Seit
mehr als zwanzig Jahren sind nicht-operative Methoden zur Stenose-Behandlung
etabliert, bei denen u.a. durch Ballondilatation (PTCA Perkutane
Transluminale Coronare Angioplastie) das verengte oder verschlossene
Blutgefäß wieder
aufgeweitet wird. Dieses Vorgehen hat sich insbesondere bei der
Therapie des akuten Myokardinfarktes bewährt. Mit dem Aufweiten des
Blutgefäßes entstehen
allerdings kleinste Verletzungen und Einrisse (Dissektionen) in
der Gefäßwand, die
zwar häufig
problemlos verheilen, jedoch in etwa einem Drittel der Fälle durch
das ausgelöste
Zellwachstum zu Wucherungen führen
(Proliferation), die letztendlich zu einer erneuten Gefäßverengung
(Restenose) führen.
Die Aufweitung beseitigt auch nicht die Ursachen der Stenose, also
die molekularpathologischen Veränderungen
in der Gefäßwand. Eine
weitere Ursache der Restenose ist die Elastizität des gedehnten Blutgefäßes. Nach
dem Entfernen des Ballons zieht sich das Blutgefäß übermäßig zusammen, so dass der Gefäßquerschnitt
verringert wird (Obstruktion, sogenanntes negatives remodeling).
Letzterer Effekt kann nur durch Platzierung eines endovaskulären Implantats,
in der Regel eines Stents, vermieden werden.
In
der interventionellen Therapie der stabilen und instabilen Angina
pectoris bei koronarer Herzkrankheit, hat die Einführung der
Stents zu einer deutlichen Reduktion der Rate an Restenosen und
damit zu besseren Langzeitresultaten geführt. Dies gilt sowohl für die primäre als auch
die Rezidivstenose. Ursächlich
für den
Nutzen der Stent-Implantation ist der höhere primäre Lumengewinn.
Durch
den Einsatz von Stents kann zwar ein optimaler Gefäßquerschnitt
erreicht werden, allerdings führt
der Einsatz von Stents ebenfalls zu kleinsten Verletzungen, die
die Proliferation induzieren können
und damit letztendlich eine Restenose auslösen können. Weiterhin initiiert die
Anwesenheit eines derartigen Fremdkörpers eine Kaskade von zellulären molekularen
Prozessen, die zu einem allmählichen
Zuwachsen des Stents führen
können.
Mittlerweile
bestehen umfangreiche Erkenntnisse zum zellbiologischen Mechanismus
und zu den auslösenden
Faktoren der Stenose und Restenose. Die Restenose entsteht als Reaktion
der Gefäßwand auf
die lokale Verletzung infolge Dehnung des atherosklerotischen Plaque. Über komplexe
Wirkmechanismen wird die lumengerichtete Migration und Proliferation
der glatten Muskelzellen der Media und der Adventitia induziert (neointimale
Hyperplasie). Unter Einfluss verschiedener Wachstumsfaktoren produzieren
die glatten Muskelzellen eine Deckschicht aus neointimalen Glattmuskelzellen
und Matrixproteinen (Elastin, Kollagen, Proteoglykane), deren ungesteuertes
Wachstum allmählich
zu einer Einengung des Lumens führen
kann. Konventionelle systemische medikamentöse Therapieeinsätze sehen
u.a. die orale Verabreichung von Calzium-Antagonisten, ACE-Hemmern,
Antikoagulantien, Antiaggregantien, Fischölen, antiproliferativen Substanzen,
antiinflammatorischen Substanzen und Serotonin-Antagonisten vor,
signifikante Reduktionen der Restenosearten wurden auf diesem Wege
bisher jedoch nicht erreicht.
Seit
einigen Jahren versucht man die Restenosegefahr bei der Implantation
von Stents durch Aufbringung spezieller Beschichtungssysteme zu
mindern. Teilweise dienen die Beschichtungssysteme als Träger, in die
ein oder mehrere pharmakologisch wirksame Subtanzen eingebettet
sind (Local Drug Delivery (LDD); drug eluting stents). Die Beschichtungssysteme
bedecken in der Regel zumindest eine der Gefäßwand zugewandte Umlaufswandung
des endovaskulären
Implantates.
Der
Träger
derartiger Beschichtungssysteme besteht aus einem biokompatiblen
Material, welches entweder natürlichen
Ursprungs ist oder auf synthetischem Wege gewonnen werden kann.
Zur Aufbringung der Beschichtungssysteme auf den Stent sind zahlreiche
Verfahren entwickelt worden, wie beispielsweise Rotationszerstäubungsverfahren,
Tauchverfahren und Sprühverfahren.
Das Beschichtungssystem bedeckt zumindest bereichsweise die der
Gefäßwand zugewandte
Umlaufswandung des Stents. Eine Freisetzung der pharmakologisch
wirksamen Substanzen erfolgt im menschlichen bzw. tierischen Körper durch
allmähliche Degradation
des Trägers
und/oder Diffusion in das umgebende Gewebe. Die Elutionscharakteristik
der Substanzen lässt
sich mit Hilfe etablierter in vitro Untersuchungen vorab abschätzen.
