EP1573008A2 - Gegen htert gerichtete polynucleotide und die verwendung dieser - Google Patents

Gegen htert gerichtete polynucleotide und die verwendung dieser

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EP1573008A2
EP1573008A2 EP03785567A EP03785567A EP1573008A2 EP 1573008 A2 EP1573008 A2 EP 1573008A2 EP 03785567 A EP03785567 A EP 03785567A EP 03785567 A EP03785567 A EP 03785567A EP 1573008 A2 EP1573008 A2 EP 1573008A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
polynucleotide
tumor
therapy
use according
carcinoma
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03785567A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Schwenzer
Uta Schmidt
Manfred P. Wirth
Kai KRÄMER
Susanne FÜSSEL
Axel Meye
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Dresden
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10306084A external-priority patent/DE10306084A1/de
Application filed by Technische Universitaet Dresden filed Critical Technische Universitaet Dresden
Publication of EP1573008A2 publication Critical patent/EP1573008A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)

Definitions

  • the present invention relates to polynucleotides which are directed against a gene of a catalytic subunit of human telomerase (hTERT) and to the use of these polynucleotides for the diagnosis, prophylaxis, treatment, monitoring of diseases associated with cell growth, differentiation and / or division , such as tumor diseases.
  • hTERT human telomerase
  • telomeres Chromosome ends are responsible, among other things, for controlling the ability of proliferation and thus for the aging of cells [Harley]. The structure of these telomeres has been studied in numerous living systems.
  • RNA component hTR
  • hTERT catalytic subunit
  • telomere activity was detected in immortalized cell lines and in> 85% of the tumors examined [Kim et al. ]. This correlates with the expression of the hTERT component, as has been shown in bladder cancer [Ito et al. ]. There is also a connection between the level of hTERT expression in bladder carcinoma and the clinical course of the tumor disease (de Kok et al.). Therefore, human telomerase is an ideal target for the diagnosis and treatment of human diseases associated with cellular proliferation. such as cancer, methods for diagnosing and treating cancer and other diseases associated with telomerase are disclosed, inter alia, in US 5,489,508 or US 5,645,986.
  • telomere activity has been shown as a specific way to therapeutically control tumor cells described. Important efforts to modify the activity of telomerase in the context of cancer are disclosed in EP 666313, WO 97/37691, WO 99/50279, US 2002/0045588 AI or WO 98/28442. Such general teachings do not reveal to the skilled person specific teachings on technical action.
  • a substance or a molecule that interacts with the entire sequence region coding for hTERT leads to a reduction in the corresponding telomerase activity, for example in a cell culture, but such substances are not suitable for application in organisms, since they usually are much too large and are attacked and destroyed by the immune system of the organism in question. In addition, a large number of undesirable interactions or side effects can occur. It was therefore an object of the invention to provide alternative compact molecules which have a simple and effective inhibitory interaction with selected, specific structural units which encode the telomerase.
  • hTERT is directed, wherein the polynucleotide specifically interacts with primary structures of this hTERT mRNA in two target sequence regions from 2176 to 2250 and 2296 to 2393 according to the gene database entry AF 015950.
  • the numbers represent - also in the following sections - the corresponding nucleotide positions within the hTERT mRNA (total length 4015 nucleotides).
  • the invention thus relates to the surprising teaching that against tumor-associated abnormal hTERT-mRJ-IA expression onsmus ⁇ -.er suw-.e telomerase activity levels by a possible hTER inhibition with the polynucleotides according to the invention.
  • polynucleotides are directed against defined hTERT mRNA sequence motifs in the range from 2000 to 2500. They can be biological and / or chemical structures that are able to interact with the target sequence area in such a way that a specific recognition / binding and interaction can be determined. Examples of polynucleotides can in particular be nucleic acid constructs and their derivatives. Of course, it is also possible to use other recognition molecules instead of or in combination with the polynucleotides, such as, for. B. antibodies, lectins, affilines, aptamers, chelators and others.
  • the polynucleotide specifically interacts with two target sequence regions 2176 to 2250 and 2296 to 2393.
  • particularly efficient hTERT inhibition is possible in these sequence regions.
  • shorter areas with changes within these target sequences or with changed edge areas or different derivatizations / modifications / fusions / complexations which can also be combined and / or coupled with other recognition molecules such as polynucleotides.
  • target sequence regions make it possible for the person skilled in the art to provide, in particular, very small and / or compact polynucleotides that essentially do not interact with other structures, in particular immunological defense structures, within the cell tissue or the organism or are attacked by them, but rather can specifically interact with the target sequence region of the hTERT mRNA.
  • the sequence region or the recognition molecule in particular the polynucleotide, is modified by addition, amplification, inversion, missense mutation, nonsense mutation, point mutation, deletion and / or substitution.
  • modifications can, for example, result in the polynucleotide binding to the mRNA of the hTERT catalytic subunit with a higher avidity or specificity.
  • the polynucleotide binds with less specificity or avidity.
  • the mutations in the hTERT sequence region can be, for example, inheritable or non-inheritable changes.
  • the modifications can be such that they can be detected directly at the RNA level or at the DNA level.
  • the mutations can also include, for example, mutations in connection with a cytologically visible genome and / or chromosome mutations which are associated with changes in hTERT. Such mutations can arise from the fact that parts of the chromosome are lost, doubled, have the opposite orientation or are transferred to other chromosomes.
  • the mutation is only one or a few neighboring base pairs, as is the case with point mutation, for example. If, for example, a base pair is lost in the form of a deletion or if a base pair is additionally inserted, as in the insertion, the reading frame of the gene concerned shifts to a reading frame mutation.
  • substitution mutation in the sense of the invention, for example, one base is exchanged for another, the consequences resulting therefrom being different:
  • a codon can be converted into a synonymous codon
  • the mutation ends the translation at a specific point, and the hTERT fragments formed can be inactive or active.
  • the polynucleotide is a nucleic acid construct.
  • Nucleic acid constructs in the sense of the invention can be all structures which are essentially based on nucleic acids or whose active center is essentially based on nucleic acids.
  • the polynucleotide can be part of complexes or formulations consisting of lipids, carbohydrates or proteins or peptides, for example in the form of a nanocapsule. This complex or formulation comprises an area which contains nucleic acids which can interact with hTERT.
  • the specialist Various ways are known to provide such constructs.
  • the nucleic acid construct is an antisense (AS) oligonucleotide (ON), a DNAzyme, a ribozyme, an siRNA and / or a peptide nucleic acid (PNA).
  • AS antisense
  • ON oligonucleotide
  • PNA peptide nucleic acid
  • AS constructs are synthetically produced molecules that enable selective inhibition of the biosynthesis of selected proteins. For example, ON, PNAs, ribozymes, DNAzymes are used.
  • the AS effect is based on the sequence-specific hybridization of the ' constructs by Watson-Crick base pairing with the target mRNA coding for the protein to be repressed, which leads to the prevention of protein synthesis via various mechanisms (Table 1).
  • Tab. 1 AS effects and their mechanisms of action ss - "Single stranded" (single strand)
  • AS-ON as therapeutic substances represents, in addition to various other application fields, a new promising therapy concept for oncological diseases [Tamm et al. ]. While conventional chemotherapy leads to non-specific inhibition of cell proliferation, AS therapy specifically inactivates those mRNAs that represent the molecular basis or an essential component of the degenerate, deregulated growth and tumor progression, and for the inhibition of the body's immune defense can be responsible.
  • AS-ON differ from other therapeutic agents, such as antibodies, toxins or immunotoxins, in that they are relatively small molecules with a molecular weight of usually about 5 kDa.
  • the small size of the AS-ON enables good tissue penetration.
  • tumor blood vessels in contrast to blood vessels of normal tissue, are permeable to substances in a size range between 4-10 kDa. This means that therapeutic AS-ON can specifically penetrate tumor blood vessels.
  • Another advantage of these substances for example compared to antibodies that are almost exclusively active against extracellular proteins, is that, in principle, all proteins, both cytoplasmic and nucleus-localized as well as membrane-bound proteins, can be attacked via the respective target mRNA.
  • the phosporthioat-AS-ON which is relatively resistant to a nuclease attack, is currently being evaluated in a number of clinical studies (phase I-III) with regard to its potential as anti-cancer therapeutics.
  • Target mRNA molecules that are overexpressed in tumors are attacked.
  • non-AS phosphothioate-ON
  • a partial terminal modification of ON constructs offers increased stability in the extra- and intracellular milieu of the target cells (protection against degradation by exonucleases), especially when applied in vivo.
  • a positive side effect that has been observed when using PS-ON is its immunostimulatory effect, which can support possible therapeutic success in some tumor applications.
  • ribozymes As catalytically active RNA molecules, ribozymes are able to recognize cellular RNA structures as substrates and cleave them sequence-specifically at a phosphorus diester bond. The detection takes place via AS arms, which enable hybridization with the target mRNA due to complementary sequences. Compared to AS-ON, ribozymes have the fundamental advantage that a ribozyme molecule as a real catalyst has a large number of identical ones
  • Ribozymes are already there effective in much lower concentration than ON and also lead to irreversible RNA degradation due to substrate cleavage [Sun et al. ].
