WO2005049106A2 - Endovaskuläres implantat mit einer ap-1 decoy dna-hyaluronan-beschichtung - Google Patents

Endovaskuläres implantat mit einer ap-1 decoy dna-hyaluronan-beschichtung Download PDF

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WO2005049106A2
WO2005049106A2 PCT/EP2004/013395 EP2004013395W WO2005049106A2 WO 2005049106 A2 WO2005049106 A2 WO 2005049106A2 EP 2004013395 W EP2004013395 W EP 2004013395W WO 2005049106 A2 WO2005049106 A2 WO 2005049106A2
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endovascular implant
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hyaluronic acid
endovascular
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Gerd Bayer
Claus Harder
Markus Hecker
Andreas Wagner
Bernd Heublein
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Biotronik Gmbh & Co Kg.
Avontec Gmbh
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    • A61L2300/258—Genetic materials, DNA, RNA, genes, vectors, e.g. plasmids

Definitions

  • the invention relates to an endovascular implant with an active coating.
  • Coronary artery disease is one of the most common causes of death in Western Europe and North America.
  • the cause of myocardial infarction is the thrombotic occlusion of a coronary artery due to rupture of an atheromatous PIaque with pre-existing stenosing atheromatosis.
  • Decisive .factors for the long-term prognosis after acute myocardial infarction are: - an effective and long-lasting reopening of the infarct artery,
  • Non-surgical stenosis treatment methods have been established for more than twenty years, which include the narrowed or closed blood vessel is expanded again by balloon dilatation (PTCA percutaneous transluminal coronary angioplasty). This procedure has proven itself particularly in the treatment of acute myocardial infarction. With the widening of the blood vessel, however, the smallest injuries and tears (dissections) occur in the vessel wall, which often heal easily, but in about a third of the cases lead to proliferation due to the triggered cell growth (proliferation), which ultimately leads to renewed vasoconstriction (restenosis) ) to lead. The widening also does not remove the causes of the stenosis, i.e. the molecular pathological changes in the vascular wall.
  • Another cause of restenosis is the elasticity of the stretched blood vessel. After removing the balloon, the blood vessel contracts excessively, so that the cross-section of the vessel is reduced (obstruction, so-called negative remodeling). The latter effect can only be avoided by placing an endovascular implant, usually a stent.
  • Some of the coating systems serve as carriers in which one or more pharmacologically active substances are embedded (local drug delivery (LDD); drug eluting stents).
  • the coating systems usually cover at least one peripheral wall of the endovascular implant facing the vessel wall.
  • the support of such coating systems consists of a biocompatible material, which is either of natural origin or can be obtained by synthetic means. Numerous processes have been developed for applying the coating systems to the stent, such as, for example, rotary atomization processes, immersion processes and spray processes.
  • the coating system covers the peripheral wall of the stent facing the vessel wall, at least in some areas.
  • the pharmacologically active substances are released in the human or animal body by gradual degradation of the carrier and / or diffusion into the surrounding tissue. The elution characteristics of the substances can be estimated in advance using established in vitro tests.
  • AP-1 is a heterodimeric transcription factor consisting of c-Jun and c-Fos protein (Curran and Franza (1988) Cell 55, 395) which interact with one another via leucine zipper motifs. Unlike c-Jun, which is able to homodimerize and bind DNA alone, c-Fos relies on binding to c-Jun to bind sequence-specific DNA. Both proteins are members of a larger family of proteins, which include JunB and JunD (Jun-related) and Fral and FosB (Fos-related) (Curran and Vogt (1992) in Transcriptional Regulation, 797 (McKnight and Yamamoto) Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • AP-1 is able to bind to the consensus sequence motif% '- TGACTCA-3', but many variations of this sequence can be strongly bound by the different homo- and heterodimers of the family members (Franza et al. (1988) Science 239, 1150; Rauscher et al. (1988) Genes Dev. 2, 1687; Risse et al. (1989) EMBO 18, 3825; Yang-Yen et al. (1990) New Biol. 2, 351).
  • Fos and Jun can lead to dramatic synergistic activation of AP-1-dependent transcription (Chiu et al. (1988) Cell 54, 541), a significant degree of experimental variability depending on the cell type used was observed. Therefore, the activities of Fos and Jun are likely to be affected by other proteins that may be expressed in a cell type-specific manner (Baichwall and Tjian (1990) Cell 63, 815) and the presence of pre-existing ones in each cell type or inducible transcription factors influences both the selection of the gene targets and the transcriptional effect of Fos-Jun families of hetero- or homodimers.
  • Fos does not activate the c-fos promoter, but represses the transcription (Sassone-Corsi (1988) Cell 54, 553; Lucibello et al. (1989) Cell 59,999 ).
  • a method for specifically influencing the transcriptional activity of a specific transcription factor is disclosed in WO 95/11687. This teaches that it is possible to interfere with the activation function of transcription factors by treating a cell with a double-stranded DNA molecule, called cis-element decoy, containing a binding site for the specific transcription factor.
  • the exogenous delivery of a large number of transcription factor binding sites to a cell, particularly in a much higher number than in the endogenous promoter in the genome creates a situation in which the majority of a particular transcription factor is specific to the particular cis-element decoy and not binds to its endogenous target genes.
  • This approach to inhibit the binding of transcription factors to their endogenous binding site is also referred to as squelching. Squelching using transcription DNA Decoys has been successfully used to inhibit the growth of cells using DNA fragments that are specifically directed to the transcription factor E2F (Morishita et al. (1995) 92, 5855).
  • a preferred approach to therapy presupposes that the double-stranded nucleic acids are released very quickly and uniformly into the cell environment adjacent to the implant or are absorbed by the latter.
  • the high lumen flow and the turbulent flow threaten to wash out the easily water-soluble nucleic acids very quickly and quickly.
  • the application of pure nucleic acids or mixtures mixed with buffer to the mostly metallic implants is anything but trivial.
  • the coatings produced are uneven, so that a local concentration of the nucleic acid in the body can diverge considerably.
  • the coating must survive an expansion of the stent during implantation without flaking or flaking off.
  • 6,228,845 pursues a novel approach to the intracorporeal application of nucleic acids by means of an intraluminal stent. It is proposed, inter alia, to introduce the nucleic acids into the neighboring tissue environment with the aid of a virus which is embedded in a matrix containing fibrin.
  • adenoviruses in particular leads to an intrinsic inflammatory activity of gene vectors.
  • integration into the genome with the consequence of changing the genetic information of the cell.
  • the production of the viruses is very complex and there is a risk of the systemic distribution of the viruses through washing out of the vessel and integration elsewhere in the body.
  • the object of the present invention is to provide a coating system which is suitable for the application of double-stranded nucleic acids and which is not based on a viral technique.
  • the endovascular implant is characterized by the fact that it comprises an active coating made of a) a biodegradable carrier matrix made of hyaluronic acid and / or hyaluronic acid derivatives and b) an active ingredient in the form of a double-stranded nucleic acid embedded in the carrier matrix.
  • the release of the embedded active ingredient with the aid of the special carrier matrix enables very rapid and rather uniform elution into the adjacent tissue.
  • the fact that the carrier matrix prevents the active ingredient from washing out, but in turn quickly degrades it, at least in part, means that the active ingredient can be released quickly and very evenly. achieve settlement.
  • the independent pharmacological effect of hyaluronic acid or its derivatives appears to support the absorption of the nucleic acid by the surrounding cell tissue.
  • nucleic acids are u. a. in the fact that they are easy to produce, can be used chemically, are safe to use and are easy to pass through cells without a viral vector.
  • the embedded double-stranded nucleic acid is able to bind to the transcription factor AP-1 in a sequence-specific manner.
  • the double-stranded nucleic acid used in this context contains one or more copies of a sequence that specifically binds AP-1 or a related transcription factor.
  • Synthetic nucleic acids are typically at most 100 bp long and can therefore recognize one or up to 10 complete transcription factor binding sites, depending on the length of the specific transcription factor recognition site that was selected.
  • Nucleic acids which are amplified by enzymatic methods such as PCR or which are propagated in a suitable prokaryotic or eukaryotic host organism contain at least approximately 10 copies, preferably at least approximately 30 copies, at least approximately 100 copies or at least approximately 300 copies of the respective transcription factor binding site.
  • the double-stranded nucleic acid is, for example, a ds oligodeoxynucleofid (dsODN).
  • the length of the double-stranded oligonucleotide is typically in the range of about 5-50 bp, preferably in the range of about 10-20 bp.
  • the double-stranded oligonucleotide preferably has a sequence which is the consensus sequence motif 5'-TGACTCA-3 'of AP-1 Contains transcription factor. Double-stranded ougonucleotides are particularly preferred, one strand being one of the sequences
  • Ougonucleotides are usually rapidly degraded by endo- and exonucleases, especially DNases and RNases in the cell. Therefore, the nucleic acid is modified to stabilize it against degradation so that a high concentration of the nucleic acid is maintained in the cell over a long period of time. Typically, such stabilization can be achieved by introducing one or more modified internucleotide phosphor groups or by introducing one or more non-phosphorus intemucleotides.
  • Modified internucleotide phosphate residues and / or non-phosphorus bridges in a nucleic acid which can be used in the present invention contain, for example, methylphosphonate, phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidate, phosphate ester, while non-phosphorus internucleotide analogs, for example siloxane Bridges, carbonate bridges, carboxymethyl ester bridges, acetamidate bridges and / or thioether bridges.
  • This modification is also intended to improve the shelf life of a mixture intended for use in a method of the present invention.
  • Nucleic acids can be further stabilized by introducing structural features into the nucleic acid that increase the half-life of the nucleic acid.
  • Such structures containing hairpin and bell DNA are disclosed in US 5,683,985.
  • the simultaneous introduction of modified internucleotide phosphate residues and / or non-phosphorus bridges, together with the structures mentioned, is also possible.
  • a suitable concentration of the nucleic acids is in the range from approximately 1 ⁇ M to approximately 50 ⁇ M and preferably 1 ⁇ m, it being possible for one or more suitable buffers to be added to the active coating.
