoleküle vorteilhafterweise
direkte kovalente Bindungen eingehen. Bei dem Einschluss in dreidimensionale
Netzwerke werden die Erkennungsmoleküle in ionotrophe Gele oder
andere dem Fachmann bekannte Strukturen eingeschlossen. Die Poren
der Matrix sind insbesondere so beschaffen, dass die Erkennungsmoleküle zurückgehalten
werden und eine Interaktion mit den Zielmolekülen bzw. mit dem Sequenzbereich
von 33 – 52,
41 – 60,
49 – 68,
92 – 114,
261 – 280,
264 – 283,
278 – 297,
282 – 301,
283 – 305,
286 – 305,
501 – 520,
504 – 523,
516 – 535,
519 – 538,
526 – 545,
532 – 551,
716 – 735, 719 – 738, 724 – 743, 740 – 759, 743 – 762, 1101 – 1120,
1103 – 1122,
1104 – 1123,
1126 – 1145,
1128 – 1147, 1302 – 1321,
1304 – 1323,
1317 – 1336,
1325 – 1344
und/oder 1327 – 1346
ermöglicht
ist. Bei der Mikroverkapselung wird der Reaktionsraum der Erkennungsmoleküle mit Hilfe
von Membranen eingegrenzt. Die Mikroverkapselung kann zum Beispiel
als Grenzflächen-Polymerisation
durchgeführt
werden. Durch die Immobilisierung bei der Mikroverkapselung werden
die Erkennungsmoleküle
unlöslich
und dadurch wieder verwendbar. Im Sinne der Erfindung sind immobilisierte
Erkennungsmoleküle
alle Erkennungsmoleküle,
die sich in einem Zustand befinden, der ihre Wiederverwendung erlaubt.
Die Einschränkung
der Beweglichkeit und der Löslichkeit
der Erkennungsmoleküle
auf chemischem, biologischem oder physikalischem Wege führt vorteilhafterweise
zu niedrigen Verfahrenskosten.
Die Erfindung betrifft auch eine
pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, gegebenenfalls
in einer Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger.
Dieser pharmazeutische Träger
kann insbesondere zusätzliche
Stoffe und Substanzen, wie beispielsweise medizinische und/oder
pharmazeutischtechnische Hilfsstoffe, umfassen. Medizinische Hilfsstoffe
sind beispielsweise solche Stoffe, die zur Produktion als Ingredienzien
von pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden. Pharmazeutisch-technische
Hilfsstoffe dienen der geeigneten Formulierung der pharmazeutischen
Zusammensetzung oder des Arzneimittels und können sogar – sofern sie nur während des
Herstellungsverfahrens benötigt
werden – anschließend entfernt
werden oder können
als pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanzen
Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Die pharmazeutische
Zusammensetzung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem
pharmazeutisch verträglichen
Verdünnungsmittel.
Hierbei kann es sich beispielsweise um phosphatgepufferte Kochsalzlösungen,
Wasser, Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene
Arten von Detergenzien, sterile Lösungen und ähnliches handeln. Die Verabreichung
der pharmazeutischen Zusammensetzung kann beispielsweise im Zusammenhang
mit einer Gen-Therapie geschehen, beispielsweise auch über geeignete
Vektoren, wie beispielsweise virale Vektoren. Die Art der Dosierung
und des Verabreichungsweges kann vom behandelnden Arzt entsprechend
den klinischen Faktoren bestimmt werden. Es ist dem Fachmann bekannt,
dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist,
wie beispielsweise der Größe, der
Körperoberfläche, dem
Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten,
aber auch von dem speziellen Mittel, welches verabreicht wird, der
Dauer und Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die
möglicherweise
parallel, insbesondere in einer Kombinationstherapie, verabreicht
werden.
