KR20140010285A - 약물전달용 조성물 및 이를 이용한 약물전달방법 - Google Patents

약물전달용 조성물 및 이를 이용한 약물전달방법 Download PDF

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Abstract

확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 RNA를 포함하는 약물전달(drug delivery)용 조성물, 및 이를 이용한 약물전달방법에 관한 것이다.

Description

약물전달용 조성물 및 이를 이용한 약물전달방법{COMPOSITION FOR DRUG DELIVERY AND DRUG DELIVERY METHOD USING THE SAME}
본원은, 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 RNA를 포함하는 약물전달(drug delivery)용 조성물, 및 이를 이용한 약물전달방법에 관한 것이다.
약물전달시스템은 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물, 예를 들어, 단백질, 핵산, 또는 기타 저분자 등을 효율적으로 전달할 수 있도록 하는 의약 기술을 의미한다. 신약 개발에 필요한 비용과 시간을 절감해 주는 상기 기술은 최근 나노기술과 결합하면서 의약계에서 새로운 부가가치를 창출하는 첨단기술의 한 분야로 자리 잡고 있으며, 미국과 일본 등 기술선진국들은 지난 80년대 후반부터 제약회사 등 기업을 중심으로 신약 개발과 함께 약물전달시스템의 개발에 전력을 쏟아 왔다.
지금까지는, 바이러스 유전자, 재조합 단백질, 리포좀(liposome), 양이온성 고분자, 그리고 다양한 형태의 나노입자와 나노물질들이 동물 세포 내로의 약물전달을 위해 이용되었다. 그러나 많은 양이온성 리포좀들과 양이온성 고분자들은 임상에 적용하기에는 세포에 독성이 강하여 부적합한 것으로 밝혀졌다. 또한, 안정적인 핵산의 세포막 투과를 위하여 핵산의 주 사슬을 화학적으로 변형시키는 방법도 시도되었다. 그러나, 이러한 방법은 비용이 비싸고 오랜 시간이 걸리며 노동 집약적인 공정이 요구되므로 임상 적용에는 적합하지 않다. 의미 있는 시도로서, 양자점, 자성 입자, 또는 금 나노입자를 포함한 다양한 형태의 나노입자를 이용한 약물전달 시스템(Drug delivery system, DDS)이 개발된 바 있다. 예를 들어, "다공성 실리콘 입자를 이용한 영상진단 약물전달체 및 그의 제조방법(대한민국 공개특허 제2010-0117433호)" 등의 관련 연구가 있었다. 그러나, 이러한 입자들은 세포에 독성을 가지며 핵산 등의 생체고분자의 도입에 용이하지 않은 구조를 가지고 있다는 문제점이 있다.
본원은, RNA와 같은 생체고분자를 기공 내로 도입하여 세포 내로 전달할 수 있으며, 상기 전달 과정에서 생체 내의 분해효소에 의한 상기 생체고분자의 분해를 억제할 수 있는, 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 RNA를 포함하는 약물전달용 조성물, 및 상기 약물전달용 조성물을 이용한 약물전달방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 RNA를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 RNA를 포함하는 약물전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 약물전달방법을 제공한다.
본원에 의하여, 고효율의 약물전달용 조성물이 제공될 수 있다. 본원에 따른 약물전달용 조성물은, 상기 약물전달용 조성물에 포함된 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 기공에 RNA가 도입되어 있으므로, 세포 내로의 도입시 외부 환경의 영향을 덜 받아 RNA의 구조가 안정하게 유지될 수 있어 약물전달의 효율이 높다. 또한, 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자를 포함한 용액과 RNA를 단순히 혼합하는 것 만으로 상기 RNA를 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 도입할 수 있으며, 화학적 결합, 가교결합, 또는 복잡한 정제 분리 과정을 필요로 하지 않으므로 간단하고 비용 효율적이다. 특히, siRNA를 상기 기공이 확장된 다공성 실리카 나노입자에 도입하고 이를 동물세포 내로 전달하여 세포 내에서 RNAi 기작을 유발함으로써 특정 유전자의 발현을 조절할 수 있고, 이를 이용하여 유전자의 과발현 또는 비정상 발현으로 인한 질병을 치료할 수 있다. 또한, 상기 실리카 나노입자는 높은 단분산 특성을 가지고 생체적합성이 뛰어나며 세포독성을 나타내지 않으므로 질병 치료를 위하여 임상적으로 사용될 수 있다.
도 1 은 본원의 일 구현예에 따른 약물전달용 조성물의 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 본원의 일 실시예에 따른 실리카 나노입자의 투과전자현미경 이미지 및 특성 분석 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 본원의 일 실시예에 따른 실리카 나노입자의 특성 분석 결과이다.
도 4 는 본원의 일 실시예에 따른 실리카 나노입자의 모식도 및 핵산분해효소에 대한 저항력 분석 결과이다.
도 5 는 본원의 일 실시예에 따른 GFP siRNA를 포함하는 실리카 나노입자의 세포 내 도입 여부 판단을 위한 형광분석 그래프 및 이미지이다.
도 6 은 본원의 일 실시예에 따른 GFP siRNA를 포함하는 실리카 나노입자의 세포 내 도입 여부 판단을 위한 유세포 분석의 결과이다.
도 7 은 본원의 일 실시예에 따른 GFP siRNA를 포함하는 실리카 나노입자의 세포 내 도입 여부 판단을 위한 형광이미지 분석 결과이다.
도 8 은 본원의 일 실시예에 따른 VEGF siRNA를 포함하는 실리카 나노입자의 세포 내 도입 여부 판단을 위한 RT-PCR 분석 결과이다.
도 9a 및 도 9b는 본원의 일 실시예에 따른 GFP siRNA를 포함하는 실리카 나노입자를 GFP를 발현하는 종양에 적용한 후 형광분석한 결과이다.
도 10 은 본원의 일 실시예에 따른 GFP siRNA를 포함하는 실리카 나노입자를 GFP를 발현하는 종양 조직에 적용한 후의 형광현미경 이미지이다.
도 11 은 본원의 일 실시예에 따른 VEGF siRNA를 포함하는 실리카 나노입자를 VEGF를 발현하는 종양에 적용한 후 종양의 크기변화를 측정한 결과이다.
도 12 는 본원의 일 실시예에 따른 VEGF siRNA를 포함하는 실리카 나노입자를 VEGF를 발현하는 종양에 적용한 후의 VEGF 발현량을 RT-PCR 분석한 것이다.
도 13 은 본원의 일 실시예에 따른 VEGF siRNA를 포함하는 실리카 나노입자를 VEGF를 발현하는 종양에 적용한 후의 종양 조직의 형광현미경 이미지이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원의 제 1 측면은, 확장된 기공을 가지는 다공성(porous) 실리카 나노입자에 흡착된 RNA를 포함하는 약물전달(drug delivery)용 조성물을 제공할 수 있다.
이와 관련하여, 도 1은 본원의 일 구현예에 따른 약물전달용 조성물의 모식도이다.
도 1을 참조하면, 본원의 일 구현예에 따른 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 작은 크기와 그 입자 특성 때문에 세포에 의해 흡수(endocytosis)될 수 있어 흡착된 siRNA와 함께 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 siRNA는 세포 내로 도입되어 세포 내에서 RNAi 기작(RNA interference pathway)을 촉발하여 목적 유전자의 발현을 저해시킨다. 이러한 유전자 발현 저해 효과로 인하여, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 siRNA는 유전자의 과발현 또는 이상 발현에 의해 유발되는 질병의 치료가 가능하다.
