ES2587007T3 - Sistema integrado para procesar muestras microfluídicas, y métodos de uso del mismo - Google Patents

Sistema integrado para procesar muestras microfluídicas, y métodos de uso del mismo Download PDF

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Karthik Ganesan
Betty Wu
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Abstract

Un aparato (981), que comprende: un compartimento de recepción (992, 2014) configurado parta recibir un cartucho microfluídico multicarril insertable (994), comprendiendo cada carril una zona de reacción de PCR (1001) configurada para aceptar una muestra que contiene polinucleótidos (996); una pluralidad de conjuntos de calefactores, cada conjunto de calefactores acoplado térmicamente a una zona de reacción de PCR en el cartucho multicarril, comprendiendo cada conjunto de calefactores una pluralidad de calefactores (1003, 1005, 1007, 1009) configurados juntos para calentar cíclicamente la zona de reacción de PCR en condiciones de ciclado térmico, la pluralidad de calefactores configurados, además, para mantener una temperatura sustancialmente uniforme por toda la zona de reacción de PCR durante cada fase del ciclado térmico un detector (999, 2009) configurado para detectar la presencia de uno o más polinucleótidos amplificados en el cartucho multicarril; y un procesador (980) configurado para controlar independientemente cada calefactor con el fin de calentar cíclicamente cada zona de reacción de PCR del cartucho multicarril, el procesador configurado, además, para realizar reacciones de PCR independientes en muestras que contienen polinucleótidos en las zonas de reacción de PCR del cartucho multicarril.