Die Erfindung betrifft auch einen
Kit umfassend die Erkennungsmoleküle und/oder die pharmazeutische
Zusammensetzung. Weiterhin betrifft die Erfindung auch ein Array
umfassend die Erkennungsmoleküle und/oder
die pharmazeutische Zusammensetzung. Der Kit und der Array können zur
Diagnose und/oder Therapie von Krankheiten eingesetzt werden, die
mit der Aktivität
des Survivin-Gens assoziiert sind.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung
der Erkennungsmoleküle,
des Kits, des Arrays zur Diagnose, Prophylaxe, Verminderung, Therapie,
Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung von mit Zellwachstum,
-differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehenden Krankheiten,
bevorzugt gut- und bösartige
Tumorerkrankungen (Neoplasmen , andere Hyper- und/oder dysproliferative
Erkrankungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang
stehende Krankheit ein Tumor. Besonders bevorzugt ist der Tumor
ein solider Tumor und/oder ein Blut- oder Lymphdrüsenkrebs.
Insbesondere kann es sich bei den
Tumoren, die epithelialen oder mesodermalen Ursprungs sein können, im
Sinne der Erfindung um gut- oder bösartige Krebsarten der Organe
der Lunge, der Prostata, der Harnblase, der Niere, der speiseröhre, des
Magens, der Bauchspeicheldrüse
(Pankreas), des Hirns, des Ovars, des Skelettsystems handeln, wobei
besonders das Adenokarzinom der Brust, der Prostata, der Lunge und
des Darms; Knochenmarkkrebs, das Melanom, das Hepatom, die Kopf-Hals-Tumoren
explizit als Vertreter bösartiger
(so genannte maligne) Tumoren behandelt. werden können. Zur
Gruppe der Blut- und Lymphdrüsenkrebsarten
werden alle Formen von Leukämien
(z.B. in Zusammenhang mit B-Zellen-Leukämie, Gemischt-Zellen-Leukämie, Nullzellen-Leukämie, T-Zellen-Leukämie, chronische
T-Zellen-Leukämie,
HTLV-II-assoziierte Leukämie,
akut lymphozytische Leukämie,
chronisch-lymphozythische Leukämie,
Mastzell-Leukämie
und myeloische Leukämie)
und Lymphomen. Als Beispiele von mesenchymalen bösartigen Tumoren (so genannte Knochen-
und Weichteilsarkome) sind folgende Entitäten bevorzugt: Fibrosarkom;
das maligne Histiozytom; das Liposarkom; das Hämangiosarkom; das Chondrosarkom
und das Osteosarkom; Ewing-Sarkom; das Leio- und Rhabdomyosarkom,
das Synovialsarkom; Karzinosarkom. Als weitere Tumorarten, die auch
unter dem Begriff „Neoplasmen" zusammengefasst
werden, gelten insbesondere Knochen-Neoplasmen, Brust-Neoplasmen,
Neoplasmen des Verdauungssystems, colorektale Neoplasmen, Leber-Neoplasmen,
Pankreas-Neoplasmen, Hirnanhang-Neoplasmen,
Hoden-Neoplasmen, Orbita-Neoplasmen, Neoplasmen des Kopfes und Halses,
des Zentralnervensystems, Neoplasmen des Hörorgans, des Beckens, des Atmungstrakts
und des Urogenitaltrakts.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist die Krebserkrankung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert
wird, ausgewählt
aus der Gruppe: Tumoren des Hals-Nasen-Ohren-Bereichs umfassend Tumoren
der inneren Nase, der Nasennebenhöhlen, des Nasopharynx, der
Lippen, der Mundhöhle,
des Oropharynx, des Larynx, des Hypopharynx, des Ohres, der Speicheldrüsen und
Paragangliome, Tumoren der Lunge umfassend nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome,
kleinzellige Bronchialkarzinome, Tumoren des Mediastinums, Tumoren
des Gastrointestinaltraktes umfassend Tumoren des Ösophagus,
des Magens, des Pankreas, der Leber, der Gallenblase und der Gallenwege,
des Dünndarms,
Kolon- und Rektumkarzinome und Analkarzinome, Urogenitaltumoren