예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 단분산(monodispersity) 특성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 단분산 특성은 분자량의 분포 범위 또는 입자 크기 범위가 매우 좁은 특성으로서, 특히 나노물질의 단분산은 나노입자의 크기와 관련하여 체계적인 약물전달시스템 설계에 있어서 필수적이다. 상기 단분산 특성은 약물전달용 조성물의 세포내 흡수 및/또는 약효를 결정하는 데에 있어서 나노물질의 모양 및/또는 표면의 화학적 특성에 더하여 하나의 요소가 될 수 있다.
예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 조절 가능한 기공, 입자 크기, 넓은 표면적, 큰 기공 부피, 표면 기능화의 용이성, 또는 세포독성이 적거나 없어 높은 생체적합성을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 자극에 반응하는 게이트 개폐시스템을 가져 조절가능한 지효성 시스템에 적용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 기공에 개폐가 가능한 게이트를 가질 수 있으며, 외부의 자극에 의하여 상기 게이트의 개폐가 조절되므로, 상기 기공 상에 포함된 약물의 해리 여부, 시기, 또는 양 등을 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 파라핀 캡 등에 의하여 기공이 외부와 차단되어 있을 수 있으며, 일정 온도 이상, 예를 들어, 파라핀 용융 온도 이상의 자극을 받으면 상기 파라핀 캡이 용융되어 기공이 노출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또는, 예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 평소에는 기공 주위에 고분자가 결합되어 있어 기공 내의 약물 등이 외부로 유출되지 않지만, 효소 등의 자극이 주어지면 상기 고분자가 절단되어 상기 기공이 노출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 RNA는 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 RNA가 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 기공 내에 포함됨으로써, 상기 RNA는 외부의 RNA 분해효소(RNase) 또는 혈청단백질을 포함하는 세포 내외의 환경으로부터 보호될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 외부 분해효소로부터의 약물 보호 기능은 약물전달체로서 임상적 의의가 있는 중요한 요소의 하나이다. 또한, 상기 RNA는 상기 RNA 분해효소 또는 상기 혈청단백질을 포함하는 세포 내외의 환경으로부터 보호되기 위하여 잠금 핵산(Locked nucleic acie; LNA), O-메틸화, 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 핵산 등과 같이 노동력을 요하고 높은 비용 및 시간을 소모하는 화학적 변형을 요구하지 않으므로 제조가 용이하고 경제적이다.
예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 그의 위치 추적을 위한 형광 염료를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 그 표면에 형광 염료를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 RNA를 흡착시키는 과정은 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자와 상기 RNA를 용액 내에 단순히 혼합하여 흡착시키는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 RNA를 흡착시키는 과정은 표면에 아민기가 결합된, 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자와 상기 RNA를 PBS(phosphate buffered saline)가 포함된 용액 내에 혼합하여 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 과정은 화학적 결합, 가교결합, 또는 복잡한 정제 분리 과정을 필요로 하지 않으므로 간단하고 비용이 적게 들며 효율적인 모듈 방식으로 실행할 수 있다.
예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 세포에 독성을 나타내지 않으며 생체친화적인 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가적으로, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 약물전달 효율 상승 및/또는 세포 내로의 도입을 위하여 추가적인 표면 처리를 필요로 하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNA는 siRNA, miRNA, tRNA, mRNA, rRNA, 또는 sRNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 miRNA(micro RNA)는 세포 내에서 특정 유전자의 전사후 발현억제를 유발하는 RNA의 일종이고, tRNA는 세포 내 번역에 관여하는 전달 RNA이고, mRNA는 DNA의 유전정보가 전사된 RNA이고, rRNA는 리보솜을 구성하는 RNA이며, sRNA는 상기 tRNA, mRNA, 및 rRNA를 제외한 작은 RNA 종류들을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 siRNA(small interfering RNA)는 진핵생물의 세포 내에서 RNAi(RNA interference) 경로를 촉발시키는 핵산의 종류이다. RNAi(RNA interference)는 필요없는 유전자의 발현을 조절하기 위하여 목적 mRNA를 절단하는, 진핵세포에 보존된 유전자 억제 메커니즘이다. 1998년에 Fire, Mello와 그 동료들에 의해 예쁜꼬마선충(C.elegans)에서 이러한 메커니즘이 발견된 이후로, 기초적인 생물학적 의문을 해결하기 위하여, 그리고 생체의학 분야에의 적용을 위하여 많은 연구가 진행되었다. 특히, RNAi는 기존의 저분자에 기초한 의약에 의하여는 치료가 불가능하다고 여겨졌던 질병들에 대한 대체치료에 있어 커다란 기회를 제공할 것으로 기대되고 있다.
RNAi 경로는 진핵세포의 세포질에 외인성 siRNA가 도입됨으로 인해 촉발된다. siRNA는 보통 21개 내지 23개의 핵산에 의해 구성되어 있으며 3'-말단에 2 염기 또는 3 염기로 돌출된 단일가닥(overhang)을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 siRNA는 동물 세포에 내재되어 있는 RNAi 기작을 이용하여 바이러스 감염에서 종양에 이르는 넓은 범위의 질병에 대한 강력한 유전자 치료제가 될 수 있으며, 이론적으로는 비정상적인 유전자의 과발현에 의해 발생하는 모든 질병에 대한 강력한 유전자 치료제가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 표면에 양전하가 형성되어 있으며, 상기 RNA는 상기 양전하와의 정전기적 상호작용에 의해 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 양전하는 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 기공 내부 표면 및/또는 바깥 표면에 아민기를 결합시킴으로써 형성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자의 표면에 아민기를 결합시키는 것은, 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane; APTES)을 상기 다공성 실리카 나노입자에 처리하는 것에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)에 의하여 기능화, 즉 폴리에틸렌글리콜화(PEGylation)된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리에틸렌글리콜화에 의하여 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 표면에 폴리에틸렌글리콜이 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리에틸렌글리콜화에 의하여 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 뭉침이 방지되거나, 다른 생분자와의 비특이적 결합이 최소화 되거나, 또는 기공 외의 RNA 흡착이 감소되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 약 100 nm 내지 약 300 nm의 크기를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 약 100 nm 내지 약 300 nm, 약 100 nm 내지 약 250 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 150 nm, 약 150 nm 내지 약 300 nm, 약 200 nm 내지 약 300 nm, 약 250 nm 내지 약 300 nm, 또는, 약 150 nm 내지 약 250 nm의 크기를 가지는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 기공의 크기는 약 5 nm 내지 약 30 nm인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 기공의 크기는 약 5 nm 내지 약 30 nm, 약 5 nm 내지 약 23 nm, 약 5 nm 내지 약 20 nm, 약 5 nm 내지 약 15 nm, 약 5 nm 내지 약 10 nm, 약 10 nm 내지 약 30 nm, 약 15 nm 내지 약 30 nm, 약 20 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 23 nm 내지 약 30 nm인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 siRNA는 GFP(green fluorescent protein), VEGF(vascular endothelial growth factor), Oct3/4, c-myc, Klf4(Kruppel-like factor 4), Sox2(SRY-box 2), Ras, Tert(telomerase reverse transcriptase), Bcl2(B-cell leukemia/lymphoma 2), LMNA(lamin A/C), CDH13(Cadherin 13; H-cadherin; or T-cadherin), NS3 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 발현을 저해하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, GFP 유전자는 모델 유전자로서 사용되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. VEGF(혈관내피성장인자) 유전자는 암 치료 관련 유전자로서 VEGFA, VEGFB, 또는 VEGFC 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. VEGF 단백질은 내피세포의 VEGF 수용체에 결합하여 내피세포를 활성화시켜 혈관의 생성을 촉진하여 빠르게 성장하는 혈관의 신생혈관생성(angiogenesis)에 중요한 역할을 수행하는 신호 전달 단백질이다. 