  • An example of such a buffer is Tyrode solution containing 144.3 mmol / l Na + , 4.0 mmol / l K + , 138.6 mmol / l Cf, 1.7 mmol / l Ca 2+ , 1.0 mmol / l Mg 2+ , 0.4 mmol / l HPO 4 2 ' , 19.9 mmol / l HCO 3 " , 10.0 mmol / l D-glucose.
  • the active coating can additionally contain at least one additive and / or auxiliary.
  • Additives and / or adjuvants such as lipids, cationic lipids, polymers, nucleic acid aptamers, peptides and proteins are intended, for example, to increase the introduction of nucleic acids into the cell in order to direct the mixture onto only a subset of cells in order to degrade them prevent nucleic acid in the cell to facilitate storage of the nucleic acid mixture prior to use and / or to improve insertion into the nucleus of the cell.
  • the endovascular implant has an active coating which essentially forms the entire outer surface of the implant and adheres to the underlying surface through physisorption or covalent bonding.
  • the active coating covers the metallic base body and possibly one or more intermediate layers applied to the base body.
  • the coating comprises a carrier matrix made of hyaluronic acid and / or hyaluronic acid derivatives.
  • Hyaluronic acid and its derivatives are characterized by their very good biocompatibility, since the materials are of natural origin. Furthermore, it has been shown that hyaluronic acid and its derivatives have an independent anti-inflammatory effect and can thus effectively prevent or at least greatly reduce tissue irritation. A synergistic effect that has not yet been clarified in detail occurs when nucleic acids are applied.
  • Hyaluronic acid is a simple glycosaminoglycan of the extracellular matrix. It is synthesized on the surface of fibroblasts and is the only glycosaminoglycan not found as a proteoglycan.
  • Hyaluronic acid is a high molecular compound with M R between 50,000 and several million.
  • the basic building block of hyaluronic acid is an aminodisaccharide composed of D-glucuronic acid and N-acetyl-d-glucosamine in a ⁇ 1-3 glycosidic bond, which is linked to the next unit ⁇ 1-4-glycosidically:
  • the unbranched chain of hyaluronic acid consists of 2,000-10,000 such units. Ss-glycosidic bonds are hydrolyzed by hyaluronidases and the hyaluronic acid is broken down into smaller fragments.
  • the hyaluronic acid - usually in the form of potassium salt - is isolated from human umbilical cords or cockscombs, but is increasingly being produced biotechnologically by bacterial fermentation.
  • hyaluronic acid can be changed in particular by N- and O-desulfation, 6-O-desulfation, deacetylation or acetylation as well as sulfation, acylation with an aliphatic or aromatic radical.
  • amino groups, sulfate or carboxyl radicals can be introduced using the known methods using protective group chemistry and known, sometimes regioselective, reactions in organic chemistry.
  • hyaluronic acid derivatives in the sense of the invention, all of them are therefore by targeted modifications of the natural Hyalu- ronic acid understood structurally modified reaction products to the starting product.
  • the term “hyaluronic acid and hyaluronic acid derivatives” is also understood to mean all polyelectrolytic salts thereof, for example sodium, potassium, magnesium and calcium salts.
  • Modifications in the sense of the invention are the listed and further known reactions of organic chemistry for converting the functional groups of hyaluronic acid.
  • Hyaluronic acid and the hyaluronic acid derivatives can be immobilized as individual substances, copolymers or block polymers of hyaluronic acid and hyaluronic acid derivatives, as well as in the form of mixtures of the aforementioned individual substances and polymers covalently and / or by physisorption on the stimulation electrode surface.
  • the carrier matrix is preferably covalently attached to the surface of the implant by single-point or multi-point suspension on spacers. Furthermore, mechanical and / or chemical stabilization of the coating material against enzymatic and hydrolytic degradation, as well as against mechanical stress, is preferably achieved, at least in some areas, by crosslinking a previously applied (primary) carrier matrix.
  • the immobilization of the carrier matrix on the surface of the implant can be carried out according to known methods of immobilizing enzymes, methods of membrane production, plastics processing, polymer chemistry, peptide, protein and sugar chemistry via covalent bonds with and without the use of spacers, by means of single-point and Multi-point suspension, end-point suspension as a monolayer or multilayer or with additional stabilization through cross-linking.
  • the hyaluronic acid or the hyaluronic acid derivatives after sterilization still have an average molecular weight in the range from approximately 300,000 to 500,000, in particular 380,000 to 420,000, daltons.
  • the independent therapeutic effects of hyaluronic acid and its derivatives reach a maximum in the claimed molecular weight range (Papakonstantinou, G. Karakiulakis, O. Eickelberg, AP Perruchoud, LH Block, and M. Roth; A 340 kDa hyaluronic acid secreted by human vascular smooth muscle cells regula - tes their proliferation and migration, Glycobiology 1998, 8, 821-830).
  • a further advantageous aspect of the teaching according to the invention lies in the targeted influencing of the in vivo degradation behavior of the biopolymer.
  • degradation behavior is understood to mean the degradation of the carrier matrix according to the invention in the living organism over time by chemical, thermal, oxidative, mechanical or biological processes.
  • the coating should prevent or at least significantly suppress surface adsorption of high-molecular biomolecules on the implant surface over a certain period of time, since otherwise intolerance reactions can be expected in the medium and long term.
  • the carrier matrix is preferably such that the in vivo degradation of the carrier matrix from the outside is slowed down in the direction of the base body of the endovascular implant.
  • the degradation behavior can be changed continuously or by leaps and bounds.
  • the carrier matrix comprises at least two partial layers with different degradation behavior, the degradation behavior continuously changing within each partial layer. Lich or constant over the sub-layer can be determined.
  • Such coatings can be produced with the aid of spraying and dip coating methods known per se.
  • the carrier matrix is preferably designed in such a way that an outer region of the carrier matrix facing away from the base body of the implant is degraded at least to 90% by weight within 0.1 to 240 h, in particular 0.2 to 24 h, in vivo.
  • the outer region is preferably 10 to 250 ⁇ m, in particular 50 to 150 ⁇ m, thick. If the carrier matrix consists of at least two partial layers with different degradation behavior, an outer partial layer is modified in order to achieve this goal in such a way that this outer partial layer changes by more than 90% by weight within 0.1 to 240 h, in particular 0.2 up to 24 h, degrades in vivo.
  • the outer partial layer is preferably 10 to 250 ⁇ m, in particular 50 to 150 ⁇ m, thick.
  • the carrier matrix is therefore preferably designed such that an inner region of the carrier matrix facing the base body of the implant is at least not completely degraded in vivo within two years.
  • the inner region is preferably 3 to 50 ⁇ m, in particular 5 to 20 ⁇ m, thick.
  • the carrier matrix consists of at least two sub-layers with different degradation behavior
  • an inner sub-layer that directly adjoins the underlying surface of the base body of the implant or, if appropriate, an intermediate layer applied thereon is modified in order to achieve this goal in such a way that this inner sub-layer surrounds itself does not degrade more than 20% by weight in vivo within two years.
  • the outer partial layer is preferably 3 to 50 ⁇ m, in particular 5 to 20 ⁇ m, thick.
  • the degradation behavior of hyaluronic acid and its derivatives can be influenced by cross-linking and reductive fixation. For this purpose, reference is generally made to the numerous processes described in the literature for carrying out the individual crosslinking reactions and expressly to the subject matter of US Pat. No.
  • Reductive fixation means the targeted implementation of unsaturated functionalities of the polysaccharide with hydridic reducing agents, such as sodium borohydride.
  • the crosslinking can be carried out, for example, using the following reagents:
  • Formaldyhyd glutaraldehyde, divinyl sulfone, polyanhydrides, Polyaldehy- de, carbodiimides, epichlorohydrin, ethylene glycol diglycidyl ether, butanediol diglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether or bis- or polyether poxy crosslinkers, such as 1, 2,3,4-diepoxybutane or 1, 2,7,8-diepoxyoctane.
  • the relationship between the degree of crosslinking, reductive fixation and degradation behavior can be determined using conventional test methods.
  • a different degree of crosslinking leads to a different swelling behavior of the carrier matrix with otherwise the same fixation.
  • the degradation of the carrier matrix is accelerated if the fixation is dispensed with or only incomplete.
  • the swelling factor can be determine gravimetrically.
  • the degree of crosslinking and the extent of the reductive fixation can be determined by infrared spectroscopic analysis on crosslinked hyaluronic acid films.
  • the relation to the degradation can be determined by GPC analysis, i.e. by determining the molar mass of degraded hyaluronic acid on eluents.
  • the carrier matrix has a swelling factor in the range of 2-6, in particular 3-4, due to crosslinking.
  • the stated range information for the swelling factor has proven to be particularly suitable in practice for a rapid in vivo release of active ingredient.
  • the coating can generally be applied to all known endovascular implants, but is particularly suitable for cardiovascular implants.
  • the thin carrier matrix made of hyaluronic acid and / or hyaluronic acid derivatives is deposited by means of common spray processes or from the solution.
  • a covalently adhering polysaccharide layer is described in WO 00/56377, the disclosure of which is fully incorporated.
  • a substrate surface is modified with reactive functionalities, activated hyaluronic acid is provided and this is then covalently bound to the reactive functionalities under suitable conditions.
  • the carrier matrix according to the invention can be bound to the surface of the endovascular implant in exactly the same way.
  • DE 196 30 563 discloses a method for improving the adhesion of a coating as a result of increased physisorption or covalent bonding.
  • a reactive functionality is generated on the substrate surface.
  • the reactive functionality includes in particular amines, aldehydes, sulfides, alcohols, acid halides and isocyanates.
  • the carrier matrix according to the invention can then be covalently bound to the functionality mentioned, using coupling methods known per se. It is further preferred if the carrier matrix comprises an adhesion promoter layer made of chitosan. The adhesion promoter layer immediately adjoins the base body and, if necessary, an intermediate layer applied thereon.
  • chitosan is a material of natural origin and therefore well biocompatible.
  • the adhesive layer is preferably 0.1 to 50 ⁇ m, in particular 1 to 10 ⁇ m, thick and, like the hyaluronic acid and its derivatives, can be modified to influence its degradation behavior.
  • the adhesion promoter layer can be designed such that it can act as an inner partial layer or an inner region of the carrier matrix in the sense mentioned above. No significant change in the release of the active ingredient by the adhesion promoter layer was found.