Als
Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen für LDD-Systeme wurden bisher
zahlreiche Präparate
vorgeschlagen, die in der Regel den konventionell eingesetzten Zytostatika
und Immunsuppresiva entsprechen. Unbeachtet der bisher umfangreichen
Aktivitäten
auf dem Bereich aktiv beschichteter endovaskulärer Implantate sind alle bisherigen
Versuche, die Restenose nach Angioplastie medikamentös einzudämmen bisher
nicht mit der gewünschten
Wirkung verbunden. Ein neuer Ansatz sieht nun vor, nicht nur die
Symptome durch Applikation geeigneter Wirkstoffe zu bekämpfen, sondern
auch die dem Krankheitsbild zugrunde liegende Struktur des menschlichen
Genoms und seine Transkription zu berücksichtigen, d. h. die die
Krankheit hervorrufenden Faktoren (z. B. Transkriptionsfaktoren,
die durch bestimmte pathologische Ereignisse aktiviert werden) zu blocken,
und zwar sehr früh,
bevor es überhaupt
zu einer Induktion von (pathologischer) Genaktivität gekommen
ist. Darüber
hinaus sollen nicht nur einzelne Faktoren gehemmt werden, sondern
mehrere pathologische Ereignisse gleichzeitig beeinflusst werden,
da Transkriptionsfaktoren in der Regel mehrere Gene aktivieren. Ein
vielversprechender Ansatz ist dabei die Applikation von doppelsträngigen DNA-Olegonukleotiden,
und zwar aus folgendem Grund:
Die meisten Zellen im Körper sind
in der G0-Phase des Zellzyklus, die auch
als die Ruhephase bezeichnet wird. Fast alle ruhenden Körperzellen
haben immer noch die Fähigkeit
zum Wachstum und können
durch eine Anzahl von Stimuli dazu angeregt werden, wieder in den
Zellzyklus einzutreten, wobei die wichtigsten stimuli Wachstumsfaktoren
und Verletzungen sind. Wachstum sowie auch Umgestaltungsprozesse
werden in erster Linie auf der Transkriptionsebene geregelt. Die
physische Belastung von beispielsweise koronarer Angioplastie oder
Stent-Implantation
wird deshalb zur Induktion einer Anzahl von Genen führen, wobei
Cycline, zellzyklus-spezifische Phosphatasen, Zellzyklusspezifische
Transkriptionsfaktoren wie Cyclin E, Cyclin A, Cyclin B, cdc25C,
cdc25A, E2F-Familienmitglieder sowie zahlreiche metabolisch wichtige
Gene oder Gene, die an der Replikation von DNA beteiligt sind (PCNA,
Histonen). Während
diese Faktoren nach Eintritt in den Zellzyklus neu synthetisiert
werden, sind viele Transkriptionsfaktoren, die in den ersten Schritten
des Wachstums involviert sind und von dem so genannten "immediate-early" Genen kodiert werden,
bereits in der Zelle vorhanden und werden durch ein bestimmtes Signal
aktiviert; ein gut bekanntes Mitglied dieser Klasse ist AP-1.
AP-1
ist ein heterodimerer Transkriptionsfaktor, der aus c-Jun- und c-Fos-Protein besteht
(Curran und Franza (1988) Cell 55, 395), die über Leuzin-Reißverschlußmotive
miteinander interagieren. Anders als c-Jun, das in der Lage ist
zu homodimerisieren und allein DNA zu binden, ist c-Fos auf die Bindung
an c-Jun angewiesen, um sequenzspezifisch DNA zu binden. Beide Proteine
sind Mitglieder einer größeren Familie
von Proteinen, die Jung und JunD (Jun-verwandt) sowie Fral und FosB
(Fos-verwandt) umfassen (Curran und Vogt (1992) in Transcriptional
Regulation, 797 (McKnight und Yamamoto) Cold Spring Harbor Laboratory
Press). AP-1 ist in der Lage an das Konsensussequenz-Motiv 5'-TGACTCA-3' zu binden, aber
viele Variationen dieser Sequenz können durch die verschiedenen
Homo- und Heterodimere der Familienmitglieder stark gebunden werden
(Franza et al. (1988) Science 239, 1150; Rauscher et al. (1988)
Genes Dev. 2, 1687; Risse et al. (1989) EMBO 18, 3825; Yang-Yen
et al. (1990) New Biol. 2, 351).
Obwohl
die gleichzeitige Expression von Fos und Jun zu dramatischer synergistischer
Aktivierung von AP-1-abhängiger
Transkription führen
kann (Chiu et al. (1988) Cell 54, 541), wurde ein bedeutender Grad
der experimentellen Variabilität
abhängig
vom benutzten Zelltyp, beobachtet. Deshalb ist es wahrscheinlich,
dass die Aktivitäten
von Fos und Jun durch andere Proteine beeinflußt werden, die möglicherweise
in Zelltyp-spezifischer Weise exprimiert werden (Baichwall und Tjian
(1990) Cell 63, 815) und, daß in
jedem Zelltyp die Gegenwart von bereits vorhandenen oder induzierbaren
Transkriptionsfaktoren sowohl die Selektion der Genziele als auch
den transkriptionellen Effekt von Fos-Jun-Familien Hetero- oder
Homodimeren beeinflußt. Übereinstimmend
mit der Promotor- und Zelltypspezifität von AP-1 wurde gezeigt, daß Fos den
c-fos-Promoter nicht aktiviert, sondern die Transkription reprimiert
(Sassone-Corsi (1988) Cell 54, 553; Lucibello et al. (1989) Cell 59,999).
Eine
Methode zur spezifischen Beeinflussung der transkriptionellen Aktivität eines
bestimmten Transkriptionsfaktors ist in WO 95/11687 offenbart. Diese
lehrt, dass es möglich
ist, mit der Aktivierungsfunktion von Transkriptionsfaktoren zu
interferieren, indem eine Zelle mit einem doppelsträngigen DNA-Molekül, Cis-Element
Decoy genannt, enthaltend eine Bindungsstelle für den spezifischen Transkriptionsfaktor,
behandelt wird. Die exogene Zufuhr einer großen Zahl von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen zu
einer Zelle, im besonderen in viel höherer Zahl als in dem endogenen
Promotor im Genom vorhanden, erzeugt eine Situation, in der die Mehrzahl
eines bestimmten Transkriptionsfaktors spezifisch an das jeweilige
Cis-Element Decoy und nicht an seine endogenen Zielgene bindet.
Dieser Ansatz zur Inhibition der Bindung von Transkriptionsfaktoren
an ihre endogene Bindungsstelle wird auch als Squelching bezeichnet.
Squelching von Transkription unter Verwendung von DNA Decoys wurde
erfolgreich eingesetzt, um das Wachstum von Zellen zu inhibieren,
unter Verwendung von DNA-Fragmenten, die spezifisch auf den Transkriptionsfaktor
E2F gerichtet sind (Morishita et al. (1995) 92, 5855).
Aus
der
DE 299 16 160 ,
deren Inhalt voll umfänglich
einbezogen wird, ist eine doppelsträngige Nukleinsäure bekannt,
die in der Lage ist, sequenzspezifisch an den Transkriptionsfaktor
AP-1 zu binden. Überraschend
wurde gefunden, daß die
Aktivierung des Endothelin-1 (ET-1)-Gens in venösen Endothelzellen durch AP-1
vermittelt wird. Diese Aktivierung wurde durch zu große mechanische
Belastung ausgelöst.
Das ET-1-Peptid, das in Antwort auf diesen Stimulus hergestellt
wird, ist hochwirksam in Vasokonstriktion und Wachstumsstimulation.