종양의 성장에서 VEGF는 중요한 역할을 하므로, 암 치료에서 VEGF의 발현 억제 또는 기능 억제는 중요한 해결과제이다. 예를 들어, 암세포에서 VEGF의 발현이 억제될 경우, 암세포의 혈관 생성이 억제되고 혈액 공급이 부족해져 암세포의 성장이 저해될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, Oct3/4, c-myc, Klf4, Sox2, 또는 Ras는 과발현될 경우 세포의 암화를 초래할 수 있고, 세포의 비정상적인 성장 또는 분화와 관련된 유전자일 수 있으며, 암세포에서 주로 발현되는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 siRNA는 서열 특이적으로 유전자의 발현을 저해할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 GFP, VEGF, Oct3/4, c-myc, Klf4, Sox2, Ras, Tert, Bcl2, LMNA, 또는 CDH13 유전자는 인간을 포함하는 동물의 세포에서 발현되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 NS3 유전자는 C형간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV)의 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는, 다공성 실리카 나노입자를 형성하는 단계; 및 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공을 확장하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자를 형성하는 단계는, 실리카 전구체로부터 다공성 실리카 나노입자를 형성하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 실리카 전구체로부터 다공성 실리카 나노입자를 형성하는 것은 상기 실리카 전구체를 계면활성제를 포함하는 용액과 혼합하는 것을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 계면활성제를 포함한 용액은 알코올, 물, 및 수산화나트륨을 추가로 포함하는 용액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 계면활성제는 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide), TMABr(hexadecyltrimethylammonium bromide), TMPrCl(hexadecyltrimethylpyridinium chloride), 또는 TMACl(tetramethylammonium chloride) 를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공을 확장하는 단계는 팽창제를 이용하여 수행되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 팽창제는 트리메틸벤젠(trimethylbenzene; TMB)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 제조방법이 단순하여 대량 합성이 용이한 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 실험실 기구를 이용할 경우 상기 제조 방법에 의해 1 회 합성에 적어도 약 1 g 이상을 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 다공성 실리카 나노입자의 기공을 확장하는 단계는, 상기 다공성 실리카 나노입자에 트리(C1-6 알킬)벤젠을 처리하여 기공을 확장시키는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 트리(C1-6 알킬)벤젠은 트리메틸벤젠, 트리에틸벤젠, 트리프로필벤젠, 트리부틸벤젠, 트리펜틸벤젠, 또는 트리헥실벤젠을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자에 트리(C1 -6 알킬)벤젠을 처리하여 기공을 확장시키는 단계는, 상기 다공성 실리카 나노입자와 트리(C1-6 알킬)벤젠이 포함된 혼합물을 약 80℃ 내지 약 200℃의 온도에서 가압처리하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 다공성 실리카 나노입자에 트리(C1-6 알킬)벤젠을 처리하여 기공을 확장시키는 단계는, 상기 다공성 실리카 나노입자와 트리(C1-6 알킬)벤젠이 포함된 혼합물을 약 80℃ 내지 약 200℃, 약 80℃ 내지 약 160℃, 약 80℃ 내지 약 120℃, 약 120℃ 내지 약 200℃, 약 160℃ 내지 약 200℃, 또는 약 120℃ 내지 약 160℃의 온도에서 가압처리하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 기공을 확장시키는 단계에 의하여 약 5 nm 미만의 크기를 가지는 기공이 약 5 nm 내지 약 30 nm의 크기를 가지는 기공으로 확장될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 2 측면은, 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 RNA를 포함하는 약물전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 약물전달방법을 제공할 수 있다.
예를 들어, 상기 약물전달용 조성물이 목적 세포 내로 도입되는 것은 세포의 흡수(endocytosis)작용에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 약물전달용 조성물은 세포질 내 또는 핵 내로 도입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 약물전달용 조성물이 목적 세포 내로 도입되는 것은, 상기 약물전달용 조성물에 포함된 RNA가 목적 세포 내에서 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자로부터 해리되는 것을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 RNA는 siRNA, miRNA, tRNA, mRNA, sRNA, 또는 rRNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 miRNA(micro RNA)는 세포 내에서 특정 유전자의 전사후 발현억제를 유발하는 RNA의 일종이고, tRNA는 세포 내 번역에 관여하는 전달 RNA이고, mRNA는 DNA의 유전정보가 전사된 RNA이고, rRNA는 리보솜을 구성하는 RNA이며, sRNA는 상기 tRNA, mRNA, 및 rRNA를 제외한 작은 RNA 종류들을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 siRNA(small interfering RNA)는 진핵생물의 세포 내에서 RNAi(RNA interference) 경로를 촉발시키는 핵산의 종류이다. RNAi(RNA interference)는 필요없는 유전자의 발현을 조절하기 위하여 목적 mRNA를 절단하는, 진핵세포에 보존된 유전자 억제 메커니즘이다. 1998년에 Fire, Mello와 그 동료들에 의해 예쁜꼬마선충(C.elegans)에서 이러한 메커니즘이 발견된 이후로, 기초적인 생물학적 의문을 해결하기 위하여, 그리고 생체의학 분야에의 적용을 위하여 많은 연구가 진행되었다. 특히, RNAi는 기존의 저분자에 기초한 의약에 의하여는 치료가 불가능하다고 여겨졌던 질병들에 대한 대체치료에 있어 커다란 기회를 제공하는 것으로 생각되었다.
