KR102050043B1 - 메조기공 실리카 입자 및 상기 입자의 표면 및 기공 내에 siRNA와 결합 가능한 금속이온을 포함하는 siRNA 전달체, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

메조기공 실리카 입자 및 상기 입자의 표면 및 기공 내에 siRNA와 결합 가능한 금속이온을 포함하는 siRNA 전달체, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 평균 직경 5 nm 이하의 미세 기공 및 10 내지 50 nm의 확장된 기공을 갖는 메조기공 실리카 나노입자(mesoporous silica nanoparticle, MSN) 및 상기 입자의 외부 표면 및 기공 내부 표면에 결합된 siRNA를 포함하는 siRNA 전달체로서, 상기 입자의 기공 내부 표면 및 외부 표면은 제1금속이온과 제2금속이온을 포함하여 이를 매개로 siRNA가 결합되는 것인, siRNA 전달체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 siRNA 전달체의 제조방법, 및 상기 siRNA 전달체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 siRNA 전달체는, 생물학적으로 안전한 칼슘 이온 등의 2가 금속 양이온을 사용하여, 종래의, 세포 독성을 가지므로 부작용을 유발할 수 있는, 아민을 이용한 기능화 없이 MSN 상에 siRNA를 로딩할 수 있다. 따라서, 본 발명의 siRNA 전달체는 우수한 생체적합성을 나타내며, siRNA를 안정적으로 세포 내로 전달할 수 있고, 공극 내에 추가의 약물을 담지함으로써, 유전자 및 약물을 동시에 전달하여 시너지적인 효과를 발휘할 수 있으므로, 암 치료를 위한 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 siRNA 전달체는 siRNA, 제1금속이온 함유 메조기공 실리카 나노입자 및 제2금속이온의 염을 단순 혼합하는 방법에 의해, 간편하고 원 포트로 제조될 수 있으며, 본 발명의 siRNA 전달체는 공극 및 입자의 크기, 및 표면 조성 등의 측면에서 다양한 성질을 갖는 넓은 범위의 실리카 입자에 대하여 확장될 수 있으므로, 신규한 유형의 siRNA 전달체 및 제조방법을 제공할 수 있다.

Description

메조기공 실리카 입자 및 상기 입자의 표면 및 기공 내에 siRNA와 결합 가능한 금속이온을 포함하는 siRNA 전달체, 이의 제조방법 및 용도{An siRNA delivery system comprising mesoporous silica particle and metal ions, to which siRNAs enable to bind, on the surface and within the pores of the particle, preparation method thereof and use thereof}
본 발명은 평균 직경 5 nm 이하의 미세 기공 및 10 내지 50 nm의 확장된 기공을 갖는 메조기공 실리카 나노입자(mesoporous silica nanoparticle, MSN) 및 상기 입자의 외부 표면 및 기공 내부 표면에 결합된 siRNA를 포함하는 siRNA 전달체로서, 상기 입자의 기공 내부 표면 및 외부 표면은 제1금속이온과 제2금속이온을 포함하여 이를 매개로 siRNA가 결합되는 것인, siRNA 전달체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 siRNA 전달체의 제조방법, 및 상기 siRNA 전달체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암 치료에 있어서, RNA 간섭(RNAi) 방법은 안티-아포토시스 유전자의 특이적 하향조절을 위해 유용한 도구를 제공한다. RNA 간섭 방법은 안티-아포토시스 유전자의 특이적 하향조절로서 암 치료에 사용된다. RNAi 메커니즘이 개시되기 위해, 짧은 간섭 RNA(siRNA)가 세포에 함입되어야 한다. 그러나, siRNA의 막 투과성이 낮고, 빠르게 파괴된다는 문제로 인해, 원하는 치료 효과를 달성함이 어렵다. 이에, siRNA를 세포 진입까지 보호하기 위한 많은 합성 수단이 시도되어 왔다.
일반적인 전달체(캐리어) 합성법으로서, 다가 음이온성 siRNA에 고분자 또는 지질 형태의 양이온 작용기 시스템을 이용하는 방법이 있다. 이러한 캐리어 시스템은 양이온으로서 많은 양의 아미노 기를 함유하게 되고, 이는 전신 투여시 세포독성, 면역원성과 같은 부작용을 일으킨다(J. Control. Release 114, 100-109 (2006)).
또는 메조기공 실리카 나노입자(MSN)를 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 음이온성인 siRNA를 로딩하기 위해 미개질된 MSN의 표면 음전하를 아민으로 기능화하는 것 등이 고려되었다(Small 8, 1752-1761 (2012)). 그러나 실리카 표면에 많은 아미노 기가 존재하면 전술한 바와 같은 단점이 나타나게 된다.
이에 본 발명자들은, MSN에 지지된 siRNA 전달 수단에 관하여 예의 연구노력한 결과, 음전하를 띤 MSN의 표면에 siRNA를 정전기적으로 부착하기 위하여 칼슘 등의 금속이온과 같이 생물학적으로 안전한 양이온을 사용함으로써, 매우 간편한 방법으로 MSN 상에 siRNA를 결합시킬 수 있음을 발견하였다. 또한, 이로써 로딩된 siRNA의 치료적 효과를 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, 평균 직경 5 nm 이하의 미세 기공 및 10 내지 50 nm의 확장된 기공을 갖는 메조기공 실리카 나노입자(mesoporous silica nanoparticle, MSN) 및 상기 입자의 외부 표면 및 기공 내부 표면에 결합된 siRNA를 포함하는 siRNA 전달체로서, 상기 입자의 기공 내부 표면 및 외부 표면은 제1금속이온과 제2금속이온을 포함하여 이를 매개로 siRNA가 결합되는 것인, siRNA 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 siRNA 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 siRNA 전달체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태는, 평균 직경 5 nm 이하의 미세 기공 및 10 내지 50 nm의 확장된 기공을 갖는 메조기공 실리카 나노입자(mesoporous silica nanoparticle, MSN) 및 상기 입자의 외부 표면 및 기공 내부 표면에 결합된 siRNA를 포함하는 siRNA 전달체로서, 상기 입자의 기공 내부 표면 및 외부 표면은 제1금속이온과 제2금속이온을 포함하여 이를 매개로 siRNA가 결합되는 것인, siRNA 전달체를 제공한다.
본 발명에서, 상기 "siRNA"는 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA)로서, 유전자 발현을 방해하며 특정 단백질의 생산을 억제하는 RNA 분자를 의미한다. 상기 siRNA는 이중가닥이며, 약 20 내지 25개의 염기쌍을 갖는 길이일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 siRNA는 암 치료용 siRNA일 수 있다.
일례로, 상기 siRNA는 Bcl-2 발현을 억제하는 siRNA인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 siRNA는 다음의 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
센스(sense): 5'-GUA CAU CCA UUA UAA GCU G dTdT-3' (서열번호 1)
안티센스(antisense): 5'-CAG CUU AUA AUG GAU GUA C dTdT-3' (서열번호 2); 또는
센스(sense): 5'-GCA UUC GUC CGG UUG CGC U dTdT-3' (서열번호 3)
안티센스(antisense): 5'-AGC GCA ACC GGA CGA AUG C dTdT-3' (서열번호 4)
또 다른 예로, 상기 siRNA는 RFP(Red Fluorescent Protein)의 발현을 억제하는 siRNA인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 siRNA는 다음의 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
센스(sense): 5'-UGU AGA UGG ACU UGA ACU C dTdT-3' (서열번호 9)
안티센스(antisense): 5'-G AGU UCA AGU CCA UCU ACA dTdT-3' (서열번호 10)
본 발명의 일 실시예에서는, 암 치료를 달성하기 위하여 Bcl-2 발현을 억제하는 siRNA를 이용하여 실험을 수행하였다. 그 결과 본 발명의 siRNA 전달체는 대조군에 비하여 Bcl-2 발현 정도를 크게 감소시키는 효과를 나타내었다(도 8). 본 발명의 또 다른 실시예에서는, RFP 발현을 억제하는 siRNA를 이용하여 실험을 수행하였으며, 그 결과 본 발명의 siRNA 전달체는 대조군에 비하여 RFP 발현 정도를 크게 감소시키는 효과를 나타내었다(도 9).