Freisetzung von ET-1 ist mit übermäßigem Wachstum
von glatten Muskelzellen sowie Umgestaltung korreliert worden. Im
Anschluß daran
war es möglich
zu zeigen, daß die
Aktivierung des ET-1-Gens in Endothelzellen durch die Einführung von
doppeisträngiger
DNA, die die AP-1 Bindestelle trug, blockiert werden konnte.
Ein
bevorzugter Ansatz der Therapie setzt voraus, dass die doppelsträngigen Nukleinsäuren sehr rasch
und gleichmäßig in die
an das Implantat anliegende Zellumgebung abgegeben bzw. von dieser
aufgenommen werden. Gerade im Bereich endovaskuläre Implantate droht aufgrund
des hohen Lumenflusses und der turbulenten Strömung ein sehr rasches und schnelles
Auswaschen der leicht wasserlöslichen
Nukleinsäuren.
Zudem ist die Aufbringung von reinen Nukleinsäuren oder nur mit Puffer vermengten
Mischungen auf die zumeist metallischen Implantate alles andere
als trivial. In der Regel sind die erzeugten Beschichtungen ungleichmäßig, so
dass eine lokale Konzentration der Nukleinsäure im Körper erheblich divergieren
kann. Schließlich
muss die Beschichtung ohne abzublättern oder abzuplatzen eine
Expansion des Stents bei der Implantation überstehen.
Einen
neuartigen Ansatz zur intrakorporalen Applikation von Nukleinsäuren mittels
eines intraluminalen Stents verfolgt die
US 6,228,845 . Es wird unter anderem
vorgeschlagen, die Nukleinsäuren
mit Hilfe eines Virus, der in eine fibrinhaltige Matrix eingebettet
ist, in die benachbarte Gewebsumgebung einzuschleusen. Der Einsatz
von insbesondere Adenoviren führt
zu einer intrinsischen inflammatorischen Aktivität von Genvektoren. Es besteht
zudem die Gefahr der Integration ins Genom mit der Folge der Veränderung
der genetischen Information der Zelle. Ferner bestehen Sicherheitsbedenken
bei der Anwendung, ist die Herstellung der Viren sehr aufwendig
und es besteht die Gefahr der systemischen Verteilung der Viren
durch Auswaschung aus dem Gefäß sowie
Integration an anderer Stelle im Körper.
Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein für die Applikation
von doppelsträngigen Nukleinsäuren geeignetes
Beschichtungssystem bereitzustellen, das nicht auf einer viralen
Technik basiert.
Diese
Aufgabe wird durch das endovaskuläre Implantat nach Anspruch
1 gelöst.
Das endovaskuläre Implantat
zeichnet sich dadurch aus, dass es eine aktive Beschichtung aus
- a) einer biodegradierbaren Trägermatrix
aus Hyaluronsäure
und/oder Hyaluronsäure-Derivaten
und
- b) einem in die Trägermatrix
eingebetteten Wirkstoff in Form einer doppelsträngigen Nukleinsäure umfasst.
Überraschenderweise
hat es sich gezeigt, dass die Freisetzung des eingebetteten Wirkstoffs
unter Zuhilfenahme der speziellen Trägermatrix eine sehr rasche
und eher gleichmäßige Elution
in das anliegende Gewebe ermöglicht.
Dadurch, dass die Trägermatrix
zwar ein Auswaschen des Wirkstoffs verhindert, jedoch ihrerseits
zumindest in Teilen schnell degradiert, lässt sich eine rasche und sehr
gleichmäßige Wirkstofffrei setzung
erzielen. Darüber
hinaus scheint die eigenständige
pharmakologische Wirkung von Hyaluronsäure bzw. seinen Derivaten die
Aufnahme der Nukleinsäure
durch das umgebende Zellgewebe zu unterstützen.
Der
Vorteil des Einsatzes von Nukleinsäuren liegt u. a. darin, dass
diese leicht herstellbar, chemisch gut verwendbar, sicher zu handhaben
und leicht zellgängig
ohne viralen Vektor sind.
In
einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die eingebettete
doppelsträngige
Nukleinsäure in
der Lage, sequenzspezifisch an den Transkriptionsfaktor AP-1 zu
binden. Die doppelsträngige
Nukleinsäure, die
in diesem Zusammenhang verwendet wird, enthält in einer bevorzugten Ausführungsform
eine oder mehrere Kopien einer Sequenz, die spezifisch AP-1 oder
einen verwandten Transkriptionsfaktor bindet. Synthetische Nukleinsäuren sind
typischerweise höchstens
100 bp lang und können
deshalb eine oder bis zu 10 vollständige Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen,
abhängig
von der Länge
der spezifischen Transkriptionsfaktorerkennungsstelle, die ausgewählt wurde,
erkennen. Nukleinsäuren,
die durch enzymatische Methoden wie beispielsweise PCR amplifiziert
werden oder in einem geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen
Gastorganismus vermehrt werden, enthalten zumindest etwa 10 Kopien,
bevorzugt zumindest etwa 30 Kopien, zumindest etwa 100 Kopien oder
zumindest etwa 300 Kopien der jeweiligen Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle.
Die
doppelsträngige
Nukleinsäure
ist beispielsweise ein ds Oligodesoxynukleotid (dsODN). Die Länge des
doppelsträngigen
Oligonukleotids liegt typischerweise im Bereich von etwa 5-50 bp,
vorzugsweise im Bereich von etwa 10-20 bp.
Vorzugsweise
weist das doppelsträngige
Oligonukleotid eine Sequenz auf, die das Konsensussequenz-Motiv
5'-TGACTCA-3' des AP-1 Transkriptionsfaktors
enthält.
Besonders bevorzugt sind doppelsträngige Oligonukleotide, wobei
ein Strang eine der Sequenzen
5 CGCTTGATGACTCAGCCGGAA 3' (SEQ ID NO:1);
5' GTGCTGACTCAGCAC
3' (SEQ ID NO:2);
5' CGCTTAGTGACTAAGCG
3' (SEQ ID NO:3);
5' TGTGCTGACTCAGCACA
3' (SEQ ID NO:4);
5' TTGTGCTGACTCAGCACAA
3'( SEQ ID NO:5);
5' TCGCTTAGTGACTAAGCGA
3' (SEQ ID NO:6);
5' TGCTGACTCATGAGTCAGCA
3' (SEQ ID NO:7);
5' TGCTGACTAATTAGTCAGCA
3'( SEQ ID NO:8);
5' GTCGCTTAGTGACTAAGCGAC
3' (SEQ ID NO:9);
5' CTTGTGCTGACTCAGCACAAG
3' (SEQ ID NO:10)
oder
5' TTGCTGACTCATGAGTCAGCAA
3 (SEQ ID NO:11) hat.