  • the hammerhead ribozyme (review: Birikh et al., 1997; Tanner, 1999) is particularly interesting for such applications because it can already be catalytically active as a comparatively small molecule (approx. 30-50 nucleotides).
  • a very effective trans-cleaving hammerhead ribozyme consists, for example, of only 14 conserved nucleotides in the catalytic domain and two variable stem sequences (advantageously each of 6-8 nucleotides), which by Watson-Crick base pairing (analogous to AS-ON) Realize sequence-specific recognition of the substrate to be cleaved and then inactivate it by cleaving a phosphorus diester bond.
  • a specific cleaving hammerhead ribozyme can be constructed against practically any RNA molecule that has a potential cleavage site with the minimal sequence requirement -NUX- and thus, for example, inhibit cellular mRNA or viral RNA.
  • Other catalytic nucleic acids from DNA-yp e.g. DNAzyme
  • DNAzyme can be used analogously.
  • RNAi RNA interference
  • siRNA small interference RNA
  • the ' siRNA constructs are associated with specific cellular proteins, followed by the recognition of the target mRNA sequence due to the complementarity of the AS-si RNA strand.
  • the intrinsic endonuclease activity of the ribonucleoprotein complex enables a specific degradation of the mRNA to be inhibited.
  • the AS-ON is a PS-ON or a nucleic acid construct modified with further chemical changes.
  • sequence region of the hTERT mRNA to which the polynucleotide is complementary is selected from the group comprising 2183-2205, 2206-2225, 2315-2334, 2317-2336, 2324-2346, 2331-2350 and / or 2333-2352.
  • Inhibition can be suppressed, among other diseases, such as tumors associated with the expression of this gene.
  • the polynucleotide is immobilized.
  • immobilization is understood to mean various methods and techniques for fixing the polynucleotides on specific supports.
  • the immobilization can be used, for example, to stabilize the polynucleotides, as a result of which they are used in particular during storage or with a single batch approach are not reduced by ⁇ biological, chemical or physical agents in their activity or adversely modified.
  • the immobilization of the polynucleotides enables repeated use under routine technical or clinical conditions; furthermore, the sample can be continuously reacted with the polynucleotides.
  • Polynucleotides are fixed together without their activity being adversely affected. As a result of the crosslinking, they are advantageously no longer soluble.
  • Binding to a carrier takes place, for example, by adsorption, ion binding or covalent binding. This can also take place within microbial cells or liposomes or other membrane-containing closed or open structures.
  • the polynucleotide is by fixation advantageously not influenced in its activity. It can advantageously be used multiple times or continuously, for example in the clinic, for diagnosis or therapy in a vehicle-bound manner.
  • inclusion takes place in the sense of the invention in particular in a semipermeable membrane in the form of gels, fibrils or fibers. Encapsulated polynucleotides are separated by a semipermeable membrane from the surrounding sample solution in such a way that they can advantageously still interact with the catalytic subunit of human telomerase or with fragments thereof.
  • immobilization such as. for example, adsorption on an inert or electrically charged inorganic or organic carrier.
  • Such carriers can be, for example, porous gels, aluminum oxide, concrete, agarose, starch, nylon or polyacrylamide.
  • the immobilization takes place here through physical binding forces, often with the participation of hydrophobic interactions and ionic bonds.
  • Such methods are advantageously easy to use and they influence the conformation of the polynucleotides only to a small extent.
  • the binding can advantageously be improved by electrostatic binding forces between the charged groups of the polynucleotides and the carrier, for example by using ion exchangers such as Sephadex.
  • Another method is covalent binding to carrier materials.
  • the carriers can be reactive Have groups that form homopolar bonds with amino acid side chains.
  • Suitable groups in polynucleotides are carboxy, hydroxyl and sulfide groups and in particular the terminal amino groups of lysines.
  • Aromatic groups offer the possibility of diazo couplings.
  • the surface of microscopic porous glass particles can be activated by treatment with silanes and then populated with polynucleotides. Hydroxy groups of natural polymers can be activated with bromocyan, for example, and then coupled with polynucleotides. Numerous polynucleotides can advantageously form direct covalent bonds with polyacrylamide resins.
  • the polynucleotides When enclosed in three-dimensional networks, the polynucleotides are enclosed in ionotrophic gels or other structures known to the person skilled in the art.
  • the pores of the matrix are in particular such that the polynucleotides are retained and an interaction with the target molecules is possible.
  • cross-linking the polynucleotides are cross-linked with bifunctional ones
  • Agents converted into polymeric aggregates are gelatinous and easily deformable and are particularly suitable for use in various reactors.
  • the mechanical and enzymatic properties can advantageously be improved by adding other inactive components, such as, for example, gelatin, during the crosslinking.
  • the reaction space of the polynucleotides is limited using membranes.
  • the microencapsulation can be carried out, for example, as an interfacial polymerization.
  • immobilized recognition molecules in particular polynucleotides, are all recognition molecules or polynucleotides which are in a state which permits their reuse.
  • the restriction of the mobility and the solubility of the polynucleotides by chemical, biological or physical means advantageously leads to low process costs.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the polynucleotides according to the invention, optionally in a combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • This pharmaceutical carrier can in particular comprise additional substances and substances, such as medical and / or pharmaceutical-technical auxiliaries.
  • Medical auxiliaries are, for example, those substances which are used for production as ingredients of pharmaceutical compositions.
  • Pharmaceutical-technical auxiliaries are used for the suitable formulation of the pharmaceutical composition or the medicament and can even - if they are only required during the production process - be subsequently removed or can be part of the pharmaceutical composition as pharmaceutically acceptable carrier substances.
  • the pharmaceutical composition is optionally in combination with a pharmaceutically acceptable diluent. This can be, for example, phosphate-buffered saline,
  • Water, emulsions such as oil / water Emulsions, various types of detergents, sterile solutions and the like act.
  • the pharmaceutical composition can be administered, for example, in connection with gene therapy.
  • gene therapy is a form of treatment using natural or recombinantly modified nucleic acid constructs, individual gene sequences or entire gene or chromosome sections or coded transcript areas, their derivatives / modifications with the aim of biologically-based and selective inhibition or Reverting the disease symptoms and / or their causal causes, which in the special case means the inhibition of a target molecule overexpressed in the course of a disease at the nucleic acid level, in particular at the transcript level.
  • Gene therapy can also be carried out, for example, using suitable vectors, such as, for example, viral vectors and / or complexing with lipids or dendrimers.
  • gene therapy can also take place via packaging in protein casings.
  • the polynucleotide it is possible for the polynucleotide to be fused or complexed with another molecule which supports the directional transport to the target site, the uptake into and / or the distribution within the target cell.
  • the type of dosage and route of administration can be determined by the attending physician according to the clinical requirements. It is known to the person skilled in the art that the type of dosage depends on various factors, such as, for example
  • the invention also relates to a kit comprising the polynucleotide and / or the pharmaceutical composition. Furthermore, the invention also relates to an array comprising the polynucleotide and / or the pharmaceutical composition.
  • the kit and array can be used to diagnose and / or treat diseases associated with the function of the catalytic subunit of human telomerase.
  • the invention also relates to the use of the polynucleotide, the kit, the array for diagnosis, prophylaxis, reduction, therapy, follow-up and / or post-treatment of diseases related to cell growth, differentiation and / or division.
  • the disease associated with cell growth, differentiation and / or division is a tumor.
  • the tumor is particularly preferably a solid tumor and / or a
  • the tumors which may be of epithelial or mesodermal origin, can be benign or malignant types of cancer of the organs of the invention
  • the group of blood and Lymphdrüsenkrebsart of the invention are within the meaning all forms' of leukemias (for example, in connection with B cell leukemia, mixed-cell leukemia, null cell leukemia, T-cell leukemia, chronic T-cell leukemia , HTLV-II-associated leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphoblastic leukemia, mast cell leukemia and myeloid leukemia) and lymphomas.
  • mesenchymal malignant tumors are: fibrosarcoma; the malignant histiocytoma; liposarcoma; hemangiosarcoma; chondrosarcoma and osteosarcoma; Ewing's sarcoma; leio and rhabdomyosarcoma, synovial sarcoma; Carcinosarcoma.
  • tumors As further types of tumors, which are also summarized in the sense of the invention under the term “neoplasms”, preferred are: bone neoplasms, breast neoplasms, neoplasms of the digestive system, colorectal neoplasms, liver neoplasms, pancreatic neoplasms, brain appendage neoplasms, testes -Neoplasms, orbital neoplasms, neoplasms of the head and neck, central nervous system, neoplasms of the ear organ, pelvis, respiratory tract and urogenital tract).