umfassend Tumoren der Nieren, der Harnleiter, der Blase, der Prostata, der
Harnröhre,
des Penis und der Hoden, gynäkologische
Tumoren umfassend Tumoren der Zervix, der Vagina, der Vulva, Korpuskarzinom,
maligne Trophoblastenerkrankung, Ovarialkarzinom, Tumoren des Eileiters
, Tumoren der Bauchhöhle,
Mammakarzinome, Tumoren endokriner Organe umfassend Tumoren der
Schilddrüse,
der Nebenschilddrüse,
der Nebennierenrinde, endokrine Pankreastumoren, Karzinoidtumoren
und Karzinoidsyndrom, multiple endokrine Neoplasien, Knochen- und
Weichteilsarkome, Mesotheliome, Hauttumoren, Melanome umfassend
kutane und intraokulare Melanome, Tumoren des zentralen Nervensystems,
Tumoren im Kindesalter umfassend Retinoblastom, Wilms Tumor, Neurofibromatose,
Neuroblastom, Ewing-Sarkom Tumorfamilie, Rhabdomyosarkom, Lymphome
umfassend Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, primäre Lymphome
des zentralen Nervensystems, Morbus Hodgkin, Leukämien umfassend
akute Leukämien, chronische
myeloische und lymphatische Leukämien,
Plasmazell-Neoplasmen,
myelodysplastische Syndrome, paraneoplastische Syndrome, Metastasen
ohne bekannten Primärtumor,
peritoneale Karzinomastose, Immunsuppression-bezogene Malignität umfassend
AIDS-bezogene Malignitäten
wie Kaposi-Sarkom,
AIDS-assoziierte Lymphome, AIDS-assoziierte Lymphome des zentralen
Nervensystems, AIDS-assoziierter Morbus Hodgkin und AIDS-assoziierter
anogenitale Tumoren, transplantationsbezogene Malignitäten, metastasierte Tumoren
umfassend Gehirnmetastasen, Lungenmetastasen, Lebermetastasen, Knochenmetastasen,
pleurale und perikardiale Metastasen und maligne Aszites.
In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung handelt es sich bei dem soliden Tumor um einen Tumor
des Urogenitaltraktes und/oder des Gastrointestinaltraktes.
In einer weiteren besonders bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung ist vorgesehen, dass der Tumor ein Kolonkarzinom,
ein Magenkarzinom, ein Pankreaskarzinom, ein Dickdarmkrebs, ein
Dünndarmkrebs, ein
Ovarialkarzinom, ein Zervixkarzinom, ein Lungenkrebs, ein Nierenzellkarzinom,
ein Hirntumor, ein Kopf-Hals-Tumor, ein Leberkarzinom und/oder eine
Metastase dieser Tumoren/Karzinome ist.
In einer weiteren besonders bevorzugten
Ausführungsform
ist der solide Tumor ein Mamma-, Bronchial-, Kolorektalund/oder
Prostatakarzinom.
In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführungsform
ist der Tumor des Urogenitaltraktes ein Harnblasenkarzinom. Das
Harnblasenkarzinom (BCa) stellt in der Bundesrepublik Deutschland
die vierthäufigste Krebsform
und siebthäufigste
Krebstodesursache bei Männern
dar. Die TUR-B als generelle. Primärtherapie des BCa erlaubt eine
organerhaltende Entfernung von oberflächlichen Tumoren. Trotz dieser
histopathologisch definierten vollständigen Entfernung des Tumors
ist mit 50-70 % der Patienten ein relativ hoher Anteil innerhalb
von zwei Jahren von einem Rezidiv betroffen [Stein et. al.]. Ein
Diagnose- sowie Therapieproblem stellt das synchrone oder metachrone
multifokale Auftreten von Tumorherden dar, wodurch das Auftreten
von Rezidiven entfernt von der resezierten Primärtumorlokalisation bedingt
sein kann [Sidransky et. al.]. Bei Auftreten eines Rezidivs oder
bei primär
als oberflächlich
eingestuften Tumoren erfolgt in der Regel nach der TUR-B eine Langzeitprophylaxe
mit einem Immun-(Bazillus
Calmette-Guérin – BCG) oder
Chemotherapeutikum (z. B. Mitomycin-C, Taxol, Gemcitabin/Cisplatin).
