Aufgabe der Erfindung war es daher,
alternative kompakte Moleküle
bereitzustellen, die mit ausgewählten,
spezifischen Struktureinheiten, die die Telomerase kodieren, einfach
und effektiv inhibierend wechselwirken.
Die Erfindung löst dieses technische Problem
durch die Bereitstellung eines Erkennungsmoleküls, das gegen eine mRNA der
katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) gerichtet
ist, wobei das Erkennungsmolekül
insbesondere mit Primärstrukturen
dieser hTERT-mRNA in einem Zielsequenzbereich von 2000 bis 2500
gemäß dem Gendatenbankeintrag
AF 015950 spezifisch interagiert. Die Zahlen repräsentieren – auch in
folgenden Anschnitten – die
entsprechenden Nukleotidpositionen innerhalb der hTERT-mRNA (Gesamtlänge 4015
Nukleotide). Die Erfindung betrifft also die überraschende Lehre, dass gegen
tumorassoziierte abnorme hTERT-mRNA-Expressionsmuster sowie Telomeraseaktivitätsniveaus
durch eine mögliche hTERT-Inhibition
mit den erfindungsgemäßen Erkennungsmolekülen vorgegangen
werden kann. Diese Erkennungsmoleküle sind gegen definierte hTERT-mRNA-Sequenzmotive
im Bereich von 2000 bis 2500 gerichtet. Sie können biologische und/oder chemische
Strukturen sein, die in der Lage sind, so mit dem Zielsequenzbereich
zu interagieren, dass eine spezifische Erkennung / Bindung und Wechselwirkung
bestimmt werden kann. Beispiele für Erkennungsmoleküle können insbesondere
Nukleinsäurekonstrukte,
Antikörper
bzw. andere zur Zielsequenz Affinität / Bindungsspezifität / Wechselwirkungsfähigkeit
aufweisende Substanzen wie Affiline, Lektine, Aptamere oder andere
Moleküle
sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung interagiert das Erkennungsmolekül mit einem Zielsequenzbereich
von 2100 bis 2400. Dieser Bereich ist vorteilhaft, um eine hTERT-Inhibition
zu erreichen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung interagiert das Erkennungsmolekül mit einem Zielsequenzbereich
von 2190 bis 2360. In diesem Bereich ist mit Vorteil eine besonders
gute hTERT-Inhibition erreichbar.
In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführungsform
interagiert das Erkennungsmolekül
spezifisch mit dem Zielsequenzbereich von 2191 bis 2224 und/oder
von 2318 bis 2346. Vorteilhafterweise ist in diesen Sequenzbereichen
eine besonders effiziente hTERT-Inhibition möglich.
Bevorzugt sind ebenfalls kürzere Bereiche
mit Veränderungen
innerhalb dieser Zielsequenzen oder mit veränderten Randbereichen oder
unterschiedlichen Derivatisierungen/ Modifizierungen/Fusionen/Komplexierungen,
die auch mit anderen Erkennungsmolekülen kombiniert und/oder gekoppelt
sein können.
Durch diese bevorzugten Zielsequenzbereiche
ist es dem Fachmann möglich,
insbesondere sehr kleine und/oder kompakte Erkennungsmoleküle bereitzustellen,
die im Wesentlichen nicht mit anderen Strukturen, insbesondere immunologischen
Abwehrstrukturen, innerhalb des Zellgewebes bzw. des Organismus
interagieren oder von diesen angegriffen werden, sondern spezifisch
mit dem Zielsequenzbereich der hTERT-mRNA interagieren können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist vorgesehen, dass der Sequenzbereich oder das Erkennungsmolekül durch
Addition, Amplifikation, Inversion, Missense-Mutation, Nonsense-Mutation,
Punktmutation, Deletion und/oder Substitution modifiziert ist. Diese
Modifikationen können
beispielsweise beim Erkennungsmolekül dazu führen, dass es mit einer höheren Avidität oder Spezifität an die mRNA
der katalytischen hTERT-Untereinheit bindet. Es kann jedoch selbstverständlich auch
vorgesehen sein, dass das Erkennungsmolekül mit geringerer Spezifität oder Avidität bindet.
Bei den Mutationen im hTERT-Sequenzbereich
kann es sich im Sinne der Erfindung zum Beispiel um vererbbare oder
nicht vererbbare Veränderungen
handeln. Die Modifikationen können
so beschaffen sein, dass sie direkt auf der mRNA-Ebene oder auf
der DNA-Ebene detektierbar werden. Zu den Mutationen können beispielsweise
auch Mutationen im Zusammenhang mit einer zytologisch sichtbaren
Genom- und/oder Chromosomenmutationen zählen, die mit Veränderungen
der hTERT assoziiert sind. Derartige Mutationen können dadurch
entstehen, dass Teile des Chromosoms verloren gehen, verdoppelt
werden, in umgekehrter Orientierung vorliegen oder auf andere Chromosomen übertragen
werden. Selbstverständlich
ist es auch möglich,
dass die Mutation nur ein oder wenige benachbarte Basenpaare betrifft,
wie dies beispielsweise bei der Punktmutation der Fall ist. Geht
beispielsweise ein Basenpaar in Form einer Deletion verloren oder
wird ein Basenpaar zusätzlich,
wie bei der Insertion, eingeschoben, so verschiebt sich das Leseraster
des betroffenen Gens zu einer Leserastermutation. Bei der Substitutionsmutation
im Sinne der Erfindung wird beispielsweise eine Base gegen eine
andere ausgetauscht, wobei die daraus resultierenden Konsequenzen
unterschiedlich sein können:
- (a) Es kann beispielsweise ein Kodon in ein
synonymes Kodon umgewandelt werden,
- (b) oder die Mutation verändert
die Kodonspezifität
und führt
damit zum Einbau anderer Aminosäuren
bzw.