Oligonukleotide
werden in der Regel schnell durch Endo- und Exonukleasen, im besonderen
DNasen und RNasen in der Zelle, abgebaut. Deshalb wird die Nukleinsäure modifiziert,
um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so daß über einen langen Zeitraum eine
hohe Konzentration der Nukleinsäure
in der Zelle beibehalten wird. Typischerweise kann eine solche Stabilisierung
durch die Einführung
von einer oder mehrerer modifizierter Internukleotid-Phosphorgruppen oder
durch die Einführung
einer oder mehrerer Nicht-Phosphor-Internukleotide, erhalten werden.
Geeignete
modifizierte Internukleotide sind in Uhlmann und Peyman ((1990)
Chem. Rev. 90, 544) zusammengefaßt. Modifizierte Internukleotid-Phosphat
Reste und/oder Nicht-Phosphor-Brücken
in einer Nukleinsäure,
die in der gegenwärtigen
Erfindung eingesetzt werden können,
enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphorodithioat,
Phosphoramidat, Phosphatester, während
Nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge, beispielsweise Siloxan-Brücken, Carbonat-Brücken, Carboxymethylester-Brücken, Acetamidat-Brücken und/oder
Thioether-Brücken
enthalten. Es ist auch beabsichtigt, daß diese Modifizierung die Haltbarkeit
einer Mischung, die für
die Benutzung in einer Methode der gegenwärtigen Erfindung gedacht ist, verbessert.
Nukleinsäuren können durch
die Einführung
struktureller Merkmale in die Nukleinsäure, die die Halbwertzeit der
Nukleinsäure
erhöhen
weiter stabilisiert werden. Solche Strukturen, die Haarnadel- und
Glocken-DNA enthalten, sind in
US
5,683,985 offenbart. Die gleichzeitige Einführung von
modifizierten Internukleotid-Phosphat-Resten und/oder Nicht-Phosphor-Brücken, zusammen
mit den genannten Strukturen, ist auch möglich.
Eine
geeignete Konzentration der Nukleinsäuren liegt im Bereich von etwa
1 μM bis
etwa 50 μM
und vorzugsweise bei 1 μM,
wobei ein oder mehrere geeignete Puffer der aktiven Beschichtung
zugesetzt werden können.
Ein Beispiel eines solchen Puffers ist Tyrode-Lösung enthaltend 144,3 mmol/l
Na+, 4,0 mmol/l K+, 138,6
mmol/l Cl–,
1,7 mmol/l Ca2+, 1,0 mmol/l Mg2+,
0,4 mmol/l HPO4 2–,
19,9 mmol/l HCO3 –,
10,0 mmol/l D-Glucose.
Die
aktive Beschichtung kann zusätzlich
mindestens einen Zusatzstoff und/oder Hilfsstoff enthalten. Zusatzstoffe
und/oder Hilfsstoffe wie Lipide, kationische Lipide, Polymere, Nukleinsäure-Aptamere,
Peptide und Proteine sind beabsichtigt, um beispielsweise die Einbringung
von Nukleinsäuren
in die Zelle zu erhöhen, um
die Mischung auf nur eine Untergruppe von Zellen zu richten, um
den Abbau der Nukleinsäure
in der Zelle zu verhindern, um die Lagerung der Nukleinsäuremischung
vor der Verwendung zu erleichtern und/oder um die Einführung in
den Kern der Zelle zu verbessern.
Das
endovaskuläre
Implantat weist eine im wesentlichen die gesamte äußere Oberfläche des
Implantats bildende aktive Beschichtung auf, die durch Physisorption
oder kovalente Bindung an der darunter liegenden Oberfläche anhaftet.
Die aktive Beschichtung bedeckt den metallischen Grundkörper und
gegebenenfalls eine oder mehrere auf dem Grundkörper aufgebrachte Zwischenschichten.
Die Beschichtung umfasst eine Trägermatrix
aus Hyaluronsäure
und/oder Hyaluronsäure-Derivaten.
Hyaluronsäure
und seine Derivate zeichnen sich durch ihre sehr gute Biokompatibilität aus, da
die Materialien natürlichem
Ursprungs sind. Weiterhin hat es sich gezeigt, dass Hyaluronsäure als
auch seine Derivate eine eigenständige
entzündungshemmende Wirkung
besitzen und damit wirkungsvoll Gewebsirritationen verhindert oder
zumindest stark vermindert werden können. Ein bisher nicht im Detail
geklärter
synergistischer Effekt tritt bei der Applikation von Nukleinsäuren auf.
Hyaluronsäure (Hyaluronan)
ist ein einfaches Glykosaminoglykan der extrazellulären Matrix.
Es wird an der Oberfläche
von Fibroblasten synthetisiert und kommt als einziges Glykosaminoglykan
nicht als Proteoglykan vor. Hyaluronsäure ist eine hochmolekulare
Verbindung mit M
R zwischen 50.000 und mehreren
Millionen. Grundbaustein der Hyaluronsäure ist ein aus D-Glucuronsäure und
N-Acetyl-d-glucosamin in β1-3-glykosidischer Bindung
aufgebautes Aminodisaccharid, das mit der nächsten Einheit β1-4-glykosidisch
verbunden ist:
Die
unverzweigte Kette der Hyaluronsäure
besteht aus 2.000-10.000 solcher Einheiten. Durch Hyaluronidasen
werden β-glykosidische
Bindungen hydrolysiert und so die Hyaluronsäure zu kleineren Bruchstücken abgebaut.
Die – meist
als Kalium-Salz – im
Handel befindliche Hyaluronsäure
ist aus menschlichen Nabelschnüren
oder Hahnenkämmen
isoliert, wird aber zunehmend biotechnologisch durch bakterielle
Fermentation hergestellt.
Zur
Modifizierung von Hyaluronsäure,
d.h. Darstellung von Hyaluronsäure-Derivaten,
werden literaturbekannte Verfahren eingesetzt (z. B. Danishefsky,
Arch. Biochem. Biophys., 90, 1960, S. 114 ff.; Nagasawa, Carbohydr.