  • the carrier matrix contains chitosan at least in partial areas or partial layers.
  • the adhesion of the carrier matrix can be further improved and uniform coatings can also be produced on the very complex geometries of the substrate.
  • the stability of the polysaccharide layer can be increased if polycationic charges are generated by quenching the aminic functions of the chitosan. If hyaluronic acid and its derivatives are added as polyanionic preparations, a symplex gel is formed.
  • the already very strong lon / lon interaction between the components can be further increased by cross-linking.
  • a proportion by weight of the chitosan in the total weight of the carrier matrix is preferably not more than 50%. Surprisingly, these modifications also have hardly any influence on the release of the nucleic acids.
  • the invention is explained in more detail below on the basis of exemplary embodiments and the associated drawings.
  • the single figure shows a schematic plan view of a stent 10 in a partial section of a development of its tubular circumferential wall.
  • a basic structure of the stent 10 comprises a multiplicity of individual cells 16 which are connected to one another in the head regions 14 in the circumferential direction via webs 12 and in the axial direction of the stent 10.
  • the stent design shown here is only to be understood as an example. Numerous other stent designs are known from the prior art which are suitable for the purposes according to the invention.
  • an active coating 18, which will be explained in more detail below, is present at least in some areas.
  • the active coating 18 is indicated by the hatching.
  • the implant surface was pre-cleaned, degreased and stirred with gentle stirring for 10 minutes at room temperature in a 0.5 to 2% acetic acid with a chitosan concentration between 0.1% and 0.5%.
  • the molecular weight of the chitosan was between 100,000 and 1,000,000 daltons.
  • the implant was then removed and dried.
  • a thin layer of chitosan could be sprayed onto the implant.
  • a 0.5% chitosan solution was prepared in a 0.5% 'strength by weight acetic acid.
  • the pre-cleaned implant was sprayed 5 to 20 times at an interval of 15 to 30 seconds for 0.5 to 1.0 seconds using an airbrush gun, the implant being dried at 40 ° C. to 70 ° C. between the spraying steps.
  • the layers applied had a layer thickness of 1 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the chitosan acts as an adhesion promoter, since chitosan is hardly soluble even in the neutral area (blood).
  • the thin adhesive layer made of chitosan from 0.1 ⁇ m to 50 ⁇ m, preferably from 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, does not result in any significant impairment of the release properties of the carrier matrix.
  • the implant was placed in an aqueous solution of hyaluronic acid with a molecular weight of at least 1,000,000 Daltons with gentle stirring for 10 minutes at room temperature.
  • the sample was immersed in a crosslinking solution of 2 to 4 ml of glutaraldehyde in a water-acetone mixture at about 30 ° C. to 40 ° C. for at least 2 h.
  • the crosslinker solution was then replaced and the crosslinking continued for 2 hours.
  • the sample was then rinsed several times with distilled water and rinsed several times with deionized water. After removal, the sample was dried in a drying cabinet at 50 ° C. for 24 hours.
  • the molecular weight of hyaluronic acid is said to be over 1,000,000 daltons, since the hyaluronic acid chains are split by the sterilization. According to the available studies, sterilization with the aid of ethylene oxide or beta radiation (electron accelerator: 4.5 mEV, 25 kGy) leads to 1 or 2 splits per chain, i.e. native hyaluronic acid is present after sterilization with a molecular weight of the order of 400,000 daltons.
  • aqueous hyaluronic acid solution Depending on the concentration of the aqueous hyaluronic acid solution, the following layer thicknesses could be achieved, the appropriate layer thicknesses being determined after drying for 24 hours at 50 ° C. With 0.25% aqueous hyaluronic acid solution: approx. 90 ⁇ m,
  • the carrier matrix can also contain polycations such as chitosan.
  • the amine of chitosan provides another functional group for the crosslinker glutardialdehyde.
  • the aldehyde function can react both with the amine function of chitosan and with the carbonyl or hydroxyl function of hyaluronic acid. These reactions can increase the degree of crosslinking and increase the ionic interaction between the polyanions and polycations.
  • the layer system consisting of polyanions and polycations can be produced by alternately spraying the electrodes with solutions of desired concentrations of chitosan, hyaluronic acid and hyaluronic acid derivatives.
  • pre-cleaned implants are alternately sprayed with an aqueous solution of hyaluronic acid or hyaluronic acid derivative and chitosan dissolved in acetic acid.
  • concentration of the hyaluronic acid or hyaluronic acid derivatives is 0.1% to 1%, preferably 0.2% to 0.5%.
  • concentration of acetic acid is 0.1% to 2%, preferably 0.5% to 1%.
  • concentration of the chitosan is 0.1% to 1%, preferably 0.2% to 0.5%.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid or the hyaluronic acid derivatives is at least 1,000,000 daltons and the molecular weight of the chitosan is at least 100,000 daltons.
  • Both solutions are every 2 seconds up to 60 seconds, preferably 15 seconds to 30 seconds, alternately applied to the samples with the aid of a spray process.
  • concentration of hyaluronic acid or chitosan and the respective spray duration the respective proportion of polyanions and polycations can be set.
  • the weight fraction of chitosan in the entire layer system is not more than 50%.
  • the number of spraying steps determines the layer thickness of the entire layer system. In 60 spray steps with a spray duration of 0.5 seconds, layer thicknesses between 5 ⁇ m and 10 ⁇ m, measured in the dry state, are achieved with conventional airbrush guns.
  • the sample is dried and then immersed in a crosslinking solution of 2 to 4 ml of glutaraldehyde in a water / acetone mixture for at least 2 h at approximately 30 ° C. to 40 ° C.
  • the crosslinking solution is then exchanged for at least another 2 hours.
  • the sample is then rinsed several times with distilled water and rinsed several times with deionized water.
  • the carrier matrix shown in the manner described above is rinsed with 0.5-1 ml of a solution of 5 ⁇ g / mol of a double-stranded nucleic acid for 1 hour before drying. The drying then takes place without further rinsing steps.
  • the following nucleic acid sequence was used as the AP1 receptor antogonist (AP-1 Decoy ODN):
  • the introduction of the double-stranded nucleic acid can optionally be modified by modifying the pH of the carrier matrix as well as the nucleic acid containing solution.
  • the pH of the solution is buffered to approximately the isoelectric point, so that the same charges of the carrier matrix and the nucleic acid counteracting the diffusion process are reduced or eliminated.
  • Another approach to integrating the nucleic acids is provided by electrophoresis, in which the penetration of the nucleic acids is supported by applying an electrical current, the implant serving as the electrode.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein endovaskuläres Implantat mit einer aktiven Beschichtung. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein für die Applikation von doppelsträngigen Nukleinsäuren geeignetes Beschichtungssystem bereitzustellen. Dazu weist das Implantat eine aktive Beschichtung auf, die aus (a) einer biodegradierbaren Trägermatrix aus Hyaluronsäure und/oder Hyaluronsäure-Derivaten und (b) einem in die Trägermatrix eingebetteten Wirkstoff in Form einer doppelsträngigen Nukleinsäure besteht.

Description

Endovaskuläres Implantat mit einer aktiven Beschichtung
Die Erfindung betrifft ein endovaskuläres Implantat mit einer aktiven Beschichtung.
Koronare Herzerkrankungen, insbesondere akute Myokardinfarkte, stellen in Westeuropa und Nordamerika eine der häufigsten Todesursachen dar. In mehr als 80% der Fälle ist die Ursache des Myokardinfarktes der thrombotische Verschluss einer Koronararterie durch Ruptur einer athe- romatösen PIaque bei vorbestehender stenosierender Atheromatose. Entscheidende .Faktoren für die Langzeitprognose nach akutem Myo- kardinfarkt sind: - eine effektive und langanhaltende Wiedereröffnung der Infarktarterie,
- die Dauer des thrombotischen Gefäßverschlusses, - die Verhinderung eines größeren Myokardverlustes und eines ventrikulären Remodeling,
- die Beherrschung rhythmogener Komplikationen.
Die genannten Faktoren bestimmen nicht nur die kardiovaskuläre Morta- lität, sondern auch die Lebensqualität nach dem Infarkt.
Seit mehr als zwanzig Jahren sind nicht-operative Methoden zur Stenose-Behandlung etabliert, bei denen u.a. durch Ballondilatation (PTCA Perkutane Transluminale Coronare Angioplastie) das verengte oder verschlossene Blutgefäß wieder aufgeweitet wird. Dieses Vorgehen hat sich insbesondere bei der Therapie des akuten Myokardinfarktes bewährt. Mit dem Aufweiten des Blutgefäßes entstehen allerdings kleinste Verletzungen und Einrisse (Dissektionen) in der Gefäßwand, die zwar häufig problemlos verheilen, jedoch in etwa einem Drittel der Fälle durch das ausgelöste Zellwachstum zu Wucherungen führen (Proliferation), die letztendlich zu einer erneuten Gefäßverengung (Restenose) führen. Die Aufweitung beseitigt auch nicht die Ursachen der Stenose, also die molekularpathologischen Veränderungen in der Gefäßwand. Eine weitere Ursache der Restenose ist die Elastizität des gedehnten Blutgefäßes. Nach dem Entfernen des Ballons zieht sich das Blutgefäß übermäßig zusammen, so dass der Gefäßquerschnitt verringert wird (Obstruktion, sogenanntes negatives remodeling). Letzterer Effekt kann nur durch Platzierung eines endovaskulären Implantats, in der Regel eines Stents, vermieden werden.
In der interventionellen Therapie der stabilen und instabilen Angina pec- toris bei koronarer Herzkrankheit, hat die Einführung der Stents zu einer deutlichen Reduktion der Rate an Restenosen und damit zu besseren Langzeitresultaten geführt. Dies gilt sowohl für die primäre als auch die Rezidivstenose. Ursächlich für den Nutzen der Stent-Implantation ist der höhere primäre Lumengewinn. Durch den Einsatz von Stents kann zwar ein optimaler Gefäßquerschnitt erreicht werden, allerdings führt der Einsatz von Stents ebenfalls zu kleinsten Verletzungen, die die Proliferation induzieren können und damit letztendlich eine Restenose auslösen können. Weiterhin initiiert die Anwesenheit eines derartigen Fremdkörpers eine Kaskade von zellulären molekularen Prozessen, die zu einem allmählichen Zuwachsen des Stents führen können.