- (c) durch die Mutation wird die Translation an einer bestimmten
Stelle beendet, wobei die gebildeten hTERT-Fragmente inaktiv oder
aktiv sein können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist das Erkennungsmolekül
ein Nukleinsäurekonstrukt,
ein Chelator, ein Lektin und/oder ein Antikörper. Nukleinsäurekonstrukte
im Sinne der Erfindung können alle
Strukturen sein, die im Wesentlichen auf Nukleinsäuren basieren
oder deren aktives Zentrum im Wesentlichen auf Nukleinsäuren basiert.
Es kann selbstverständlich
möglich
sein, dass das gesamte Erkennungsmolekül vor allem aus Lipiden, Kohlenhydraten
oder Proteinen bzw. Peptiden besteht – beispielsweise in Form einer
Nanokapsel – und
dieses Konstrukt einen Bereich umfasst, der Nukleinsäuren enthält, die
mit hTERT wechselwirken können.
Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten
bekannt, derartige Konstrukte bereitzustellen. Ein Chelator im Sinne
der Erfindung ist eine Sammelbezeichnung für zyklische Verbindungen, bei denen
Metalle, Gruppierungen mit einsamen Elektronenpaaren oder mit Elektronenlücken und
Wasserstoff an der Ringbildung beteiligt sind und die weiterhin
in der Lage sind, mit der hTERT-mRNA spezifisch zu interagieren.
Die Koordinationsverbindungen der Metalle, die im Sinne der Erfindung
als Metallchelatoren bezeichnet werden können, sind besonders vorteilhaft.
Es sind Verbindungen, in denen ein einzelner Ligand mehr als eine Koordinationsstelle
an einem Zentralatom besetzt, das heißt mindestens zweizellig ist.
In diesem Falle werden normalerweise gestreckte Verbindungen durch
Komplexbildung über
ein Metallatom oder -ion zu Ringen geschlossen, wobei diese Ringe
in der Lage sind, spezifisch mit der hTERT-mRNR zu interagieren.
Ein Lektin im Sinne der Erfindung ist insbesondere ein Phytohämagglutinin,
häufig
ein Pflanzenprotein, das aufgrund seiner hohen Affinität zu bestimmten
Komponenten an der Oberfläche
bestimmter Nukleinsäurestrukturen
spezifisch binden und agglutinieren kann. Insbesondere wechselwirken
Lektine mit Zuckerstrukturen, die mit spezifischen Sequenzbereichen
einer Nukleinsäure
assoziiert sein können.
Ein Antikörper
im Sinne der Erfindung bindet die genannten hTERT-Zielbereiche spezifisch.
Die Antikörper
können
auch modifizierte Antikörper
sein (zum Beispiel oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte
Antikörper).
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Antikörper umfasst
sowohl intakte Moleküle
als auch Antikörperfragmente,
die bestimmte Determinanten des Zielbereiches binden. Bei diesen
Fragmenten ist die Fähigkeit
des Antikörpers
zur selektiven Bindung teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente
wie folgt definiert sind:
- (1) Fab, das Fragment,
das ein monovalentes Antigenbindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich
mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain
erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil einer schweren
Kette erhalten werden;
- (2) das Fab'-Fragment
eines Antikörper-Moleküls lässt sich
mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion
gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren
Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden
zwei Fab'-Fragmente
erhalten;
- (3) F(ab')2, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung
eines ganzen Antikörpers
mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F(ab')2 ist
eine Dimer von zwei Fab'-Fragmenten, die durch
zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
- (4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen
Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren
Kette enthält
und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und
- (5) Einzelketten-Antikörper
(„SCA"), definiert als
gentechnisch verändertes
Molekül,
das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich
der schweren Kette enthält,
die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem fusionierten
Einzelketten-Molekül
verbunden sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Nukleinsäurekonstrukt
ein Antisense(AS)-Oligonukleotid (ON), ein DNAzym, ein Ribozym,
eine siRNA und/oder eine Peptid-Nukleinsäure (PNA).
Bei AS-Konstrukten handelt es sich
um synthetisch hergestellte Moleküle, die eine selektive Inhibition der
Biosynthese ausgewählter
Proteine ermöglichen.
Zum Einsatz kommen zum Beispiel ON, PNAs, Ribozyme, DNAzyme. Die
AS-Wirkung beruht
auf der sequenzspezifischen Hybridisierung der Konstrukte durch
Watson-Crick-Basenpaarung mit der für das zu reprimierende Protein
kodierenden Ziel-mRNA, was über
verschiedene Mechanismen zu einer Verhinderung der Proteinsynthese
führt (Tab.1).
Tab.