Patienten mit muskelinvasiven BCa und mit entdifferenzierten, oberflächlichen
Tumoren, die trotz dieser Therapie rezidivieren, werden in der Regel
radikal zystektomiert bzw. unter Erhalt der Blase mittels Mono-/Polychemo-,
Immun- oder Strahlentherapie bzw. Kombinationsverfahren dieser Methoden
behandelt. Chemo-, Immun- oder Strahlenbehandlungen sind aufgrund
ihrer relativ unspezifischen Wirkmechanismen von einer hohen therapieinduzierten
Toxizität
begleitet.
Aufgrund der gesundheitspolitischen
Bedeutung des Harnblasenkarzinoms (insbesondere in den westlichen
Industrieländern),
dem Fehlen tumorspezifischer Marker sowie der bekannten tumorbiologischen und
zellulären
Heterogenität
des Tumors gibt es eine intensive Suche auf dem klinischen Forschungsgebiet zum
Harnblasenkarzinom, die insbesondere auf die Identifizierung neuer
oder/und ergänzender
Therapieoptionen zielen.
In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung werden das Erkennungsmolekül, die pharmazeutische Zusammensetzung,
der Kit und/oder der Array für
eine Verlaufskontrolle verwendet, die im Wesentlichen eine Überwachung
der Wirksamkeit einer Antitumorbehandlung darstellt. weiterhin ist
es bevorzugt, dass das Erkennungsmolekül in einer Kombinationstherapie,
insbesondere zur Behandlung von Tumoren, verwendet wird. Besonders
bevorzugt ist hierbei, dass die Kombinationstherapie eine Chemotherapie,
eine Zytostatikabehandlung und/oder eine Strahlentherapie umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Kombinationstherapie eine adjuvante biologisch-spezifizierte
Therapieform. Ganz besonders bevorzugt ist hierbei, dass diese Therapieform eine
Immuntherapie ist. Weiterhin ist besonders bevorzugt, dass die Kombinationstherapie
eine Gentherapie und/oder eine Therapie mit einem Erkennungsmolekül desselben
oder eines anderen Zielmoleküls
umfasst. Eine Gentherapie im Sinne der Erfindung ist eine Behandlungsform
unter Einsatz von natürlichen
oder rekombinant veränderten
Nukleinsäure- Konstrukten, einzelner
Gensequenzen oder ganzer Gen- bzw. Chromosomenabschnitte bzw. kodierter
Transkriptbereiche, deren Derivate/Modifizierungen mit dem Ziel
einer biologisch-basierten und selektiven Hemmung bzw. Revertierung
der Krankheitssymptome und/oder deren kausalen Ursachen, wobei im
speziellen Fall darunter die Inhibition eines im Verlauf einer Krankheit überexprimierten Zielmoleküls auf Ebene
der Nukleinsäuren,
insbesondere auf der Transkriptebene, verstanden wird.
Dem Fachmann sind verschiedene Kombinationstherapien,
insbesondere zur Behandlung von Tumoren, bekannt. Es kann zum Beispiel
vorgesehen sein, dass innerhalb einer Kombinationstherapie eine
Zytostatikabehandlung erfolgt oder beispielsweise eine Bestrahlung
eines bestimmten Tumorareals, wobei diese Behandlung mit einer Gentherapie
kombiniert wird, wobei das erfindungsgemäße Erkennungsmolekül als Antikrebsmittel
eingesetzt wird. Das erfindungsgemäße Erkennungsmolekül kann jedoch
auch in Kombination mit anderen Erkennungsmolekülen eingesetzt werden, die
gegen dasselbe Zielmolekül
gerichtet sind oder gegen eine vollkommen andere Struktur. Demgemäß kann ganz
besonders bevorzugt das Erkennungsmolekül zur Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen
gegenüber
Zytostatika und/oder Strahlen verwendet werden. Weiterhin ist bevorzugt,
dass das Erkennungsmolekül
zur Hemmung der Viabilität,
der Proliferationsrate von Zellen und/oder zur Induktion von Apoptose
und eines Zellzyklusarrests verwendet wird.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand
von Beispielen näher
erläutert
werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Beispiele
1. Survivin-gerichtete
Antisense-Konstrukte (Antisense-ON und Ribozyme) und deren Wirksamkeit
Im Rahmen der Voruntersuchungen wurden
potentielle Zielmotive innerhalb der Ziel-mRNA von Survivin identifiziert,
die als einzelsträngige
Strukturen für
eine Hybridisierung gut zugänglich
sein sollten (Tab. 2). Gegen diese Einzelstrangmotive (ss-Motive)
wurden insgesamt 27 AS-ON und fünf
Nonsense-ON verschiedene Antisense-Oligonukleotide entworfen, die in Tab.