Mittlerweile bestehen umfangreiche Erkenntnisse zum zellbiologischen Mechanismus und zu den auslösenden Faktoren der Stenose und Restenose. Die Restenose entsteht als Reaktion der Gefäßwand auf die lokale Verletzung infolge Dehnung des atherosklerotischen PIaque. Über komplexe Wirkmechanismen wird die lumengerichtete Migration und Proliferation der glatten Muskelzellen der Media und der Adventitia induziert (neointimale Hyperplasie). Unter Einfluss verschiedener Wachs- tumsfaktoren produzieren die glatten Muskelzellen eine Deckschicht aus neointimalen Glattmuskelzellen und Matrixproteinen (Elastin, Kollagen, Proteoglykane), deren ungesteuertes Wachstum allmählich zu einer Einengung des Lumens führen kann. Konventionelle systemische medikamentöse Therapieeinsätze sehen u.a. die orale Verabreichung von Calzium-Antagonisten, ACE-Hemmern, Antikoagulantien, Antiaggregan- tien, Fischölen, antiproliferativen Substanzen, antiinflammatorischen Substanzen und Serotonin-Antagonisten vor, signifikante Reduktionen der Restenosearten wurden auf diesem Wege bisher jedoch nicht erreicht.
Seit einigen Jahren versucht man die Restenosegefahr bei der Implantation von Stents durch Aufbringung spezieller Beschichtungssysteme zu mindern. Teilweise dienen die Beschichtungssysteme als Träger, in die ein oder mehrere pharmakologisch wirksame Subtanzen eingebettet sind (Local Drug Delivery (LDD); drug eluting stents). Die Beschich- tungssysteme bedecken in der Regel zumindest eine der Gefäßwand zugewandte Umlaufswandung des endovaskulären Implantates. Der Träger derartiger Beschichtungssysteme besteht aus einem biokompatiblen Material, welches entweder natürlichen Ursprungs ist oder auf synthetischem Wege gewonnen werden kann. Zur Aufbringung der Beschichtungssysteme auf den Stent sind zahlreiche Verfahren entwi- ekelt worden, wie beispielsweise Rotationszerstäubungsverfahren, Tauchverfahren und Sprühverfahren. Das Beschichtungssystem bedeckt zumindest bereichsweise die der Gefäßwand zugewandte Umlaufswandung des Stents. Eine Freisetzung der pharmakologisch wirksamen Substanzen erfolgt im menschlichen bzw. tierischen Körper durch all- mähliche Degradation des Trägers und/oder Diffusion in das umgebende Gewebe. Die Elutionscharakteristik der Substanzen lässt sich mit Hilfe etablierter in vitro Untersuchungen vorab abschätzen.
Als Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen für LDD-Systeme wurden bisher zahlreiche Präparate vorgeschlagen, die in der Regel den kon- ventionell eingesetzten Zytostatika und Immunsuppresiva entsprechen. Unbeachtet der bisher umfangreichen Aktivitäten auf dem Bereich aktiv beschichteter endovaskulärer Implantate sind alle bisherigen Versuche, die Restenose nach Angioplastie medikamentös einzudämmen bisher nicht mit der gewünschten Wirkung verbunden. Ein neuer Ansatz sieht nun vor, nicht nur die Symptome durch Applikation geeigneter Wirkstoffe zu bekämpfen, sondern auch die dem Krankheitsbild zugrunde liegende Struktur des menschlichen Genoms und seine Transkription zu berücksichtigen, d. h. die die Krankheit hervorrufenden Faktoren (z. B. Transkriptionsfaktoren, die durch bestimmte pathologische Ereignisse aktiviert werden) zu blocken, und zwar sehr früh, bevor es überhaupt zu einer Induktion von (pathologischer) Genaktivität gekommen ist. Darüber hinaus sollen nicht nur einzelne Faktoren gehemmt werden, sondern mehrere pathologische Ereignisse gleichzeitig beeinflusst werden, da Transkriptionsfaktoren in der Regel mehrere Gene aktivieren. Ein viel- versprechender Ansatz ist dabei die Applikation von doppelsträngigen DNA-Olegonukleotiden, und zwar aus folgendem Grund: Die meisten Zellen im Körper sind in der G0-Phase des Zellzyklus, die auch als die Ruhephase bezeichnet wird. Fast alle ruhenden Körperzellen haben immer noch die Fähigkeit zum Wachstum und können durch eine Anzahl von Stimuli dazu angeregt werden, wieder in den Zellzyklus einzutreten, wobei die wichtigsten Stimuli Wachstumsfaktoren und Verletzungen sind. Wachstum sowie auch Umgestaltungsprozesse werden in erster Linie auf der Transkriptionsebene geregelt. Die physische Belastung von beispielsweise koronarer Angioplastie oder Stent- lmplantation wird deshalb zur Induktion einer Anzahl von Genen führen, wobei Cycline, zellzyklus-spezifische Phosphatasen, Zellzyklus- spezifische Transkriptionsfaktoren wie Cyclin E, Cyclin A, Cyclin B, cdc25C, cdc25A, E2F-Familienmitglieder sowie zahlreiche metabolisch wichtige Gene oder Gene, die an der Replikation von DNA beteiligt sind (PCNA, Histonen). Während diese Faktoren nach Eintritt in den Zellzyk- lus neu synthetisiert werden, sind viele Transkriptionsfaktoren, die in den ersten Schritten des Wachstums involviert sind und von dem so genannten "immediate-early" Genen kodiert werden, bereits in der Zelle vorhanden und werden durch ein bestimmtes Signal aktiviert; ein gut bekanntes Mitglied dieser Klasse ist AP-1.
AP-1 ist ein heterodimerer Transkriptionsfaktor, der aus c-Jun- und c- Fos-Protein besteht (Curran und Franza (1988) Cell 55, 395), die über Leuzin-Reißverschlußmotive miteinander interagieren. Anders als c-Jun, das in der Lage ist zu homodimerisieren und allein DNA zu binden, ist c- Fos auf die Bindung an c-Jun angewiesen, um sequenzspezifisch DNA zu binden. Beide Proteine sind Mitglieder einer größeren Familie von Proteinen, die JunB und JunD (Jun-verwandt) sowie Fral und FosB (Fos-verwandt) umfassen (Curran und Vogt (1992) in Transcriptional Regulation, 797 (McKnight und Yamamoto) Cold Spring Harbor Laboratory Press). AP-1 ist in der Lage an das Konsensussequenz- Motiv %'-TGACTCA-3' zu binden, aber viele Variationen dieser Sequenz können durch die verschiedenen Homo- und Heterodimere der Familienmitglieder stark gebunden werden (Franza et al. (1988) Science 239, 1150; Rauscher et al. (1988) Genes Dev. 2, 1687; Risse et al. (1989) EMBO 18, 3825; Yang-Yen et al. (1990) New Biol. 2, 351).
Obwohl die gleichzeitige Expression von Fos und Jun zu dramatischer synergistischer Aktivierung von AP-1 -abhängiger Transkription führen kann (Chiu et al. (1988) Cell 54, 541), wurde ein bedeutender Grad der experimentellen Variabilität abhängig vom benutzten Zelltyp, beobachtet. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass die Aktivitäten von Fos und Jun durch andere Proteine beeinflußt werden, die möglicherweise in Zelltyp-spezifischer Weise exprimiert werden (Baichwall und Tjian (1990) Cell 63, 815) und, daß in jedem Zelltyp die Gegenwart von bereits vorhandenen oder induzierbaren Transkriptionsfaktoren sowohl die Selektion der Genziele als auch den transkriptionellen Effekt von Fos-Jun-Familien Hetero- oder Homodimeren beeinflußt. Übereinstimmend mit der Promotor- und Zelltypspezifität von AP-1 wurde gezeigt, daß Fos den c-fos-Promoter nicht aktiviert, sondern die Transkription reprimiert (Sassone-Corsi (1988) Cell 54, 553; Lucibello et al. (1989) Cell 59,999).
Eine Methode zur spezifischen Beeinflussung der transkriptioneilen Aktivität eines bestimmten Transkriptionsfaktors ist in WO 95/11687 offenbart. Diese lehrt, dass es möglich ist, mit der Aktivierungsfunktion von Transkriptionsfaktoren zu interferieren, indem eine Zelle mit einem doppelsträngigen DNA-Molekül, Cis-Element Decoy genannt, enthaltend eine Bindungsstelle für den spezifischen Transkriptionsfaktor, behandelt wird. Die exogene Zufuhr einer großen Zahl von Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen zu einer Zelle, im besonderen in viel höherer Zahl als in dem endogenen Promotor im Genom vorhanden, erzeugt eine Situation, in der die Mehrzahl eines bestimmten Transkriptionsfaktors spezifisch an das jeweilige Cis-Element Decoy und nicht an seine endogenen Zielgene bindet. Dieser Ansatz zur Inhibition der Bindung von Transkriptionsfaktoren an ihre endogene Bindungsstelle wird auch als Squelching bezeichnet. Squelching von Transkription unter Verwendung von DNA Decoys wurde erfolgreich eingesetzt, um das Wachstum von Zellen zu inhibieren, unter Verwendung von DNA-Fragmenten, die spezifisch auf den Transkriptionsfaktor E2F gerichtet sind (Morishita et al. (1995) 92, 5855).
Aus der DE 299 16 160, deren Inhalt voll umfänglich einbezogen wird, ist eine doppelsträngige Nukleinsäure bekannt, die in der Lage ist, sequenzspezifisch an den Transkriptionsfaktor AP-1 zu binden. Überraschend wurde gefunden, daß die Aktivierung des Endothelin-1 (ET-l)-Gens in venösen Endothelzellen durch AP-1 vermittelt wird. Diese Aktivierung wurde durch zu große mechanische Belastung ausgelöst. Das ET-1-Peptid, das in Antwort auf diesen Stimulus hergestellt wird, ist hochwirksam in Vasokonstriktion und Wachstumsstimulation. Freisetzung von ET-1 ist mit übermäßigem Wachstum von glatten Muskelzellen sowie Umgestaltung korreliert worden. Im Anschluß daran war es möglich zu zeigen, daß die Aktivierung des ET-1-Gens in Endothelzellen durch die Einführung von doppeisträngiger DNA, die die AP-1 Bindestelle trug, blockiert werden konnte.