1 AS-Effekte und ihre Wirkungsmechanismen ss – "single stranded" (Einzelstrang)
Die Entwicklung von AS-ON als therapeutische
Substanzen stellt neben verschiedenen anderen Anwendungsfeldern
auch ein neues erfolgversprechendes Therapiekonzept für onkologische
Erkrankungen dar [Tamm et al.]. Während es bei der konventionellen
Chemotherapie zu einer unspezifischen Hemmung der Zellproliferation
kommt, werden mit der AS-Therapie
ganz gezielt solche mRNAs inaktiviert, die die molekulare Grundlage
oder einen wesentlichen Bestandteil des entarteten, deregulierten
Wachstums und der Tumorprogression darstellen sowie für die Inhibierung
der körpereigenen
Immunabwehr verantwortlich sein können.
AS-ON unterscheiden sich von anderen
Therapeutika, wie Antikörpern,
Toxinen oder Immuntoxinen dahingehend, dass es sich um relativ kleine
Moleküle
mit einem Molekulargewicht von üblicherweise
etwa 5 kDa handelt. Die geringe Größe der AS-ON ermöglicht eine
gute Gewebepenetration. Außerdem
ist bekannt, dass Tumorblutgefäße im Gegensatz
zu Blutgefäßen normaler
Gewebe für
Substanzen in einem Größenbereich
zwischen 4–10
kDa durchlässig
sind. Das bedeutet, dass therapeutische AS-ON gezielt Tumorblutgefäße penetrieren
können.
Ein weiterer Vorteil dieser Substanzen, zum Beispiel gegenüber Antikörpern, die
nahezu ausschließlich
gegen extrazelluläre
Proteine wirksam sind, besteht darin, dass über die jeweilige Ziel-mRNA prinzipiell
alle, also sowohl zytoplasmatische als auch kernlokalisierte sowie
membranständige
Proteine angegriffen werden können.
Die gegen einen Nuklease-Angriff
relativ resistenten Phosporthioat-AS-ON werden gegenwärtig in
einer Reihe von klinischen Studien (Phase I-III) hinsichtlich ihres
Potentials als Anti-Krebs-Therapeutika evaluiert. Dabei werden in
Tumoren überexprimierte
Ziel-mRNA-Moleküle
angegriffen.
Bei Verwendung der Phosphothioat-ON
(PS-ON) wurde eine Reihe von unerwarteteten, so genannten "non-AS"-Effekten beobachtet,
die zudem zu einer unspezifischen Hemmung des Zellwachstums führen können. Diese
Effekte sind stark von der ON-Sequenz bzw. von bestimmten Sequenzmotiven
abhängig
und treten auf Grund der starken polyanionischen Ladung der PS-ON
auf, welche eine Bindung der PS-ON an lebenswichtige Proteine zur
Folge haben kann. Die erwähnten
negativen Effekte können
insbesondere durch Verwendung von partiell phosphothioat-modifizierten
AS-ON oder durch weitere Modifikationen, z.B. Einbau von Ribonukleotiden
anstatt Desoxyribonukleotiden, überwunden
werden. Eine partielle endständige
Modifizierung von ON-Konstrukten (bevorzugt 2 bis 5 Bindungen vom
3'- und 5'-Nukleinsäureterminus
sind modifiziert) bietet eine erhöhte Stabilität im extra-
und intrazellulären
Milieu der Zielzellen (Schutz vor Abbau durch Exonukleasen), insbesondere
bei einer Applikation in vivo. Ein positiver Nebeneffekt, der bei
Verwendung der PS-ON beobachtet wurde, ist deren immunstimulatorische
Wirkung, die bei einigen Tumoranwendungen durchaus einen möglichen
Therapieerfolg unterstützen
kann.
Zur Erhöhung der Stabilität und Spezifität von AS-ON
und zur Verminderung der „non-AS"-Effekte können weitere
chemische Modifikationen zum Einsatz kommen, z.B. Einbau von 2'-O-Methylribonukleotiden,
Methylphosphonat-Segmenten, „locked
nucleic acids" (Methylenbrücke zwischen
2'-Sauerstoff und 4'-Kohlenstoff der
Ribose), Austausch des Cytosins durch 5'-Methylcytosin und/oder eine 2'-5'-Tetraadenylat-Modifizierung.
Dabei kann es sich sowohl um partiell
modifizierte oder vollständig
via dieser chemischen Modifikation veränderte ON-Konstrukte handeln.
Ribozyme sind als katalytisch aktive
RNA-Moleküle
in der Lage, zelluläre
RNA-Strukturen als Substrate zu erkennen und sequenzspezifisch an
einer Phosphordiesterbindung zu spalten. Die Erkennung erfolgt über AS-Arme,
die aufgrund komplementärer
Sequenzen eine Hybridisierung mit der Ziel-mRNA ermöglichen. Gegenüber AS-ON
besitzen Ribozyme den grundsätzlichen
Vorteil, dass ein Ribozym-Molekül
als echter Katalysator eine große
Anzahl identischer Substratmoleküle
umsetzen kann. Daher sind Ribozyme bereits in wesentlich geringerer
Konzentration als ON wirksam und führen darüber hinaus durch die Substrat-Spaltung
zu einem irreversiblen RNA-Abbau [Sun et al.].