본 발명에서, 상기 "메조기공 실리카 나노입자(mesoporous silica nanoparticle, MSN)"는 메조기공을 갖는 실리카로 된 수 나노미터 내지 서브 마이크로미터 크기의 입자를 의미한다. 일반적으로, "메조기공"은 약 2 내지 50 nm의 크기의 공극을 의미할 수 있다. 본 발명의 제1금속이온 함유 메조기공 실리카 나노입자는 실리카 나노입자가 일반적으로 갖는 평균 2 내지 4 nm 크기의 미세기공 이외에 평균 10 내지 30 nm 크기의 확장된 공극을 추가로 포함할 수 있다. 상기 확장된 공극은 이에 로딩되는 siRNA가 공극 내부에도 담지될 수 있도록 할 뿐만 아니라 이와 함께 전달하고자 하는 추가적인 약물을 담지할 수 있는 공간을 제공할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 MSN은 siRNA를 탑재하여 siRNA 전달체를 구성하기 위한 기반이 되는 물질에 해당한다.
MSN은 조절가능한 공극 및 입자 크기, 높은 표면적을 가지며 표면 개질이 용이하고 생체적합성이 높은 등의 특징을 가져, 약물의 전달체로 사용될 수 있음이 알려져 있다. 그러나 종래기술은 MSN에 siRNA를 탑재하기 위하여 아민계 양이온 또는 아민 표면 개질을 사용하는데, 이는 세포독성을 유발한다는 문제점이 있다(도 6).
본 발명에서, 상기 "금속이온"은 본 발명의 목적상 siRNA와 MSN이 결합하는 데에 이용되는 것으로서, 여기에서 상기 "금속"은 주기율표 상의 알칼리 토금속, 전이 금속, 전이후 금속 및 준금속 등을 포함할 수 있고, "금속이온"은 상기 금속의 "2가 양이온" 즉, 상기 금속의 2+ 전하를 띤 양이온일 수 있다.
구체적으로, 상기 금속이온은 칼슘 이온(Ca2 +), 아연 이온(Zn2 +), 마그네슘 이온(Mg2+), 망간 이온(Mn2 +), 철 이온(Fe2 +), 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 제1금속이온 및 제2금속이온은 각각 독립적으로 칼슘 이온(Ca2 +), 아연 이온(Zn2 +), 마그네슘 이온(Mg2 +), 또는 이들의 조합일 수 있으며, 보다 구체적으로 칼슘 이온 및/또는 아연 이온일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 칼슘 이온을 사용하여 siRNA가 로딩된 MSN을 형성하였으며, 칼슘 이온 대신에 다른 2가의 금속이온인 아연 이온을 사용하여 동등한 효과가 나타남을 확인하였다.
상기 제1금속이온 및 제2금속이온은 siRNA 및 MSN의 사이에 결합된 상태일 수 있다. 예컨대, 제1금속이온 및 제2금속이온은 siRNA 및 MSN의 사이에 위치하여 이들의 결합을 매개할 수 있다(도 1의 (a) 및 (b) 참조).
칼슘은 인체에 다량 존재하는 원소의 하나로서, 본 발명의 일 실시예에서 상기 칼슘 이온은 MSN의 음전하를 띠는 표면에 siRNA를 정전기적으로 부착하는, 생물학적으로 안전한 양이온 접착제(glue)의 역할을 할 수 있다.
도 1의 (a) 및 (b)는 본 발명의 일 실시예에 따라, siRNA의 인산 이온 부분과 MSN의 실리케이트 외부 표면 및 기공 내부 표면을 칼슘으로 부착함으로써 siRNA를 MSN에 로딩하는 것을 도시한다. 칼슘 이온(Ca2 +)은 2가 양이온으로서, -1의 음전하를 갖는 2개의 음이온에 정전기적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 칼슘 이온은 한쪽의 실리카 표면 상의 실란올(-SIO-) 기에 결합할 뿐 아니라, 다른 쪽의 siRNA의 인산 이온과도 결합한다.
즉, 본 발명은 MSN 상에 siRNA를 탑재하기 위하여, MSN 표면을 아민 등으로 개질할 필요 없이, 칼슘 이온과 같은 2가 금속 양이온을 매개로 MSN 및 siRNA를 결합시킬 수 있다. 이로써 종래의 아민 개질된 MSN을 이용한 전달체에 비하여 우수한 생체적합성을 나타낸다.
본 발명은 생물학적으로 안전한 칼슘 이온 등의 2가 금속 양이온을 사용하여, siRNA가 MSN에 탑재된 siRNA 전달체를 제공하며, siRNA를 세포 내로 안정적으로 전달하면서도, 종래의 전달체에 비하여 낮은 세포독성 및 우수한 생체적합성을 나타내는 효과가 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 siRNA 전달체의 세포 흡수, in vitro 세포독성 등을 평가하였다. 그 결과 본 발명의 siRNA 전달체는 siRNA를 세포 내로 안정적으로 전달하는 동시에, 아민화된 대조군인 APTS(3-aminopropyltriethoxysilane)로 연결된 APTS-MSN 및 PEI(polyethylenimine)로 연결된 PEI-MSN에 비하여 현저히 낮은 세포독성을 나타내었다(도 6).
구체적으로, 칼슘이 결합된 MSN(Ca-MSN)은 음의 표면 전하를 띠는 반면, 종래의 아민 개질된 MSN인, APTS-MSN 및 PEI-MSN은 강한 양의 표면 전하를 띠었다. 나아가 Ca-MSN은 세포 사멸을 유발하지 않았으나, 아민 개질된 MSN은 세포 생존율을 약 50%로 감소시켰다. 즉, 본 발명의 siRNA 전달체는 종래의 아민화된 전달체에 비하여 우수한 생체적합성을 가진다.
일례로, 본 발명의 Ca2 +가 결합된 MSN의 제타 전위는 -6.3 내지 -5.9 mV(-6.1 ± 0.2 mV)이며, siRNA가 로딩된 MSN의 제타 전위는 -9.7 내지 -6.9 mV(-8.3 ± 1.4 mV)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 메조기공 실리카 나노입자는 평균 2 내지 4 nm 크기 공극 및 평균 10 내지 30 nm 크기의 공극을 갖는 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
나아가, 상기 메조기공 실리카 나노입자는 평균 50 내지 200 nm, 구체적으로는 50 내지 100 nm의 직경을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 메조기공 실리카 나노입자는 공극 내에 약물을 추가로 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 입자는 2 내지 4 nm의 미세기공 이외에 10 내지 30 nm 크기의 확장된 기공을 더 포함하여 추가인 공간을 제공할 수 있으므로 약물의 담지에 보다 유리할 수 있다.
본 발명에서, "약물"은 질병, 부상, 기타 신체의 이상을 치료 또는 완화하기 위하여 생물에게 투여되는 물질을 의미한다.