  • neoplasms preferred are: bone neoplasms, breast neoplasms, neoplasms of the digestive system, colorectal neoplasms, liver neoplasms, pancreatic neoplasms, brain appendage neoplasms, testes -Neoplasms, orbital ne
  • the cancer or the tumor that is treated or prevented is selected from the group: tumors of Ear, nose and throat area including tumors of the inner nose, paranasal sinuses, nasopharynx, lips, oral cavity, oropharynx, larynx, hypopharynx, ear, salivary glands and paragangliomas, lung tumors including non-small cell bronchial carcinomas , small cell bronchial carcinomas, tumors of the mediastinum, tumors of the gastrointestinal tract including tumors of the esophagus, stomach, pancreas, liver, gallbladder and biliary tract, small intestine, colon and rectal carcinomas and anal cancers, urogenital kidney tumors, including tumors of the ureter, kidney tumors, including tumors the bladder, prostate, urethra, penis and testes, gynecological tumors including tumors of the cervix, vagina, vulva, carcinoma of the group: tumors of E
  • the solid tumor is a tumor of the urogenital tract and / or the gastrointestinal tract.
  • the tumor is a colon carcinoma, a gastric carcinoma, a pancreatic carcinoma, a colon cancer, a small bowel cancer, an ovarian carcinoma, a cervical carcinoma, a lung cancer, a renal cell carcinoma, a brain tumor, a head and neck tumor Liver carcinoma and / or a metastasis of these tumors / carcinomas.
  • the solid tumor is a breast, bronchial, colorectal and / or prostate carcinoma.
  • the tumor of the urogenital tract is a bladder carcinoma (BCa).
  • BCa bladder carcinoma
  • the BCa is the fourth most common form of cancer and the seventh most common cancer death in the Federal Republic of Germany.
  • TUR-B as a general primary therapy for BCa allows organ-preserving removal of superficial tumors. Despite this histopathologically defined complete removal of the tumor, a relatively high proportion of 50-70% of patients are affected by a relapse within two years [Stein et al. ].
  • a synchronous or metachronous multifocal occurrence of tumor foci represents a diagnosis and therapy problem, which may result in the occurrence of recurrences remote from the resected primary tumor location [Sidransky et al. ].
  • recurrence or tumors primarily classified as superficial, long-term prophylaxis with an immune (Bacillus Calmette-Guerin - BCG) or chemotherapeutic agent is usually carried out after TUR-B
  • the polynucleotide, the pharmaceutical composition, the kit and / or the array are used for a follow-up control, which essentially represents monitoring the effectiveness of an antitumor treatment.
  • the polynucleotide is used in a combination therapy, in particular for the treatment of tumors.
  • the combination therapy comprises chemotherapy, cytostatic treatment and / or radiation therapy.
  • the combination therapy is an adjuvant, biologically specified form of therapy. It is very particularly preferred that this form of therapy is an immunotherapy.
  • the combination therapy is a gene therapy and / or a
  • a polynucleotide against the same or a different target molecule Various combination therapies, in particular for the treatment of tumors, are known to the person skilled in the art. It can be provided, for example, that cytostatic treatment takes place within a combination therapy or, for example, radiation of a specific tumor area, this treatment being combined with gene therapy, the polynucleotide according to the invention being used as an anti-cancer agent. However, the polynucleotide according to the invention can also be used in combination with other polynucleotides can be used against the same or a different target molecule. Accordingly, it can be particularly preferred that the polynucleotide is used to increase the sensitivity of tumor cells to 'cytostatic and / or radiation. It is further preferred that the polynucleotide is used to inhibit the vitality, the proliferation rate of cells and / or to induce apoptosis and cell cycle arrest.
  • the easily transfectable human urinary bladder carcinoma line EJ28 showed, after transfection, in particular when using five specific anti-hTERT-AS constructs (cf. Table 2), an immediate and continuous reduction in their viability by more than 65% compared to that
  • Nonsense (NS) control (Fig. 2). It was particularly noticeable that four of the most effective constructs were directed against a single mRNA sequence motif.
  • BCa cell line 5637 was able to significantly increase the viability-inhibiting effect of the chemotherapeutic agent with the AS-ON constructs AStel2206 and AStel2331 Detect cisplatin in two different doses (Fig. 5).
  • the name contains the sequence area of the hTERT mRNA (Acc. No.: AF015950), to which the respective AS-ON is complementary; 2
  • the motifs depicted each contain 10 nt double-stranded RNA at the 5 'and 3'term;
  • nucleotides in bold represent the area in AS-ON. which is complementary to the actual SS region of the target motif.
  • Boiziau C Elector R, Cazenave C, Roig V, Thuong NT,
  • Crooke ST Molecular mechanisms of action of antisense drugs. Biochim Biophys Acta (1999) 1489: 31-44.
  • Greider CW, Blackburn EH Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell (1985) 43: 405-13.
  • telomerase reverse transcriptase mRNA in urothelial cell carcinomas.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Polynucleotide, die gegen ein Gen einer katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase gerichtet sind sowie die Verwendung dieser Polynucleotide zur Diagnose, Prophylaxe, Verminderung, Verlaufskontrolle von mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehenden Krankheiten, wie beispielsweise Tumorerkrankungen.

Description

Gegen hTERT gerichtete Polynucleotide und die Verwendung dieser
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Polynucleotide, die gegen ein Gen einer katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) gerichtet sind sowie die Verwendung dieser Polynucleotide zur Diagnose, Prophylaxe, Behandlung, Verlaufskontrolle von mit Zellwachstum, -dif erenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehenden Krankheiten, wie beispielsweise Tumorerkrankungen.
Es ist bekannt, dass die Replikation der Enden von eukaryotischen Chromosomen spezialisierte Zellbestandteile erfordert. Die Replikation eines linearen DNA-Stranges erfolgt in der Regel in 5' -3 ' -Richtung. Durch die Entfernung der zum äußeren 3' -Ende der chromosomalen DNA komplementären RNA-Primer, die für die Replikations- initiation essentiell sind, bleiben bei jeder Replikationsrunde die 5' -Enden neusynthetisierter DNA- Stränge unvollständig. Dadurch kommt es zu einer fortschreitenden Verkürzung der Tochterstränge bei jeder Replikationsrunde (End-Replikationsproblem) [Levy et al . ] . Diese Verkürzung an den als Telomere bezeichneten Chromosomenenden ist unter anderem für die Steuerung der Proliferationsfähigkeit und damit für die Alterung von Zellen verantwortlich [Harley] . Die Struktur dieser Telomere ist in zahlreichen lebenden Systemen untersucht .
Das Ribonukleoenzyrrf Telomerase besitzt in einer Vielzahl von Organismen die Aufgabe, die Telomere proliferierender Zellen zu verlängern und zu stabilisieren, womit das End- Replikationsproblem nivelliert wird [Greider et al . ] . Diese reverse Transkriptase besteht aus zwei essentiellen Untereinheiten: einer RNA-Komponente (hTR) und einer katalytischen Untereinheit (hTERT) [Beattie et al . ] .
Übereinstimmend mit der Beziehung zwischen Telomeren und der Telomerase sowie der Proliferationsfähigkeit der Zellen wurde in immortalisierten Zelllinien sowie in >85% der untersuchten Tumoren eine Telomerase -aktivität nachgewiesen [Kim et al . ] . Diese korreliert mit der Expression der hTERT-Komponente, wie beim Harnblasenkarzinom gezeigt wurde [Ito et al . ] . Weiterhin ist ein Zusammenhang zwischen dem hTERT-Expressionsniveau im Harnblasenkarzinom und dem klinischen Verlauf der Tumorerkrankung bekannt (de Kok et al . ] . Daher ist die humane Telomerase ein ideales Ziel für die Diagnose und Behandlung menschlicher Krankheiten, die mit zellulärer Proliferation im Zusammenhang stehen, wie beispielsweise Krebs . Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Krebs und anderen mit der Telomerase assoziierten Krankheiten sind unter anderem offenbart in der US 5 489 508 oder US 5 645 986. Die Hemmung der Telomerase wurde als spezifische Möglichkeit zur therapeutischen Kontrolle von Tumorzellen beschrieben. Wichtige Bemühungen, die Aktivität der Telomerase im Zusammenhang von Krebserkrankungen zu modifizieren, sind in der EP 666313, WO 97/37691, WO 99/50279, US 2002/0045588 AI oder der WO 98/28442 offenbart. Derartige allgemeine Lehren offenbaren dem Fachmann ' aber keine konkreten Lehren zum technischen Handeln. Eine Substanz bzw. ein Molekül, das mit dem gesamten für hTERT kodierenden Sequenzbereich wechselwirkt, führt zwar dazu, dass die entsprechende Telomeraseaktivität - beispielsweise in einer Zellkultur - reduziert wird, derartige Substanzen eignen sich aber nicht zur Applikation in Organismen, da sie in der Regel viel zu groß sind und vom Immunsystem des betreffenden Organismus angegriffen und zerstört werden. Darüber hinaus kann eine Vielzahl unerwünschter Wechselwirkungen bzw. Nebenwirkungen auftreten. Aufgabe der Erfindung war es daher, alternative kompakte Moleküle bereitzustellen, die mit ausgewählten, spezifischen Struktureinheiten, die die Telomerase kodieren, einfach und effektiv inhibierend wechselwirken.