Description

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DESCRIPCION
Sistema integrado para procesar muestras microflmdicas, y metodos de uso del mismo Campo tecnico
La tecnolog^a descrita en el presente documento se refiere a un aparato integrado para procesar muestras que contienen polinucleotidos y llevar a cabo analisis de diagnostico en las mismas. Mas espedficamente, la tecnolog^a se refiere a un aparato para obtener un resultado de diagnostico en una muestra biologica usando un cartucho microflmdico que recibe la muestra, junto con un sistema de mesa. En el presente documento tambien se describen metodos de uso de la tecnologfa.
Antecedentes
La industria del diagnostico medico es un elemento cntico de la infraestructura sanitaria actual. Actualmente, sin embargo, los analisis de diagnostico, no importa lo rutinarios que sean, se han convertido en un cuello de botella en la atencion al paciente. Existen varias razones para esto. En primer lugar, habitualmente hay varias etapas en un analisis de diagnostico entre recoger la muestra, y obtener un resultado de diagnostico, que requieren diferentes niveles de habilidad por parte de los operadores, y diferentes niveles de complejidad del equipo. Por ejemplo, una muestra biologica, una vez extrafda de un paciente, se debe poner en una forma adecuada para un regimen de procesamiento que normalmente implica usar reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar un nucleotido de interes. Una vez amplificado, la presencia de un nucleotido de interes en la muestra necesita ser determinada de forma inequvoca. La preparacion de muestras es un proceso que es susceptible de automatizacion pero tambien se lleva a cabo de forma relativamente rutinaria en casi cualquier ubicacion. En cambio, etapas tales como PCR y deteccion de nucleotidos han estado, por regla general, solamente al alcance de individuos con formacion especial que tienen acceso a equipo especializado. En segundo lugar, muchos analisis de diagnostico solamente pueden realizarse con equipo altamente especializado que es tanto caro como manejable solamente por facultativos formados. Dicho equipo se encuentra en solamente unas pocas ubicaciones - a menudo solo una en cualquier area urbana dada. Esto significa que la mayona de los hospitales tienen que externalizar muestras a esas ubicaciones para analisis, incurriendo de este modo en costes de envfo y retrasos por transporte, y posiblemente incluso perdida o mezcla de muestras. En tercer lugar, cierto equipo especializado normalmente no esta disponible “a demanda” sino que, en su lugar, funciona por lotes, retrasando de este modo el tiempo de procesamiento para muchas muestras, dado que estas deben esperar a que una maquina se llene antes de que puedan ser analizadas.
El analisis de una muestra biologica para conseguir un diagnostico particular normalmente incluye detectar uno o mas polinucleotidos presentes en la muestra. Un ejemplo de deteccion es deteccion cualitativa, que se refiere, por ejemplo, a la determinacion de la presencia del polinucleotido y/o la determinacion de informacion relacionada con, por ejemplo, el tipo, tamano, presencia o ausencia de mutaciones, y/o la secuencia del polinucleotido. Otro ejemplo de deteccion es deteccion cuantitativa, que se refiere, por ejemplo, a la determinacion de la cantidad de polinucleotido presente. La deteccion puede incluir, por lo tanto, generalmente aspectos tanto cualitativos como cuantitativos. Detectar polinucleotidos cualitativamente a menudo implica establecer la presencia de cantidades extremadamente pequenas en una muestra. Para mejorar la sensibilidad, por lo tanto, la cantidad de polinucleotido en cuestion a menudo se amplifica. Por ejemplo, algunos metodos de deteccion incluyen amplificacion de polinucleotidos mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o una tecnica de amplificacion relacionada. Dichas tecnicas usan un coctel de ingredientes, que incluyen uno o mas de una enzima, una sonda, y un agente de marcado. Por lo tanto, la deteccion de polinucleotidos puede requerir el uso de diversos reactivos diferentes, muchos de los cuales requieren manipulacion sensible para mantener su integridad, tanto durante el uso como a lo largo del tiempo.
Entendiendo que el flujo de muestra se descompone en varias etapas clave, sena deseable considerar maneras de automatizar tantas de estas como fuera posible y, deseablemente, facilitar la consecucion de tantas como fuera posible con una unica maquina que se puede poner a disposicion, a peticion, de muchos usuarios. Existe, por lo tanto, una necesidad de un metodo y un aparato para llevar a cabo etapas de preparacion de muestras, PCR, y deteccion en muestras biologicas de tal manera que se lleven a cabo las menos etapas independientes posibles.
La publicacion de solicitud de patente europea n.° 15745862 describe un aparato y metodo para amplificar acidos nucleicos. El aparato incluye un sustrato, un recipiente de reaccion formado dentro del sustrato, y una unidad calefactora instalada sobre el sustrato. La unidad calefactora incluye un calefactor para calentar el sustrato de una temperatura predeterminada y para calentar y enfriar periodicamente el sustrato. Las figuras 9A y 9B muestran un sustrato con dos recipientes de reaccion.
La descripcion de los antecedentes de la tecnologfa en el presente documento se incluye para explicar el contexto de la tecnologfa. Esto no debe tomarse como una admision de que cualquiera del material mencionado estaba publicado, era conocido, o formaba parte del conocimiento general comun como en la fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones.
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En toda la descripcion y las reivindicaciones de la memoria descriptiva, la palabra “comprenden” y variaciones de la misma, tales como “que comprende/n” y “comprende”, no pretenden excluir otros aditivos, componentes, numeros enteros o etapas.
Sumario
La invencion se define en las reivindicaciones independientes, a las que se hace referencia a continuacion. Caractensticas preferidas se exponen en las reivindicaciones dependientes.
De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, un aparato comprende un compartimento de recepcion configurado para recibir un cartucho microflmdico multicarril insertable, comprendiendo cada carril una zona de reaccion de PCR configurada para aceptar una muestra que contiene polinucleotidos. El aparato comprende, ademas, una pluralidad de conjuntos de calefactores, cada conjunto de calefactores acoplado termicamente a una zona de reaccion de PCR en el cartucho multicarril. Cada conjunto de calefactores comprende una pluralidad de calefactores juntos configurados para calentar dclicamente la zona de reaccion de PCR en condiciones de ciclado termico. La pluralidad de calefactores estan configurados, ademas, para mantener una temperatura sustancialmente uniforme en toda la zona de reaccion de PCR durante cada fase del ciclado termico. El aparato comprende, ademas, un detector configurado para detectar la presencia de uno o mas polinucleotidos amplificados en el cartucho multicarril. El aparato comprende, ademas, un procesador configurado para controlar independientemente cada calefactor con el fin de calentar dclicamente cada zona de reaccion de pCr del cartucho multicarril. El procesador esta configurado, ademas, para realizar reacciones de PCR independientes en muestras que contienen polinucleotidos en las zonas de reaccion de PCR del cartucho multicarril.