Ein bevorzugter Ansatz der Therapie setzt voraus, dass die dop- pelsträngigen Nukleinsäuren sehr rasch und gleichmäßig in die an das Implantat anliegende Zellumgebung abgegeben bzw. von dieser aufgenommen werden. Gerade im Bereich endovaskuläre Implantate droht aufgrund des hohen Lumenflusses und der turbulenten Strömung ein sehr rasches und schnelles Auswaschen der leicht wasserlöslichen Nuk- leinsäuren. Zudem ist die Aufbringung von reinen Nukleinsäuren oder nur mit Puffer vermengten Mischungen auf die zumeist metallischen Implantate alles andere als trivial. In der Regel sind die erzeugten Beschichtungen ungleichmäßig, so dass eine lokale Konzentration der Nukleinsäure im Körper erheblich divergieren kann. Schließlich muss die Beschichtung ohne abzublättern oder abzuplatzen eine Expansion des Stents bei der Implantation überstehen. Einen neuartigen Ansatz zur intrakorporalen Applikation von Nukleinsäuren mittels eines intraluminalen Stents verfolgt die US 6,228,845. Es wird unter anderem vorgeschlagen, die Nukleinsäuren mit Hilfe eines Virus, der in eine fibrinhaltige Matrix eingebettet ist, in die benachbarte Gewebsumgebung einzuschleusen. Der Einsatz von insbesondere Adenoviren führt zu einer intrinsischen inflammatorischen Aktivität von Genvektoren. Es besteht zudem die Gefahr der Integration ins Genom mit der Folge der Veränderung der genetischen Information der Zelle. Ferner bestehen Sicherheitsbedenken bei der Anwendung, ist die Herstel- lung der Viren sehr aufwendig und es besteht die Gefahr der systemischen Verteilung der Viren durch Auswaschung aus dem Gefäß sowie Integration an anderer Stelle im Körper.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein für die Applikation von doppelsträngigen Nukleinsäuren geeignetes Beschich- tungssystem bereitzustellen, das nicht auf einer viralen Technik basiert.
Diese Aufgabe wird durch das endovaskuläre Implantat nach Anspruch 1 gelöst. Das endovaskuläre Implantat zeichnet sich dadurch aus, dass es eine aktive Beschichtung aus a) einer biodegradierbaren Trägermatrix aus Hyaluronsäure und/oder Hyaluronsäure-Derivaten und b) einem in die Trägermatrix eingebetteten Wirkstoff in Form einer doppelsträngigen Nukleinsäure umfasst.
Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass die Freisetzung des eingebetteten Wirkstoffs unter Zuhilfenahme der speziellen Trägermatrix eine sehr rasche und eher gleichmäßige Elution in das anliegende Gewebe ermöglicht. Dadurch, dass die Trägermatrix zwar ein Auswaschen des Wirkstoffs verhindert, jedoch ihrerseits zumindest in Teilen schnell degradiert, lässt sich eine rasche und sehr gleichmäßige Wirkstofffrei- setzung erzielen. Darüber hinaus scheint die eigenständige pharmako- logische Wirkung von Hyaluronsäure bzw. seinen Derivaten die Aufnahme der Nukleinsäure durch das umgebende Zellgewebe zu unterstützen.
Der Vorteil des Einsatzes von Nukleinsäuren liegt u. a. darin, dass diese leicht herstellbar, chemisch gut verwendbar, sicher zu handhaben und leicht zellgängig ohne viralen Vektor sind.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist die eingebettete doppelsträngige Nukleinsäure in der Lage, sequenzspezifisch an den Transkriptionsfaktor AP-1 zu binden. Die doppelsträngige Nukleinsäure, die in diesem Zusammenhang verwendet wird, enthält in einer bevorzugten Ausführungsform eine oder mehrere Kopien einer Sequenz, die spezifisch AP-1 oder einen verwandten Transkriptionsfaktor bindet. Synthetische Nukleinsäuren sind typischerweise höchstens 100 bp lang und können deshalb eine oder bis zu 10 vollständige Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, abhängig von der Länge der spezifischen Transkriptionsfaktorerkennungsstelle, die ausgewählt wurde, erkennen. Nukleinsäuren, die durch enzymatische Methoden wie beispielsweise PCR amplifiziert werden oder in einem geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Gastorganismus vermehrt werden, enthalten zumindest etwa 10 Kopien, bevorzugt zumindest etwa 30 Kopien, zumindest etwa 100 Kopien oder zumindest etwa 300 Kopien der jeweiligen Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle.
Die doppelsträngige Nukleinsäure ist beispielsweise ein ds Oligodesoxynukleofid (dsODN). Die Länge des doppelsträngigen Oligonukleotids liegt typischerweise im Bereich von etwa 5-50 bp, vorzugsweise im Bereich von etwa 10-20 bp.
Vorzugsweise weist das doppelsträngige Oligonukleotid eine Sequenz auf, die das Konsensussequenz-Motiv 5'-TGACTCA-3' des AP-1 Transkriptionsfaktors enthält. Besonders bevorzugt sind doppelsträngige Oügonukleotide, wobei ein Strang eine der Sequenzen
5' CGCTTGATGACTCAGCCGGAA 3' (SEQ ID NO:1 );
5' GTGCTGACTCAGCAC 3' (SEQ ID NO:2); 5' CGCTTAGTGACTAAGCG 3' (SEQ ID NO:3);
5' TGTGCTGACTCAGCACA 3' (SEQ ID NO:4);
5' TTGTGCTGACTCAGCACAA 3'( SEQ ID NO:5);
5' TCGCTTAGTGACTAAGCGA 3' (SEQ ID NO:6);
5' TGCTGACTCATGAGTCAGCA 3' (SEQ ID NO:7); 5' TGCTGACTAATTAGTCAGCA 3'( SEQ ID NO:8);
5' GTCGCTTAGTGACTAAGCGAC 3' (SEQ ID NO:9);
5' CTTGTGCTGACTCAGCACAAG 3' (SEQ ID NO:10) oder
5' TTGCTGACTCATGAGTCAGCAA 3' (SEQ ID NO:11) hat.
Oügonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- und Exonukleasen, im besonderen DNasen und RNasen in der Zelle, abgebaut. Deshalb wird die Nukleinsäure modifiziert, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so daß über einen langen Zeitraum eine hohe Konzentration der Nukleinsäure in der Zelle beibehalten wird. Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch die Einführung von einer oder mehrerer modifizierter Internukleotid-Phosphorgruppen oder durch die Einführung einer oder mehrerer Nicht-Phosphor- Intemukleotide, erhalten werden.
Geeignete modifizierte Interriukleotide sind in Uhlmann und Peyman ((1990) Chem. Rev. 90, 544) zusammengefaßt. Modifizierte Internukleotid-Phosphat Reste und/oder Nicht-Phosphor-Brücken in einer Nukleinsäure, die in der gegenwärtigen Erfindung eingesetzt werden können, enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Phosphoramidat, Phosphatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge, beispielsweise Siloxan-Brücken, Carbonat-Brücken, Carboxymethylester-Brücken, Acetamidat-Brücken und/oder Thioether-Brücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, daß diese Modifizierung die Haltbarkeit einer Mischung, die für die Benutzung in einer Methode der gegenwärtigen Erfindung gedacht ist, verbessert.
Nukleinsäuren können durch die Einführung struktureller Merkmale in die Nukleinsäure, die die Halbwertzeit der Nukleinsäure erhöhen weiter stabilisiert werden. Solche Strukturen, die Haarnadel- und Glocken-DNA enthalten, sind in US 5,683,985 offenbart. Die gleichzeitige Einführung von modifizierten Internukleotid-Phosphat-Resten und/oder Nicht- Phosphor-Brücken, zusammen mit den genannten Strukturen, ist auch möglich.
Eine geeignete Konzentration der Nukleinsäuren liegt im Bereich von etwa 1 μM bis etwa 50 μM und vorzugsweise bei 1μM, wobei ein oder mehrere geeignete Puffer der aktiven Beschichtung zugesetzt werden können. Ein Beispiel eines solchen Puffers ist Tyrode-Lösung enthaltend 144,3 mmol/l Na+, 4,0 mmol/l K+, 138,6 mmol/l Cf, 1 ,7 mmol/l Ca2+, 1 ,0 mmol/l Mg2+, 0,4 mmol/l HPO4 2' , 19,9 mmol/l HCO3 ", 10,0 mmol/l D- Glucose. Die aktive Beschichtung kann zusätzlich mindestens einen Zusatzstoff und/oder Hilfsstoff enthalten. Zusatzstoffe und/oder Hilfsstoffe wie Lipide, kationische Lipide, Polymere, Nukleinsäure-Aptamere, Peptide und Proteine sind beabsichtigt, um beispielsweise die Einbringung von Nukleinsäuren in die Zelle zu erhöhen, um die Mischung auf nur eine Untergruppe von Zellen zu richten, um den Abbau der Nukleinsäure in der Zelle zu verhindern, um die Lagerung der Nukleinsäuremischung vor der Verwendung zu erleichtem und/oder um die Einführung in den Kern der Zelle zu verbessern.
Das endovaskuläre Implantat weist eine im wesentlichen die gesamte äußere Oberfläche des Implantats bildende aktive Beschichtung auf, die durch Physisorption oder kovalente Bindung an der darunter liegenden Oberfläche anhaftet. Die aktive Beschichtung bedeckt den metallischen Grundkörper und gegebenenfalls eine oder mehrere auf dem Grundkör- per aufgebrachte Zwischenschichten. Die Beschichtung umfasst eine Trägermatrix aus Hyaluronsäure und/oder Hyaluronsäure-Derivaten. Hyaluronsäure und seine Derivate zeichnen sich durch ihre sehr gute Biokompatibilität aus, da die Materialien natürlichem Ursprungs sind. Weiterhin hat es sich gezeigt, dass Hyaluronsäure als auch seine Deri- vate eine eigenständige entzündungshemmende Wirkung besitzen und damit wirkungsvoll Gewebsirritationen verhindert oder zumindest stark vermindert werden können. Ein bisher nicht im Detail geklärter synergistischer Effekt tritt bei der Applikation von Nukleinsäuren auf.