Die Erfindung löst dieses technische Problem durch die
Bereitstellung eines Polynucleotids, das gegen eine mRNA der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase
(hTERT) gerichtet ist, wobei das Polynucleotid insbesondere mit PrimärStrukturen dieser hTERT-mRNA in zwei Zielsequenzbereichen von 2176 bis 2250 und 2296 bis 2393 gemäß dem Gendatenbankeintrag AF 015950 spezifisch interagiert . Die Zahlen repräsentieren - auch in folgenden Anschnitten - die entsprechenden Nukleotidpositionen innerhalb der hTERT-mRNA (Gesamtlänge 4015 Nukleotide) . Die Erfindung betrifft also die überraschende Lehre, dass gegen tumorassoziierte abnorme hTERT-mRJ-IA-Express onsmusτ-.er suw-.e Telomeraseaktivitätsniveaus durch eine mögliche hTER - Inhibition mit den erfindungsgemäßen Polynucleotiden vorgegangen werden kann. Diese Polynucleotide sind gegen definierte hTERT-mRNA-Sequenzmotive im Bereich von 2000 bis 2500 gerichtet. Sie können biologische und/oder chemische Strukturen sein, die in der Lage sind, so mit dem Zielsequenzbereich zu interagieren, dass eine spezifische Erkennung / Bindung und Wechselwirkung bestimmt werden kann. Beispiele für Polynucleotide können insbesondere Nukleinsäurekonstrukte und deren Derivatesein. Selbstverständlich ist es auch möglich, anstatt oder in Kombination mit den Polynucleotiden andere Erkennungs- moleküle zu verwenden, wie z. B. Antikörper, Lektine, Affiline, Aptamere, Chelatoren und andere.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform interagiert das Polynucleotid spezifisch mit zwei Zielsequenzbereichen 2176 bis 2250 und 2296 bis 2393. Vorteilhafterweise ist in diesen Sequenzbereichen eine besonders effiziente hTERT- Inhibition möglich. Bevorzugt sind ebenfalls kürzere Bereiche mit Veränderungen innerhalb dieser Zielsequenzen oder mit veränderten Randbereichen oder unterschiedlichen Derivatisierungen/Modifizierungen/Fusionen/Komplexierungen, die auch mit anderen Erkennungsmolekülen wie Polynucleotiden kombiniert und/oder gekoppelt sein können.
Durch diese bevorzugten Zielsequenzbereiche ist es dem Fachmann möglich, insbesondere sehr kleine und/oder kompakte Polynucleotid bereitzustellen, die im Wesentlichen nicht mit anderen Strukturen, insbesondere immunologischen Abwehrstrukturen, innerhalb des Zellgewebes bzw. des Organismus interagieren oder von diesen angegriffen werden, sondern spezifisch mit dem Zielsequenzbereich der hTERT- mRNA interagieren können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungs orm der Erfindung ist vorgesehen, dass der Sequenzbereich oder das Erkennungsmolekül, insbesondere das Polynucleotid durch Addition, Amplifikation, Inversion, Missense-Mutation, Nonsense-Mutation, Punktmutation, Deletion und/oder Substitution modifiziert ist. Diese Modifikationen können beispielsweise beim Polynucleotid dazu führen, dass es mit einer höheren Avidität oder Spezifität an die mRNA der katalytischen hTERT-Untereinheit bindet. Es kann jedoch selbstverständlich auch vorgesehen sein, dass das Polynucleotid mit geringerer Spezifität oder Avidität bindet. Bei den Mutationen im hTERT-Sequenzbereich kann es sich im Sinne der Erfindung zum Beispiel um vererbbare oder nicht vererbbare Veränderungen handeln. Die Modif kationen können so beschaffen sein, dass sie direkt auf der RNA- Ebene oder auf der DNA-Ebene detektierbar werden. Zu den Mutationen können beispielsweise auch Mutationen im Zusammenhang mit einer zytologisch sichtbaren Genom- und/oder Chromosomenmutationen zählen, die mit Veränderungen der hTERT assoziiert sind. Derartige Mutationen können dadurch entstehen, dass Teile des Chromosoms verloren gehen, verdoppelt werden, in umgekehrter Orientierung vorliegen oder auf andere Chromosomen übertragen werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass die Mutation nur ein oder wenige benachbarte Basenpaare betrifft, wie dies beispielsweise bei der Punktmutation der Fall ist. Geht beispielsweise ein Basenpaar in Form einer Deletion verloren oder wird ein Basenpaar zusätzlich, wie bei der Insertion, eingeschoben, so verschiebt sich das Leseraster des betroffenen Gens zu einer Leserastermutation. Bei der Substitutionsmutation im Sinne der Erfindung wird beispielsweise eine Base gegen eine andere ausgetauscht, wobei die daraus resultierenden Konsequenzen unterschiedlich sein können:
(a) Es kann beispielsweise ein Kodon in ein synonymes Kodon umgewandelt werden,
(b) oder die Mutation verändert die Kodonspezifität und führt damit zum Einbau anderer Aminosäuren bzw.
(c) durch die Mutation wird die Translation an einer bestimmten Stelle beendet, wobei die gebildeten hTERT-Fragmente inaktiv oder aktiv sein können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polynucleotid ein Nukleinsäurekonstrukt . Nukleinsäure- konstrukte im Sinne der Erfindung können alle Strukturen sein, die im Wesentlichen auf Nukleinsäuren basieren oder deren aktives Zentrum im Wesentlichen auf Nukleinsäuren basiert . Das Polynucleotid kann Bestandteil von Komplexen oder Formulierungen sein, bestehend aus Lipiden, Kohlenhydraten oder Proteinen bzw. Peptiden, beispielsweise in Form einer Nanokapsel . Dieser Komplex bzw. diese Formulierung umfasst einen Bereich, der Nukleinsäuren enthält, die mit hTERT wechselwirken können. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten bekannt, derartige Konstrukte bereitzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäurekonstrukt ein Antisense (AS) -Oligonukleotid (ON) , ein DNAzym, ein Ribozym, eine siRNA und/oder eine Peptid-Nukleinsäure (PNA) .
Bei AS-Konstrukten handelt es s.ich um synthetisch hergestellte Moleküle, die eine selektive Inhibition der Biosynthese ausgewählter Proteine ermöglichen. Zum Einsatz kommen zum Beispiel ON, PNAs, Ribozyme, DNAzyme. Die AS- Wirkung beruht auf der sequenzspezifischen Hybridisierung der' Konstrukte durch Watson-Crick-Basenpaarung mit der für das zu reprimierende Protein kodierenden Ziel-mRNA, was über verschiedene Mechanismen zu einer Verhinderung der Proteinsynthese führt (Tab.l).
Tab. 1 AS-Effekte und ihre Wirkungsmechanismen ss - "Single stranded" (Einzelstrang)
Die Entwicklung von AS-ON als therapeutische Substanzen stellt neben verschiedenen anderen Anwendungsfeidern auch ein neues erfolgversprechendes Therapiekonzept für onkologische Erkrankungen dar [Tamm et al . ] . Während es bei der konventionellen Chemotherapie zu einer unspezifischen Hemmung der Zeilproliferation kommt, werden mit der AS- Therapie ganz gezielt solche mRNAs inaktiviert, die die molekulare Grundlage oder einen wesentlichen Bestandteil des entarteten, deregulierten Wachstums und der Tumorprogression darstellen sowie für die Inhibierung der körpereigenen Immunabwehr verantwortlich sein können.
AS-ON unterscheiden sich von anderen Therapeutika, wie Antikörpern, Toxinen oder Immuntoxinen dahingehend, dass es sich um relativ kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht von üblicherweise etwa 5 kDa handelt . Die geringe Größe der AS-ON ermöglicht eine gute Gewebepenetration. Außerdem ist bekannt, dass Tumorblutgefäße im Gegensatz zu Blutgefäßen normaler Gewebe für Substanzen in einem Größenbereich zwischen 4-10 kDa durchlässig sind. Das bedeutet, dass therapeutische AS-ON gezielt Tumorblutgefäße penetrieren können. Ein weiterer Vorteil dieser Substanzen, zum Beispiel gegenüber Antikörpern, die nahezu ausschließlich gegen extrazelluläre Proteine wirksam sind, besteht darin, dass über die jeweilige Ziel-mRNA prinzipiell alle, also sowohl zytoplasmatische als auch kernlokalisierte sowie membranständige Proteine angegriffen werden können.
Die gegen einen Nuklease-Angriff relativ resistenten Phosporthioat-AS-ON werden gegenwärtig in einer Reihe von klinischen Studien (Phase I-III) hinsichtlich ihres Potentials als Anti-Krebs-Therapeutika evaluiert . Dabei werden in Tumoren überexprimierte Ziel-mRNA-Moleküle angegriffen.