RNAi 경로는 진핵세포의 세포질에 외인성 siRNA가 도입됨으로 인해 촉발된다. siRNA는 보통 21 개 내지 23 개의 핵산에 의하여 구성되어 있으며 3'-말단에 2 염기 내지 3 염기로 돌출된 단일가닥(overhang)을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 siRNA는 동물 세포에 내재되어 있는 RNAi 기작을 이용하여 바이러스 감염에서 종양에 이르는 넓은 범위의 질병에 대한 강력한 유전자 치료제가 될 수 있으며, 이론적으로는 비정상적인 유전자의 과발현에 의해 발생하는 모든 질병에 대한 강력한 유전자 치료제가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 세포 내에 siRNA를 도입함으로써 목적 mRNA를 절단하여 목적 유전자의 발현을 저해할 수도 있지만, 목적 유전자의 전사 및/또는 목적 유전자의 단백질로의 번역을 억제하는 유전자의 mRNA에 대한 siRNA를 도입함으로써 목적 유전자의 발현을 유도할 수도 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 siRNA는 GFP(green fluorescent protein), VEGF(vascular endothelial growth factor), Oct3/4, c-myc, Klf4(Kruppel-like factor 4), Sox2(SRY-box 2), Ras, Tert(telomerase reverse transcriptase), Bcl2(B-cell leukemia/lymphoma 2), LMNA(lamin A/C), CDH13(Cadherin 13; H-cadherin; or T-cadherin), NS3 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 발현을 저해하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, GFP 유전자는 모델 유전자로서 사용되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 VEGF(혈관내피성장인자) 유전자는 암 치료 관련 유전자로서, VEGFA, VEGFB, 또는 VEGFC 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. VEGF 단백질은 내피세포의 VEGF 수용체에 결합하여 내피세포를 활성화시켜 혈관의 생성을 촉진하여 빠르게 성장하는 혈관의 신생혈관생성(angiogenesis)에 중요한 역할을 수행하는 신호 전달 단백질이다. 종양의 성장에서 VEGF는 중요한 역할을 하므로, 암 치료에서 VEGF의 발현 억제 또는 기능 억제는 중요한 해결과제이다. 예를 들어, 암세포에서 VEGF의 발현이 억제될 경우, 암세포의 혈관 생성이 억제되고 혈액 공급이 부족해져 암세포의 성장이 저해될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, Oct3/4, c-myc, Klf4, Sox2, 또는 Ras는 과발현될 경우 세포의 암화를 초래할 수 있고, 세포의 비정상적인 성장 또는 분화와 관련된 유전자일 수 있으며, 암세포에서 주로 발현되는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 GFP, VEGF, Oct3/4, c-myc, Klf4, Sox2, Ras, Tert, Bcl2, LMNA, 또는 CDH13 유전자는 인간을 포함하는 동물의 세포에서 발현되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 NS3 유전자는 C형간염 바이러스(Hepatitis C virus; HCV)의 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 siRNA는 서열 특이적으로 유전자의 발현을 저해할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약물전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은 상기 약물전달용 조성물을 세포 배양액에 첨가하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약물전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은 상기 약물전달용 조성물을 혈관 내 투여, 경구투여, 또는 주사에 의한 국부투여에 의하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 혈관 내 투여에 의하면 순환계를 통하여 몸 전체에 약물을 전달하는 것이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 경구투여에 의하면 주로 소화계로의 약물전달이 용이해질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 주사에 의한 국부투여는 눈, 피부, 점막, 또는 국부적인 종양 조직과 같은 국소적이고 국부적 조직에의 적용이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 국부투여시 높은 생물학적 적용 가능성, 목적 조직에의 접근성, 및/또는 전신 적용시 일반적으로 수반되는 부작용을 줄일 수 있다. 예를 들어, 상기 국부 투여의 타겟이 되는 질병에는 시력 감퇴, 아토피성 피부염, 헌팅턴병, 만성 통증, 또는 다형교아증 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
다공성 실리카 나노입자( mesoporous silica nanoparticle ; MSN )의 합성
세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide; CTAB) 3.94 g과 1 M의 수산화나트륨(NaOH) 용액 2.28 ml을 메탄올과 물의 혼합 용액 800 g (메탄올:물=0.4:0.6, w/w)에 용해시켰다. 다음으로 상기 수득된 용액을 격렬하게 교반하면서 테트라메톡시실란(tetramethoxysilane; TMOS) 1.3 ml을 대기 조건에서 상기 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 8 시간 동안 교반한 뒤 밤새 숙성시켰다. 그 결과 수득된 백색 침전물을 원심분리하여 남아있는 계면활성제를 제거하여 정제하였으며, 에탄올과 물을 각각 이용하여 다섯 번씩 세척하였다. 상기와 같이 제조된 다공성 실리카 나노입자를 20 ml의 에탄올에 현탁시키고, 4 ml의 염산을 첨가하였다. 이어서, 상기 현탁액을 밤새 환류시켜 백색 분말을 수득하였다. 상기 생성된 백색 분말을 필터로 걸러 분리하고 에탄올로 세척하여 2 nm의 기공 크기를 가지는 다공성 실리카 나노입자(MSN2)를 수득하였다.
다공성 실리카 나노입자의 기공 확장
기공 크기 23 nm의 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자(MSN23)를 준비하기 위하여, 상기 실시예에 의하여 제조된 다공성 실리카 나노입자를 에탄올에서 30 분간 초음파 처리하여 분산시키고, 물과 트리메틸벤젠(trimethylbenzene; TMB)을 첨가하였다 (1:1 혼합비(v/v)로 총 20 ml). 이후 상기 혼합물을 가압처리기(autoclave)에 넣고 140℃에서 4일간 유지하였다. 이로써 생성된 백색 분말은 에탄올과 물을 이용하여 다섯 번씩 세척하였다. 이후, 상기와 같이 제조된 다공성 실리카 나노입자를 20 ml의 에탄올에 현탁시키고, 4 ml의 염산을 첨가하여 밤새 용액에서 환류시킴으로써 유기 계면활성제를 제거하였다.
도 2a에서 보여지는 바와 같이, 상기 생성된 MSN23을 투과전자현미경에 의해 관찰한 결과 MSN23은 MSN2에 비하여 다수의 큰 기공을 포함하는 더욱 거친 표면을 가진다는 것이 관찰되었다.
MSN2 와 MSN23 의 표면 특성 분석
MSN의 표면적, 기공 크기, 및 기공 부피의 물리적 특성 분석을 위하여 질소 흡착 실험이 진행되었다. 질소 흡착 등온선은 NOVA 흡착 장치에 의하여 측정되었다.
표면적은 Brunauer-Emmett-Teller(BET) 방법에 의해 계산되었는데, 도 2b에 보여지는 바와 같이 MSN2 의 표면적은 1337 m2/g 이었고, MSN23의 표면적은 395 m2/g로 나타났으며, 이로써 예상하였던 바와 같이 기공의 확장에 의하여 표면적이 감소되었음을 확인할 수 있었다. 또한 상기 MSN의 기공 크기의 범위는 Barrett-Joyner-Halenda(BJH) 방법에 의하여 계산되었는데, MSN2 와 MSN23의 평균 기공 크기는 각각 2.2 nm 와 23 nm로 계산되었다(도 2b).
실리카 나노입자의 아민 기능화와 형광물질 결합
MSN2와 MSN23 각 100 mg을 톨루엔에 현탁시키고 아민 기능화를 위하여 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES) 1 ml을 첨가하였다. 상기 현탁액을 밤새 환류시킨 후, 필터를 이용하여 여과하고, 잔여물을 에탄올로 씻어내어 아민에 의해 기능화된 MSN2와 MSN23을 수득하였다. 상기 아민 기능화 후 원소 분석에 의해 질소와 탄소의 상대량을 측정함으로써 MSN2 및 MSN23의 아민화 정도를 측정한 결과, 상기 MSN2 및 상기 MSN23은 각각 그램당 비슷한 양의 아민(3.5 mmol/g)을 가지는 것으로 나타났다. 상기 아민이 결합된 MSN2 및 MSN23 각 30 mg을 DMSO 1 ml에 현탁시키고 2.5 mg/ml 농도로 DMSO에 포함된 N-hydroxysuccinimide(NHS)-activated carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) 용액 10 ㎕을 현탁액에 첨가하였다. 상기 용액을 3시간 동안 교반한 후 원심분리하여 핑크색의 분말을 얻었다. 상기 분말을 에탄올과 물을 이용하여 다섯 번씩 세척하여 형광물질인 TAMRA가 결합된 아민 기능화 MSN2 및 MSN23(TAMRA-conjugated MSN; T-MSN)을 수득하였다.
실리카 나노입자의 PEG 처리
MeO-PEG-NH2 (분자량 5000 g/mol, Sunbio Inc.)를 같은 양의 3,3'-디티오디프로피오닉 애시드 디(N-하이드록시수시니미드 에스터)[3,3′-dithiodipropionic acid di(N-hydroxysuccinimide ester)]와 반응시키고 밤새 실온에서 정치시켰다. 상기 반응 혼합물은 정제작업 없이 T-MSN23의 현탁액에 첨가되었고, 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후 상기 현탁액은 에탄올과 물을 이용하여 다섯 번씩 세척하였다. 이로써 수득된 고체는 진공에서 건조한 후 핵산분해효소가 없는 물(nuclease-free water)에 분산시켜 PEG 처리된 T-MSN23(PEGylated T-MSN23; P-T-MSN23)을 수득하였다.
겔 지연 분석( Gel retardation assay )
siRNA-MSN 복합체를 제조하기 위하여, 100 pmol의 siRNA를 정해진 양의 P-T-MSN23와 함께 4℃의 PBS에 넣어 인큐베이션하였다. 1시간 후, 각각의 혼합물에 RNA 염색 시약을 첨가하고, 상기 혼합물을 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하였다. 겔 전기영동은 90 V에서 30분간 TBE(Tris/borate/EDTA) 버퍼에서 수행되었으며, RNA 밴드는 자외선조사기(trans-illuminator)에서 가시화되었다.