Hyaluronsäure (Hyaluronan) ist ein einfaches Glykosaminoglykan der extrazellulären Matrix. Es wird an der Oberfläche von Fibroblasten synthetisiert und kommt als einziges Glykosaminoglykan nicht als Prote- oglykan vor. Hyaluronsäure ist eine hochmolekulare Verbindung mit MR zwischen 50.000 und mehreren Millionen. Grundbaustein der Hyaluronsäure ist ein aus D-Glucuronsäure und N-Acetyl-d-glucosamin in ß1-3- glykosidischer Bindung aufgebautes Aminodisaccharid, das mit der nächsten Einheit ß1-4-glykosidisch verbunden ist:
Figure imgf000015_0001
Die unverzweigte Kette der Hyaluronsäure besteht aus 2.000-10.000 solcher Einheiten. Durch Hyaluronidasen werden ß-glykosidische Bindungen hydrolysiert und so die Hyaluronsäure zu kleineren Bruchstü- cken abgebaut. Die - meist als Kalium-Salz - im Handel befindliche Hyaluronsäure ist aus menschlichen Nabelschnüren oder Hahnenkämmen isoliert, wird aber zunehmend biotechnologisch durch bakterielle Fermentation hergestellt.
Zur Modifizierung von Hyaluronsäure, d.h. Darstellung von Hyaluronsäu- re-Derivaten, werden literaturbekannte Verfahren eingesetzt (z. B. Da- nishefsky, Arch. Biochem. Biophys., 90, 1960, S. 114 ff.; Nagasawa, Carbohydr. Res., 58, 1977, S. 47 ff.; Ayotte, Carbohydr. Res. 145, 1986, S. 267 ff.; Ogamo, Carbohydr. Res. 193, 1989, S. 165 ff.; Jesaja, Can. J. Chem.; 67, 1989, S. 1449 ff.; Mulloy, Carbohydr. Res. 255, 1994, S. 1 ff.). Dabei handelt es sich um regio- und stereoselektive und nicht regio- und stereoselektive (statische) Reaktionen. Basierend auf diesem Verfahren kann Hyaluronsäure insbesondere durch N- und O- Desulfatierung, 6-O-Desulfatierung, Deacetylierung oder Acetylierung sowie Sulfatierung, Acylierung mit aliphatischen oder aromatischem Rest verändert werden. Insbesondere können durch die bekannten Verfahren Aminogruppen, Sulfat- oder Carboxylreste unter Anwendung von Schutzgruppenchemie und bekannten, zum Teil regioselektiven Reaktionen der organischen Chemie eingeführt werden.
Unter dem Begriff "Hyaluronsäue-Derivate" im Sinne der Erfindung werden demnach alle durch gezielte Modifizierungen der natürlichen Hyalu- ronsäure strukturell zum Ausgangsprodukt veränderten Reaktionsprodukte verstanden. Unter dem Begriff "Hyaluronsäure und Hyaluronsäu- re-Derivate" werden ferner alle polyelektrolytischen Salze derselben, z.B. Natrium-, Kalium-, Magnesium- und Kalziumsalze, verstanden. Als "Modifizierungen" im erfindungsgemäßen Sinne werden die aufgeführten und weiteren bekannten Reaktion der organischen Chemie zur Umsetzung der funktionellen Gruppen der Hyaluronsäure angesehen.
Hyaluronsäure und die Hyaluronsäure-Derivate können als Einzelsubstanzen, Co- oder Blockpolymere aus Hyaluronsäure und Hyaluronsäu- re-Derivaten, als auch in Form von Mischungen der vorgenanten Einzelsubstanzen und Polymere kovalent und/oder durch Physisorption an der Stimulationselektrodenoberfläche immobilisiert werden.
Eine kovalente Anbindung der Trägermatrix an die Oberfläche des Implantats erfolgt vorzugsweise durch Einpunkts- oder Mehrpunktsaufhän- gung an Spacer. Weiterhin wird vorzugsweise zumindest bereichsweise durch Vernetzung einer zuvor aufgebrachten (primären) Trägermatrix eine mechanische und/oder chemische Stabilisierung des Beschich- tungsmaterials gegen enzymatischen und hydrolytischen Abbau, als auch gegen mechanischen Stress erreicht. Die Immobilisierung der Trä- germatrix auf der Oberfläche des Implantats kann nach bekannten Methoden der Immobilisierung von Enzymen, Methoden der Membranherstellung, Kunststoffverarbeitung, Polymerchemie, der Peptid-, Protein- und Zuckerchemie über kovalente Bindungen mit und ohne Verwendung von Spacern, mittels Einpunkts- und Mehrpunktaufhängung, End- punktaufhängung als Mono- oder Multilayer oder mit zusätzlicher Stabilisierung durch Quervernetzung erfolgen.
Als vorteilhaft hat sich eine aktive Beschichtung mit einer Schichtdicke im Bereich zwischen 10-400 μm, insbesondere 50-120 μm, erwiesen.
Bei den genannten Schichtdicken ist eine noch hinreichende Freiset- zung des Wirkstoffs sichergestellt, ohne dass die aktive Beschichtung bereits einen unerwünschten Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des Implantats hat.
Weiterhin ist bevorzugt, wenn die Hyaluronsäure oder die Hyaluronsäu- re-Derivate nach Sterilisation noch ein durchschnittliches Molekularge- wicht im Bereich von ca. 300.000 bis 500.000, insbesondere 380.000 bis 420.000 Dalton aufweisen. Im beanspruchten Molekulargewichtsbereich erreicht die eigenständige therapeutische Wirkung der Hyaluronsäure und seiner Derivate ein Maximum (Papakonstantinou, G. Karakiulakis, O. Eickelberg, A.P. Perruchoud, L.H. Block, and M. Roth ; A 340 kDa hyaluronic acid secreted by human vascular smooth muscle cells regula- tes their proliferation and migration, Glycobiology 1998, 8, 821-830).
Ein weiterer vorteilhafter Aspekt der erfindungsgemäßen Lehre liegt in der gezielten Beeinflussung des in vivo Degradationsverhalten des Biopolymers. Unter dem Begriff "Degradationsverhalten" wird der durch chemische, thermische, oxidative, mechanische oder biologische Prozesse stattfindende Abbau der erfindungsgemäßen Trägermatrix im lebendem Organismus über die Zeit verstanden. Einerseits soll sichergestellt werden, dass die eingebetteten Wirkstoffe besonders rasch nach der Implantation freigesetzt werden. Andererseits soll die Beschichtung über einen bestimmten Zeitraum eine Oberflächenadsorption von hochmolekularen Biomolekülen auf der Implantatsoberfläche verhindern oder zumindest deutlich zurückdrängen, da ansonsten mittel- und langfristig mit Unverträglichkeitsreaktionen zu rechnen ist.
Vorzugsweise ist die Trägermatrix derart beschaffen, dass die in vivo Degradation der Trägermatrix von außen in Richtung des Grundkörpers des endovaskulären Implantats verlangsamt ist. Das Degradationsverhalten kann dabei kontinuierlich oder sprunghaft verändert werden. Nach letzterer Variante umfasst die Trägermatrix zumindest zwei Teilschichten mit unterschiedlichem Degradationsverhalten, wobei das De- gradationsverhaiten innerhalb jeder Teilschicht kontinuierlich veränder- lich oder konstant über die Teilschicht festlegbar ist. Die Herstellung derartiger Beschichtungen kann mit Hilfe an sich bekannter Sprüh- und Tauchbeschichtungsverfahren erfolgen.
Vorzugsweise ist die Trägermatrix derart beschaffen, dass ein dem Grundkörper des Implantats abgewandter, äußerer Bereich der Trägermatrix zumindest zu 90 Gew.% innerhalb von 0,1 bis 240 h, insbesondere 0,2 bis 24 h, in vivo abgebaut wird. Der äußere Bereich ist vorzugsweise 10 bis 250 μm, insbesondere 50 bis 150 μm, dick. Wenn die Trägermatrix aus zumindest zwei Teilschichten mit unterschiedlichem De- gradationsverhalten besteht, ist zur Erreichung dieses Ziels eine äußere Teilschicht derart modifiziert, dass sich diese äußere Teilschicht um mehr als 90 Gew.% innerhalb von 0,1 bis 240 h, insbesondere 0,2 bis 24 h, in vivo abbaut. Die äußere Teilschicht ist vorzugsweise 10 bis 250 μm, insbesondere 50 bis 150 μm, dick.
Es hat sich ferner überraschenderweise gezeigt, dass in Gegenwart der erfindungsgemäßen Trägermatrix auch die Oberflächenadsorption von hochmolekularen Biomolekülen auf der Implantatsoberfläche verhindert oder zumindest deutlich zurückgedrängt ist. Vorzugsweise ist daher die Trägermatrix derart beschaffen, dass ein dem Grundkörper des Implan- tats zugewandter, innerer Bereich der Trägermatrix zumindest nicht vollständig innerhalb von zwei Jahren in vivo abgebaut wird. Der innere Bereich ist vorzugsweise 3 bis 50 μm, insbesondere 5 bis 20 μm, dick. Wenn die Trägermatrix aus zumindest zwei Teilschichten mit unterschiedlichem Degradationsverhalten besteht, ist zur Erreichung dieses Ziels insbesondere eine innere Teilschicht, die sich unmittelbar der darunter liegenden Oberfläche des Grundkörpers des Implantats oder gegebenenfalls einer hierauf aufgebrachten Zwischenschicht anschließt, derart modifiziert, dass sich diese innere Teilschicht um nicht mehr als 20 Gew.% innerhalb von zwei Jahren in vivo abbaut. Die äußere Teil- Schicht ist vorzugsweise 3 bis 50 μm, insbesondere 5 bis 20 μm, dick. Das Degradationsverhalten von Hyaluronsäure und seiner Derivate kann u.a. durch Quervemetzung und reduktive Fixierung beeinflusst werden. Hierzu wird generell auf die in der Literatur zahlreichen beschriebenen Verfahren zur Durchführung der einzelnen Vernetzungsreaktionen und ausdrücklich auf den Gegenstand der US 4,582,865, US 5,550,187, US 5,510,121 und WO 00/46252 verwiesen. Unter reduktive Fixierung wird die gezielte Umsetzung ungesättigter Funktionalitäten des Polysaccha- rids mit hydridischen Reduktionsmitteln, wie z.B. Natriumborhydrid, verstanden. Die Quervernetzung kann z.B. mit Hilfe der folgenden Reagen- zien durchgeführt werden:
Formaldyhyd, Glutaraldehyd, Divinylsulfon, Polyanhydride, Polyaldehy- de, Carbodiimide, Epichlorohydrin, Ethylenglykol-diglycidylether, Butan- diol-diglycidylether, Polyglycerol-polyglycidylether, Polyethylenglykol- diglycidylether, Polypropylenglykol-diglycidylether oder bis- oder Polye- poxy-Vernetzer, wie 1 ,2,3,4-Diepoxybutan oder 1 ,2,7,8-Diepoxyoctan.