Bei Verwendung der Phosphothioat-ON (PS-ON) wurde eine Reihe von unerwarteteten, so genannten "non-AS"-Effekten beobachtet, die zudem zu einer unspezifischen Hemmung des Zellwachstums führen können. Diese Effekte sind stark von der ON-Sequenz bzw. von bestimmten Sequenzmotiven abhängig und treten auf Grund der starken polyanionischen Ladung der PS-ON auf, welche eine Bindung der PS-ON an lebenswichtige Proteine zur Folge haben kann. Die erwähnten negativen Effekte können insbesondere durch Verwendung von partiell phosphothioat-modifizierten AS-ON oder durch weitere Modifikationen, z.B. Einbau von Ribonukleotiden anstatt Desoxyribonukleotiden, überwunden werden. Eine partielle endständige Modifizierung von ON-Konstrukten (bevorzugt 2 bis 5 Bindungen vom 3'- und 5' -Nukleinsäureterminus sind modifiziert) bietet eine erhöhte Stabilität im extra- und intrazellulären Milieu der Zielzellen (Schutz vor Abbau durch Exonukleasen) , insbesondere bei einer Applikation in vivo . Ein positiver Nebeneffekt, der bei Verwendung der PS- ON beobachtet wurde, ist deren immunstimulatorische Wirkung, die bei einigen Tumoranwendungen durchaus einen möglichen Therapieerfolg unterstützen kann.
Zur Erhöhung der Stabilität und Spezifität von AS-ON und zur Verminderung der „non-ASw-Effekte können weitere chemische Modifikationen zum Einsatz kommen, z.B. Einbau von 2 ' -O-Methylribonukleotiden, Methylphosphonat-Segmenten, „locked nucleic acids" (Methylenbrücke zwischen 2 ' - Sauerstoff und 4' -Kohlenstoff der Ribose) , Austausch des Cytosins durch 5' -Methylcytosin und/oder eine 2'-5'- Tetraadenylat-Modifizierung.
Dabei kann es sich sowohl um partiell modifizierte oder vollständig via dieser chemischen Modifikation veränderte
ON- onstrukte handeln.
Ribozyme sind als katalytisch aktive RNA-Moleküle in der Lage, zelluläre RNA-Strukturen als Substrate zu erkennen und sequenzspezifisch an einer Phosphordiesterbindung zu spalten. Die Erkennung erfolgt über AS-Arme, die aufgrund komplementärer Sequenzen eine Hybridisierung mit der Ziel-mRNA ermöglichen. Gegenüber AS-ON besitzen Ribozyme den grundsätzlichen Vorteil, dass ein Ribozym-Molekül als echter Katalysator eine große Anzahl identischer
Substratmoleküle umsetzen kann. Daher sind Ribozyme bereits in wesentlich geringerer Konzentration als ON wirksam und führen darüber hinaus durch die Substrat-Spaltung zu einem irreversiblen RNA- bbau [Sun et al . ] .
Unter den bisher bekannten Ribozymtypen ist das Hammerhead-Ribozym (Review: Birikh et al., 1997; Tanner, 1999) für derartige Anwendungen besonders interessant, weil es als vergleichsweise kleines Molekül (ca. 30-50 Nukleotide) bereits katalytisch aktiv sein kann. Ein sehr wirksames trans-spaltendes Hammerhead-Ribozym besteht zum Beispiel aus lediglich 14 konservierten Nukleotiden in der katalytischen Domäne und zwei variablen Stammsequenzen (vorteilhafterweise aus jeweils 6-8 Nukleotiden) , die durch Watson-Crick-Basenpaarung (analog der AS-ON) die sequenzspezifische Erkennung des zu spaltenden Substrates realisieren und dieses anschließend durch Spaltung einer Phosphordiester-Bindung inaktivieren. In dieser Form lässt sich praktisch gegen jedes beliebige RNA-Molekül, welches eine potentielle Spaltstelle mit der minimalen Sequenzanforderung -NUX- besitzt, ein spezifisch spaltendes Hammerhead-Ribozym konstruieren und somit beispielsweise zelluläre mRNA oder virale RNA inhibieren. Weitere katalytische Nukleinsäuren vom DNA- yp (z.B. DNAzyme) sind analog einsetzbar.
RNAi ("RNA interference" ) ist eine neue Methodik, die eine spezifische Geninhibition von Zielmolekülen auf mRNA-Ebene ermöglicht. Hierfür müssen doppelsträngige RNA-Moleküle („small interference RNA", siRNA) mit ihren zwei Nukleotiden langen 3 ' -Überhängen, bestehend bevorzugt aus Thymidin-Nukleotiden, in Zellen transfiziert werden. Zunächst erfolgt eine Assoziation der ' siRNA-Konstrukte mit spezifischen zellulären Proteinen, gefolgt durch die Erkennung der Ziel-mRNA-Sequenz aufgrund der Komplemen- tarität des AS-si-RNA-Stranges. Die intrinsische Endonukleaseaktivität des Ribonukleoproteinkomplexes ermöglicht eine spezifische Degradation der zu inhibierenden mRNA.
In einer besonderen Ausfuhrungsform der Erfindung ist das AS-ON ein PS-ON bzw. ein mit weiteren chemischen Veränderungen modifiziertes Nukleinsäurekonstrukt .
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist der Sequenzbereich der hTERT-mRNA, zu der das Polynucleotid komplementär ist, ausgewählt aus der Gruppe umfassend 2183-2205, 2206-2225, 2315-2334, 2317-2336, 2324- 2346, 2331-2350 und/oder 2333-2352.
Mit diesen Sequenzbereichen ist es vorteilhafterweise möglich, die hTERT-Expression zu inhibieren. Durch die
Inhibition können unter anderem Krankheiten, die mit der Expression dieses Gens assoziiert sind, unterdrückt werden, wie zum Beispiel Tumoren.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist das Polynucleotid immobilisiert. Im Sinne der Erfindung werden unter Immobilisierung verschiedene Verfahren und Techniken zum Fixieren der Polynucleotide auf bestimmten Trägern verstanden. Die Immobilisierung kann beispielsweise der Stabilisierung der Polynucleotide dienen, wodurch diese insbesondere bei Lagerung oder bei einmaligem Batch-Ansatz durch ■ biologische, chemische oder physikalische Einwirkungen in ihrer Aktivität nicht reduziert oder nachteilig modifiziert werden. Durch die Immobilisierung der Polynucleotide ist ein wiederholter Einsatz unter technischen oder klinischen Routine-Bedingungen möglich; weiterhin kann die Probe mit den Polynucleotiden kontinuierlich umgesetzt werden. Dies kann insbesondere durch verschiedene Immobilisierungstechniken erreicht werden, wobei die Bindung der Polynucleotide an andere Polynucleotide oder Moleküle bzw. an einen Träger so erfolgt, dass die dreidimensionale Struktur am aktiven Zentrum der entsprechenden Moleküle, insbesondere der Polynucleotide, nicht verändert wird. Vorteilhafterweise geht die Spezifität zu hTERT und die Spezifität der eigentlichen Bindungsreaktion durch die Immobilisierung nicht verloren. Im Sinne der Erfindung können drei grundsätzliche Methoden zur Immobilisierung verwendet werden:
(i) Quervernetzung: Bei der Quervernetzung werden die
Polynucleotide miteinander fixiert, ohne dass ihre Aktivität nachteilig beeinflusst wird. Sie sind vorteilhafterweise durch die Quervernetzung nicht mehr löslich.
(ii) Bindung an einen Träger: Die Bindung an einen Träger erfolgt zum Beispiel durch Adsorption, Ionenbindung oder kovalente Bindung. Dies kann auch innerhalb von mikrobiellen Zellen bzw. Liposomen oder anderen membranhaltigen geschlossenen bzw. offenen Strukturen erfolgen. Das Polynucleotid wird durch die Fixierung vorteilhafterweise nicht in seiner Aktivität beeinflusst. Es kann mit Vorteil zum Beispiel in der Klinik in Diagnose oder Therapie trägergebunden mehrfach oder kontinuierlich eingesetzt werden.
(iii) Einschluss: Der Einschluss erfolgt im Sinne der Erfindung insbesondere in eine semipermeable Membran in Form von Gelen, Fibrillen oder Fasern. Gekapselte Polynucleotide sind durch eine semipermeable Membran so durch die umgebende Probenlδsung getrennt, dass sie vorteilhafterweise noch mit der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase oder mit Fragmenten dieser interagieren können.