MSN2 와 MSN23 의 siRNA 의 수용 능력 비교
siRNA의 MSN에의 흡착 및 MSN의 수용 능력은 제타 전위의 측정과 겔 전기영동에 의하여 분석되었다. 상기 겔 전기영동 실험 결과 P-T-MSN2의 siRNA의 수용 능력은 무시할 수 있을 정도로 미미하였으므로, 본 실시예에서는 P-T-MSN23과 T-MSN2의 siRNA 흡착 및 수용 능력을 비교하였다.
도 3a 에 의하면, T-MSN2에 siRNA가 도입되면서 제타 전위는 8.1 mV에서 -6.49 mV로 변화된 반면, P-T-MSN23의 경우에는 제타 전위가 19.4에서 2.54 mV로 변화되었는데, 이는 P-T-MSN23은 T-MSN2와 달리 음전하를 띠는 siRNA가 도입된 후에도 여전히 양의 제타전위값을 유지한다는 것을 보여준다. 각각의 입자의 siRNA의 수용 능력은 전기영동 후에 겔에 남겨진 미부착 siRNA 밴드의 상대적 강도를 측정하여 계산되었다. P-T-MSN23과 siRNA의 복합체는 T-MSN2와 siRNA의 복합체보다 2 배 높은 siRNA의 수용능력을 보여, P-T-MSN23이 T-MSN2보다 siRNA 전달 시스템으로서 유용하다는 것을 나타내었다.
다음으로, MSN의 제타 전위와 siRNA의 도입에 대하여 생리화학적인 차이를 연구하였다. siRNA와 아민에 의해 기능화된 MSN은 서로 반대 전하를 띠므로, siRNA가 MSN에 도입되는 데에 있어서 정전기적 인력이 주된 영향력일 것으로 예상되었므로 용매에 분산된 MSN의 차폐 정전기 포텐셜을 나타내는 제타 전위는 MSN의 표면 전하 밀도에 비례할 것으로 기대되었다. MSN2의 표면적[외부(0.14 ㎛2)+ 기공 표면(17 ㎛2) ≒ 17.1 ㎛2]은 MSN23의 표면적[외부(0.17 ㎛2)+ 기공 표면(2.7 ㎛2) ≒ 2.9 ㎛2]보다 넓을 것으로 추측되었으며 MSN2와 MSN23에 포함된 아민기의 양도 비슷하였다. 42 개의 염기를 가지는 siRNA는 인산기에 의하여 음의 유효전하(Zeff)를 가지고, siRNA 분자의 MSN에의 흡착에 의한 자유에너지 안정화는 εint = - Zeff eζ이다[여기에서, e는 전기소량(e ≒ 1.602 × 10-19 C)이고 ζ는 제타전위이다]. 계산은 입자가 TAMRA나 PEG에 의하여 변형되지 않았음을 가정하고 수행되었다. Poisson-Boltsmann 방정식에 의해 도출된 세부적인 전위는 MSN2의 내부가 외부 표면의 전위보다 높은 값을 가짐을 보여주었다. 이러한 내부와 외부 전위의 상대적 차이는 기공의 크기가 작아짐에 따라 증가하였다. 반대 이온에 의한 아민 전하의 차단은 MSN2에서와 같이 RP가 디바이(debye) 차폐 길이와 비슷하거나 작아지면 효과가 없다(RP = 1.05 nm ≒ κ - 1 ≒ 1 nm). 기공을 향한 강력한 전기장에도 불구하고, siRNA의 크기보다 작은 기공의 반경에 의하여 기공 내로의 siRNA의 유입이 차단되었다(siRNA의 회전 반경 RG, RP < RG ≒ 2.0 nm). 반면에, siRNA보다 큰 기공 크기를 가지는 MSN23에서는(RG < RP) siRNA가 자유롭게 기공 속으로 들어가 기공의 벽에 붙을 수 있음을 보여주었다. 비록 생리화학적 계산 결과는 siRNA가 기공 내로 원활하게 도입되었음을 제시하나, siRNA가 MSN의 표면에 흡착될 가능성까지 완전히 제외할 수는 없었다. 그러나, 비록 약간의 siRNA가 MSN의 표면에 흡착되었다고 하여도, 대부분의 siRNA는 기공 내로 도입되었을 것으로 예측되었다 (도 3 b).
MSN - siRNA 복합체의 RNase 에 대한 저항성 실험
본 실시예에서는 RNase-매개 siRNA의 분해에 대한 siRNA-MSN 복합체의 저항성을 측정하였다. 핵산분해효소로부터의 siRNA의 보호는 siRNA 전달체로서 임상적 의의가 있는 중요한 요소이다. siRNA가 분해되는 정도는 최종농도 25 pmol의 GFP siRNA를 20 ㎍의 MSN과 함께 50 ㎕의 PBS에 첨가하여 생성된 siGFP-T-MSN2와 siGFP-P-T-MSN23 복합체를 이용하여 측정하였다. 상기 복합체를 최종농도 0.05%의 RNase 존재하에 37℃의 온도에서 1 시간 또는 2 시간 동안 인큐베이션 한 후, 헤파린 처리하여 siRNA가 입자로부터 떨어지도록 한 뒤 겔 전기영동을 수행하여 siRNA의 분해 정도를 측정하였다. 도 4의 하단 가운데 사진에서 보여지는 겔 이미지에서, P-T-MSN23에 도입된 siRNA는 RNase 존재하에 37℃에서 1 시간 동안 유지되었음에도 불구하고 손상되지 않았으나, T-MSN2에 도입된 siRNA는 완전히 분해되었음을 보여주며, 이는 상기 P-T-MSN23의 경우 siRNA는 기공 내로 도입되었으며 이에 따라서 도 4의 상단 이미지와 같이 RNase가 siRNA에 닿는 것을 막아준다는 것을 의미한다. 그러나 RNase 존재하에 2 시간 동안 유지된 siRNA-P-T-MSN23에서는 상당한 siRNA의 분해가 유발되었는데 (도 4의 하단 우측 사진 참조), 이는 인큐베이션 시간이 길어짐에 따라 부착 상태와 미부착 상태 간의 평형을 이룸으로써 느리지만 지속적인 siRNA의 해리가 일어남에 인한 것으로 판단되었다. 60 ㎍의 헤파린을 10 ㎕의 PBS에 포함된 10 ㎍의 siRNA-MSN에 사용하였을 경우 도입된 siRNA 는 단 5 분간의 인큐베이션에 의해서도 완전히 분해되었다.
MSN 의 세포독성검사
본 실시예에서 P-T-MSN23의 세포독성 검사는 HeLa(American Type Culture Collection; ATCC, Manassas, VA, USA) 세포에 상기 P-T-MSN23을 처리한 후의 생존을 CCK-8 분석을 이용하여 수행하였다. 상기 HeLa 세포는 P-T-MSN23을 처리하기 24시간 전에 98 웰 세포 배양 접시에 웰 당 1 x 104 세포의 농도로 심어졌다. 24시간 동안 배양한 후, 세포에 다양한 농도의 P-T-MSN23이 처리되었고, 대조군 세포는 동일한 부피의 PBS가 처리되었다. 24시간 후, 배지를 제거하고, 무혈청 배지 100 ㎕와 CCK-8 용액 10 ㎕을 각 웰 별로 첨가하였다. 세포는 1 시간 동안 배양되었다. 포마잔(formazan)염의 450 nm 파장에서의 흡광도가 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Inc., USA)를 이용하여 측정되었다. 실험은 3회 반복 수행되었으며, 데이터는 평균 값에 평균 표준 오차를 가감하여 표시되었다.
세포독성실험 결과, 상기 P-T-MSN23은 심지어 대표적으로 사용된 농도(80 ㎍/ml)에서보다 훨씬 높은 농도(640 ㎍/ml)에서도 세포의 생존을 저하시키지 않았다(106 ± 5.3%).