일례로, 상기 약물은 항암제일 수 있으며, 구체적으로 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin, DOX), 캄프토테신(camptothecin), 커큐민(curcumin), 파클리탁셀(paclitaxel), 또는 이들의 조합일 수 있고, 보다 구체적으로 독소루비신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
MSN의 공극에 DOX를 로딩하는 것은, MSN의 siRNA 로딩 효율에 유의미한 영향을 미치지 않는다. 이는 siRNA의 분자 크기가 비교적 크기 때문인 것으로 판단된다. 즉, MSN의 외부 표면에 siRNA가 흡착되므로, siRNA의 탑재량은 siRNA에 비하여 크기가 작은 메조기공이 비어 있는지 여부에 무관하다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 siRNA 전달체는 siRNA의 안정성을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 칼슘에 의하여 siRNA를 탑재한 MSN(siRNA@Ca-MSN) 및 원래 형태의(naked) siRNA를 겔 전기영동하였을 때, 원래 형태의 siRNA는 RNase에 의해 쉽게 분해되어 신호를 나타내지 않은 반면, MSN에 로딩된 siRNA는 헤파린에 노출되자 siRNA를 방출하여, 염색된 밴드를 나타내었다. 즉 본 발명에 따른 siRNA 전달체는 원래 형태의 siRNA에 비하여 siRNA의 안정성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, siRNA, 제1금속이온 함유 메조기공 실리카 입자 및 제2금속이온의 염을 용매 내에서 혼합하는 단계를 포함하는, 상기 siRNA 전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 siRNA 로딩 방법은 간편하며 원 포트(one-pot)로 이루어진다. 일례로, 제1금속이온을 포함하여 제조된 MSN을 뉴클레아제-미함유 물에 현탁시키고, 여기에 염화칼슘(CaCl2) 수용액 및 siRNA를 교반 하에서 순차적으로 가한다. 상기 혼합 용액을 실온에서 1시간 교반한 후, 얻어진 입자를 원심분리로 정제하고 신선한 배지, 예컨대 중성 PBS에 다시 분산시킬 수 있다.
이에 앞서 합성된 제1금속이온 함유 MSN은 아민화와 같은 별도의 표면 개질 단계 없이, 증류수에 현탁시켜 바로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 제2금속이온의 염은 칼슘, 아연, 마그네슘 또는 이들의 조합의 클로라이드염 또는 질산염일 수 있고, 구체적으로 염화칼슘, 염화아연, 질산칼슘 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 용매는 수용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 제조방법에서 사용되는 제1금속이온 함유 메조기공 실리카 나노입자는 통상의 메조기공 실리카 나노입자 제조방법을 이용하되, 실리카 나노입자 제조시 반응 용액에 제1금속이온의 염을 추가로 포함하여 합성함으로써 준비할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 제한없이 적용 또는 변경하여 수행할 수 있다. 이때 첨가되는 제1금속이온의 염은 칼슘, 아연, 마그네슘 또는 이들의 조합의 클로라이드염 또는 질산염일 수 있고, 구체적으로 염화칼슘, 염화아연, 질산칼슘 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 용매 중에서 금속이온의 염 대 siRNA의 몰 비율은 260:1 내지 1600:1인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, Ca2 +:siRNA 몰 비율이 약 4.8×102:1일 때, CaCl2 수용액 중에서 siRNA만을 교반한 경우, 입자 또는 침전이 형성되지 않았다. 이는 Ca-siRNA 입자를 형성하기에 칼슘 농도가 충분히 높지 않았기 때문으로 생각된다. 동일한 조건에서 칼슘 농도를 높일 경우(Ca2 +:siRNA = 약 1.6×103:1), 불규칙적인 형상을 갖는 바람직하지 못한 침전물이 형성되었다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 제조방법은 상기 메조기공 실리카 나노입자의 공극에 약물을 담지시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 "약물"에 관하여는 전술한 바와 같다.
일례로 상기 약물 담지 단계는 공극이 빈 메조기공 실리카 나노입자 및 약물을 용매 내에서 혼합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 siRNA 전달체를 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서는, 상기 siRNA 전달체를 이용하여 약학적 조성물을 제조할 수 있고, 구체적으로 암 치료를 위한 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
암 치료를 위한 약학적 조성물로 사용하기 위해서는, 본 발명에서 전달하고자 하는 siRNA를 암 치료용 siRNA로 사용할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 항-세포사멸 Bcl-2 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 이용하여 암 치료 효능을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 siRNA 전달체에 추가로 담지될 수 있는 약물로서 항암제를 이용하여 암 치료 효능을 보다 높일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 약물로서 독소루비신을 이용하여 암 치료 효능을 확인하였다.
본 발명에서 '약학적 조성물'은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 상처의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 siRNA 전달체는 in vitro 및 in vivo에서 세포 내로 siRNA를 전달하여 치료적 효과를 발휘할 수 있다. 구체적으로, Bcl-2 siRNA를 로딩한 본 발명의 siRNA 전달체는 대조군에 비하여 Bcl-2 발현 정도를 약 40.7%로 크게 감소시켰다. 또한 본 발명의 siRNA 전달체는 siRNA에 더불어 DOX와 같은 약물을 추가로 담지함으로써, 상승적 치료 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA 전달체는, 생물학적으로 안전한 칼슘 이온 등의 2가 금속 양이온을 사용하여, 종래의, 세포 독성을 가지므로 부작용을 유발할 수 있는, 아민을 이용한 기능화 없이 MSN 상에 siRNA를 로딩할 수 있다. 따라서, 본 발명의 siRNA 전달체는 우수한 생체적합성을 나타내며, siRNA를 안정적으로 세포 내로 전달할 수 있고, 공극 내에 추가의 약물을 담지함으로써, 유전자 및 약물을 동시에 전달하여 시너지적인 효과를 발휘할 수 있으므로, 암 치료를 위한 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 siRNA 전달체는 siRNA, 제1금속이온 함유 메조기공 실리카 나노입자 및 제2금속이온의 염을 단순 혼합하는 방법에 의해, 간편하고 원 포트로 제조될 수 있다.
나아가, 본 발명의 siRNA 전달체는 공극 및 입자의 크기, 및 표면 조성 등의 측면에서 다양한 성질을 갖는 넓은 범위의 실리카 입자에 대하여 확장될 수 있으며, 신규한 유형의 siRNA 전달체 및 제조방법을 제공할 수 있다.
도 1은 (a) 및 (b) 각각 본 발명에 따른, 칼슘 이온에 의하여 MSN 외부 표면 및 확장된 기공 내부 표면에 siRNA가 부착되는 과정, (c) 본 발명의 비교예 1에 따라 제조된 입자의 TEM 이미지, 및 (d) 제조된 입자의 제타 전위를 나타낸다.
도 2는 (a) 본 발명의 비교예 1에 따라 제조된 입자의 EDX 맵핑 이미지, (b) 스펙트럼, 및 (c) 상대적 함량을 나타낸다.
도 3은 (a) 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 입자의 TEM 이미지, (b) 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 입자에 대해 측정된 흡탈착 곡선, 및 (c) 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 입자에 포함된 기공 크기 분포도를 나타낸다.
도 4는 (a) 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 입자의 EDX 맵핑 이미지, 및 (b) 제조된 입자의 제타 전위를 나타낸다.
도 5는 (a) 칼슘 이온에 의해 siRNA-로딩된 실리카 입자, (b) 아연 이온에 의해 siRNA가 로딩된 MSN 입자, (c) 칼슘 이온에 의해 siRNA가 로딩된 칼슘 이온 함유 MSN 입자의 겔 전기영동 분석 결과, 및 (d) 확장된 기공을 포함하는 실리카 입자에서 증가된 siRNA 로딩 용량을 나타내는 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 비교예 3에 따른, (a) APTS-MSN 및 PEI-MSN의 표면, 및 (b) 미개질 MSN, Ca-MSN, APTS-MSN 및 PEI-MSN의 처리에 따른 in vitro 세포적합성을 나타낸다.