Res., 58, 1977, S. 47 ff.; Ayotte, Carbohydr. Res. 145, 1986, S.
267 ff.; Ogamo, Carbohydr. Res. 193, 1989, S. 165 ff.; Jesaja, Can.
J. Chem.; 67, 1989, S. 1449 ff.; Mulloy, Carbohydr. Res. 255, 1994,
S. 1 ff.). Dabei handelt es sich um regio- und stereoselektive und
nicht regio- und
stereoselektive (statische) Reaktionen. Basierend auf diesem Verfahren
kann Hyaluronsäure
insbesondere durch N- und O-Desulfatierung, 6-O-Desulfatierung,
Deacetylierung oder Acetylierung sowie Sulfatierung, Acylierung
mit aliphatischen oder aromatischem Rest verändert werden. Insbesondere
können
durch die bekannten Verfahren Aminogruppen, Sulfat- oder Carboxylreste
unter Anwendung von Schutzgruppenchemie und bekannten, zum Teil
regioselektiven Reaktionen der organischen Chemie eingeführt werden.
Unter
dem Begriff "Hyaluronsäue-Derivate" im Sinne der Erfindung
werden demnach alle durch gezielte Modifizierungen der natürlichen
Hyalu ronsäure
strukturell zum Ausgangsprodukt veränderten Reaktionsprodukte verstanden.
Unter dem Begriff "Hyaluronsäure und
Hyaluronsäure-Derivate" werden ferner alle
polyelektrolytischen Salze derselben, z.B. Natrium-, Kalium-, Magnesium-
und Kalziumsalze, verstanden. Als "Modifizierungen" im erfindungsgemäßen Sinne werden die aufgeführten und
weiteren bekannten Reaktion der organischen Chemie zur Umsetzung
der funktionellen Gruppen der Hyaluronsäure angesehen.
Hyaluronsäure und
die Hyaluronsäure-Derivate
können
als Einzelsubstanzen, Co- oder Blockpolymere aus Hyaluronsäure und
Hyaluronsäure-Derivaten,
als auch in Form von Mischungen der vorgenanten Einzelsubstanzen
und Polymere kovalent und/oder durch Physisorption an der Stimulationselektrodenoberfläche immobilisiert
werden.
Eine
kovalente Anbindung der Trägermatrix
an die Oberfläche
des Implantats erfolgt vorzugsweise durch Einpunkts- oder Mehrpunktsaufhängung an
Spacer. Weiterhin wird vorzugsweise zumindest bereichsweise durch
Vernetzung einer zuvor aufgebrachten (primären) Trägermatrix eine mechanische
und/oder chemische Stabilisierung des Beschichtungsmaterials gegen
enzymatischen und hydrolytischen Abbau, als auch gegen mechanischen
Stress erreicht. Die Immobilisierung der Trägermatrix auf der Oberfläche des
Implantats kann nach bekannten Methoden der Immobilisierung von
Enzymen, Methoden der Membranherstellung, Kunststoffverarbeitung,
Polymerchemie, der Peptid-, Protein- und Zuckerchemie über kovalente Bindungen mit
und ohne Verwendung von Spacern, mittels Einpunkts- und Mehrpunktaufhängung, Endpunktaufhängung als
Mono- oder Multilayer oder mit zusätzlicher Stabilisierung durch
Quervernetzung erfolgen.
Als
vorteilhaft hat sich eine aktive Beschichtung mit einer Schichtdicke
im Bereich zwischen 10-400 μm,
insbesondere 50-120 μm,
erwiesen. Bei den genannten Schichtdicken ist eine noch hinreichende
Freisetzung des Wirkstoffs sichergestellt, ohne dass die aktive
Beschichtung bereits einen unerwünschten
Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des Implantats hat.
Weiterhin
ist bevorzugt, wenn die Hyaluronsäure oder die Hyaluronsäure-Derivate
nach Sterilisation noch ein durchschnittliches Molekulargewicht
im Bereich von ca. 300.000 bis 500.000, insbesondere 380.000 bis
420.000 Dalton aufweisen. Im beanspruchten Molekulargewichtsbereich
erreicht die eigenständige
therapeutische Wirkung der Hyaluronsäure und seiner Derivate ein
Maximum (Papakonstantinou, G. Karakiulakis, O. Eickelberg, A.P.
Perruchoud, L.H. Block, and M. Roth ; A 340 kDa hyaluronic acid
secreted by human vascular smooth muscle cells regulates their proliferation
and migration, Glycobiology 1998, 8, 821-830).
Ein
weiterer vorteilhafter Aspekt der erfindungsgemäßen Lehre liegt in der gezielten
Beeinflussung des in vivo Degradationsverhalten des Biopolymers.
Unter dem Begriff "Degradationsverhalten" wird der durch chemische,
thermische, oxidative, mechanische oder biologische Prozesse stattfindende
Abbau der erfindungsgemäßen Trägermatrix
im lebendem Organismus über
die Zeit verstanden. Einerseits soll sichergestellt werden, dass
die eingebetteten Wirkstoffe besonders rasch nach der Implantation
freigesetzt werden. Andererseits soll die Beschichtung über einen
bestimmten Zeitraum eine Oberflächenadsorption
von hochmolekularen Biomolekülen
auf der Implantatsoberfläche
verhindern oder zumindest deutlich zurückdrängen, da ansonsten mittel-
und langfristig mit Unverträglichkeitsreaktionen
zu rechnen ist.
Vorzugsweise
ist die Trägermatrix
derart beschaffen, dass die in vivo Degradation der Trägermatrix von
außen
in Richtung des Grundkörpers
des endovaskulären
Implantats verlangsamt ist. Das Degradationsverhalten kann dabei
kontinuierlich oder sprunghaft verändert werden. Nach letzterer
Variante umfasst die Trägermatrix
zumindest zwei Teilschichten mit unterschiedlichem Degradationsverhalten,
wobei das Degradationsverhalten innerhalb jeder Teilschicht kontinuierlich
veränder lich
oder konstant über
die Teilschicht festlegbar ist. Die Herstellung derartiger Beschichtungen
kann mit Hilfe an sich bekannter Sprüh- und Tauchbeschichtungsverfahren
erfolgen.