Unter den bisher bekannten Ribozymtypen
ist das Hammerhead-Ribozym (Review: Birikh et al., 1997; Tanner,
1999) für
derartige Anwendungen besonders interessant, weil es als vergleichsweise
kleines Molekül (ca.
30–50
Nukleotide) bereits katalytisch aktiv sein kann. Ein sehr wirksames
trans-spaltendes Hammerhead-Ribozym besteht zum Beispiel aus lediglich
14 konservierten Nukleotiden in der katalytischen Domäne und zwei
variablen Stammsequenzen (vorteilhafterweise aus jeweils 6–8 Nukleotiden),
die durch Watson-Crick-Basenpaarung (analog der AS-ON) die sequenzspezifische
Erkennung des zu spaltenden Substrates realisieren und dieses anschließend durch
Spaltung einer Phosphordiester-Bindung inaktivieren. In dieser Form
lässt sich
praktisch gegen jedes beliebige RNA-Molekül, welches eine potentielle
Spaltstelle mit der minimalen Sequenzanforderung -NUX- besitzt,
ein spezifisch spaltendes Hammerhead-Ribozym konstruieren und somit
beispielsweise zelluläre
mRNA oder virale RNA inhibieren. Weitere katalytische Nukleinsäuren vom DNA-Typ
(z.B. DNAzyme) sind analog einsetzbar.
RNAi ("RNA interference") ist eine neue Methodik, die eine spezifische
Geninhibition von Zielmolekülen
auf mRNA-Ebene ermöglicht.
Hierfür
müssen
doppelsträngige
RNA-Moleküle
(„small
interference RNA", siRNA)
mit ihren zwei Nukleotiden langen 3'-Überhängen, bestehend
bevorzugt aus Thymidin-Nukleotiden, in Zellen transfiziert werden.
Zunächst
erfolgt eine Assoziation der siRNA-Konstrukte mit spezifischen zellulären Proteinen,
gefolgt durch die Erkennung der Ziel-mRNA-Sequenz aufgrund der Komplementarität des AS-si-RNA-Stranges.
Die intrinsische Endonukleaseaktivität des Ribonukleoproteinkomplexes
ermöglicht
eine spezifische Degradation der zu inhibierenden mRNA.
In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung ist das AS-ON ein PS-ON bzw. ein mit weiteren chemischen
Veränderungen
modifiziertes Nukleinsäurekonstrukt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist der Sequenzbereich der hTERT-mRNA, zu der das
Erkennungsmolekül
komplementär
ist, ausgewählt
aus der Gruppe umfassend 2183–2205,
2206–2225,
2315–2334,
2317-2336, 2324–2346,,
2331–2350
und/oder 2333–2352.
Mit diesen Sequenzbereichen ist es
vorteilhafterweise möglich,
die hTERT-Expression zu inhibieren. Durch die Inhibition können unter
anderem Krankheiten, die mit der Expression dieses Gens assoziiert
sind, unterdrückt
werden, wie zum Beispiel Tumoren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Erkennungsmolekül immobilisiert. Im Sinne der
Erfindung werden unter Immobilisierung verschiedene Verfahren und
Techniken zum Fixieren der Erkennungsmoleküle auf bestimmten Trägern verstanden.
Die Immobilisierung kann beispielsweise der Stabilisierung der Erkennungsmoleküle dienen,
wodurch diese insbesondere bei Lagerung oder bei einmaligem Batch-Ansatz
durch biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in
ihrer Aktivität
nicht reduziert oder nachteilig modifiziert werden. Durch die Immobilisierung
der Erkennungsmoleküle
ist ein wiederholter Einsatz unter technischen oder klinischen Routine-Bedingungen
möglich;
weiterhin kann die Probe mit den Erkennungsmolekülen kontinuierlich umgesetzt
werden. Dies kann insbesondere durch verschiedene Immobilisierungstechniken
erreicht werden, wobei die Bindung der Erkennungsmoleküle an andere
Erkennungsmoleküle
oder Moleküle
bzw. an einen Träger
so erfolgt, dass die dreidimensionale Struktur am aktiven Zentrum
der entsprechenden Moleküle,
insbesondere der Erkennungsmoleküle,
nicht verändert
wird. Vorteilhafterweise geht die Spezifität zu hTERT und die Spezifität der eigentlichen
Bindungsreaktion durch die Immobilisierung nicht verloren. Im Sinne
der Erfindung können
drei grundsätzliche
Methoden zur Immobilisierung verwendet werden:
- (i)
Quervernetzung: Bei der Quervernetzung werden die Erkennungsmoleküle miteinander
fixiert, ohne dass ihre Aktivität
nachteilig beeinflusst wird. Sie sind vorteilhafterweise durch die
Quervernetzung nicht mehr löslich.
- (ii) Bindung an einen Träger:
Die Bindung an einen Träger
erfolgt zum Beispiel durch Adsorption, Ionenbindung oder kovalente
Bindung. Dies kann auch innerhalb von mikrobiellen Zellen bzw. Liposomen
oder anderen membranhaltigen geschlossenen bzw. offenen Strukturen
erfolgen. Das Erkennungsmolekül
wird durch die Fixierung vorteilhafterweise nicht in seiner Aktivität beeinflusst.
Es kann mit Vorteil zum Beispiel in der Klinik in Diagnose oder
Therapie trägergebunden
mehrfach oder kontinuierlich eingesetzt werden.