3 in einer Übersicht
dargestellt sind.
Als Modell für das BCa haben wir die BCa-Zelllinie
EJ28 ausgewählt,
da in umfangreichen Voruntersuchungen eine lipidvermittelte ON-Transfektion
effizient gelang und die Zellen eine distinkte mRNA- und Proteinexpression
von Survivin aufweisen (Kappler et al., im Druck). Überraschenderweise
zeigten mehrere verschiedene AS-Konstrukte
im direkten Vergleich mit den Nonsense-ON-Kontrollansätzen eine effiziente viabilitätshemmende
und targetspezifische Antisense-Wirkung, die auf verschiedenen Untersuchungsebenen
nachweisbar war. Insbesondere in Viabilitätsuntersuchungen (WST-1-Test,
Fa. Roche) konnte eindeutig eine markante Reduktion für 11 der
31 getesteten anti-Survivin AS-ON-Konstrukte (Tab. 3) nachgewiesen
werden (1). Eine spezifische Viabilitätshemmung
war prinzipiell im Zeitraum 12–48
h nach einmaliger Transfektion und im ON-Konzentrationsbereich 250–750 nM
nachweisbar.
Die Hemmung der Tumorzellviabilität korrelierte
dabei direkt mit einer detektierbaren Senkung der Survivin mRNA-Expressionsrate
(Nachweis über
quantitative Taq-Man RT-PCR, 2) und
des korrespondierenden Proteinexpressionsniveaus (Nachweis über Western-Blot
und Survivin-ELISA, 3 und 4) von ca. einem Drittel in den AS-ON-transfizierten
Zellen gegenüber
den gleichbehandelten Nonsense-ON-Kontrollansätzen.
Diese Befunde belegen die effiziente
Internalisierung, Target-Hybridisierung und -Blockierung bzw. -Degradation
der Survivin mRNA-Zielmoleküle.
Tab.
2: Definition von Survivin-mRNA-Motiven, die für Nukleinsäurekonstrukte zugängliche
sind (ss-Motive) Bezug auf mRNA-Sequenz von Datenbankeintrag NM_001168
Tab 3: Antisense- und
Nonsense-ON-Konstrukte
Die Bezeichnung bezieht sich auf
die erste Position (in 5' → 3'-Richtung) innerhalb
der Ziel-mRNA von Survivin (Datenbankeintrag NM_001168), die mit
dem entsprechenden Antisense-Konstrukt hybridisiert. *Der angegebenen
ON entstammt einer bereits publizierten Quelle (Olie et al. 2000)
1:
AS-ON-spezifische Viabilitätshemmung
von EJ28-Zellen 48 h nach einer einmaligen Transfektion mit 250
nM ON (komlexiert mit Lipofectin im w/w-Ratio 1:3). Die Werte sind
Mittelwerte einer parallelen Vierfachbestimmung (mit Standardabweichungen).
Zu beachten ist, dass zwei der angeführten AS-ON (SVV0232 und SVV
1099) und ein Kontroll-ON
(NS-1) aus der Literatur entnommen (Olie et al. 2000, Chen et al.
2000) zum Vergleich in der Versuchsreihe mitgeführt worden sind.
2:
AS-spezifische Verringerung der Survivin-mRNA-Expression: EJ28-Zellen wurden 4 h mit
je 250 nM ON (komlexiert mit Lipofectin im w/w-Ratio 1:3) transfiziert
und 24 h nach TF geerntet. Nach der RNA-Extraktion und cDNA-Synthese
wurde die Survivin-Transkriptmenge im Verhältnis zum Referenzgen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)
mittels quantitativer RT-PCR (TaqMan, Fa. Roboscreen) in Doppelbestimmung
ermittelt und die Ergebnisse auf NS-1 normiert.