도 7은 (a) Cy5.5-Bcl-2-siRNA@Ca-MSN의 SKOV3 세포 내 전달을 나타내는 형광 이미지, (b) 유세포 분석, (c) Bcl-2 유전자 발현, 및 (d) 다양한 실리카 입자 처리에 따른 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 (a) Cy5.5-Bcl-2-siRNA@Ca-CaMSN의 SKOV3 세포 내 전달을 나타내는 형광 이미지(삽입도) 및 유세포 분석, 및 (b) Bcl-2 유전자 발현을 나타낸다.
도 9는 (a) 다양한 실리카 입자 처리에 따른 세포독성 분석 결과, (b) 유세포분석에 의한 세포 사멸 분석 결과, 및 (c) RFP 발현 및 이에 따른 형광 이미지를 나타낸다.
도 10은 (a) 대조군에 비하여 RFP-siRNA@Ca-MSN의 RFP 발현 억제 효과를 보여 주는 유세포 분석, 및 (b) RFP의 상대적 형광 세기를 나타낸다.
도 11은 (a) Cy5.5-Bcl-2 siRNA+DOX@Ca-MSN(위) 및 Cy5.5-siRNA(아래)로 처리된 쥐에 대한 in vivo NIRF 이미지, (b) 종양의 ex vivo 이미지, 및 (c) 종양 절단면(적색은 Cy5.5-siRNA, 청색은 DAPI-염색된 핵을 나타냄)을 나타낸다.
도 12는 (a) 다양한 MSN으로 처리된 쥐의 종양 부피 변화, 및 (b) 체중 변화를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
비교예 1. 칼슘 이온 매개로 결합된 siRNA 로딩된 메조기공 실리카 나노입자의 합성
단계 1: 메조기공 실리카 나노입자의 합성
달리 기재하지 않는 한, 이하 모든 시료는 Sigma Aldrich 사에서 구입하여, 수령한 그대로 사용하였다.
염기-촉매 졸-겔 과정을 사용하여 빈 공극을 갖는 메조기공 실리카 나노입자(mesoporous silica nanoparticle, MSN)를 합성하였다. 간략히 설명하면, 공극 템플릿제로 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB) 125 mg, 2 M NaOH 0.438 mL, 및 탈이온수 60 mL를 교반하고 80℃로 가열하였다. 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 0.625 mL를 교반 하에 천천히 가하였다. 2시간 교반 후, 제조된 입자를 원심분리하고, 물 및 메탄올로 세척, 및 진공 하에서 건조하였다. 합성된 입자를 산성 메탄올 중 70℃에서 밤새 교반함으로써 CTAB 계면활성제를 제거하였다. 계면활성제가 추출된 MSN을 원심분리로 회수하여 메탄올로 세척하고, 진공 하에서 건조하였다.
단계 2: 약물 로딩된 MSN의 제조
상기 단계 1로부터 수득한 MSN 20 mg을 독소루비신(doxorubicin, DOX) 수용액 2 mL(5.5 mM)에 함침시켜 암실 실온에서 3일간 교반하여, MSN의 빈 공극에 DOX를 로딩하였다. 얻어진 DOX-로딩된 MSN(DOX@MSN)을 원심분리 및 진공 하에서 건조하였다.
상기 단계 1 및 2에 따라 합성된 입자는 모두 구형(평균 지름 약 84.6 nm)이었으며, 일반적인 균일한 공극(크기 약 2.4 nm)을 가짐을 확인하였다.
단계 3: 칼슘 이온 매개로 결합된 siRNA 로딩된 MSN의 제조
상기 단계 1 또는 2에 따라 합성된 MSN에 siRNA 분자를 로딩하기 위해, 우선 디에틸파이로카보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC)-처리된 물에 CaCl2 과립을 분산시켜 1.2 M CaCl2 용액을 제조하였다. siRNA 로딩을 위해, 뉴클레아제-미함유 물 100 μL에, 단계 1에 따라 준비한, MSN 100 μg을 분산시켰다. 이후, siRNA(125 pmol) 및 CaCl2 수용액 100 μL를 교반 하에서 실리카 용액에 가하였다. 상기 MSN, siRNA 및 CaCl2을 포함한 혼합 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 원심분리하여 제조된, 약물로서 DOX를 불포함 또는 포함하고, 칼슘 이온을 매개로 결합된 siRNA 로딩된 MSN(각각 siRNA@Ca-MSN 및 DOX+siRNA@Ca-MSN)을 회수하고, 신선한 배지(중성 PBS 또는 세포 배양 배지)에 재분산시켰다.
비교예 2. siRNA 로딩된 칼슘 이온 함유 메조기공 실리카 나노입자의 합성
단계 1: 칼슘 이온 함유 메조기공 실리카 나노입자의 합성
테트라에틸 오르토실리케이트와 함께 질산칼슘4수화물(Ca(NO3)2·4H2O, 0.469 g) 및 트리에틸 포스페이트(77.5 mg)를 추가로 첨가하는 것을 제외하고는 상기 비교예 1의 단계 1과 동일한 방법으로 칼슘 이온 함유 메조기공 실리카 나노입자(CaMSN)를 합성하였다.
합성된 입자는 구형(지름 약 78.2±15.8 nm)이었으며, 약 2.4 nm 크기의 일반적인 균일한 공극 이외에 추가로 형성된 평균 16 nm 크기의 확장된 공극을 가짐을 확인하였다.
단계 2: 약물 로딩된 칼슘 이온 함유 MSN의 제조
상기 단계 1로부터 수득한 CaMSN 20 mg을 DOX 수용액 2 mL(5.5 mM)에 함침시켜 암실 실온에서 3일간 교반하여, MSN의 빈 공극에 DOX를 로딩하였다. 얻어진 DOX-로딩된 MSN(DOX@CaMSN)을 원심분리 및 진공 하에서 건조하였다.
단계 3: siRNA 로딩된 칼슘 이온 함유 MSN의 제조
상기 단계 1 또는 2에 따라 합성된 MSN에 siRNA 분자를 로딩하기 위해, 뉴클레아제-미함유 물 100 μL에, 단계 1에 따라 준비한, MSN 100 μg을 분산시켰다. 이후, siRNA(125 pmol) 및 CaCl2 수용액 100 μL를 교반 하에서 실리카 용액에 가하였다. 상기 MSN, 및 siRNA를 포함한 혼합 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 원심분리하여 제조된, 약물로서 DOX를 불포함 또는 포함하고, siRNA 로딩된 CaMSN(각각 siRNA@CaMSN 및 DOX+siRNA@CaMSN)을 회수하고, 신선한 배지(중성 PBS 또는 세포 배양 배지)에 재분산시켰다.
비교예 3. 표면을 아민기로 개질한 메조기공 실리카 나노입자의 합성
단계 1: 아민기로 표면 개질된 메조기공 실리카 나노입자의 합성
상기 비교예 1의 단계 1과 동일하게 염기-촉매 졸-겔 과정을 통해 합성한 MSN을 APTS(3-aminopropyltriethoxysilane) 및 PEI(polyethylenimine)와 반응시켜 표면이 양이온성을 띄도록 아민기를 도입하였다. 이상과 같이 제조된 비교예는 각각 APTS-MSN 및 PEI-MSN로 표기하였다.
구체적으로, APTS-MSNs을 합성하기 위하여, 비처리 MSNs(10 mg)을 APTS(0.1 mL)와 함께 톨루엔(1 mL)에 부유시켜(suspended) 밤새도록 환류시켰다. 생성물을 원심분리로 회수하여, 에탄올과 PBS로 세척하고, 진공 하에 건조시켰다.