- (iii) Einschluss: Der Einschluss erfolgt im Sinne der Erfindung
insbesondere in eine semipermeable Membran in Form von Gelen, Fibrillen
oder Fasern. Gekapselte Erkennungsmoleküle sind durch eine semipermeable
Membran so durch die umgebende Probenlösung getrennt, dass sie vorteilhafterweise
noch mit der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase oder
mit Fragmenten dieser interagieren können.
Für
die Immobilisierung stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, wie
beispielsweise die Adsorption an einen inerten oder elektrisch geladenen
anorganischen oder organischen Träger. Solche Träger können beispielsweise
poröse
Gele, Aluminiumoxid, Betonid, Agarose, Stärke, Nylon oder Polyacrylamid
sein. Die Immobilisierung erfolgt hierbei durch physikalische Bindungskräfte, oft
unter Beteiligung von hydrophoben Wechselwirkungen und ionischen
Bindungen. Derartige Methoden sind vorteilhafterweise einfach zu
handhaben und sie beeinflussen die Konformation der Erkennungsmoleküle nur in
geringem Umfang. Durch elektrostatische Bindungskräfte zwischen
den geladenen Gruppen der Erkennungsmoleküle und dem Träger kann
die Bindung vorteilhafterweise verbessert werden, zum Beispiel durch
die Verwendung von Ionenaustauschern, wie zum Beispiel Sephadex.
Ein weiteres Verfahren ist die kovalente Bindung an Trägermaterialien.
Die Träger
können dazu
reaktive Gruppen aufweisen, die mit Aminosäure-Seitenketten homöopolare
Bindungen eingehen. Geeignete Gruppen in Erkennungsmolekülen sind
Carboxy-, Hydroxy- und Sulfidgruppen und insbesondere die endständigen Aminogruppen
von Lysinen. Aromatische Gruppen bieten die Möglichkeit für Diazo-Kupplungen. Die Oberfläche von
mikroskopischen porösen
Glaspartikeln kann durch Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit
Erkennungsmolekülen
besetzt werden. Hydroxy-Gruppen natürlicher Polymere können zum Beispiel
mit Bromzyan aktiviert und anschließend mit Erkennungsmolekülen gekoppelt
werden. Mit Polyacrylamid-Harzen können zahlreiche Erkennungsmoleküle vorteilhafterweise
direkte kovalente Bindungen eingehen. Bei dem Einschluss in dreidimensionale
Netzwerke werden die Erkennungsmoleküle in ionotrophe Gele oder
andere dem Fachmann bekannte Strukturen eingeschlossen. Die Poren
der Matrix sind insbesondere so beschaffen, dass die Erkennungsmoleküle zurückgehalten
werden und eine Interaktion mit den Ziel-Molekülen möglich ist. Bei der Quervernetzung
werden die Erkennungsmoleküle
durch Vernetzung mit bifunktionellen Agenzien in polymere Aggregate
umgewandelt. Derartige Strukturen sind gelatinös und leicht verformbar und insbesondere
für den
Einsatz in verschiedenen Reaktoren geeignet. Durch Zugabe anderer
inaktiver Komponenten, wie zum Beispiel Gelatine, bei der Vernetzung
können
die mechanischen und enzymatischen Eigenschaften vorteilhafterweise
verbessert werden. Bei der Mikroverkapselung wird der Reaktionsraum
der Erkennungsmoleküle
mit Hilfe von Membranen eingegrenzt. Die Mikroverkapselung kann
zum Beispiel als Grenzflächen-Polymerisation durchgeführt werden.
Durch die Immobilisierung bei der Mikroverkapselung werden die Erkennungsmoleküle unlöslich und
dadurch wiederverwendbar. Im Sinne der Erfindung sind immobilisierte
Erkennungsmoleküle
alle Erkennungsmoleküle,
die sich in einem Zustand befinden, der ihre Wiederverwendung erlaubt.
Die Einschränkung
der Beweglichkeit und der Löslichkeit
der Erkennungsmoleküle
auf chemischem, biologischem oder physikalischem Wege führt vorteilhafterweise
zu niedrigen Verfahrenskosten.
Die Erfindung betrifft auch eine
pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, gegebenenfalls
in einer Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger.
Dieser pharmazeutische Träger
kann insbesondere zusätzliche
Stoffe und Substanzen, wie beispielsweise medizinische und/oder
pharmazeutisch-technische Hilfsstoffe, umfassen. Medizinische Hilfsstoffe
sind beispielsweise solche Stoffe, die zur Produktion als Ingredienzien
von pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden. Pharmazeutisch-technische Hilfsstoffe
dienen der geeigneten Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung
oder des Arzneimittels und können
sogar – sofern
sie nur während
des Herstellungsverfahrens benötigt
werden – anschließend entfernt
werden oder können
als pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanzen
Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Die pharmazeutische
Zusammensetzung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem
pharmazeutisch verträglichen
Verdünnungsmittel.
Hierbei kann es sich beispielsweise um phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Wasser,
Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene
Arten von Detergenzien, sterile Lösungen und ähnliches handeln. Die Verabreichung
der pharmazeutischen Zusammensetzung kann beispielsweise im Zusammenhang
mit einer Gentherapie geschehen.