Vorzugsweise
ist die Trägermatrix
derart beschaffen, dass ein dem Grundkörper des Implantats abgewandter, äußerer Bereich
der Trägermatrix
zumindest zu 90 Gew.% innerhalb von 0,1 bis 240 h, insbesondere 0,2
bis 24 h, in vivo abgebaut wird. Der äußere Bereich ist vorzugsweise
10 bis 250 μm,
insbesondere 50 bis 150 μm,
dick. Wenn die Trägermatrix
aus zumindest zwei Teilschichten mit unterschiedlichem Degradationsverhalten
besteht, ist zur Erreichung dieses Ziels eine äußere Teilschicht derart modifiziert,
dass sich diese äußere Teilschicht
um mehr als 90 Gew.% innerhalb von 0,1 bis 240 h, insbesondere 0,2
bis 24 h, in vivo abbaut. Die äußere Teilschicht
ist vorzugsweise 10 bis 250 μm,
insbesondere 50 bis 150 μm,
dick.
Es
hat sich ferner überraschenderweise
gezeigt, dass in Gegenwart der erfindungsgemäßen Trägermatrix auch die Oberflächenadsorption
von hochmolekularen Biomolekülen
auf der Implantatsoberfläche
verhindert oder zumindest deutlich zurückgedrängt ist. Vorzugsweise ist daher
die Trägermatrix
derart beschaffen, dass ein dem Grundkörper des Implantats zugewandter,
innerer Bereich der Trägermatrix
zumindest nicht vollständig
innerhalb von zwei Jahren in vivo abgebaut wird. Der innere Bereich
ist vorzugsweise 3 bis 50 μm,
insbesondere 5 bis 20 μm,
dick. Wenn die Trägermatrix
aus zumindest zwei Teilschichten mit unterschiedlichem Degradationsverhalten
besteht, ist zur Erreichung dieses Ziels insbesondere eine innere
Teilschicht, die sich unmittelbar der darunter liegenden Oberfläche des
Grundkörpers
des Implantats oder gegebenenfalls einer hierauf aufgebrachten Zwischenschicht
anschließt,
derart modifiziert, dass sich diese innere Teilschicht um nicht
mehr als 20 Gew.% innerhalb von zwei Jahren in vivo abbaut. Die äußere Teilschicht
ist vorzugsweise 3 bis 50 μm,
insbesondere 5 bis 20 μm,
dick.
Das
Degradationsverhalten von Hyaluronsäure und seiner Derivate kann
u.a. durch Quervernetzung und reduktive Fixierung beeinflusst werden.
Hierzu wird generell auf die in der Literatur zahlreichen beschriebenen
Verfahren zur Durchführung
der einzelnen Vernetzungsreaktionen und ausdrücklich auf den Gegenstand der
US 4,582,865 ,
US 5,550,187 ,
US 5,510,121 und WO 00/46252 verwiesen.
Unter reduktive Fixierung wird die gezielte Umsetzung ungesättigter
Funktionalitäten
des Polysaccharids mit hydridischen Reduktionsmitteln, wie z.B.
Natriumborhydrid, verstanden. Die Quervernetzung kann z.B. mit Hilfe
der folgenden Reagenzien durchgeführt werden:
Formaldyhyd,
Glutaraldehyd, Divinylsulfon, Polyanhydride, Polyaldehyde, Carbodiimide,
Epichlorohydrin, Ethylenglykol-diglycidylether, Butandiol-diglycidylether,
Polyglycerol-polyglycidylether, Polyethylenglykoldiglycidylether,
Polypropylenglykol-diglycidylether oder bis- oder Polyepoxy-Vernetzer,
wie 1,2,3,4-Diepoxybutan oder 1,2,7,8-Diepoxyoctan.
Der
Zusammenhang zwischen Vernetzungsgrad, reduktiver Fixierung und
Degradationsverhalten kann über
herkömmliche
Testverfahren ermittelt werden. Ein unterschiedlicher Vernetzungsgrad
führt bei
ansonsten gleicher Fixierung zu einem unterschiedlichen Quellverhalten
der Trägermatrix.
Durch Verzicht auf die Fixierung oder nur unvollständige Fixierung
wird die Degradation der Trägermatrix
beschleunigt. Der Quellfaktor lässt
sich u.a. gravimetrisch bestimmen. Weiterhin lässt sich der Vernetzungsgrad
und der Umfang der reduktiven Fixierung durch infrarotspektroskopische
Analyse an vernetzten Hyaluronsäurefolien
bestimmen. Der Bezug zur Degradation kann durch eine GPC Analytik,
d.h. durch Molmassenbestimmung degradierter Hyaluronsäure, an
Eluenten hergestellt werden.
Der
Einfluss der genannten Modifikationen auf das in vivo Degradationsverhalten
ist allgemein bekannt. Da das Abbauverhalten aber u.a. auch von
weiteren geometrischen und physiologischen Faktoren ab hängt, ist
in der Regel eine individuelle Anpassung des Systems an die jeweiligen
Erfordernisse notwendig.
Weiterhin
ist bevorzugt, dass die Trägermatrix
durch Vernetzung einen Quellfaktor im Bereich von 2-6, insbesondere
3-4, aufweist. Die genannten Bereichsangaben für den Quellfaktor haben sich
als in der Praxis besonders geeignet für eine rasche in vivo Wirkstofffreisetzung
erwiesen.
Die
Beschichtung kann in der Regel auf alle bekannten endovaskulären Implantate
aufgebracht werden, eignet sich aber insbesondere für kardiovaskuläre Implantate.
Die dünne
Trägermatrix
aus Hyaluronsäure und/oder
Hyaluronsäure-Derivaten
wird dazu mittels gängiger
Sprühverfahren
oder aus der Lösung
abgeschieden.
Die
prinzipielle Herstellung einer kovalent anhaftenden Polysaccharidschicht
wird in der WO 00/56377 beschrieben, deren Offenbarung vollumfänglich mit
einbezogen wird. Eine Substratoberfläche wird dazu mit reaktiven
Funktionalitäten
modifiziert, aktivierte Hyaluronsäure wird bereit gestellt und
diese wird dann unter geeigneten Bedingungen kovalent an die reaktiven
Funktionalitäten
gebunden. In eben gleicher Weise lässt sich die erfindungsgemäße Trägermatrix
an die Oberfläche
des endovaskulären
Implantats binden.