세포의 배양
HeLa 세포, GFP-발현 HeLa 세포, 및 MDA-MB-231세포(American Type Culture Collection; ATCC, Manassas, VA, USA)는 D-글루코스(D-glucose)를 포함한(4.5 g/L) DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 10%의 우태아혈청(FBS), 페니실린(100 유닛/ml), 그리고 스트렙토마이신(100 g/ml)을 첨가한 배지에서 배양되었다. 상기 세포들은 가습 배양기에서 5%의 이산화탄소와 37℃의 온도 하에서 유지되었다.
GFP siRNA ( siGFP )를 포함한 MSN 에 의한 시험관 내 GFP 사일런싱 ( GFP silencing ) 실험
모델유전자인 GFP를 발현하도록 형질전환된 HeLa 세포는 24 웰(well) 세포 배양 접시에 웰 당 2 x 104개 세포의 밀도로 형질도입 24 시간 전에 심어졌다. siGFP-입자 복합체는 PBS내 25 pmol의 GFP siRNA를 20 ㎍의 P-T-MSN23과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 준비하였다. 각각의 혼합물(총 부피 5 ㎕)은 무혈청 배지 245 ㎕에 희석되었다. 무혈청 배지 또는 혈청을 포함한 배지 250 ㎕에 포함된 siGFP 복합체는 세포에 첨가되었고 37℃에서 8 시간 동안 배양하였다. 그 후 상기 세포를 PBS로 세척하여 추가로 48 시간 동안 새로운 혈청 포함 배지 500 ㎕과 함께 배양하였다. 이후의 배양, 유전자 발현 저하 및 세포 내로의 흡수는 형광현미경(Nikon Co., JAPAN)과 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 형광 이미지와 투과전자현미경 이미지는 세포질 내부로 도입되어 존재하는 MSN23을 보여주었으며, 이들은 특히 핵 주변 부위에 주로 존재한다는 것을 보여주었다. 유전자 발현 저하 효율의 정량화를 위하여, 상기 세포를 PBS로 세척하고 트립신 처리한 뒤 채취하였다. 상기 세포 샘플은 4℃에서 원심분리되었고 차가운 PBS로 세척되었다. 원심분리된 후, 가라앉은 세포를 1%의 우태아혈청을 포함하는 PBS로 현탁시킨 뒤, 상기 현탁액을 필터링하여 분리하였다. 형광 강도는 아르곤 레이저를 구비한 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, USA)를 이용하여 유세포 분석에 의해 측정되었다. 형광 강도는 GFP의 형광의 평균값을 나타낸다. 측정 결과, 상대적인 GFP 발현 정도는 GFP의 평균적인 형광에 기초하였을 때, T-MSN2와 P-T-MSN23에서 각각 69%와 15%로 분석되었으며, 이에 따라 상기 P-T-MSN23이 상기 T-MSN2보다 siRNA 전달체로서 더욱 큰 가능성을 가짐을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
siRNA 의 농도에 따른 유전자 사일런싱(silencing)과 Lipofectamin 과의 비교
본 실시예에서는 siRNA의 농도에 따른 유전자 사일런싱을 실험하였으며, P-T-MSN23과 Lipofectamine(Lipofectamine 2000)에 의한 목적 유전자의 억제 정도 및 혈청 단백질의 효과를 비교하였다. 도 6에서 보여지는 바에 따르면, 대조군 세포와 비교하였을 때 50 nM과 100 nM의 siGFP와 복합체를 이룬 P-T-MSN23를 무혈청 배지에서 처리시 GFP 유전자의 평균 발현률은 각각 26%와 12%로 감소하였다. 유전자의 억제는 10%의 혈청의 존재 하에서도 농도에 의존적으로 나타났으나, 효율이 약간 떨어졌다. GFP 발현을 12%까지 저하시킨 상기 P-T-MSN23에 의한 siGFP 전달의 효율은, 상기 Lipofectamine에 의한 siGFP의 전달 효율(GFP 발현을 30%까지 저하)보다도 상당히 높았다. 상기 P-T-MSN23의 세포 내 흡수 및 GFP의 상대적인 발현 수준은 형광현미경 이미지에 의하여 추가적으로 확인되었는데 (도 7 참조), P-T-MSN23만을 처리한 대조군 세포와 비교하였을 때 siGFP-P-T-MSN23을 처리한 HeLa 세포는 녹색 형광을 거의 발현하지 않았으며, 입자들이 핵 주변 부위에 뭉쳐있는 것이 상기 P-T-MSN23에 처리된 TAMRA로부터 발현되는 적색 형광의 관찰로 확인되었다.
추가적으로, MSN의 표면에 세포 침투성 펩타이드(MPAP, myristoylated poly arginine peptide)를 적용하였을 때 GFP 발현 저하 효율의 상승이 관찰되지 않은 바, 본 siRNA 전달 시스템은 유전자 발현 저하 효율 상승을 위하여 추가적인 표면 처리를 필요로 하지 않는 것으로 보여졌다.
VEGF siRNA ( siVEGF )를 포함하는 MSN 에 의한 시험관 내 VEGF 사일런싱 ( VEGF silencing ) 실험
VEGF mRNA의 발현 수준은 reverse transcription-PCR(RT-PCR) 분석을 이용해 측정되었다. MDA-MB-231(American Type Culture Collection; ATCC, Manassas, VA, USA) 세포는 MSN 도입 24 시간 전에 12 웰 세포 배양 접시 상에 웰 당 4 x 104 개 세포의 밀도로 심어졌다. 상기 세포를 24 시간 동안 배양한 후, 무혈청 DMEM으로 배지를 교환하고, MSN(80 ㎍/ml)과 50 nM 또는 100 nM siVEGF의 복합체, MSN 과 100 nM siGFP 복합체, 100 nM siVEGF-Lipofectamine 복합체 등 다양한 나노입자 복합체 각각 5 ㎕를 세포에 처리하였다. 이후 4 시간 동안 세포를 배양하고, 상기 배지를 제거한 후 혈청을 포함하는 배지로 교환하였다. 세포는 20 시간 후 트립신 처리하여 채취되었다. Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 총 RNA를 분리하였다. RT-PCR은 Super-Script II RT kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 수행되었다. 상기 RT-PCR은 하기 열 순환 조건에 따라 수행되었다: cDNA 합성: 5 분간 65℃, 2 분간 42℃, 50 분간 42℃에서 한 사이클, 비활성화: 15 분간 70℃, 변성: 2 분간 94℃에서 한 사이클, PCR 증폭: 20 초간 94℃, 30 초간 60℃, 30 초간 72℃에서 32 사이클, 최종 신장: 5 분간 70℃에서 한 사이클. 탐지를 위한 인간 VEGF의 PCR 프라이머(forward, 5′-AGGAGGGCAGAATCATCACG-3 ′; reverse, 5′-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3′)와 인간 β-actin의 프라이머 (forward, 5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3′; reverse, 5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTT-3′)는 Genotech, Inc. (Daejeon, Korea)의 프라이머를 사용하였다. 상기 VEGF와 상기 β-actin의 PCR 산물의 크기는 각각 522 염기와 1153 염기였다. 상기 PCR 산물은 0.8%의 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분리되었다.