Im Sinne der Erfindung ist eine Gentherapie
eine Behandlungsform unter Einsatz von natürlichen oder rekombinant veränderten
Nukleinsäure-Konstrukten,
einzelner Gensequenzen oder ganzer Gen- bzw. Chomosomenabschnitte
bzw. kodierter Transkriptbereiche, deren Derivate/ Modifizierungen
mit dem Ziel einer biologisch-basierten und selektiven Hemmung bzw.
Revertierung der Krankheitssymptome und/oder deren kausalen Ursachen,
wobei im speziellen Fall darunter die Inhibition eines im Verlauf
einer Krankheit überexprimierten Zielmoleküls auf Ebene
der Nukleinsäuren,
insbesondere auf der Transkriptebene, verstanden wird.
Die Gentherapie kann beispielsweise
auch über
geeignete Vektoren, wie beispielsweise virale Vektoren oder/und
eine Komplexierung mit Lipiden oder Dendrimeren erfolgen. Die Gentherapie
kann insbesondere auch über
die Verpackung in Proteinhüllen
erfolgen. Weiterhin ist es möglich,
dass das Erkennungsmolekül
mit einem weiteren Molekül
fusioniert oder komplexiert ist, welches den gerichteten Transport
zum Zielort, die Aufnahme in und/oder die Verteilung innerhalb der
Zielzelle unterstützt.
Die Art der Dosierung und des Verabreichungsweges kann vom behandelnden
Arzt entsprechend den klinischen Anforderungen bestimmt werden.
Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen
Faktoren abhängig
ist, wie beispielsweise der Größe, der
Körperoberfläche, dem
Alter, dem Geschlecht oder dem allgemeinen und krankheitsspezifischen
Gesundheitszustand des Patienten, aber auch von dem speziellen Mittel,
welches verabreicht wird, der Dauer und Art der Verabreichung und
von anderen Medikamenten, die möglicherweise
parallel, insbesondere in einer Kombinationstherapie, verabreicht
werden.
Die Erfindung betrifft auch einen
Kit umfassend das Erkennungsmolekül und/oder die pharmazeutische
Zusammensetzung. Weiterhin betrifft die Erfindung auch ein Array
umfassend das Erkennungsmolekül und/oder
die pharmazeutische Zusammensetzung. Der Kit und der Array können zur
Diagnose und/oder Therapie von Krankheiten eingesetzt werden, die
mit der Funktion der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase
assoziiert sind. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des
Erkennungsmoleküls,
des Kits, des Arrays zur Diagnose, Prophylaxe, Verminderung, Therapie,
Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung von mit Zellwachstum,
-differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehenden Krankheiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang
stehende Krankheit ein Tumor. Besonders bevorzugt ist der Tumor
ein solider Tumor und/oder ein Blut- oder Lymphdrüsenkrebs.
Insbesondere kann es sich bei den
Tumoren, die epithelialen oder mesodermalen Ursprungs sein können, im
Sinne der Erfindung um gut- oder bösartige Krebsarten der Organe
der Lunge, der Prostata, der Harnblase, der Niere, der Speiseröhre, des
Magens, der Bauchspeicheldrüse
(Pankreas), des Hirns, des Ovars, des Skelettsystems handeln, wobei
besonders das Adenokarzinom der Brust, der Prostata, der Lunge und
des Darms, Knochenmarkkrebs, das Melanom, das Hepatom, die Kopf-Hals-Tumoren
explizit als Vertreter bösartiger
(so genannte maligne) Tumoren bevorzugt sind. Zur Gruppe der Blut-
und Lymphdrüsenkrebsarten
werden im Sinne der Erfindung alle Formen, von Leukämien (z.B.
in Zusammenhang mit B-Zellen-Leukämie, Gemischt-Zellen-Leukämie, Nullzellen-Leukämie, T-Zellen-Leukämie, chronische
T-Zellen-Leukämie,
HTLV-II-assoziierte Leukämie,
akute lymphatische Leukämie,
chronisch-lymphatische Leukämie,
Mastzell-Leukämie
und myeloische Leukämie)
und Lymphomen gezählt.
Beispiele von mesenchymalen bösartigen
Tumoren (sogenannte Knochen- und Weichteilsarkome) sind:
Fibrosarkom;
das maligne Histiozytom; das Liposarkom; Hämangiosarkom; das Chondrosarkom
und das Osteosarkom; Ewing-Sarkom; das Leio- und Rhabdomyosarkom,
das Synovialsarkom; Karzinosarkom,. Als weitere Tumorarten, die
im Sinne der Erfindung auch unter dem Begriff „Neoplasmen" zusammengefasst
werden, sind bevorzugt: Knochen-Neoplasmen, Brust-Neoplasmen, Neoplasmen
des Verdauungssystems, colorektale Neoplasmen, Leber-Neoplasmen,
Pankreas-Neoplasmen,
Hirnanhang-Neoplasmen, Hoden-Neoplasmen, Orbita-Neoplasmen, Neoplasmen
des Kopfes und Halses, des Zentralnervensystems, Neoplasmen des
Hörorgans,
des Beckens, des Atmungstrakts und des Urogenitaltrakts).