또한, MSNs의 표면을 PEI로 코팅하기 위하여, MSNs(10 mg)을 2.6 mg/mL 농도의 PEI(가지형 PEI; MW 0.8 kD) 에탄올 용액(2 mL)에 분산시켰다(dispersed). 상기 용액을 30분 동안 교반하고, 생성된 PEI-MSNs는 원심분리하여 회수하여, 에탄올과 초음파처리하여 세척하였다. 상기 과정을 3회 반복하고 최종 생성물은 원심분리한 후 진공 하에 건조시켰다.
실시예 1. 칼슘 이온 매개로 결합된 siRNA 로딩된 칼슘 이온 함유 메조기공 실리카 나노입자의 합성
비교예 2의 단계 1 또는 단계 2와 동일한 방법으로 준비한 DOX를 불포함 또는 포함하는 CaMSN에 siRNA 분자를 로딩하기 위해, 우선 DEPC-처리된 물에 CaCl2 과립을 분산시켜 1.2 M CaCl2 용액을 제조하였다. siRNA 로딩을 위해, 뉴클레아제-미함유 물 100 μL에, 단계 1에 따라 준비한, 칼슘 이온 함유 MSN 100 μg을 분산시켰다. 그 후, 적정량의 siRNA 및 CaCl2 수용액 100 μL를 교반 하에서 실리카 용액에 가하였다. MSN, siRNA 및 CaCl2을 포함한 혼합 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 원심분리하여 제조된, 약물로서 DOX를 불포함 또는 포함하고, 칼슘 이온 매개로 결합된 siRNA 로딩된 CaMSN(각각 siRNA@Ca-CaMSN 및 DOX+siRNA@Ca-CaMSN)을 회수하고, 신선한 배지(중성 PBS 또는 세포 배양 배지)에 재분산시켰다.
실험예 1. 제조된 입자의 특성 분석
상기 비교예 및 실시예에 따라 제조된 입자의 모폴로지를 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM) 및 스캐닝 TEM(STEM)으로 이미지화하였다(FEI Tecnai G2 F20(FEI, 200 kV)/FEI Talos F200X (200 kV) 사용). DOX 분자의 로딩은 Agilent Technologies Cary series 분광광도계로 UV-Vis 흡수를 측정하여 확인하였다.
도 1의 (c)는 미처리 MSN, Ca2 +-처리 MSN(Ca-MSN), 및 Ca2 +-처리하여 siRNA-로딩된 Ca-MSN(siRNA@Ca-MSN)의 TEM 이미지를 보여 준다. 상기 입자들은 구형 모양을 유지하나, 내부 메조기공의 가시성이 변화하는 것을 알 수 있다. Ca-MSN의 경우, FFT-처리된 이미지의 회절 패턴으로부터 정렬된 메조기공이 분명히 식별된다. 한편 siRNA@Ca-MSN의 경우, 공극 및 대응되는 FFT-처리 회절이 거의 보이지 않게 되는데, 이는 입자 표면을 핵산 분자가 덮고 있기 때문이라 할 수 있다.
Ca2 + 이온 처리 후, 중성 PBS 중에서 초기에 큰 음의 값이었던(-17.2 ± 0.5 mV) MSN의 제타 전위는 0에 가깝게 변하였다가(-7.1 ± 0.6 mV), siRNA 로딩 후 -12.3 ± 0.3 mV로 다시 감소하였다(도 1의 (d)). 아민화된 MSN의 경우와 달리, Ca-MSN은 양의 표면 전하를 갖지 않음에도 표면에 올리고뉴클레오타이드를 로딩할 수 있었다는 것을 주목할 만하다. 이는 전기음성적인 siRNA의 인산 이온 부분에 대한 Ca2 + 이온의 높은 친화도가, 입자의 제타 전위 값이 여전히 음수임에도 Ca-MSN 표면 상의 정전기적 착체 형성을 가능케 한 것으로 생각된다.
도 2의 (a)는 Ca-MSN(위) 및 siRNA@Ca-MSN(아래)의 STEM 이미지(왼쪽)와, Si, O, Ca 및 Cl의 분포를 색상으로 시각화한 EDX 맵핑 이미지를 보여 준다. 또한 도 2의 (b)의 EDX 스펙트럼에 의하면 두 입자 중의 이들 4개 원소의 존재를 확인하였다. 실리카 입자 중 siRNA의 존재에 따라 Ca:Cl의 원소 비율이 현저히 변화하는 것으로 나타났다. 즉, siRNA@Ca-MSN은 Ca-MSN에 비하여 Cl의 신호 강도가 감소되어 있다. 이에 관하여 더 알아보기 위해, Ca 및 Cl의 상대적 함량을 원소 퍼센트(at%)로 나타내는 정량분석 EDX 데이터를 사용하였다. MSN이 CaCl2만으로 처리된 경우, Ca:Cl 원소 비율은 약 48:52, 즉 거의 1:1에 가까웠다. 전구 용액(CaCl2)의 초기 1:2 비율과 비교하면, 이러한 비율 변화는 Ca2 +가 CaCl2 한쪽의 1개의 Cl-를 잃고 실리카 표면에 결합되는 것을 나타낸다(즉, -SiO--Ca2 +-Cl-). 상기 비율은 siRNA@Ca-MSN의 경우 더욱 크게 변화하였다(Ca:Cl = 약 92:8 = 약 1:0.09). 이는 얻어진 입자가 거의 무시할 수 있는 양의 Cl- 이온을 포함함을 나타낸다. 이는 도 1의 (a)에 도시된 바와 같이 siRNA의 인산 이온 부분이 표면의 Ca2 + 이온과 결합함을 보여 준다(즉, -SiO--Ca2+-인산 이온). 또한 이중가닥 siRNA는 상대적으로 큰 분자 크기를 가져(지름 약 2.6 nm 및 길이 약 5.8 nm) MSN의 내부 공극 채널에 진입할 수 없으므로 입자의 외부 실리케이트 표면에 부착된다는 점으로부터, 실리카 구체의 전체 표면적으로부터 빈 공극 면적을 빼 MSN의 유효 외부 표면적(ESAeff)을 계산하였다. 그리고 ESAeff(약 0.02 μm2/입자) 및 EDX로 분석된 총 Ca 함량(약 1.3wt%)을 이용하여 표면 Ca 함량을 계산하여, 결과적으로 siRNA 탑재량 약 1.25 pmol/μg의 siRNA@Ca-MSN에 대하여 대략적인 Ca:P 비율이 1:4임을 얻었다.
나아가, 본 발명의 실시예 1에 따른 Ca2 + 처리하여 siRNA-로딩된 칼슘 이온 함유 MSN(siRNA@Ca-CaMSN)의 형태를 TEM으로 관찰하여 그 결과를 도 3(a)에 나타내었다. 이에 대한 흡탈착 곡선 및 기공 크기도 측정하여 도 3(b) 및 (c)에 함께 나타내었다. 도 3의 (a)에 나타난 바와 같이, 비교예 1의 입자와 유사하게, siRNA@Ca-CaMSN는 구형을 나타내었으며, 그 크기는 평균 78.2±15.8 nm였다. 한편, 이에 대해 측정된 비교예 1의 입자는 평균 크기 2.4 nm의 균일한 기공을 포함하였으나, 실시예 1에 따른 입자는 2.4 nm 크기의 기공 이외에 평균 크기 16.0 nm의 확장된 기공을 추가로 갖는 것으로 확인되었다(도 3의 (c)).