3:
AS-spezifische Verringerung der Survivin-Protein-Expression: EJ28-Zellen wurden 4 h mit
je 250 nM ON (komlexiert mit Lipofectin im w/w-Ratio 1:3) transfiziert
und 24 h nach Transfektion geerntet. Zelllysate von jeweils 2×104 Zellen wurden im Westernblot eingesetzt
(SVV+ = rekombinantes Survivin mit His-Tag).Zum Vergleich wurden
die Zellen mit verschiedenen Nonsense-Kontrollen (NS-1 bis -5) bzw.
unbehandelte Zellen (+/- LF) mit Vollmedium (VM) oder Optimem (OM)
inkubiert. Mit dem Anti-Survivin- Antikörper AF886
(Fa. R&D) wurde
wurde eine dem Molekulargewicht von Survivin entsprechende Bande
bei ca. 16,5kDa detektiert.
4:
AS-spezifische Verringerung der Survivin-Protein-Expression: Im Survivin-ELISA (Fa. R&D) wurde 24 h
nach der Transfektion mit je 250nM ON (Dauer 4 h) in jeweils 2×104 EJ28-Zellen der Gehalt an Survivin-Protein
quantifiziert. Die Survivin-Konzentration (pg/ml) wurde in Relation-
zur Gesamtprotein-Konzentration (mg/ml) gesetzt. Die absoluten Mittelwerte
(pg Survivin / μg
Protein) wurden auf NS-1 normiert.
2. Survivin-gerichtete
siRNA-Konstrukte und deren Wirksamkeit
Es sind zwei Tumorzelllinien (Sarkomzelllinie
US 8/93 [Taubert et al. 1997], Osteosarkom-Zelllinie Saos-2: HTB
85) in Bezug auf ihr Verhalten, nach einer Behandlung mit siRNA
(Tab. 4), die gegen Survivin (IAP) gerichtet waren, untersucht worden.
Bei diesen Zelllinien handelt es sich um tumorbiologisch gut charakterisierte
Sarkomzelllinien.
Tab. 4: anti-Survivin-siRN
A-Konstrukte und zugehörige
Nonsense-si-RNA-Kontrolle
Die Numerierung des Zielmotives bezieht
sich auf den Datenbankeintrag NM 001168 der Survivin-mRNA. (s =
sense, as = antisense)
Nach einer einmaligen Behandlung
mit SiRNA (300 nM)(SiRNA 1 und 2 gerichtet gegen Survivin 92–114 bzw.
SiRNA 3 und 4 als Nonsensekontrolle) zeigten die so therapierten
Zellen a) reduzierte Survivin-mRNA und Proteinmengen, b) einen Anstieg
der Apoptose, nachgewiesen durch Zellüberstandsanalysen, c) ein stark
reduziertes Zellüberleben
im Zellkoloniebildungstest und d) das Auftreten von Riesenzellen
(polyploid). Normalisiert wurden diese Analysen zu einer unter gleichen
Bedingungen behandelten Vergleichsgruppe, die im Unterschied zur
Analysegruppe mit einem Kontroll-RNAi-Konstrukt behandelt wurde,
das kein Zielgen hatte (Nonsense – Kontrolle).
Die Reduktion der Survivin-mRNA durch
spezifische SiRNA ist über
ca. 3 Tage stabil, was die zeitliche Wirkung der Therapie dokumentiert
(6). Dabei wird die SurvivinmRNA um
bis zu 90 % im Vergleich zur Kontrolle reduziert (5 und 6). Zwischen verschiedenen Zelllinien bestehen – entsprechend
der Ausgangsexpression – starke
Unterschiede. Eine Reduktion der Survivin-mRNA auf bis zu 2 zmol
Survivin/amol GRPDH konnte in den Untersuchungen nachgewiesen werden.