Weiterhin
offenbart die bereits erwähnte
DE 196 30 563 ein Verfahren
zur Verbesserung der Haftung einer Beschichtung infolge verstärkter Physisorption
bzw. kovalenter Bindung. In einem ersten Schritt wird eine reaktive
Funktionalität
auf der Substratobertläche
erzeugt. Die reaktive Funktionalität umfasst insbesondere Amine,
Aldehyde, Sulfide, Alkohole, Säurehalogenide
und Isocyanate. An die genannte Funktionalität kann dann – unter
Rückgriff
auf an sich bekannte Kopplungsverfahren – die erfindungsgemäße Trägermatrix
kovalent gebunden werden.
Weiterhin
ist bevorzugt, wenn die Trägermatrix
eine Haftvermittlerschicht aus Chitosan umfasst. Die Haftvermittlerschicht
schließt
sich unmittelbar dem Grundkörper
und ggf. eine darauf aufgebrachten Zwischenschicht an. Es hat sich überraschenderweise
gezeigt, dass in Gegenwart einer solchen Haftvermittlerschicht sehr
gleichmäßige und
stark haftende Beschichtungen erzeugt werden können. Zudem ist Chitosan Werkstoff natürlichem
Ursprungs und damit gut bioverträglich.
Die als Haftvermittlerschicht ist vorzugsweise 0,1 bis 50 μm, insbesondere
1 bis 10 μm,
dick und kann ebenso wie die Hyaluronsäure und ihre Derivate zur Beeinflussung
Ihres Degradationsverhaltens modifiziert werden. Insbesondere kann
die Haftvermittlerschicht derart ausgebildet sein, dass sie als
innere Teilschicht oder innerer Bereich der Trägermatrix im oben genannten
Sinne agieren kann. Eine signifikante Änderung der Wirkstofffreisetzung
durch die Haftvermittlerschicht wurde nicht festgestellt.
Nach
einer weiteren bevorzugten Variante der Erfindung beinhaltet die
Trägermatrix
zumindest in Teilbereichen oder Teilschichten Chitosan. Hierdurch
kann das Haftvermögen
der Trägermatrix
weiter verbessert werden und es können auch auf den sehr komplexen
Geometrien des Substrats gleichmäßige Beschichtungen erzeugt
werden. Die Stabilität
der Polysacharidschicht kann gesteigert werden, wenn durch Quarternisierung der
aminischen Funktionen des Chitosans polykationische Ladungen erzeugt
werden. Weiden Hyaluronsäure und
seine Derivate als polyanionische Präparate zugemengt, so bildet
sich ein Symplexgel. Die schon sehr starke Ion/Ion-Wechselwirkung
zwischen den Komponenten kann durch Quervernetzung weiter erhöht werden.
Ein Gewichtsanteil des Chitosans am Gesamtgewicht der Trägermatrix
beträgt
vorzugsweise nicht mehr als 50 %. Auch diese Modifikationen haben überraschenderweise
kaum Einfluss auf die Freisetzung der Nukleinsäuren.
Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und der dazugehörigen Zeichnungen
näher erläutert.
Die
einzige Figur zeigt eine schematische Draufsicht auf einen Stent 10 in
einem Teilabschnitt einer Abwicklung seiner rohrförmig verlaufenden
Umlaufswandung. Ein Grundgerüst
des Stents 10 umfasst eine Vielzahl einzelner Zellen 16,
die in Umlaufsrichtung über
Stege 12 und in axialer Richtung des Stents 10 teils in
ihren Kopfbereichen 14 miteinander verbunden sind. Selbstverständlich ist
das hier dargestellte Stentdesign nur beispielhaft zu verstehen.
Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche weitere Stentdesigns bekannt,
die sich für
die erfindungsgemäßen Zwecke
eignen. Erfindungswesentlich ist lediglich, dass zumindest bereichsweise
eine im folgenden noch näher
erläuterte,
aktive Beschichtung 18 vorhanden ist. Die aktive Beschichtung 18 ist
durch die Schraffur angedeutet.
Die
Darstellung eines solchen Stent mit aktiver Beschichtung 18 wird
nachfolgend an Ausführungsbeispielen
kurz erläutert:
Chitosan als
Haftvermittler für
die Trägermatrix
Die
Implantatsoberfläche
wurde vorgereinigt, entfettet und unter leichtem Rühren für 10 Minuten
bei Raumtemperatur in eine 0,5 bis 2%ige Essigsäure mit einer Chitosankonzentration
zwischen 0,1% und 0,5% gerührt.
Das Molekulargewicht des Chitosans betrug zwischen 100.000 und 1.000.000
Dalton. Anschließend wurde
das Implantat entnommen und getrocknet.
Alternativ
konnte eine dünne
Schicht aus Chitosan durch Aufsprühen auf das Implantat aufgebracht werden.
Hierzu wurde eine 0,5%ige Chitosanlösung in einer 0,5%igen Essigsäure angesetzt.
Das vorgereinigte Implantat wurde 5 bis 20 mal im Abstand von 15
bis 30 Sekunden für
0,5 bis 1,0 sec mit Hilfe einer Airbrushpistole besprüht, wobei
zwischen den Sprühschritten
das Implantat bei 40°C
bis 70°C
getrocknet wurde. Die aufgebrachten Schichten wiesen eine Schichtdicke
von 1 μm
bis 10μm
auf.
Das
Chitosan fungiert als Haftvermittler, da Chitosan selbst im neutralen
Bereich (Blut) schwer löslich ist.
Die dünne
Haftvermittlerschicht aus Chitosan von 0,1 μm bis 50 μm, vorzugsweise von 1 μm bis 10 μm, hat keine
signifikante Beeinträchtigung
der Freisetzungseigenschaften der Trägermatrix zur Folge.
Aufbringunq
der Trägermatrix
Nach
Trocknung wurde das Implantat unter leichtem Rühren für 10 Minuten bei Raumtemperatur
in eine wässrige
Lösung
von Hyaluronsäure
mit einem Molekulargewicht von mindestens 1.000.000 Dalton gelegt.
Nach Entnahme und Trocknung wurde die Probe für mindestens 2 h bei ca. 30°C bis 40°C in eine
Vernetzerlösung
von 2 bis 4 ml Glutaraldehyd in einem Wasser-Aceton Gemisch getaucht.
Danach wurde die Vernetzerlösung
ausgetauscht und die Vernetzung 2 h fortgeführt.
Anschließend wurde
die Probe mehrfach mit destilliertem Wasser gespült und mehrfach mit deionisiertem
Wasser gespült.