Für die Immobilisierung stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, wie. beispielsweise die Adsorption an einen inerten oder elektrisch geladenen anorganischen oder organischen Träger. Solche Träger können beispielsweise poröse Gele, Aluminiumoxid, Betonid, Agarose, Stärke, Nylon oder Polyacrylamid sein. Die Immobilisierung erfolgt hierbei durch physikalische Bindungskräfte, oft unter Beteiligung von hydrophoben Wechselwirkungen und ionischen Bindungen. Derartige Methoden sind vorteilhafterweise einfach zu handhaben und sie beeinflussen die Konformation der Polynucleotide nur in geringem Umfang. Durch elektrostatische Bindungskräfte zwischen den geladenen Gruppen der Polynucleotide und dem Träger kann die Bindung vorteilhafterweise verbessert werden, zum Beispiel durch die Verwendung von Ionenaustauschern, wie zum Beispiel Sephadex. Ein weiteres Verfahren ist die kovalente Bindung an Trägermaterialien. Die Träger können dazu reaktive Gruppen aufweisen, die mit Aminosäure-Seitenketten homöopolare Bindungen eingehen. Geeignete- Gruppen in Polynucleotiden sind Carboxy- , Hydroxy- und Sulfidgruppen und insbesondere die endständigen Aminogruppen von Lysinen. Aromatische Gruppen bieten die Möglichkeit für Diazo- Kupplungen. Die Oberfläche von mikroskopischen porösen Glaspartikeln kann durch Behandlung mit Silanen aktiviert und anschließend mit Polynucleotiden besetzt werden. Hydroxy-Gruppen natürlicher Polymere können zum Beispiel mit Bromzyan aktiviert und anschließend mit Polynucleotiden gekoppelt werden. Mit Polyacrylamid-Harzen können zahlreiche Polynucleotide vorteilhafterweise direkte kovalente Bindungen eingehen. Bei dem Einschluss in dreidimensionale Netzwerke werden die Polynucleotide in ionotrophe Gele oder andere dem Fachmann bekannte Strukturen eingeschlossen. Die Poren der Matrix sind insbesondere so beschaffen, dass die Polynucleotide zurückgehalten werden und eine Interaktion mit den Ziel- Molekülen möglich ist. Bei der Quervernetzung werden die Polynucleotide durch Vernetzung mit bifunktionellen
Agenzien in polymere Aggregate umgewandelt . Derartige Strukturen sind gelatinös und leicht verformbar und insbesondere für den Einsatz in verschiedenen Reaktoren geeignet. Durch Zugabe anderer inaktiver Komponenten, wie zum Beispiel Gelatine, bei der Vernetzung können die mechanischen und enzymatischen Eigenschaften vorteilhafterweise verbessert werden. Bei der Mikroverkapselung wird der Reaktionsraum der Polynucleotide mit Hilfe von Membranen eingegrenzt. Die Mikroverkapselung kann zum Beispiel als Grenzflächenpolymerisation durchgeführt werden. Durch die Immobilisierung bei der Mikroverkapselung werden die Polynucleotide unlöslich und dadurch wiederverwendbar. Im Sinne der Erfindung sind immobilisierte Erkennungsmoleküle, insbesondere Polynucleotide alle Erkennungsmoleküle oder Polynucleotide, die sich in einem Zustand befinden, der ihre Wiederverwendung erlaubt . Die Einschränkung der Beweglichkeit und der Löslichkeit der Polynucleotide auf chemischem, biologischem oder physikalischem Wege führt vorteilhafterweise zu niedrigen Verfahrenskosten.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die erfindungsgemäßen Polynucleotide, gegebenenfalls in einer Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Dieser pharmazeutische Träger kann insbesondere zusätzliche Stoffe und Substanzen, wie beispielsweise medizinische und/oder pharmazeutisch-technische Hilfsstoffe, umfassen. Medizinische Hilfsstoffe sind beispielsweise solche Stoffe, die zur Produktion als Ingredienzien von pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden. Pharmazeutischtechnische Hilfsstoffe dienen der geeigneten Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Arzneimittels und können sogar - sofern sie nur während des Herstellungsverfahrens benötigt werden - anschließend entfernt werden oder können als pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanzen Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung erfolgt gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel . Hierbei kann es sich beispielsweise um phosphatgepufferte Kochsalzlösung,
Wasser, Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser- Emulsionen, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen und ähnliches handeln. Die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung kann beispielsweise im Zusammenhang mit einer Gentherapie geschehen.
Im Sinne der Erfindung ist eine Gentherapie eine Behandlungsform unter Einsatz von natürlichen oder rekombinant veränderten Nukleinsäure-Konstrukten, einzelner Gensequenzen oder ganzer Gen- bzw. Chomosomenabschnitte bzw. kodierter Transkriptbereiche, deren Derivate/ Modifizierungen mit dem Ziel einer biologisch-basierten und selektiven Hemmung bzw. Revertierung der KrankheitsSymptome und/oder deren kausalen Ursachen, wobei im speziellen Fall darunter die Inhibition eines im Verlauf einer Krankheit überexprimierten Zielmoleküls auf Ebene der Nukleinsäuren, insbesondere auf der Transkriptebene, verstanden wird.
Die Gentherapie kann beispielsweise auch über geeignete Vektoren, wie beispielsweise virale Vektoren oder/und eine Komplexierung mit Lipiden oder Dendrimeren erfolgen. Die Gentherapie kann insbesondere auch über die Verpackung in Proteinhüllen erfolgen. Weiterhin ist es möglich, dass das Polynucleotid mit einem weiteren Molekül fusioniert oder komplexiert ist, welches den gerichteten Transport zum Zielort, die Aufnahme in und/oder die Verteilung innerhalb der Zielzelle unterstützt. Die Art der Dosierung und des Verabreichungsweges kann vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Anforderungen bestimmt werden. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie beispielsweise der
Größe, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder dem allgemeinen und krankheitsspezifischen Gesundheitszustand des Patienten, aber auch von dem speziellen Mittel, welches verabreicht wird, der Dauer und Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel, insbesondere in einer Kombinationstherapie, verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit umfassend das Polynucleotid und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung. Weiterhin betrifft die Erfindung auch ein Array umfassend das Polynucleotid und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung. Der Kit und der Array können zur Diagnose und/oder Therapie von Krankheiten eingesetzt werden, die mit der Funktion der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase assoziiert sind. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Polynucleotids, des Kits, des Arrays zur Diagnose, Prophylaxe, Verminderung, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung von mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehenden Krankheiten.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehende Krankheit ein Tumor. Besonders bevorzugt ist der Tumor ein solider Tumor und/oder ein
Blut- oder Lymphdrüsenkre s.
Insbesondere kann es sich bei den Tumoren, die epithelialen oder mesodermalen Ursprungs sein können, im Sinne der Erfindung um gut- oder bösartige Krebsarten der Organe der
Lunge, der Prostata, der Harnblase, der Niere, der Speiseröhre, des Magens, der Bauchspeicheldrüse (Pankreas) , des Hirns, des Ovars, des Skelettsystems handeln, wobei besonders das Adenokarzinom der Brust, der Prostata, der Lunge und des Darms, Knochenmarkkrebs, das Melanom, das Hepatom, die Kopf-Hals-Tumoren explizit als Vertreter bösartiger (so genannte maligne) Tumoren bevorzugt sind. Zur Gruppe der Blut- und Lymphdrüsenkrebsarten werden im Sinne der Erfindung alle Formen' von Leukämien (z.B. in Zusammenhang mit B-Zellen-Leukämie, Gemischt-Zellen- Leukämie, Nullzellen-Leukämie, T-Zellen-Leukämie, chronische T-Zellen-Leukämie, HTLV-II-assoziierte Leukämie, akute lymphatische Leukämie, chronisch-lymphatische Leukämie, Mastzell-Leukämie und myeloische Leukämie) und Lymphomen gezählt. Beispiele von mesenchymalen bösartigen Tumoren (sogenannte Knochen- und Weichteilsarkome) sind: Fibrosarkom; das maligne Histiozytom; das Liposarkom; Hämangiosarkom; das Chondrosarkom und das Osteosarkom; Ewing-Sarkom; das Leio- und Rhabdomyosarkom, das Synovialsarkom; Karzinosarkom. Als weitere Tumorarten, die im Sinne der Erfindung auch unter dem Begriff „Neoplasmen" zusammengefasst werden, sind bevorzugt: Knochen-Neoplasmen, Brust-Neoplasmen, Neoplasmen des VerdauungsSystems, colorektale Neoplasmen, Leber-Neoplasmen, Pankreas- Neoplasmen, Hirnanhang-Neoplasmen, Hoden-Neoplasmen, Orbita-Neoplasmen, Neoplasmen des Kopfes und Halses, des Zentralnervensystems, Neoplasmen des Hδrorgans, des Beckens, des Atmungstrakts und des Urogenitaltrakts) .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Krebserkrankung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert wird, ausgewählt aus der Gruppe: Tumoren des Hals-Nasen-Ohren-Bereichs umfassend Tumoren der inneren Nase, der Nasennebenhöhlen, des Nasopharynx, der Lippen, der Mundhöhle, des Oropharynx, des Larynx, des Hypopharynx, des Ohres, der Speicheldrüsen und Paragangliome, Tumoren der Lunge umfassend nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome, kleinzellige Bronchialkarzinome, Tumoren des Mediastinums, Tumoren des Gastrointestinaltraktes umfassend Tumoren des Ösophagus, des Magens, des Pankreas, der Leber, der Gallenblase und der Gallenwege, des Dünndarms, Kolon- und Rektumkarzinome und Analkarzinome, Urogenitaltumoren umfassend Tumoren der Nieren, der Harnleiter, der Blase, der Prostata, der Harnröhre, des Penis und der Hoden, gynäkologische Tumoren umfassend Tumoren der Zervix, der Vagina, der Vulva, Korpuskarzinom, maligne Trophoblastenerkrankung, Ovarialkarzinom, Tumoren des Eileiters (Tuba Faloppii) , Tumoren der Bauchhöhle, Mammakarzinome, Tumoren endokriner Organe umfassend Tumoren der Schilddrüse, der Nebenschilddrüse, der Nebennierenrinde, endokrine Pankreastumoren, Karzinoidtumoren und Karzinoidsyndrom, multiple endokrine Neoplasien, Knochen- und Weichteilsarkome, Mesotheliome, Hauttumoren, Melanome umfassend kutane und intraokulare Melanome, Tumoren des zentralen Nervensystems, Tumoren im Kindesalter umfassend Retinoblastom, Wilms Tumor, Neurofibromatose, Neuroblastom, Ewing-Sarkom-Tumorfamilie, Rhabdomyosarkom, Lymphome umfassend Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zeil-Lymphome, primäre Lymphome des zentralen Nervensystems, Morbus Hodgkin, Leukämien umfassend akute Leukämien, chronische myeloische und lymphatische Leukämien, Plasmazell-Neoplasmen, myelodysplastische Syndrome, paraneoplastische Syndrome, Metastasen ohne bekannten Primärtumor (CUP-Syndrom) , peritoneale Karzinomastose, Immunsuppression-bedingte Malignität umfassend AIDS-bezogene Malignitäten wie Kaposi-Sarkom, AIDS-assoziierte Lymphome, AIDS-assoziierte Lymphome des zentralen Nervensystems, AIDS-assoziierten Morbus Hodgkin und AIDS-assoziierte anogenitale Tumoren, Transplantationsbedingte Malignitäten, metastasierte Tumoren umfassend Gehirnmetastasen, Lungenmetastasen, Lebermetastasen, Knochenmetastasen, pleurale und perikardiale Metastasen und maligne Aszites.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem soliden Tumor um einen Tumor des Urogenitaltraktes und/oder des Gastrointestinaltraktes .