상기 24 시간의 배양 후 각 샘플에서의 상기 VEGF mRNA 수준은 반정량적인 RT-PCR에 의해 분석되었는데, 도 8에서 보여지는 바에 따르면 농도에 따른 VEGF 발현의 저하[3열(50 nm의 siVEGF) 및 4열(100 nm의 siVEGF)]가 관찰되었다. 상기 VEGF mRNA 수준은 siVEGF와 함께 처리된 세포에서만 저하되었으며 siGFP와 함께 처리된 세포에서는 저하되지 않았는데, 이는 상기 VEGF mRNA 수준의 저하가 상기 siVEGF에 의해 서열특이적으로 유발되었다는 것을 의미한다. 상기 siVEGF-P-T-MSN23 복합체는 Lipofectamine 시스템에 의한 siVEGF보다 효과적으로 VEGF 유전자의 사일런싱을 유발하였는데, 이는 동일한 농도의 siVEGF가 사용된 경우의 희미한 밴드와 밝은 밴드에 의해 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 GFP 유전자 발현 저하의 결과와 동일하였다.
GFP siRNA 를 포함하는 MSN 에 의한 생체 내 GFP 사일런싱 ( GFP silencing ) 실험
본 실시예에서는 siRNA 전달 시스템의 생체 내 적용 가능성을 확인하기 위하여 GFP를 발현하는 HeLa 세포와 MDA-MB-231을 이용한 이종 이식을 통하여 실험하였다. 모든 동물의 사육과 실험 과정은 KAIST의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다. 생체 내 광학 이미징을 위하여, PBS에 현탁한 상기 HeLa 세포(종양당 2 x 106 개 세포)를 암컷 누드 마우스의 옆구리 부위에 피하주사하여 이종이식 종양모델을 생성하였다. 종양의 직경이 약 5 mm에 도달하였을 때, P-T-MSN23과 복합체를 형성한 GFP siRNA(1 nmol)를 PBS에 현탁하여 종양 내에 2회 주사하였다(하루에 1회). 대조군은 동일한 양의 MSN23을 siRNA를 제외하고 PBS에 현탁시켜 주사하였다. 마지막 주입으로부터 4일 후, 상기 종양의 GFP 발현을 IVIS Lumina imaging system (Xenogen, USA)를 이용하여 가시화하였다. 적출된 상기 종양조직 역시 IVIS Lumina imaging system (Xenogen, USA)를 이용하여 관찰하였다. 상기 종양조직은 고정되어 파라핀 내에 고정되고, 5 ㎛ 두께로 박리되어 다시 수화되었다. 상기 조직 절편은 DAPI로 염색되고 형광 도립 현미경(Nikon Co., Japan)을 이용하여 분석하였다.
도 9a는 상기 GFP를 발현하는 HeLa 세포가 이종 이식된 쥐에서 siGFP-P-T-MSN23이 종양 내로 주입되기 전과 후의 생체내 형광 이미지를 보여준다. 대조군으로는 PBS가 주입되었다. 상기 siGFP-P-T-MSN23이 처리된 이종 종양의 GFP의 녹색 형광 강도가 PBS를 처리한 것에 비하여 감소한 것이 명확하게 관찰되었다(도 9b). GFP로부터 발광되는 형광의 감소는 상기 적출된 종양에서도 관찰되었으며, 형광은 42%로 감소되었다. P-T-MSN23 단독으로, 그리고 상기 siGFP-P-T-MSN23 복합체가 처리된 이종 이식 종양의 조직 박편을 형광현미경 하에서 관찰하였다. TAMRA의 밝은 적색 형광 형광이 두 종양 박편 이미지 모두에서 관찰되었다. 그러나, GFP로부터 발광되는 녹색 형광은 상기 siGFP-P-T-MSN23이 처리된 종양 박편에서 뚜렷하게 감소하였으며, 이는 P-T-MSN23에 의해 매개된 기능성 siGFP 전달이 생체 내에서 성취되었으며 그러한 GFP 유전자의 사일런싱은 siGFP와 P-T-MSN23의 복합체에 의한 것이고 P-T-MSN23 단독에 의한 것이 아니라는 것을 보여주었다(도 10 참조).
VEGF siRNA 를 포함하는 MSN 에 의한 생체 내 VEGF 사일런싱 ( VEGF silencing ) 실험
이종이식 종양모델은 PBS에 현탁된 MDA-MB-231세포(종양당 2 x 106개 세포)를 암컷 누드 마우스의 옆구리에 피하주사하여 생성하였다. 종양의 부피가 약 50 mm3에 도달하였을 때, P-T-MSN23와 VEGF siRNA 복합체 1 nmol을 PBS에 현탁하여 0 일차, 5 일차, 10 일차, 그리고 20 일차에 상기 종양 내로 주입하였다. 대조군은 PBS 내에 동일한 양의 siRNA를 현탁하여 주입하였다. 상기 종양의 부피는 디지털캘리퍼스를 이용하여 직경을 측정하여 하기의 식에 의하여 종양 성장 경향을 계산하였다 [종양 부피= 장축 x (단축)2 x (π/6)]. 최초 주입으로부터 30 일 경과 후, 상기 종양은 적출되어 IVIS Lumina imaging system 을 이용하여 MSN의 존재 여부를 확인하였다. 상기 종양 조직은 무게를 달고 균질화(homogenize)된 후, 상기 종양 내부의 VEGF mRNA 수준을 측정하기 위하여, Trizol을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 총 RNA를 상기 종양 조직으로부터 분리하였다. RT-PCR이 세 가지의 조직을 이용하여 수행되었다. 수행 방법은 상기 기술한 바와 동일하다. 상기 조직은 고정되고, 파라핀 내에 고정된 후, 5 ㎛ 두께로 박리되어 다시 수화되었다. 전처리로서 시트르산 버퍼 조건 하에 가열하였고, 상기 조직 절편은 1%의 우혈청알부민(BSA)을 포함한 PBS와 함께 인큐베이션한 후 CD31 항체와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 상기 절편들은 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody와 함께 인큐베이션된 후 세척되어 DAPI와 함께 고정시켰다. 상기 절편은 60배(1.4 수치의 조리개)의 대물렌즈(Nikon Co., 일본)와 CoolSNAP CCD 카메라(Photometrics, Tucson, AZ)를 장비한 형광 도립 현미경에 의하여 분석되었다.
상기 종양의 성장 과정을 보여주는 도 11에 의하면 siVEGF-P-T-MSN23을 처리한 종양이 siVEFG 단독으로 또는 PBS만을 처리한 종양에 비하여 성장이 저하된 것을 관찰할 수 있다. PBS, siVEGF 단독, 그리고 siVEGF-P-T-MSN23 복합체를 처리한 상기 종양을 적출하여 무게를 잰 결과 각각 240 g, 190 g, 그리고 52 g이었다. 최초 주입으로부터 30 일이 도과한 후 적출된 상기 종양을 이용하여 VEGF mRNA의 수준을 RT-PCR로 측정하였다. 도 12에서 보여지는 바에 따르면, siVEGF-P-T-MSN23 처리한 종양의 경우 PBS 또는 siVEGF 단독으로 처리한 경우보다 VEGF mRNA 수준의 저하가 더욱 뚜렷하게 관찰되었다.
추가적으로, siVEGF에 의해 유발된 RNAi 기작에 의한 혈관 생성 저해 효과를 평가하기 위하여 siRNA 복합체를 처리한 이종이식 종양의 박편에서 혈관을 가시화하기 위한 항-CD31 항체를 이용하여 면역조직화학법을 수행하였다. 상기 종양 박편의 형광현미경 이미지 관찰 결과, siVEGF-P-T-MSN23 복합체를 처리한 종양에서 항-CD31에 의한 염색이 매우 약하게 나타난 반면 대조군의 종양은 항-CD31에 의하여 밝은 형광을 나타내었는데, 이는 siVEGF-P-T-MSN23 복합체는 혈관성장을 저해한다는 것을 나타낸다 (도 13 참조). 전체적으로, 본 P-T-MSN23에 기반한 siRNA 전달 시스템은 모델 유전자인 GFP와 치료 목적 유전자인 VEGF 모두에서 효과적인 것으로 나타났으며, 생체 내 이종이식 모델에서의 혈관 성장 저해에 관한 RT-PCR 결과는 siVEGF 매개 유전자 사일런싱(gene silencing) 효율을 확증하였다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성요소들도 결합된 형태로 실시될 수도 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 RNA를 포함하는,
    약물전달(drug delivery)용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 RNA는 siRNA, miRNA, tRNA, mRNA, sRNA, 또는 rRNA를 포함하는 것인, 약물전달용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 표면에 양전하가 형성되어 있으며, 상기 RNA는 상기 양전하와의 정전기적 상호작용에 의해 상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착되는 것인,
    약물전달용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 표면이 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 의하여 기능화되어 있는 것인, 약물전달용 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는 100 nm 내지 300 nm의 크기를 가지는 것인, 약물전달용 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자의 기공의 크기는 5 nm 내지 30 nm인 것인, 약물전달용 조성물.