Der Zusammenhang zwischen Vernetzungsgrad, reduktiver Fixierung und Degradationsverhalten kann über herkömmliche Testverfahren ermittelt werden. Ein unterschiedlicher Vernetzungsgrad führt bei ansonsten gleicher Fixierung zu einem unterschiedlichen Quellverhalten der Trägermatrix. Durch Verzicht auf die Fixierung oder nur unvollständige Fixierung wird die Degradation der Trägermatrix beschleunigt. Der Quellfaktor lässt sich u.a. gravimetrisch bestimmen. Weiterhin lässt sich der Vernetzungsgrad und der Umfang der reduktiven Fixierung durch infrarotspektroskopische Analyse an vernetzten Hyaluronsäurefolien bestimmen. Der Bezug zur Degradation kann durch eine GPC Analytik, d.h. durch Molmassenbestimmung degradierter Hyaluronsäure, an E- luenten hergestellt werden.
Der Einfluss der genannten Modifikationen auf das in vivo Degradationsverhalten ist allgemein bekannt. Da das Abbauverhalten aber u.a. auch von weiteren geometrischen und physiologischen Faktoren ab- hängt, ist in der Regel eine individuelle Anpassung des Systems an die jeweiligen Erfordernisse notwendig.
Weiterhin ist bevorzugt, dass die Trägermatrix durch Vernetzung einen Quellfaktor im Bereich von 2-6, insbesondere 3-4, aufweist. Die genann- ten Bereichsangaben für den Quellfaktor haben sich als in der Praxis besonders geeignet für eine rasche in vivo Wirkstofffreisetzung erwiesen.
Die Beschichtung kann in der Regel auf alle bekannten endovaskulären Implantate aufgebracht werden, eignet sich aber insbesondere für kardi- ovaskuläre Implantate. Die dünne Trägermatrix aus Hyaluronsäure und/oder Hyaluronsäure-Derivaten wird dazu mittels gängiger Sprühverfahren oder aus der Lösung abgeschieden.
Die prinzipielle Herstellung einer kovalent anhaftenden Polysaccharid- schicht wird in der WO 00/56377 beschrieben, deren Offenbarung voll- umfänglich mit einbezogen wird. Eine Substratoberfläche wird dazu mit reaktiven Funktionalitäten modifiziert, aktivierte Hyaluronsäure wird bereit gestellt und diese wird dann unter geeigneten Bedingungen kovalent an die reaktiven Funktionalitäten gebunden. In eben gleicher Weise lässt sich die erfindungsgemäße Trägermatrix an die Oberfläche des endo- vaskulären Implantats binden.
Weiterhin offenbart die bereits erwähnte DE 196 30 563 ein Verfahren zur Verbesserung der Haftung einer Beschichtung infolge verstärkter Physisorption bzw. kovalenter Bindung. In einem ersten Schritt wird eine reaktive Funktionalität auf der Substratoberfläche erzeugt. Die reaktive Funktionalität umfasst insbesondere Amine, Aldehyde, Sulfide, Alkohole, Säurehalogenide und Isocyanate. An die genannte Funktionalität kann dann - unter Rückgriff auf an sich bekannte Kopplungsverfahren - die erfindungsgemäße Trägermatrix kovalent gebunden werden. Weiterhin ist bevorzugt, wenn die Trägermatrix eine Haftvermittlerschicht aus Chitosan umfasst. Die Haftvermittlerschicht schließt sich unmittelbar dem Grundkörper und ggf. eine darauf aufgebrachten Zwischenschicht an. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass in Gegenwart einer solchen Haftvermittlerschicht sehr gleichmäßige und stark haftende Beschichtungen erzeugt werden können. Zudem ist Chitosan Werkstoff natürlichem Ursprungs und damit gut bioverträglich. Die als Haftvermittlerschicht ist vorzugsweise 0,1 bis 50 μm, insbesondere 1 bis 10 μm, dick und kann ebenso wie die Hyaluronsäure und ihre Derivate zur Be- einflussung Ihres Degradationsverhaltens modifiziert werden. Insbesondere kann die Haftvermittlerschicht derart ausgebildet sein, dass sie als innere Teilschicht oder innerer Bereich der Trägermatrix im oben genannten Sinne agieren kann. Eine signifikante Änderung der Wirkstofffreisetzung durch die Haftvermittlerschicht wurde nicht festgestellt.
Nach einer weiteren bevorzugten Variante der Erfindung beinhaltet die Trägermatrix zumindest in Teilbereichen oder Teilschichten Chitosan. Hierdurch kann das Haftvermögen der Trägermatrix weiter verbessert werden und es können auch auf den sehr komplexen Geometrien des Substrats gleichmäßige Beschichtungen erzeugt werden. Die Stabilität der Polysacharidschicht kann gesteigert werden, wenn durch Quartemi- sierung der aminischen Funktionen des Chitosans polykationische Ladungen erzeugt werden. Werden Hyaluronsäure und seine Derivate als polyanionische Präparate zugemengt, so bildet sich ein Symplexgel. Die schon sehr starke lon/lon-Wechselwirkung zwischen den Komponenten kann durch Quervernetzung weiter erhöht werden. Ein Gewichtsanteil des Chitosans am Gesamtgewicht der Trägermatrix beträgt vorzugsweise nicht mehr als 50 %. Auch diese Modifikationen haben überraschenderweise kaum Einfluss auf die Freisetzung der Nukleinsäuren.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und der dazugehörigen Zeichnungen näher erläutert. Die einzige Figur zeigt eine schematische Draufsicht auf einen Stent 10 in einem Teilabschnitt einer Abwicklung seiner rohrförmig verlaufenden Umlaufswandung. Ein Grundgerüst des Stents 10 umfasst eine Vielzahl einzelner Zellen 16, die in Umlaufsrichtung über Stege 12 und in axialer Richtung des Stents 10 teils in ihren Kopfbereichen 14 miteinander verbunden sind. Selbstverständlich ist das hier dargestellte Stentdesign nur beispielhaft zu verstehen. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche weitere Stentdesigns bekannt, die sich für die erfindungsgemäßen Zwecke eignen. Erfindungswesentlich ist lediglich, dass zumindest be- reichsweise eine im folgenden noch näher erläuterte, aktive Beschichtung 18 vorhanden ist. Die aktive Beschichtung 18 ist durch die Schraf- fur angedeutet.
Die Darstellung eines solchen Stent mit aktiver Beschichtung 18 wird nachfolgend an Ausführungsbeispielen kurz erläutert:
Chitosan als Haftvermittler für die Träqermatrix
Die Implantatsoberfläche wurde vorgereinigt, entfettet und unter leichtem Rühren für 10 Minuten bei Raumtemperatur in eine 0,5 bis 2%ige Essigsäure mit einer Chitosankonzentration zwischen 0,1% und 0,5% gerührt. Das Molekulargewicht des Chitosans betrug zwischen 100.000 und 1.000.000 Dalton. Anschließend wurde das Implantat entnommen und getrocknet.
Alternativ konnte eine dünne Schicht aus Chitosan durch Aufsprühen auf das Implantat aufgebracht werden. Hierzu wurde eine 0,5%ige Chitosan- lösung in einer 0,5%'ιgen Essigsäure angesetzt. Das vorgereinigte Imp- lantat wurde 5 bis 20 mal im Abstand von 15 bis 30 Sekunden für 0,5 bis 1 ,0 sec mit Hilfe einer Airbrushpistole besprüht, wobei zwischen den Sprühschritten das Implantat bei 40°C bis 70°C getrocknet wurde. Die aufgebrachten Schichten wiesen eine Schichtdicke von 1 μm bis 10μm auf. Das Chitosan fungiert als Haftvermittler, da Chitosan selbst im neutralen Bereich (Blut) schwer löslich ist. Die dünne Haftvermittlerschicht aus Chitosan von 0,1 μm bis 50 μm, vorzugsweise von 1 μm bis 10 μm, hat keine signifikante Beeinträchtigung der Freisetzungseigenschaften der Trägermatrix zur Folge.
Aufbringung der Träqermatrix
Nach Trocknung wurde das Implantat unter leichtem Rühren für 10 Minuten bei Raumtemperatur in eine wässrige Lösung von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von mindestens 1.000.000 Dalton gelegt. Nach Entnahme und Trocknung wurde die Probe für mindestens 2 h bei ca. 30°C bis 40°C in eine Vernetzerlösung von 2 bis 4 ml Glutaraldehyd in einem Wasser-Aceton Gemisch getaucht. Danach wurde die Vernetzerlösung ausgetauscht und die Vernetzung 2 h fortgeführt.
Anschließend wurde die Probe mehrfach mit destilliertem Wasser ge- spült und mehrfach mit deionisiertem Wasser gespült. Nach Entnahme wurde die Probe für 24 Stunden bei 50°C im Trockenschrank getrocknet.