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Tumor ein Kolonkarzinom, ein Magenkarzinom, ein Pankreaskarzinom, ein Dickdarmkrebs, ein Dünndarmkrebs, ein Ovarialkarzinom, ein Zervikalkarzinom, ein Lungenkrebs, ein Nierenzellkarzinom, ein Hirntumor, ein Kopf-Halstumor, ein Leberkarzinom und/oder eine Metastase dieser Tumoren/Karzinome ist.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist der solide Tumor ein Mamma-, Bronchial-, Kolorektal- und/oder Prostatakarzinom.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Tumor des Urogenitaltraktes ein Harnblasenkarzinαm (BCa) . Das BCa stellt in der Bundesrepublik Deutschland die vierthäufigste Krebsform und siebthäufigste Krebstodes- Ursache bei Männern dar. Die TUR-B als generelle Primärtherapie des BCa erlaubt eine organerhaltende Entfernung von oberflächlichen Tumoren. Trotz dieser histopathologisch definierten vollständigen Entfernung des Tumors ist mit 50-70 % der Patienten ein relativ hoher Anteil innerhalb von zwei Jahren von einem Rezidiv betroffen [Stein et al . ] . Ein Diagnose- sowie Therapieproblem stellt das synchrone oder metachrone multifokale Auftreten von Tumorherden dar,, wodurch das Auftreten von Rezidiven entfernt von der resezierten Primärtumorlokalisation bedingt sein kann [Sidransky et al . ] . Bei Auftreten eines Rezidivs oder bei primär als oberflächlich eingestuften Tumoren erfolgt in der Regel nach der TUR-B eine Langzeitprophylaxe mit einem Immun- (Bazillus Calmette-Guerin - BCG) oder Chemotherapeutikum
(z. B. Mitomycin-C, Taxol, Gemcitabin/Cisplatin) . Patienten mit muskelinvasiven BCa und mit entdifferenzierten, oberflächlichen Tumoren, die trotz dieser Therapie rezidivieren, werden in der Regel radikal zystektomiert bzw. unter Erhalt der Blase mittels Mono-/Polychemo- , Immun- oder Strahlentherapie bzw. Kombinationsverfahren dieser Methoden behandelt. Chemo-, Immun- oder Strahlenbehandlungen sind aufgrund ihrer relativ unspezifischen Wirkmechanismen von einer hohen therapieinduzierten Toxizität begleitet.
Aufgrund der gesundheitspolitischen Bedeutung des BCa
(insbesondere in den westlichen Industrieländern) , dem
Fehlen tumorspezifischer Marker sowie der bekannten tumorbiologischen und zellulären Heterogenitat des Tumors gibt es eine intensive Suche auf dem klinischen Forschungsgebiet zum BCa, die insbesondere auf die Identifizierung neuer oder/und ergänzender Therapieoptionen zielen.
In einer besonderen Ausfuhrungsform der Erfindung werden das Polynucleotid, die pharmazeutische Zusammensetzung, der Kit und/oder der Array für eine Verlaufskontrolle verwendet, die im Wesentlichen eine Überwachung der Wirksamkeit einer Antitumorbehandlung darstellt . Weiterhin ist es bevorzugt, dass das Polynucleotid in einer Kombinationstherapie, insbesondere zur Behandlung von Tumoren, verwendet wird. Besonders bevorzugt ist hierbei, dass die Kombinationstherapie eine Chemotherapie, eine Zytostatikabehandlung und/oder eine Strahlentherapie umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Kombinationstherapie eine adjuvante biologisch-spezifizierte Therapieform. Ganz besonders bevorzugt ist hierbei, dass diese Therapieform eine Immuntherapie ist. Weiterhin ist besonders bevorzugt, dass die Kombinationstherapie eine Gentherapie und/oder eine
Therapie mit einem Polynucleotid gegen dasselbe oder ein anderes Zielmolekül umfasst. Dem Fachmann sind verschiedene Kombinationstherapien, insbesondere zur Behandlung von Tumoren, bekannt. Es kann zum Beispiel vorgesehen sein, dass innerhalb einer Kombinationstherapie eine Zytostatikabehandlung erfolgt oder beispielsweise eine Bestrahlung eines bestimmten Tumorareals, wobei diese Behandlung mit einer Gentherapie kombiniert wird, wobei das erfindungsgemäße Polynucleotid als Antikrebsmittel eingesetzt wird. Das erfindungsgemäße Polynucleotid kann jedoch auch in Kombination mit anderen Polynucleotiden gegen das selbe oder ein anderes Zielmolekül eingesetzt werden. Demgemäß kann es ganz besonders bevorzugt sein, dass das Polynucleotid zur Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber ' Zytostatika und/oder Strahlen verwendet wird. Weiterhin ist es bevorzugt, dass das Polynucleotid zur Hemmung der Vitalität, der Proliferationsrate von Zellen und/oder zur Induktion von Apoptose und eines Zellzyklus-Arrests verwendet wird.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Beispiel 1
Die gut transfizierbare humane Harnblasenkarzinom- elllinie EJ28 zeigte nach Transfektion insbesondere bei Verwendung von fünf spezifischen anti-hTERT-AS-Konstrukten (vgl. Tab. 2) eine unmittelbar einsetzende und kontinuierliche Reduktion ihrer Viabilität um mehr als 65 % gegenüber der
Nonsense (NS) -Kontrolle (Abb. 2). Dabei war die Beobachtung besonders auffällig, dass vier der wirksamsten Konstrukte gegen ein einzelnes mRNA-Sequenzmotiv gerichtet waren.
Bereits nach vier von fünf Behandlungen mit dem Konstrukt AStel2331-50" waren nahezu keine lebenden Zellen mehr im Kulturgefäß nachweisbar. Die Behandlung telomerasenegativer humaner Fibroblasten führte hingegen zu keinen signifikanten Unterschieden zwischen AS- und NS-ON- behandelten Zellen, was eine Spezifität der AS-O-N-Wirkung auf die BCa-Zelllinie EJ28 indirekt belegt (Daten nicht gezeigt) . Die AS-spezifische Wirksamkeit wurde anschließend detailliert untersucht : in Übereinstimmung mit dem Viabilitätstest konnte in Bezug auf das Proliferations- und Zellkoloniebildungsverhalten (Abb. 3) ein Hemmeffekt dieser fünf AS-ON belegt werden. Zudem konnte die AS-spezifische Verringerung des Zellanteils in der DNA-Synthesephase (bis ca. 30 %) in Richtung einer Gl-Arretierung nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Der Beweis für die AS- spezifische Wirkung der gegen die Zielmotive gerichteten AS-ON wurde in Form einer signi ikanten und zeitabhängigen Reduktion der hTERT-Transkriptmenge erbracht (Abb. 4) . In Übereinstimmung damit wurde auch die hTERT- Proteinexpression reprimiert . Außerdem wurde als Folge davon die Telomeraseaktivität der EJ28-Zellen um mehr als 60 % gehemmt (Daten nicht gezeigt) .
Die AS-ODN spezifischen Effekte bezüglich einer Wachstumsund Proliferationsinhibierung wurden zudem für andere humane BCa-Zellinien belegt (Kraemer et al . ) .