도 4에는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 입자의 EDX 맵핑 이미지, 및 제타 전위를 나타내었다. 비교예에서와 마찬가지로, 도 4의 (a)에 나타난 EDX 맵핑 이미지로부터 Si, O, Ca 및 Cl의 4개 원소의 존재를 확인하였다. 한편, 도 4의 (b)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 칼슘 함유 MSN(CaMSN, -6.1 mV))은 칼슘 이온으로의 표면 처리에 의해 제타 전위가 다소 낮은 음의 값(-5.1 mV)으로 변화하였으며, 이에 siRNA를 도입함에 따라 보다 낮은 음의 값(-8.3 mV)으로 이동하였다. 이러한 경향은 도 1의 (d)에서 관찰된 것과 유사하며, MSN에 칼슘 이온을 함유함으로써 전반적으로 보다 낮은 음의 값으로 이동한 것으로 나타났다.
실험예 2. 겔 전기영동 분석
siRNA-로딩된 실리카 입자 방출 거동 및 안정성을 확인하기 위해, 겔 전기영동 분석을 수행하였다.
PBS 중의 입자 현탁물을 2% 아가로스 및 SYBR Gold(Invitrogen, USA)를 함유한 겔에 로딩하고, TAE 완충 용액 중 100 V에서 전기영동하였다. siRNA 로딩 안정성을 평가하기 위해, siRNA-로딩된 실리카 100 μg(또는 이에 상응하는 양의 원래 형태의(naked) siRNA)를 PBS 40 μL에 분산시키고 다양한 양의 RNase A(0.025 내지 0.25v/v%)와 함께 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 각 시료를 분취하여 겔에 로딩해 전기영동하였다. 잔여 RNase-포함 분석물을 즉시 헤파린으로 처리하여 마찬가지로 겔 상에 처리하였다. 얻어진 SYBR Gold-염색된 siRNA 밴드를 겔 이미지 분석 시스템(MiniBis Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Israel)으로 촬영하였다.
도 5의 (a)에 나타난 바와 같이, 원래 형태의 뉴클레오타이드 시료는 겔 어디에서도 siRNA 신호를 나타내지 않았으며, 이는 siRNA 자체의 불안정성으로 인해 쉽게 분해되는 특성을 반영하는 것이다. 반면, siRNA@Ca-MSN은 모든 시험된 RNase 농도에 대하여 겔 웰에서 명백한 siRNA 밴드를 나타냈으며, 유리 siRNA의 존재는 발견되지 않았다. 뉴클레아제 처리된 siRNA@Ca-MSN이 다가 음이온성 헤파린에 노출된 후 겔 전기영동이 이루어진 경우, SYBR Gold-염색된 밴드가 나타났으며, 이는 siRNA가 분해되어 방출되었음을 나타내는 것이다.
이는 Ca-MSN이 로딩된 siRNA를 효소적 분해로부터 보호할 뿐 아니라, 적절한 자극이 주어져 siRNA를 방출하지 않는 한 siRNA 로딩을 안정적으로 유지함을 입증한다.
Ca-MSN 뿐만 아니라 다른 2가 금속 양이온이 결합된 MSN에서도 이러한 현상이 나타나는지 확인하기 위하여, 염화칼슘 대신에 염화아연을 사용하여 전술한 비교예 1과 동일한 방법으로 Zn-MSN 입자를 합성하였으며, 상기와 동일하게 겔 전기영동으로 분석하였다. 그 결과, 이러한 경향은 각각 아연 이온에 의해 siRNA가 로딩된 MSN 입자(siRNA@Zn-MSN)는 물론, 본 발명의 실시예 1에 따른 칼슘 이온에 의해 siRNA가 로딩된 칼슘 이온 함유 MSN 입자(siRNA@Ca-CaMSN)에 대한 겔 전기영동 분석 결과를 나타낸 도 5의 (b) 및 (c)에서도 유사하게 관찰되었다. 헤파린 등의 자극이 제공되지 않는 한, siRNA는 분해 및/또는 방출되지 않고 입자의 표면 및/또는 기공에 함유된 채로 유지되었다. 이는 Ca-MSN에서와 같이, Zn-MSN 및 Ca-CaMSN 역시 이에 로딩된 siRNA를 효소적 분해로부터 보호할 뿐 아니라, 적절한 자극이 주어져 siRNA를 방출하지 않는 한 siRNA 로딩을 안정적으로 유지함을 나타내는 것이다.
겔 전기영동에 의해 로딩된 siRNA 양을 측정하여, 그 결과를 도 5(d)에 나타내었다. 도 5(d)에 나타난 바와 같이, 확장된 기공을 지닌 칼슘 이온 함유 MSN은 1.66 pmol/μg의 값을 나타내었으며, 이는 2.4 nm 크기의 기공만을 지닌 MSN(1.25 pmol/μg)의 약 130%를 초과하는 수치이다.
실험예 3. in vitro 세포독성 및 세포 사멸 분석
본 발명의 siRNA 전달체의 생체적합성을 평가하기 위하여, SKOV3(인간 난소암 세포주) 세포에 대하여 in vitro 세포독성을 분석하였다.
세포를 웰 플레이트에 시딩하고(웰당 5.0×103 세포) 입자 처리(10 μg/mL) 후 24시간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 10% FBS/RPMI 중에서 48시간 더 인큐베이션하였다. PBS 세척 후, 배지를 CCK-8 시약으로 교환하고 각 웰의 450 nm에서의 흡광을 측정하였다.
또한 SKOV3 세포를 웰 플레이트에 시딩하고(웰당 1.5×105 세포) 24시간 인큐베이션하고, 입자 처리해 24시간 인큐베이션한 후, 세척 및 추가 인큐베이션을 거쳐 트립신화 및 원심분리하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)-표지된 아넥신 V로 염색하여 유세포분석으로 세포 사멸을 분석하였다.
Ca-MSN의 음의 표면 전하(약 -7.1 mV)는, 아민에 의해 강한 양의 표면 전하가 높은 세포독성을 유발하는 것에 비하여, 독성학적으로 바람직한 특성을 줄 것으로 예상되었다. 도 6의 (b)에 나타난 결과는 Ca-MSN이 개질되지 않은 MSN과 유사하게, 시험된 모든 입자 농도에 대하여 세포 사멸을 전혀 또는 거의 유발하지 않음을 보여 준다. 반면, 대조군으로서 아민화되어 강한 양의 표면 전하를 띠는, APTS(3-aminopropyltriethoxysilane)로 연결된 APTS-MSN 및 PEI(polyethylenimine)로 연결된 PEI-MSN(각각 +29.7 ± 1.4 mV 및 +26.5 ± 4.6 mV)는 세포 생존에 부정적인 영향을 미쳐, PEI-MSN 100 μg/mL의 경우 약 50%로 감소하였다.
이러한 결과는 본 발명의 Ca를 포함하는 유전자 전달 캐리어 시스템은 자체로서 세포 독성을 나타내지 않는 뛰어난 생체적합성을 가지며, 아민화된 MSN에 비해 우수함을 입증한다.
실험예 4. 세포 흡수 평가
형광을 통하여 본 발명의 siRNA 전달체의 세포 흡수를 조사하였다.
SKOV3 세포를 접시에 시딩하였다(접시당 2×105 세포). 37℃에서 24시간 인큐베이션 후, 일부 세포에 Cy5.5-표지한 siRNA-로딩된 실리카(10 μg/mL)를 가하고 FBS-미함유 배지 중에서 24시간 더 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 4%(v/v) 파라포름알데히드로 고정한 후 DAPI로 염색하였다. 세포의 형광 이미지를 측정하였다. 대상 Cy5.5-표지한 siRNA-로딩된 실리카로는, 칼슘을 불포함 또는 포함하는 실리카 입자에 칼슘 이온을 매개로 또는 비처리 상태로 단순 siRNA를 로딩시킨 입자에 Cy5.5를 표지하여 준비하였다. 음성대조군으로는 siRNA를 로딩하지 않은 칼슘을 불포함 또는 포함하는 실리카 입자들을 사용하였다.