Das Molekulargewicht der Hyaluronsäure soll über 1.000.000 Dalton betragen, da die Hyaluronsäureketten durch die Sterilisation gespalten werden. Nach vorliegenden Untersuchungen kommt es bei einer Sterili- sation mit Hilfe von Ethylenoxid oder beta-Bestrahlung (Elektronenbeschleuniger: 4,5 mEV, 25 kGy) zu 1 bis 2 Spaltungen pro Kette, d.h. native Hyaluronsäure liegt nach Sterilisation mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 400.000 Dalton vor.
In Abhängigkeit von der Konzentration der wässrigen Hyaluronsäurelö- sung konnten folgende Schichtdicken erzielt werden, wobei die angemessenen Schichtdicken nach 24stündiger Trocknung bei 50°C ermittelt wurden: • bei 0.25%iger wässriger Hyaluronsäurelösung: ca. 90μm,
• bei 0,5%iger wässriger Hyaluronsäurelösung: ca. 160μm,
• bei einer 1 %igen wässrigen Hyaluronsäurelösung: ca. 200μm
• und bei einer 2%igen wässrigen Hyaluronsäurelösung: 145μm.
Chitosan als Zusatz zur Träqermatrix
Neben den Polyanionen Hyaluronsäure bzw. seinen Hyaluronsäure- Derivaten kann die Trägermatrix noch Polykationen wie Chitosan enthalten. Durch das Amin des Chitosans liegt eine weitere funktioneile Gruppe für den Vernetzer Glutardialdehyd vor. Die Aldehydfunktion kann so- wohl mit der Aminfunktion des Chitosans als auch mit der Carbonyl- bzw. Hydroxylfunktion der Hyaluronsäure reagieren. Durch diese Reaktionen kann der Vernetzungsgrad erhöht und die ionische Wechselwirkung zwischen den Polyanionen und Polykationen verstärkt werden. Das Schichtsystem aus Polyanionen und Polykationen kann durch ab- wechselndes Besprühen der Elektroden mit Lösungen gewünschter Konzentrationen von Chitosan, Hyaluronsäure und Hyaluronsäure- Derivaten hergestellt werden.
Hierbei werden vorgereinigte Implantate abwechselnd mit einer wässrigen Lösung aus Hyaluronsäure oder Hyaluronsäure-Derivat und in Es- sigsäure gelöstem Chitosan besprüht. Dabei beträgt die Konzentration der Hyaluronsäure oder Hyaluronsäure-Derivate 0,1% bis 1%, vorzugsweise 0,2% bis 0,5%. Die Konzentration der Essigsäure beträgt 0,1% bis 2%, vorzugsweise 0,5% bis 1%. Die Konzentration des Chitosans beträgt 0,1% bis 1%, vorzugsweise 0,2% bis 0,5%. Das Molekulargewicht der Hyaluronsäure oder der Hyaluronsäure-Derivate beträgt mindestens 1.000.000 Dalton und das Molekulargewicht des Chitosans mindestens 100.000 Dalton. Beide Lösungen werden im Abstand von 2 Sekunden bis 60 Sekunden, vorzugsweise 15 Sekunden bis 30 Sekunden, mit Hilfe eines Sprühverfahrens abwechselnd auf die Proben aufgebracht. Durch die Wahl der Konzentration an Hyaluronsäure bzw. Chitosan und der jeweiligen Sprühdauer kann der jeweilige Anteil an Polyanionen und Polykationen eingestellt werden. Der Gewichtsanteil an Chitosan am gesamten Schichtsystem beträgt nicht mehr als 50 %. Die Anzahl der Sprühschritte bestimmt die Schichtdicke des gesamten Schichtsystems. So werden bei 60 Sprühschritten mit einer Sprühdauer von 0,5 Sekunden mit üblichen Airbrushpistolen Schichtdicken zwischen 5 μm und 10 μm, gemessen im trockenen Zustand, erreicht. Nach der Beschichtung wird die Probe getrocknet und anschließend für mindestens 2 h bei ca. 30°C bis 40°C in eine Vemetzerlösung von 2 bis 4 ml Glutaraldehyd in einem Wasser-Aceton Gemisch getaucht. Danach wird die Vemetzerlösung für mindestens weitere 2 h ausgetauscht. Anschlie- ßend wird die Probe mehrfach mit destilliertem Wasser gespült und mehrfach mit deionisiertem Wasser gespült.
Einbindung der doppelsträngigen Nukleinsäuren
Die in zuvor beschriebener Weise dargestellter Trägermatrix wird vor dem Trocknen mit 0,5 - 1 ml einer Lösung von 5 μg/mol einer dop- pelsträngigen Nukleinsäure für 1h gespült. Ohne weitere Spülschritte erfolgt dann die Trocknung. Folgende Nukleinsäuresequenz wurde als AP1-Rezeptor-Antogonist (AP-1 Decoy ODN) eingesetzt:
G*T*G*CTGACTCAG*C*A*C und rev G*T*G*CTGAGTCAG*C*A*C
, wobei * für eine phosphorothioat-modifizierte Bindung steht. Das Mole- kulargewicht der Sequenz beträgt 9.146 g/mol und die Sequenz weist 15 Basenpaare auf.
Die Einbringung der doppelsträngigen Nukleinsäure kann optional unter Modifikation des pH-Werts der Trägermatrix als auch der nukleinsäure- haltigen Lösung erfolgen. Dabei wird beispielsweise der pH-Wert der Lösung auf etwa den isoelektrischen Punkt gepuffert, so dass die dem Diffusionsprozess entgegenwirkenden gleichen Ladungen der Trägermatrix und der Nukleinsäure verringert oder beseitigt werden.
Einen weiteren Ansatz zur Einbindung der Nukleinsäuren liefert die E- lektrophorese, bei der das Eindringen der Nukleinsäuren durch Anlegen eines elektrischen Stromes unterstützt wird, wobei das Implantat als Elektrode dient.

Claims

Patentansprüche
1. Endovaskuläres Implantat (10) mit einer aktiven Beschichtung (18) aus
(a) einer biodegradierbaren Trägermatrix aus Hyaluronsäure und/oder Hyaluronsäure-Derivaten und
(b) einem in die Trägermatrix eingebetteten Wirkstoff in Form einer doppelsträngigen Nukleinsäure.
2. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix durch Vernetzung einen Quell- faktor im Bereich von 2 bis 6, insbesondere 3 bis 4, besitzt.
3. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Degradationsverhalten der Trägermatrix so gewählt ist, dass mindestens 90 Gew.% der Trägermatrix im Bereich von 0,1 bis 240 h, insbesondere 0,2 bis 24 h, in vivo ab- gebaut ist.
4. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure und Hyaluronsäure-Derivate nach einer Sterilisation ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 300.000 bis 500.000 Dalton aufweisen.
5. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Implantat ein Stent ist.
6. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenzen eine Länge im Bereich von etwa 5 bis 50 bp, vorzugsweise von etwa 10-20 bp aufweisen.
7. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die doppelsträngige Nukleinsäure des Wirkstoffs in der Lage ist, sequenzspezifisch an den Transkriptionsfaktor AP-1 zu binden.
8. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die doppelsträngige Nukleinsäure eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis 11 aufweist.
9. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix derart beschaffen ist, dass die in vivo Degradation der Trägermatrix von außen in Richtung des Grundkörpers (11) des Implantats (10) verlangsamt ist.
10. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein innerer Bereich der Trägermatrix zumindest nicht vollständig innerhalb von zwei Jahren in vivo abbaubar ist.
11. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 10, dadurch gekenn- zeichnet, dass der innere Bereich 3 bis 50 μm, insbesondere 5 bis 20 μm, dick ist.
12. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein äußerer Bereich der Trägermatrix zu mindestens 90 Gew.% im Bereich von 0,1 bis 240 h, insbesondere 0,2 bis 24 h, in vivo abbaubar ist.
13. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der äußere Bereich 10 bis 250 μm, insbesondere 50 bis 150 μm, dick ist.
14. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 9, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Trägermatrix zumindest zwei Teilschichten mit unterschiedlichem Degradationsverhalten umfasst, wobei das Degradationsverhalten innerhalb jeder Teilschicht kontinuierlich veränderlich oder konstant über die Teilschicht festlegbar ist.
15. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 14, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Trägermatrix eine innere Teilschicht umfasst, die um nicht mehr als 20 Gew% innerhalb von 2 Jahren in vivo abbaubar ist.
16. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der innere Teilschicht 3 bis 50 μm, insbesondere 5 bis 20 μm, dick ist.
17. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix eine äußere Teilschicht umfasst, die zu mindestens 90 Gew.% im Bereich von 0,1 bis 240 h, insbesondere 0,2 bis 24 h, in vivo abbaubar ist.
18. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der äußere Teilschicht 10 bis 250 μm, insbesondere 50 bis 150 μm, dick ist.
19. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Schichtdicke der Beschichtung (17) zwischen 10-400 μm liegt.
20. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke 50-120 μm beträgt.
21. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hy- aluronsäure oder Hyaluronsäure-Derivate als Einzelsubstanzen, Co- oder Blockpolymere aus Hyaluronsäure und Hyaluronsäure- Derivaten oder in Form von Mischungen der vorgenanten Einzelsubstanzen und Polymere Bestandteil der Beschichtung (17) sind.
22. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix eine Haftvermittlerschicht aus Chitosan umfasst.
23. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittlerschicht 0,1 bis 50 μm, insbeson- dere 1 bis 10 μm, dick ist.
24. Endovaskuläres Implantat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix zumindest in Teilbereichen oder Teilschichten Chitosan beinhaltet.
25. Endovaskuläres Implantat nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass ein Anteil des Chitosans am Gesamtgewicht der Trägermatrix nicht mehr als 50 Gew.% beträgt. Die Erfindung betrifft ein endovaskuläres Implantat mit einer aktiven Beschichtung. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein für die Applikation von doppelsträngigen Nukleinsäuren geeignetes Be- schichtungssystem bereitzustellen. Dazu weist das Implantat eine aktive Beschichtung auf, die aus
(a) einer biodegradierbaren Trägermatrix aus Hyaluronsäure und/oder Hyaluronsäure-Derivaten und
(b) einem in die Trägermatrix eingebetteten Wirkstoff in Form einer doppelsträngigen Nukleinsäure besteht.
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