Beispiel 2
In Experimenten zur Wirkung von verschiedenen Chemotherapeutika (Mitomycin-C, Cisplatin, Gemcitabin) auf das Wachstumsverhalten von verscheidenen BCa-Zellinien wurde unerwarteterweise ein signifikanter
Verstärkungse fekt, bedingt durch die Zugabe einzelner
Polynucleotide im Sinne der Erfindung, beobachtet werden
(Daten nicht gezeigt) . Am Beispiel der gut transfizierbaren
BCa-Zellinie 5637 konnte mit den AS-ON-Konstrukten AStel2206 und AStel2331 eine signifikante Steigerung der viabilitätsinhibitorischen Wirkung des Chemotherapeutikums Cisplatin in zwei verschiedenen Dosierungen nachgeweisen werden (Abb. 5) .
Tab. 2 hTERT-AS- und NS-ON: Nukleotid- und Zielsequenzen
Bezeichnung ss-Motiv SequenzJ (5' -> 3' )
AS-ON ASteΪ2206-2225 2191-2224 tgtcctgggggatggtgtcg
AStel2315-2334 ttgaaggccttgcggacgtg AStel2317-2336 tcttgaaggccttgcggäcg"
2318-2346 ÄSteΪ2"331-"235Ö ggtagagacgtggctcttga AStel2333-2352 I äaggtägagacgtggctctt
NS-ON NS-K2™ cagtctcagtactgaagctg
NS-K3 cagcttcagtactgagactg
1 Der Name beinhaltet den Sequenzbereich der hTERT-mRNA (Acc. No. : AF015950) , zu der das jeweilige AS-ON komplementär ist; 2 Die dargestellten Motive enthalten am 5'- und 3' -Terminus jeweils 10 nt doppelsträngige RNA;
3 Die fett gedruckten Nukleotide stellen den Bereich im AS- ON. dar, der komplementär zur eigentlichen ss-Region des Zielmotivs ist. Literaturverzeichnis
Agrawal S, Zhao Q: Antisense therapeutics. Curr Opin Chem Biol (1998) 2: 519-28.
Beattie TL, Zhou ■ W, Robinson MO, Harrington L:
Reconstitution of human telomerase activity in vitro. Curr
Biol (1998) 8: 177-80.
Boiziau C, Kurfürst R, Cazenave C, Roig V, Thuong NT,
Toul e JJ: Inhibition of translation initiation by antisense oligonucleotides via an RNase-H independent echanism. Nucleic Acids Res (1991) 19: 1113-9.
Crooke ST: Molecular mechanisms of action of antisense drugs. Biochim Biophys Acta (1999) 1489: 31-44.
Greider CW, Blackburn EH: Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell (1985) 43: 405-13.
Harley . CB: Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? Mutat Res (1991) 256: 271-82.
Ito H, Kyo S, Kanaya T, Takakura M, . Inoue M, Na iki M: Expression of human telomerase subunits and correlation with telomerase activity in urothelial cancer. Clin Cancer Res (1998) 4: 1603-8.
Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW: Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science (1994) 266: 2011-5. De Kok JB, Schalken JA, Aalders TW, Ruers TJ,. Willems HL,
Swinkels DW: Quantitative measurement of telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA in urothelial cell carcinomas .
Int J Cancer (2000) 87: 217-20.
Kole R, Sazani P: Antisense effects in the cell nucleus : modification of splicing. Curr Opin Mol Ther (2001) 3: 229-
34.
Kraemer K, Fuessel S, Schmidt U, Kotzsch M, Schwenzer B, Wirth MP, Meye A: Antisense-mediated hTERT Inhibition Specifically Reduces the Growth of Human Bladder Cancer Cells. Clin Cancer Res (2003) 9: 3794-800.
Levy MZ, Allsopp RC, Futcher AB, Greider CW, Harley CB: Telomere end-replication problem and cell aging. J Mol Biol (1992) 225: 951-60.
Moser HE, Dervan PB: Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science (1987) 238: 645-50.
Stein JP, Grossfeld GD, Ginsberg DA, Esrig D, Freeman JA, Figueroa AJ, Skinner DG, Cote RJ: Prognostic markers in bladder cancer: a contemporary review of the literature. J Urol (1998) 160: 645-59.
Sun LQ, Cairns MJ, Saravolac EG, Baker A, Gerlach WL: Catalytic nucleic acids : from lab to applications . Pharmacol Rev (2000) 52: 325-47. Tamm I, Dorken B, Hartmann G: Antisense therapy in oncology: new hope for an old idea? Lancet (2001) 358: 489- 97.

Claims

Patentansprüche
1. Polynucleotid gerichtet gegen ein Gen einer katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid mit der mRNA der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase mindestens in zwei Zielsequenzbereichen 2176 bis 2250 und 2296 bis 2393 gemäß der Accession number AF015950 spezifisch interagiert.
2. Polynucleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid mit den Zielsequenzbereichen ausgewählt aus der Gruppe umfassend 2183-2205, 2206-2225, 2315-2334, 2317-2336, 2324-2346, 2331-2350 und/oder 2333-2352 interagiert.
3. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Sequenzbereich und/oder das Polynucleotid durch Addition,
Amplifikation, Inversion, Missense-Mutation, Nonsense-Mutation, Punktmutation, Deletion und/oder Substitution modifiziert ist.
4. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid immobilisiert ist.
5. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid ein
Nukleinsäurekonstrukt bzw. dessen Derivat ist.
6. Polynucleotid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einem weiteren Molekül fusioniert oder komplexiert ist, welches den gerichteten Transport zum Zielort, die Aufnahme in und/oder die Verteilung innerhalb der Zielzelle unterstützt .
7. Polynucleotid nach Anspruch 5 oder 6 , dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt ein Antisense-Oligonukleotid, ein DNAzym, eine Peptid-Nukleinsäure, ein Ribozym und/oder eine siRNA ist.
8. Polynucleotid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Antisense- Oligonukleotid durch Phosphothioatbindungen und/oder andere chemische Modifikationen verändert ist.
9. Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Sequenzbereich der hTERT-mRNA, zu der das Polynucleotid komplementär ist, aus der Gruppe umfassend 2183-2205, 2206-2225, 2315- 2334, 2317-2336, 2324-2346, 2331-2350 und/oder 2333- 2352 ausgewählt ist.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 allein oder in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
11. Kit umfassend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10.
12. Array umfassend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10.
13. Verwendung eines Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einer pharmazeutischen
Zusammensetzung nach Anspruch 10, eines Kits nach Anspruch 11 und/oder eines Arrays nach Anspruch 12 zur Diagnose, Prophylaxe, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung von mit Zellwachstum, -differenzierung und/oder -teilung im Zusammenhang stehenden Krankheiten.
14. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit ein Tumor ist.
15. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein solider Tumor oder eine Leukämie ist.
16. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der solide Tumor ein Tumor des Urogenitaltraktes und/oder des Gastrointestinaltraktes ist .
17. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein Kolonkarzinom, ein Magenkarzinom, ein Pankreas- karzinom, ein Dünndarmkrebs, ein Ovarialkarzinom, ein Zervikalkarzinom, ein Lungenkrebs, ein Nierenzellkarzinom, ein Hirntumor, ein Kopf-Halstumor, ein Leberkarzinom und/oder eine Metastase dieser Tumoren ist .
18. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der solide Tumor ein Mamma-, Bronchial-, Kolorektal- und/oder Prostatakarzinom und/oder eine Metastase dieser Tumoren ist.
19. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor des Urogenitaltraktes ein Harnblasenkarzinom und/oder eine Metastase dieser Tumoren ist.
20. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Verlaufkontrolle eine
Überwachung der Wirksamkeit einer Antitumorbehandlung ist .
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynucleotid in einer Kombiijiationstherapie verwendet wird.
22. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombinationstherapie eine Chemotherapie, eine Zytostatikabehandlung und/ oder eine Strahlentherapie umfasst.
23. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombinationstherapie eine adjuvante biologisch-spezifizierte Therapiefprm umfasst.
24. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Therapieform eine Immuntherapie ist.
25. Verwendung nach einem Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombinationstherapie eine Gentherapie und/oder eine Therapie mit einem
Polynucleotid gegen das selbe oder ein anderes Zielmolekül umfasst.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 25 zur Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber Zytostatika und/oder Strahlen.
27. Verwendung eines Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder nach einem der Ansprüche 13 bis 26 zur Hemmung der Vitalität, der Proliferationsrate von Zellen, zur Induktion von Apoptose und/oder eines Zellzyklus-Arrests .
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Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5645986A (en) * 1992-05-13 1997-07-08 Board Of Reagents, The University Of Texas System Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US6444650B1 (en) 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
US6093809A (en) * 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
EP0917579A1 (de) * 1997-07-01 1999-05-26 Cambia Biosystems LLC Gene und proteine von vertebraten telomerasen, und deren verwendungen
US6608188B1 (en) * 1998-01-08 2003-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CRT-1 gene having reverse transcriptase motif
US6492171B2 (en) 2000-05-16 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of TERT expression
US20050153916A1 (en) * 2001-05-18 2005-07-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of telomerase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060257851A1 (en) * 2002-11-26 2006-11-16 Itzhak Bentwich Bioinformatically detectable group of novel viral regulatory genes and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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