또한 세포를 웰 플레이트에 시딩하고(웰당 1.5×105 세포) 24시간 인큐베이션하여, Cy5.5-표지한 siRNA-로딩된 실리카 또는 원래 형태의 Cy5.5-siRNA로 24시간 처리하고, 세척, 트립신화 및 원심분리하여, 세포 흡수 효율을 유세포분석기로 분석하였다.
도 7의 (a)에 나타난 바와 같이, 세포질에서 밝은 Cy5.5 형광 신호가 관찰되었다. 이는 Cy5.5-표지한 Bcl-2 siRNA가 실리카 캐리어에 의해 안정적으로 세포 내로 전달되었음을 가리킨다. 또한 유세포분석 결과 Cy5.5-Bcl-2 siRNA@Ca-MSN은 원래 형태의 siRNA로 처리된 경우에 비하여, Cy5.5 형광을 방출하는 세포의 수를 크게 증가시켰다. 즉, 본 발명의 siRNA 전달체는 세포 내로 siRNA를 효율적으로 전달할 수 있다. 이러한 경향은 도 8(a)에 나타난, Cy5.5-Bcl-2 siRNA@Ca-CaMSN에 대한 결과에서도 동일하게 나타났다.
실험예 5. in vitro Bcl -2 사일런싱 분석
본 발명의 siRNA 전달체의 in vitro 유전자 발현 억제 및 치료 효과를 평가하였다.
맞춤화된 Bcl-2 siRNA 및 비표적화된 siRNA(scRNA)를 Bioneer로부터 구입하였다. Bcl-2 siRNA의 서열을 표 1에 나타내었다.
Bcl-2 siRNA 센스 5'-GUA CAU CCA UUA UAA GCU G-dTdT-3' (서열번호 1)
안티센스 5'-CAG CUU AUA AUG GAU GUA C-dTdT-3' (서열번호 2)
Bcl-2 유전자 발현 정도를 평가하기 위하여, SKOV3 세포를 웰 플레이트에 시딩하고(웰당 1.5×105 세포) 24시간 인큐베이션하였다. siRNA 불포함 또는 로딩된 입자 처리하여(10 μg/mL) 단순 RPMI에서 24시간 인큐베이션 후, PBS로 2회 세척하고 10% FBS/RPMI에서 48시간 더 인큐베이션하였다. 세포를 트립신화 및 원심분리하고, Trizol(Invitrogen, USA)로 세포로부터 RNA를 추출하였고, 상보적 DNA(cDNA)를 High-Capacity RNA-to cDNA 키트(Applied Biosystems, USA)로 합성하였다. 생성된 cDNA를 SYBR Green master Mix(Applied Biosystems, USA) 및 Bcl-2 프라이머(또는 β-액틴 프라이머)와 혼합하고 qRT-PCR을 수행하였다. Bcl-2 및 β-액틴에 대한 프라이머 서열은 각각 표 2 및 표 3에 나타내었다. 생성된 Bcl-2 DNA의 양을 β-액틴 DNA에 대하여 정규화하였다.
Bcl-2 센스 5'-CGACG ACTTC TCCCG CCGCT ACCGC-3' (서열번호 5)
안티센스 5'-CCGCA TGCTG GGGCC GTACA GTTCC-3' (서열번호 6)
β-actin 센스 5'-GCTCG TCGTG GACAA CGGCT C-3' (서열번호 7)
안티센스 5'-CAAAC ATGAT CTGGG TCATC TTCTC-3' (서열번호 8)
도 7의 (c)에 나타난 결과는 Bcl-2 siRNA@Ca-MSN이 대조군에 비하여 Bcl-2 발현 정도를 약 57%로 크게 감소시킨 것을 보여 준다. 반면, 비표적화된 siRNA-로딩된 MSN(scRNA@Ca-MSN)은 Bcl-2 발현을 감소시키지 않아, 전달된 Bcl-2 siRNA의 유전자-특이적 표적화를 입증한다. 또한, 로딩되지 않은 MSN은 오히려 Bcl-2 발현을 증가시켰고, 원래 형태의 Bcl-2 siRNA도 미미한 정도의 유전자 발현 감소 효과만을 나타내었다. 따라서, 이러한 결과는 본 발명의 칼슘 매개 전달체를 이용한 Bcl-2 siRNA 전달이 세포 내에서 항세포사멸 Bcl-2 유전자를 억제하는 데 충분한 효과를 나타냄을 입증한다.
추가로, MSN의 공극에 DOX와 같은 항암제 약물을 로딩하였을 경우의, DOX와 siRNA의 상승적 암치료 효과를 확인하기 위하여, DOX-로딩된 MSN(DOX@MSN)을 사용하였다. 비교를 위해, 로딩되지 않은 MSN, Ca-MSN, Ca가 부재하는 MSN 및 Bcl-2 siRNA의 물리적 혼합물(siRNA@MSN)을 사용하였다.
도 7의 (d)와 같이, 대조군 입자는 SKOV3 세포에 대해 영향을 미치지 않았다. 이는 Ca-부착 siRNA 전달 방법의 생체적합성을 나타내는 동시에, 기능화되지 않은 MSN에 siRNA를 부착하는 데에 Ca2 + 이온이 중요한 역할을 함을 나타낸다. siRNA 또는 DOX 중 하나만을 로딩한 입자는(즉, Bcl-2 siRNA@Ca-MSN 또는 DOX@MSN) 세포 생존을 각각 약 85% 및 62%로 감소시켰으며, 두 경우 모두 충분한 정도의 세포 사멸을 유발할 수 있음을 보였다. 특히, Bcl-2 siRNA 및 DOX가 함께 로딩된 MSN으로 처리된 세포의 경우, 세포 생존은 더욱 낮은 수준에 이르렀다(약 47%).
또한, 칼슘 이온 함유 MSN을 기반으로 하는 전달체에 대한 결과를 나타낸, 도 8의 (b) 역시 도 7의 (d)와 유사한 경향을 나타내었다. 나아가, 도 8의 (b) 및 도 7의 (d) 그래프의 최우측에 위치한 칼슘 불포함 또는 포함 MSN 상에 칼슘 이온을 매개로 siRNA가 로딩된 각 입자에 의한 결과를 비교하면, 칼슘 이온을 불포함하는 MSN을 기반으로 한 전달체에 비해 칼슘 이온 함유 MSN 기반의 전달체(si-Bcl-2@Ca-CaMSNs)에서 15% 이상 Bcl-2 발현이 더 억제된 것을 확인하였다. 나아가, 항암제를 추가로 포함하는 입자에 대한 암세포 사멸 실험 결과를 나타낸 도 9의 (a)는 상기 도 7의 (d)에서와 마찬가지로 칼슘 이온 함유 MSN 기반의 전달체에서도 siRNA인 siBcl-2 또는 항암제인 DOX를 단독으로 포함하는 입자에 비해 시너지적인 세포 사멸 효과를 나타냄을 보여준다. 이는 도 9(b)에 나타난 유세포분석에 의한 세포 사멸 분석 결과와도 일치하였다.
이러한 결과는 암 치료에 있어서 암치료용 siRNA 및 항암제가 함께 로딩된 MSN이 시너지적인 치료 효과를 나타냄을 입증한다.
실험예 6. RFP 사일런싱 분석
상기 실시예 7에서 Bcl-2 siRNA@Ca-MSN의 Bcl-2 사일런싱 효과를 확인한바, 나아가 다른 siRNA에 대해서도 효과를 달성할 수 있는지 확인하고자, RFP 발현을 억제하는 siRNA를 탑재한 전달체를 합성하여 실험을 진행하였다.