Nach Entnahme wurde die Probe für
24 Stunden bei 50°C
im Trockenschrank getrocknet.
Das
Molekulargewicht der Hyaluronsäure
soll über
1.000.000 Dalton betragen, da die Hyaluronsäureketten durch die Sterilisation
gespalten werden. Nach vorliegenden Untersuchungen kommt es bei
einer Sterilisation mit Hilfe von Ethylenoxid oder beta-Bestrahlung
(Elektronenbeschleuniger: 4,5 mEV, 25 kGy) zu 1 bis 2 Spaltungen
pro Kette, d.h. native Hyaluronsäure
liegt nach Sterilisation mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung
von 400.000 Dalton vor.
In
Abhängigkeit
von der Konzentration der wässrigen
Hyaluronsäurelösung konnten
folgende Schichtdicken erzielt werden, wobei die angemessenen Schichtdicken
nach 24stündiger
Trocknung bei 50°C
ermittelt wurden:
- • bei 0.25%iger wässriger
Hyaluronsäurelösung: ca.
90μm,
- • bei
0,5%iger wässriger
Hyaluronsäurelösung: ca.
160μm,
- • bei
einer 1 %igen wässrigen
Hyaluronsäurelösung: ca.
200μm
- • und
bei einer 2%igen wässrigen
Hyaluronsäurelösung: 145μm.
Chitosan als
Zusatz zur Trägermatrix
Neben
den Polyanionen Hyaluronsäure
bzw. seinen Hyaluronsäure-Derivaten kann die
Trägermatrix noch
Polykationen wie Chitosan enthalten. Durch das Amin des Chitosans
liegt eine weitere funktionelle Gruppe für den Vernetzer Glutardialdehyd
vor. Die Aldehydfunktion kann sowohl mit der Aminfunktion des Chitosans
als auch mit der Carbonyl- bzw.
Hydroxylfunktion der Hyaluronsäure
reagieren. Durch diese Reaktionen kann der Vernetzungsgrad erhöht und die
ionische Wechselwirkung zwischen den Polyanionen und Polykationen
verstärkt
werden. Das Schichtsystem aus Polyanionen und Polykationen kann
durch abwechselndes Besprühen
der Elektroden mit Lösungen
gewünschter
Konzentrationen von Chitosan, Hyaluronsäure und Hyaluronsäure-Derivaten hergestellt
werden.
Hierbei
werden vorgereinigte Implantate abwechselnd mit einer wässrigen
Lösung
aus Hyaluronsäure oder
Hyaluronsäure-Derivat
und in Essigsäure
gelöstem
Chitosan besprüht.
Dabei beträgt
die Konzentration der Hyaluronsäure
oder Hyaluronsäure-Derivate
0,1 % bis 1 %, vorzugsweise 0,2% bis 0,5%. Die Konzentration der
Essigsäure
beträgt
0,1 % bis 2%, vorzugsweise 0,5% bis 1 %. Die Konzentration des Chitosans
beträgt 0,1
% bis 1 %, vorzugsweise 0,2% bis 0,5%. Das Molekulargewicht der
Hyaluronsäure
oder der Hyaluronsäure-Derivate
beträgt
mindestens 1.000.000 Dalton und das Molekulargewicht des Chitosans
mindestens 100.000 Dalton. Beide Lösungen werden im Abstand von
2 Sekunden bis 60 Sekunden, vorzugsweise 15 Sekunden bis 30 Sekunden,
mit Hilfe eines Sprühverfahrens
abwechselnd auf die Proben aufgebracht. Durch die Wahl der Konzentration
an Hyaluronsäure
bzw. Chitosan und der jeweiligen Sprühdauer kann der jeweilige Anteil
an Polyanionen und Polykationen eingestellt werden. Der Gewichtsanteil
an Chitosan am gesamten Schichtsystem beträgt nicht mehr als 50 %. Die
Anzahl der Sprühschritte
bestimmt die Schichtdicke des gesamten Schichtsystems. So werden
bei 60 Sprühschritten
mit einer Sprühdauer
von 0,5 Sekunden mit üblichen Airbrushpistolen
Schichtdicken zwischen 5 μm
und 10 μm,
gemessen im trockenen Zustand, erreicht. Nach der Beschichtung wird
die Probe getrocknet und anschließend für mindestens 2 h bei ca. 30°C bis 40°C in eine Vernetzerlösung von
2 bis 4 ml Glutaraldehyd in einem Wasser-Aceton Gemisch getaucht.
Danach wird die Vernetzerlösung
für mindestens
weitere 2 h ausgetauscht. Anschließend wird die Probe mehrfach
mit destilliertem Wasser gespült
und mehrfach mit deionisiertem Wasser gespült.
Einbindung
der doppelsträngigen
Nukleinsäuren
Die
in zuvor beschriebener Weise dargestellter Trägermatrix wird vor dem Trocknen
mit 0,5 – 1
ml einer Lösung
von 5 μg/mol
einer doppelsträngigen
Nukleinsäure
für 1 h
gespült.
Ohne weitere Spülschritte
erfolgt dann die Trocknung. Folgende Nukleinsäuresequenz wurde als AP1-Rezeptor-Antogonist
(AP-1 Decoy ODN) eingesetzt:
G*T*G*CTGACTCAG*C*A*C und rev
G*T*G*CTGAGTCAG*C*A*C
wobei * für eine phosphorothioat-modifizierte
Bindung steht. Das Molekulargewicht der Sequenz beträgt 9.146 g/mol
und die Sequenz weist 15 Basenpaare auf.
Die
Einbringung der doppelsträngigen
Nukleinsäure
kann optional unter Modifikation des pH-Werts der Trägermatrix
als auch der nukleinsäure haltigen
Lösung
erfolgen. Dabei wird beispielsweise der pH-Wert der Lösung auf
etwa den isoelektrischen Punkt gepuffert, so dass die dem Diffusionsprozess
entgegenwirkenden gleichen Ladungen der Trägermatrix und der Nukleinsäure verringert
oder beseitigt werden.
Einen
weiteren Ansatz zur Einbindung der Nukleinsäuren liefert die Elektrophorese,
bei der das Eindringen der Nukleinsäuren durch Anlegen eines elektrischen
Stromes unterstützt
wird, wobei das Implantat als Elektrode dient. Sequenzprotokoll