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist die Krebserkrankung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert
wird, ausgewählt
aus der Gruppe: Tumoren des Hals-Nasen-Ohren-Bereichs umfassend Tumoren
der inneren Nase, der Nasennebenhöhlen, des Nasopharynx, der
Lippen, der Mundhöhle,
des Oropharynx, des Larynx, des Hypopharynx, des Ohres, der Speicheldrüsen und
Paragangliome, Tumoren der Lunge umfassend nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome,
kleinzellige Bronchialkarzinome, Tumoren des Mediastinums, Tumoren
des Gastrointestinaltraktes umfassend Tumoren des Ösophagus,
des Magens, des Pankreas, der Leber, der Gallenblase und der Gallenwege,
des Dünndarms,
Kolon- und Rektumkarzinome und Analkarzinome, Urogenitaltumoren
umfassend Tumoren der Nieren, der Harnleiter, der Blase, der Prostata, der
Harnröhre,
des Penis und der Hoden, gynäkologische
Tumoren umfassend Tumoren der Zervix, der Vagina, der Vulva, Korpuskarzinom,
maligne Trophoblastenerkrankung, Ovarialkarzinom, Tumoren des Eileiters (Tuba
Faloppii), Tumoren der Bauchhöhle,
Mammakarzinome, Tumoren endokriner Organe umfassend Tumoren der
Schilddrüse,
der Nebenschilddrüse,
der Nebennierenrinde, endokrine Pankreastumoren, Karzinoidtumoren
und Karzinoidsyndrom, multiple endokrine Neoplasien, Knochen- und
Weichteilsarkome, Mesotheliome, Hauttumoren, Melanome umfassend
kutane und intraokulare Melanome, Tumoren des zentralen Nervensystems,
Tumoren im Kindesalter umfassend Retinoblastom, Wilms Tumor, Neurofibromatose,
Neuroblastom, Ewing-Sarkom-Tumorfamilie, Rhabdomyosarkom, Lymphome
umfassend Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, primäre Lymphome
des zentralen Nervensystems, Morbus Hodgkin, Leukämien umfassend akute
Leukämien,
chronische myeloische und lymphatische Leukämien, Plasmazell-Neoplasmen,
myelodysplastische Syndrome, paraneoplastische Syndrome, Metastasen
ohne bekannten Primärtumor
(CUP-Syndrom), peritoneale Karzinomastose, Immunsuppression-bedingte
Malignität
umfassend AIDS-bezogene Malignitäten
wie Kaposi-Sarkom, AIDS-assoziierte Lymphome, AIDS-assoziierte Lymphome
des zentralen Nervensystems, AIDS-assoziierten Morbus Hodgkin und
AIDS-assoziierte anogenitale Tumoren, Transplantationsbedingte Malignitäten, metastasierte
Tumoren umfassend Gehirnmetastasen, Lungenmetastasen, Lebermetastasen,
Knochenmetastasen, pleurale und perikardiale Metastasen und maligne
Aszites.
In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung handelt es sich bei dem soliden Tumor um einen Tumor
des Urogenitaltraktes und/oder des Gastrointestinaltraktes.
In einer weiteren besonders bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung ist vorgesehen, dass der Tumor ein Kolonkarzinom,
ein Magenkarzinom, ein Pankreaskarzinom, ein Dickdarmkrebs, ein
Dünndarmkrebs, ein
Ovarialkarzinom, ein Zervikalkarzinom, ein Lungenkrebs, ein Nierenzellkarzinom,
ein Hirntumor, ein Kopf-Halstumor, ein Leberkarzinom und/oder eine
Metastase dieser Tumoren/Karzinome ist.
In einer weiteren besonders bevorzugten
Ausführungsform
ist der solide Tumor ein Mamma-, Bronchial- Kolorektal- und/oder Prostatakarzinom.
In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführungsform
ist der Tumor des Urogenitaltraktes ein Harnblasenkarzinom (BCa).
Das BCa stellt in der Bundesrepublik Deutschland die vierthäufigste
Krebsform und siebthäufigste
Krebstodesursache bei Männern
dar. Die TUR-B als generelle Primärtherapie des BCa erlaubt eine
organerhaltende Entfernung von oberflächlichen Tumoren. Trotz dieser
histopathologisch definierten vollständigen Entfernung des Tumors
ist mit 50–70
% der Patienten ein relativ hoher Anteil innerhalb von zwei Jahren
von einem Rezidiv betroffen [Stein et al.]. Ein Diagnose- sowie
Therapieproblem stellt das synchrone oder metachrone multifokale
Auftreten von Tumorherden dar, wodurch das Auftreten von Rezidiven
entfernt von der resezierten Primärtumorlokalisation bedingt
sein kann [Sidransky et al.]. Bei Auftreten eines Rezidivs oder
bei primär
als oberflächlich
eingestuften Tumoren erfolgt in der Regel nach der TUR-B eine Langzeitprophylaxe mit
einem Immun- (Bazillus
Calmette-Guerin – BCG)
oder Chemotherapeutikum (z. B. Mitomycin-C, Taxol, Gemcitabin/Cisplatin).