5:
siRNA-spezifische Verringerung der Survivin-mRNA-Expression: WTS Zelllinien (8/93, 11/98, 10/98,
7/99) wurden 6 h mit je 300 nM siRNA 1-2 (komlexiert mit Oligofectamin
im w/w-Ratio 1:1) transfiziert und 24 h nach dem Beginn der Transfektion
geerntet. Nach der RNA-Extraktion
und cDNA-Synthese wurde die Survivin-Transcriptmenge je Zellinie ins Verhältnis zu
den mit dem Nonsense-siRNA 3-4 behandelten Zellen gesetzt. Hierbei
wurden die Nonsense-Kontroll-siRNA 3-4 behandelten Zellen gleich
100 gesetzt und es ergab sich für
die mit je 300 nM siRNA 1-2 behandelten Zellen eine relative Transkriptionsmenge
(mit Standardabweichungen).
6:
Darstellung der Zeit-abhängigen
Reprimierung der Survivin-mRNA bei der Zelllinien 7/99 nach siRNAi-Applikation (6 h
mit je 300 nM siRNA 1-2 bzw. NonsensesiRNA 3-4 (komlexiert mit Oligofectamin
im w/w-Ratio 1:1) transfiziert). Die Zellen wurden 24 h ,48 h ,
bzw 72 h nach der Transfktion geerntet. Nach der RNA-Extraktion
und cDNA-Synthese wurde die Survivin-Transkriptmenge ermittelt (zmol
Survivin/ amol GAPDH).
Entsprechend der Reduktion der mRNA
wurde auch das Produkt der Survivin-mRNA – das Survivinprotein – um etwa
50 reduziert (7).
Der wesentliche zellbiologische Effekt
der spezifischen Survivininhibierung war eine deutliche Erhöhung der
Apoptose. Diese wurde durch Bestimmung der in der Kulturflasche
abgeschwommenen Zellen bestimmt, wobei 70 – 90 % aller im Überstand
gefundenen Zellen apoptotisch wurden (Bestimmung der Zellkernmorphologie
nach DAPI-Färbung).
Hierbei wurde eine zeitlich progressive Apoptoserate der mit anti-Survivin siRNA
behandelten Zellen gefunden, wobei nach 3 Tagen bis zu 19 % aller
Zellen apoptotisch wurden. Diese Reaktion konnte durch den Nachweis
eines verringerten Überlebens
der so behandelten Zellen verifiziert werden. Zellkoloniebildungstests
zeigten im Vergleich zur Nonsense-Kontrolle eine reduzierte Zellviabilität von ca. 50
% (8).
7:
siRNA-spezifische Verringerung der Survivin-Protein-Expression: VTS Zelllinien (8/93,
11/98, 10/98, 7/99) wurden 6 h mit je 300 nM siRNA 1-2 (komlexiert
mit Oligofectamin im w/w-Ratio 1:1) transfiziert und 24 h nach dem
Beginn der Transfektion geerntet. Im Survivin-ELISA (Fa. R&D) wurde 24h nach
der Transfektion der Gehalt an Survivin-Protein quantifiziert. Die
Survivin-Konzentration (pg/ml) wurde in Relation zur Gesamtprotein-Konzentration
(mg/ml) gesetzt. Die absoluten Mittelwerte (pg Survivin / μg Protein)
wurden ins Verhältnis
zu den mit dem NonsensesiRNA 3-4 behandelten Zellen gesetzt. Hierbei
wurden die Nonsense-Kontroll-siRNA 3-4 behandelten Zellen gleich
100-% gesetzt und es ergab sich für die mit je 300 nM siRNA 1-2
behandelten Zellen eine relative Transkriptionsmenge (mit Standardabweichungen).
Darstellung der Survivin-Proteinexpression
nach siRNA-Applikation
siehe oben.
8:
Darstellung der Plattiereffizenz der WTS Zelllinien (8/93, 11/98,
10/98, 7/99) diese wurden 6 h mit je 300 nM siRNA 1-2 (komlexiert
mit Oligofectamin im w/w-Ratio
1:1) transfiziert und 24 h nach dem Beginn der Transfektion definiert
in Zellkulturflaschen eingestreut. Nach 14-tägigem Wachstum wurden die aufgewachsenen
Zellkolonien ausgezählt
und in Relation zu der zellspezifischen Nonsense -siRNA 3-4 behandelten Kontrolle
gesetzt.