  7. 제 2 항에 있어서,
    상기 siRNA는 GFP, VEGF, Oct3/4, c-myc, Klf4, Sox2, Ras, Tert, Bcl2, LMNA, CDH13, NS3 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 발현을 저해하는 것인, 약물전달용 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자는,
    다공성 실리카 나노입자를 형성하는 단계; 및
    상기 다공성 실리카 나노입자의 기공을 확장하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인,
    약물전달용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 다공성 실리카 나노입자의 기공을 확장하는 단계는,
    상기 다공성 실리카 나노입자에 트리(C1-6 알킬)벤젠을 처리하여 기공을 확장시키는 것을 포함하는,
    약물전달용 조성물.
  10. 확장된 기공을 가지는 다공성 실리카 나노입자에 흡착된 RNA를 포함하는 약물전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 약물전달방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 RNA는 siRNA, miRNA, tRNA, mRNA, sRNA, 또는 rRNA를 포함하는 것인, 약물전달방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 siRNA는 GFP, VEGF, Oct3/4, c-myc, Klf4, Sox2, Ras, Tert, Bcl2, LMNA, CDH13, NS3및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자의 발현을 저해하는 것인, 약물전달방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 약물전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은,
    상기 약물전달용 조성물을 세포 배양액에 첨가하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인,
    약물전달방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 약물전달용 조성물을 목적 세포 내로 도입하는 것은,
    상기 약물전달용 조성물을 혈관 내 투여, 경구투여, 또는 주사에 의한 국부투여에 의하여 상기 목적 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 것인,
    약물전달방법.

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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190011701A (ko) * 2017-07-25 2019-02-07 주식회사 레모넥스 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물
KR102012469B1 (ko) * 2018-03-19 2019-08-20 한국과학기술연구원 siRNA 및 메조기공 실리카 나노입자가 금속 이온으로 결합된 siRNA 전달체, 이의 제조방법 및 용도
KR102050043B1 (ko) * 2018-08-09 2019-11-28 한국과학기술연구원 메조기공 실리카 입자 및 상기 입자의 표면 및 기공 내에 siRNA와 결합 가능한 금속이온을 포함하는 siRNA 전달체, 이의 제조방법 및 용도
WO2020027571A1 (ko) * 2018-07-31 2020-02-06 주식회사 레모넥스 상처 치료용 의약 조성물
WO2020027640A1 (ko) * 2018-07-31 2020-02-06 주식회사 레모넥스 Ctgf 발현 억제용 조성물
KR20200103568A (ko) * 2019-02-22 2020-09-02 주식회사 레모넥스 면역활성 또는 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물
WO2021020945A1 (ko) * 2019-07-31 2021-02-04 주식회사 레모넥스 항암제 및 다공성 실리카 입자의 제조방법
KR20210072741A (ko) * 2017-07-28 2021-06-17 주식회사 레모넥스 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
JP2021532769A (ja) * 2018-07-31 2021-12-02 レモネックス インコーポレイテッドLemonex Inc. Ｃｔｇｆ発現抑制用組成物
US11530132B2 (en) 2017-09-05 2022-12-20 Lemonex Inc. Composition comprising porous silica particles carrying a cell fate modulating factor
EP3831365A4 (en) * 2018-08-03 2023-05-10 Lemonex Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF ATOPIC DISEASES
US11786469B2 (en) 2014-07-22 2023-10-17 Cheolhee WON Silica nanoparticle composition for delivering bioactive material or protein such as a human proteasome
US11793757B2 (en) 2017-02-06 2023-10-24 Lemonex Inc. Physiologically active substance carrier

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11786469B2 (en) 2014-07-22 2023-10-17 Cheolhee WON Silica nanoparticle composition for delivering bioactive material or protein such as a human proteasome
US11793757B2 (en) 2017-02-06 2023-10-24 Lemonex Inc. Physiologically active substance carrier
KR20200086238A (ko) * 2017-07-25 2020-07-16 주식회사 레모넥스 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물
AU2021229131B2 (en) * 2017-07-25 2023-03-30 Lemonex Inc. Composition for delivering physiologically active ingredients into blood vessel
KR20200085246A (ko) * 2017-07-25 2020-07-14 주식회사 레모넥스 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물
AU2018308332B2 (en) * 2017-07-25 2021-11-18 Lemonex Inc. Composition for delivering physiologically active ingredients into blood vessel
JP2020528788A (ja) * 2017-07-25 2020-10-01 レモネックス インコーポレイテッドＬｅｍｏｎｅｘ Ｉｎｃ． 血管内生理活性物質送達用組成物
EP3659585A4 (en) * 2017-07-25 2020-12-02 Lemonex Inc. COMPOSITION FOR ADMINISTERING PHYSIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES INTO A BLOOD VESSEL
KR20190011701A (ko) * 2017-07-25 2019-02-07 주식회사 레모넥스 혈관 내 생리활성물질 전달용 조성물
JP2021106889A (ja) * 2017-07-25 2021-07-29 レモネックス インコーポレイテッドＬｅｍｏｎｅｘ Ｉｎｃ． 血管内生理活性物質送達用組成物
KR20210072741A (ko) * 2017-07-28 2021-06-17 주식회사 레모넥스 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US11530132B2 (en) 2017-09-05 2022-12-20 Lemonex Inc. Composition comprising porous silica particles carrying a cell fate modulating factor
KR102012469B1 (ko) * 2018-03-19 2019-08-20 한국과학기술연구원 siRNA 및 메조기공 실리카 나노입자가 금속 이온으로 결합된 siRNA 전달체, 이의 제조방법 및 용도
KR20220003495A (ko) * 2018-07-31 2022-01-10 주식회사 레모넥스 Ctgf 발현 억제용 조성물
JP2021532769A (ja) * 2018-07-31 2021-12-02 レモネックス インコーポレイテッドLemonex Inc. Ｃｔｇｆ発現抑制用組成物
WO2020027640A1 (ko) * 2018-07-31 2020-02-06 주식회사 레모넥스 Ctgf 발현 억제용 조성물
WO2020027571A1 (ko) * 2018-07-31 2020-02-06 주식회사 레모넥스 상처 치료용 의약 조성물
EP3831365A4 (en) * 2018-08-03 2023-05-10 Lemonex Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF ATOPIC DISEASES
KR102050043B1 (ko) * 2018-08-09 2019-11-28 한국과학기술연구원 메조기공 실리카 입자 및 상기 입자의 표면 및 기공 내에 siRNA와 결합 가능한 금속이온을 포함하는 siRNA 전달체, 이의 제조방법 및 용도
KR20200103568A (ko) * 2019-02-22 2020-09-02 주식회사 레모넥스 면역활성 또는 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물
WO2021020945A1 (ko) * 2019-07-31 2021-02-04 주식회사 레모넥스 항암제 및 다공성 실리카 입자의 제조방법

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