Patienten mit muskelinvasiven BCa und mit entdifferenzierten, oberflächlichen
Tumoren, die trotz dieser Therapie rezidivieren, werden in der Regel
radikal zystektomiert bzw. unter Erhalt der Blase mittels Mono-/Polychemo-,
Immun- oder Strahlentherapie bzw. Kombinationsverfahren dieser Methoden
behandelt. Chemo-, Immun- oder Strahlenbehandlungen sind aufgrund
ihrer relativ unspezifischen Wirkmechanismen von einer hohen therapieinduzierten
Toxizität
begleitet.
Aufgrund der gesundheitspolitischen
Bedeutung des BCa (insbesondere in den westlichen Industrieländern),
dem Fehlen tumorspezifischer Marker sowie der bekannten tumorbiologischen
und zellulären
Heterogenität
des Tumors gibt es eine intensive Suche auf dem klinischen Forschungsgebiet
zum BCa, die insbesondere auf die Identifizierung neuer oder/und
ergänzender
Therapieoptionen zielen.
In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung werden das Erkennungsmolekül, die pharmazeutische Zusammensetzung,
der Kit und/oder der Array für
eine Verlaufskontrolle verwendet, die im Wesentlichen eine Überwachung
der Wirksamkeit einer Antitumorbehandlung darstellt. Weiterhin ist
es bevorzugt, dass das Erkennungsmolekül in einer Kombinationstherapie,
insbesondere zur Behandlung von Tumoren, verwendet wird. Besonders
bevorzugt ist hierbei, dass die Kombinationstherapie eine Chemotherapie,
eine Zytostatikabehandlung und/oder eine Strahlentherapie umfasst.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist
die Kombinationstherapie eine adjuvante biologisch-spezifizierte
Therapieform. Ganz besonders bevorzugt ist hierbei, dass diese Therapieform
eine Immuntherapie ist. Weiterhin ist besonders bevorzugt, dass
die Kombinationstherapie eine Gentherapie und/oder eine Therapie
mit einem Erkennungsmolekül
gegen dasselbe oder ein anderes Zielmolekül umfasst. Dem Fachmann sind
verschiedene Kombinationstherapien, insbesondere zur Behandlung
von Tumoren, bekannt. Es kann zum Beispiel vorgesehen sein, dass
innerhalb einer Kombinationstherapie eine Zytostatikabehandlung
erfolgt oder beispielsweise eine Bestrahlung eines bestimmten Tumorareals,
wobei diese Behandlung mit einer Gentherapie kombiniert wird, wobei
das erfindungsgemäße Erkennungsmolekül als Antikrebsmittel
eingesetzt wird. Das erfindungsgemäße Erkennungsmolekül kann jedoch
auch in Kombination mit anderen Erkennungsmolekülen eingesetzt werden. Demgemäß kann es
ganz besonders bevorzugt sein, dass das Erkennungsmolekül zur Erhöhung der
Sensitivität
von Tumorzellen gegenüber
Zytostatika und/oder Strahlen verwendet wird. Weiterhin ist es bevorzugt,
dass das Erkennungsmolekül
zur Hemmung der Vitalität,
der Proliferationsrate von Zellen und/oder zur Induktion von Apoptose
und eines Zellzyklus-Arrests verwendet wird.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand
eines Beispiels näher
erläutert
werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu sein.
Beispiel
Die gut transfizierbare humane Harnblasenkarzinom-Zelllinie
EJ28 zeigte nach Transfektion insbesondere bei Verwendung von fünf spezifischen
anti-hTERT-AS-Konstrukten (vgl. Tab. 2) eine unmittelbar einsetzende
und kontinuierliche Reduktion ihrer Viabilität um mehr als 65 % gegenüber der
Nonsense (N5)-Kontrolle (vgl. 2).
Dabei war die Beobachtung besonders auffällig, dass vier der wirksamsten
Konstrukte gegen ein einzelnes mRNA-Sequenzmotiv gerichtet waren.
Bereits nach vier von fünf Behandlungen
mit dem Konstrukt AStel2331-50 waren nahezu keine lebenden Zellen
mehr im Kulturgefäß nachweisbar.
Die Behandlung telomerasenegativer humaner Fibroblasten führte hingegen
zu keinen signifikanten Unterschieden zwischen AS- und NS-ON-behandelten Zellen,
was eine Spezifität
der AS-O-N-Wirkung auf die BCa-Zelllinie EJ28 indirekt belegt (Daten
nicht gezeigt). Die AS-spezifische Wirksamkeit wurde anschließend detailliert
untersucht: in Übereinstimmung
mit dem Viabilitätstest
konnte in Bezug auf das Proliferations- und Zellkoloniebildungsverhalten
(4) ein Hemmeffekt dieser
fünf AS-ON
belegt werden. Zudem konnte die AS-spezifische Verringerung des
Zellanteils in der DNA-Synthesephase (bis ca. 30 %) in Richtung
einer G1-Arretierung nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
Der Beweis für
die AS- spezifische
Wirkung der gegen die Zielmotive gerichteten AS-ON wurde in Form
einer signifikanten und zeitabhängigen
Reduktion der hTERT-Transkriptmenge erbracht (3). In Übereinstimmung damit wurde
auch die hTERT-Proteinexpression
reprimiert. Außerdem
wurde als Folge davon die Telomeraseaktivität der EJ28-Zellen um mehr als
60 % gehemmt (Daten nicht gezeigt).
Tab.
2 hTERT-AS- und NS-ON: Nukleotid- und Zielsequenzen
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