구체적으로, 실시예 7의 Bcl-2 siRNA@Ca-MSN에 관한 방법과 유사하게, 로딩되지 않은 MSN 또는 RFP 발현을 억제하는 siRNA를 탑재한 전달체(RFP-siRNA@Ca-MSN)로 RFP-발현 SKOV3 세포를 처리하였다. RFP-siRNA의 서열은 아래와 같다.
RFP siRNA 센스 5'-UGU AGA UGG ACU UGA ACU C dTdT-3' (서열번호 9)
안티센스 5'-G AGU UCA AGU CCA UCU ACA dTdT-3' (서열번호 10)
도 10 및 도 9의 (c)에 나타난 바와 같이, RFP-siRNA@Ca-MSN 전달체 및 RFP-siRNA@Ca-CaMSN 전달체는 미처리 또는 로딩되지 않은 MSN으로 처리된 대조군에 비하여 형광 발현을 감소시킴을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 발명의 siRNA 전달체가 다양한 종류의 siRNA를 전달시킬 수 있음을 입증한다.
실험예 7. in vivo 종양 축적 및 종양 성장 억제
본 발명의 siRNA 전달체의 in vivo 종양 성장 억제 효과를 평가하였다.
5주령 수컷 Crlj 누드 마우스를 사용하여 in vivo 마우스 실험을 수행하였다. 종양-이종이식 마우스 모델을 얻기 위하여, 마우스를 마취하고 SKOV3 세포(5×106 세포)를 옆구리에 피하 주입하였다. in vivo 형광 이미지화를 위해, 중성 PBS 60 μL 중에 Cy5.5-표지한 siRNA-로딩된 실리카 입자 250 μg을 현탁시켜 종양 주위에 주사하였다. 여러 시간 지점에서 마우스의 in vivo 형광 이미지를 수집하였다. ex vivo 이미지화를 위해, 종양 주위 주사 2일 후 마우스로부터 종양을 추출하고, 중성 완충된 포르말린 고정 후 OCT 화합물에 포매하였다. 종양 블록을 약 10 μm로 절단하고 핵 염색을 위해 DAPI 처리하였다. 종양 단면의 형광 이미지를 수집하였다. 암 치료 효율을 평가하기 위하여, 종양 크기가 약 45 mm3에 이른 후 마우스를 임의로 3개 집단으로 나누었다(n = 4/집단). 실리카 입자(로딩되지 않은 MSN, DOX@MSN, 또는 Bcl-2 siRNA+DOX@Ca-MSN)를 12.5 mg/kg의 투약량으로 종양 주위에 주사하였다. 종양 부피와 체중을 9일간 관찰하였다.
도 11의 (a)는 Cy5.5-Bcl-2 siRNA+DOX@Ca-MSN의 주사 전후의 근적외선 형광 이미지(near infrared fluorescence, NIRF, λex = 675 nm, λem = 720 nm)를 나타낸다. 입자가 종양 주위에 주사된 후, 종양 부위에서 시간에 따라 NIRF 신호가 빠르게 증가하는 것이 관찰되었다. 이는 siRNA-로딩된 입자가 종양 조직을 성공적으로 투과하였음을 가리킨다. 한편, 동일한 조건에서 유리 Cy5.5-siRNA가 주사된 경우, 종양 투과가 일어나지 못하고 보호되지 않은 siRNA가 빠르게 효소 분해됨으로써, 형광이 종양으로부터 빠르게 소멸하였으며, 이는 in vitro 세포 흡수 결과와 일치한다. 추출된 종양(도 11의 (b)) 및 절단면(도 11의 (c)) 이미지에 의하여도 본 발명에 따른 siRNA 전달을 확인할 수 있다.
또한 도 12의 (a)와 같이, 로딩되지 않은 MSN으로 처리된 종양은 빠르게 성장하여, 초기 부피보다 2.6배 가량 증가된 약 115 mm3에 도달하였다. 반면, DOX@MSN의 투여시 최종 종양 크기가 약 84.4 mm3에 이르러, 대조군에 비해 종양 성장을 약 27% 억제하였다. 특히, bcl-2 siRNA+DOX@Ca-MSN으로 처리된 마우스는 가장 높은 종양 억제율(약 47%)을 보였다.
이러한 결과는 본 발명의 siRNA 로딩 방법이 종양 내로 siRNA를 안정적으로 전달하며, 또한 함께 로딩된 DOX에 의해 상승적인 암 치료 효과를 발휘함을 입증한다.
본 명세서는 본 출원의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 출원의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 출원은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 출원의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
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Claims (18)

  1. 평균 직경 5 nm 이하의 미세 기공 및 10 내지 50 nm의 확장된 기공을 갖는 메조기공 실리카 나노입자(mesoporous silica nanoparticle, MSN) 및 상기 입자의 외부 표면 및 기공 내부 표면에 결합된 siRNA를 포함하는 siRNA 전달체로서,
    상기 입자의 기공 내부 표면 및 외부 표면은 제1금속이온과 제2금속이온을 포함하여 이를 매개로 siRNA가 결합되는 것인, siRNA 전달체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1금속이온 및 제2금속이온은 각각 독립적으로 칼슘 이온, 아연 이온, 마그네슘 이온, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 2가 금속이온인 것인, siRNA 전달체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 메조기공 실리카 나노입자는 평균 2 내지 4 nm의 공극 및 평균 10 내지 30 nm의 공극을 갖는 것인, siRNA 전달체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 메조기공 실리카 나노입자의 공극 내에 약물을 추가로 포함하는 것인, siRNA 전달체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것인, siRNA 전달체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항암제는 독소루비신, 캄프토테신, 커큐민, 파클리탁셀, 또는 이들의 조합인 것인, siRNA 전달체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 siRNA는 암 치료용 siRNA인 것인, siRNA 전달체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 siRNA는 Bcl-2 발현을 억제하는 siRNA인 것인, siRNA 전달체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 siRNA는 하기 서열로 표시되는 것인, siRNA 전달체.
    센스: 5'-GUA CAU CCA UUA UAA GCU G dTdT-3' (서열번호 1)
    안티센스: 5'-CAG CUU AUA AUG GAU GUA C dTdT-3' (서열번호 2); 또는
    센스: 5'- GCA UUC GUC CGG UUG CGC U dTdT-3' (서열번호 3)
    안티센스: 5'- AGC GCA ACC GGA CGA AUG C dTdT-3' (서열번호 4)
  10. 제1항에 있어서, 상기 siRNA 전달체는 siRNA의 안정성을 증가시키는 것인, siRNA 전달체.
  11. siRNA, 제1금속이온 함유 메조기공 실리카 입자 및 제2금속이온의 염을 용매 내에서 혼합하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 siRNA 전달체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제2금속이온의 염은 칼슘, 아연, 마그네슘 또는 이들의 조합의 클로라이드염 또는 질산염인 것인, siRNA 전달체의 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제1금속이온 함유 메조기공 실리카 나노입자는, 메조기공 실리카 나노입자 제조시 제1금속이온의 염을 추가로 포함하여 합성함으로써 준비되는 것인, siRNA 전달체의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1금속이온의 염은 칼슘, 아연, 마그네슘 또는 이들의 조합의 클로라이드염 또는 질산염인 것인, siRNA 전달체의 제조 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 용매 내에서 제2금속이온의 염 대 siRNA의 몰 비율은 260:1 내지 1600:1인 것인, siRNA 전달체의 제조 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 메조기공 실리카 나노입자의 공극에 약물을 담지시키는 단계를 추가로 포함하는, siRNA 전달체의 제조 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 용매는 수용액인 것인, siRNA 전달체의 제조 방법.
  18. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 siRNA 전달체를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
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