Verwendete
Referenzen
- Agrawal S, Zhao Q: Antisense therapeutics. Curr Opin Chem
Biol (1998) 2: 519-28.
- Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene,
survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med. (1997) 3: 917-21.
- Asanuma K, Moriai R, Yajima T, Yagihashi A, Yamada M, Kobayashi
D, Watanabe N. Survivin as a radioresistance factor in pancreatic
cancer. Jpn J Cancer Res. 2000 91: 1204-9.
- Boiziau C, Kurfurst R, Cazenave C, Roig V, Thuong NT, Toulme
JJ: Inhibition of translation initiation by antisense oligonucleotides
via an RNase-H independent mechanism. Nucleic Acids Res (1991) 19:
1113-9.
- Chen J, Wu W, Tahir SK, Kroeger PE, Rosenberg SH, Cowsert LM,
Bennett F, Krajewski S, Krajewska M, Welsh K, Reed JC, Ng SC. Down-regulation
of survivin by antisense oligonucleotides increases apoptosis, inhibits
cytokinesis and anchorage-independent growth. Neoplasia (2000) 2:235-41.
- Crooke ST: Molecular mechanisms of action of antisense drugs.
Biochim Biophys Acta (1999) 1489: 31-44.
- Kole R, Sazani P: Antisense effects in the cell nucleus: modification
of splicing. Curr Opin Mol Ther (2001) 3: 229-34.
- Grossman D, Kim PJ, Schechner JS, Altieri DC. Inhibition of
melanoma tumor growth in vivo by survivin targeting. Proc Natl Acad
Sci USA (2001) 98: 635-40.
- Kappler M, Kohler T, Kampf C, Diestelkotter P, Wurl P, Schmitz
M, Bartel F, Lautenschlager C, Rieber EP, Schmidt H, Bache M, Taubert
H, Meye A. Increased survivin transcript levels: an independent
negative predictor of survival in soft tissue sarcoma patients.
Int J Cancer (2001) 95: 360-3.
- Kato J, Kuwabara Y, Mitani M, Shinoda N, Sato A, Toyama T, Mitsui
A, Nishiwaki T, Moriyama S, Kudo J, Fujii Y. Expression of survivin
in esophageal cancer: correlation with the prognosis and response
to chemotherapy. Int J Cancer (2001) 95: 92-5.
- Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD, Toyoda M, Tenjo T, Tanigawa N.
Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates
in colorectal cancer. Cancer Res (1998) 58: 5071-4.
- Li F, Ambrosini G, Chu EY, Plescia J, Tognin S, Marchisio PC,
Altieri DC. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint
by survivin. Nature (1998) 396: 580-4.
- Mahotka C, Wenzel M, Springer E, Gabbert HE, Gerharz CD. Survivin-deltaEx3
and survivin-2B: two novel splice variants of the apoptosis inhibitor
survivin with different antiapoptotic properties. Cancer Res (1999)
59: 6097-102.
- Mirza A, McGuirk M, Hockenberry TN, Wu Q, Ashar H, Black S,
Wen SF, Wang L, Kirschmeier P, Bishop WR, Nielsen LL, Pickett CB,
Liu S. Human survivin is negatively regulated by wild-type p53 and
participates in p53-dependent
apoptotic pathway. Oncogene (2002) 21: 2613-22. Moser HE, Dervan
PB: Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix
formation. Science (1987) 238: 645-50.
- Olie RA, Simoes-Wust AP, Baumann B, Leech SH, Fabbro D, Stahel
RA, Zangemeister-Wittke U. A novel antisense oligonucleotide targeting
survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer
cells to chemotherapy. Cancer Res (2000) 60: 2805-9.
- Sun LQ, Cairns MJ, Saravolac EG, Baker A, Gerlach WL: Catalytic
nucleic acids: from lab to applications. Pharmacol Rev (2000) 52:
325-47.
- Swana HS, Grossman D, Anthony JN, Weiss RM, Altieri DC. Tumor
content of the antiapoptosis molecule survivin and recurrence of
bladder cancer. N Engl J Med (1999) 341:452-3.
und/oder deren Komplementäre umfassen.