La solicitud tambien desvela:
Un aparato, que comprende: un compartimento de recepcion configurado para recibir un cartucho microflmdico insertable; al menos una fuente de calor acoplada termicamente al cartucho y configurada para aplicar calor a una o mas regiones seleccionadas del cartucho en uno o mas momentos seleccionados, con el fin de: crear una microgotita de una muestra biologica que contiene polinucleotidos contenida en el cartucho; hacer que la microgotita se mueva entre una o mas posiciones en el cartucho microflmdico; lisar celulas, donde esten presentes en la muestra biologica, liberando de este modo polinucleotidos de las celulas; preparar uno o mas de los polinucleotidos para amplificacion; y amplificar uno o mas de los polinucleotidos; un detector configurado para detectar la presencia de los uno o mas polinucleotidos amplificados; y un procesador acoplado al detector y la al menos una fuente de calor, donde el procesador esta configurado para controlar la aplicacion de calor a las una o mas regiones seleccionadas del cartucho microflmdico en uno o mas momentos seleccionados.
El sistema comprende, ademas, un sistema integrado, que comprende un aparato y un cartucho complementario, donde juntos, el aparato y el cartucho procesan una muestra que ha sido inyectada en el cartucho, y proporcionan un resultado de diagnostico sobre la muestra.
El compartimento de recepcion del aparato puede estar configurado para recibir selectivamente el cartucho microflmdico, tal como se describe adicionalmente en el presente documento y se ejemplifica mediante los dibujos adjuntos. Por ejemplo, el compartimento de recepcion y el cartucho microflmdico pueden ser de forma complementaria, de modo que el cartucho microflmdico pueda ser recibido selectivamente en, por ejemplo, una unica orientacion. El cartucho microflmdico puede tener un miembro de colocacion correcta que encaja en una caractenstica complementaria del compartimento de recepcion. Recibiendo selectivamente el cartucho, el compartimento de recepcion puede ayudar a un usuario a colocar el cartucho, de modo que el aparato pueda operar apropiadamente sobre el cartucho. El compartimento de recepcion tambien puede estar configurado de modo que diversos componentes del aparato que pueden operar sobre el cartucho microflmdico (bombas de calor, refrigeradores Peltier, elementos electronicos que eliminan el calor, detectores, miembros de fuerza, y similares) puedan situarse para operar apropiadamente sobre el cartucho microflmdico. Por ejemplo, una fuente de calor por contacto puede estar situada en el compartimento de recepcion, de modo que pueda estar acoplada termicamente a una o mas ubicaciones distintas de un cartucho microflmdico que puede estar recibido selectivamente en el compartimento de recepcion.
La bomba de calor puede ser, por ejemplo, una fuente de calor tal como una resistencia, una bomba de calor reversible tal como un circuito de transferencia de calor lleno de lfquido o un elemento termoelectrico, una fuente de calor por radiacion tal como una lampara de xenon, y similares. La bomba de calor puede usarse no solamente para proporcionar calor a los elementos microflmdicos sino tambien para retirar calor de elementos microflmdicos tal como para reducir la actividad de ciertos reactivos, congelar lfquido en un microcanal para cambiar su fase de lfquida a solida, reducir la presion de una camara de aire para crear un vacfo parcial, etc.)
En diversas realizaciones del aparato: el aparato puede incluir, ademas, un miembro de colocacion correcta que es complementario al cartucho microflmdico, con lo que la compartimento de recepcion recibe el cartucho microflmdico en una unica orientacion; el aparato puede incluir, ademas, un sensor acoplado a un procesador, el sensor configurado para detectar si el cartucho microflmdico puede ser recibido selectivamente.
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El procesador puede ser programable para hacer funcionar el detector para detectar un polinucleotido o una sonda del mismo en un cartucho microflmdico ubicado en el compartimento de recepcion.
El detector puede ser, por ejemplo, un detector optico. Por ejemplo, el detector puede incluir una fuente de luz que emite luz en una banda de absorcion de un colorante fluorescente y un detector de luz que detecta luz en una banda de emision del colorante fluorescente, donde el colorante fluorescente corresponde a una sonda polinucleotfdica fluorescente o un fragmento de la misma. Por ejemplo, el detector optico puede incluir un diodo con filtro de paso de banda que emite selectivamente luz en la banda de absorcion del colorante fluorescente y un fotodiodo con filtro de paso de banda que detecta selectivamente luz en la banda de emision del colorante fluorescente; o por ejemplo, el detector optico puede estar configurado para detectar independientemente una pluralidad de colorantes fluorescentes que tienen diferentes espectros de emision fluorescente, donde cada colorante fluorescente corresponde a una sonda polinucleotidica fluorescente o un fragmento de la misma; o por ejemplo, el detector optico puede estar configurado para detectar independientemente una pluralidad de colorantes fluorescentes en una pluralidad de ubicaciones diferentes en el cartucho, donde cada colorante fluorescente corresponde a una sonda polinucleotfdica fluorescente o un fragmento de la misma.
El procesador puede ser, por ejemplo, programable para hacer funcionar la al menos una bomba de calor.
En diversas realizaciones, la al menos una bomba de calor puede ser una fuente de calor por contacto seleccionada entre un calefactor resistivo, un radiador, un intercambiador de calor flmdico y un dispositivo de Peltier. La fuente de calor por contacto puede estar configurada en el compartimento de recepcion para estar acoplada termicamente a una ubicacion distinta en un cartucho microflmdico recibido en el compartimento de recepcion, con lo que la ubicacion distinta puede calentarse selectivamente. Al menos una fuente de calor por contacto adicional puede estar incluida, donde las fuentes de calor por contacto pueden estar, cada una, configuradas en el compartimento de recepcion para estar acopladas termicamente de forma independiente a una ubicacion distinta diferente en un cartucho microflmdico recibido en el compartimento de recepcion, con lo que las ubicaciones distintas pueden calentarse independientemente. La fuente de calor por contacto puede estar configurada para estar en contacto ffsico directo con una ubicacion distinta de un cartucho microflmdico recibido en el compartimento de recepcion. En diversas realizaciones, cada fuente de calor por contacto puede estar configurada para calentar una ubicacion distinta que tiene un diametro promedio en 2 dimensiones de aproximadamente 1 milfmetro (mm) a aproximadamente 15 mm (normalmente de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 10 mm), o una ubicacion distinta que tiene un area superficial de entre aproximadamente 1 mm2 y aproximadamente 225 mm2 (normalmente entre aproximadamente 1 mm2 y aproximadamente 100 mm2, o en algunas realizaciones entre aproximadamente 5 mm2 y aproximadamente 50 mm2).
En diversas realizaciones, el aparato puede incluir una capa flexible en la fuente de calor por contacto, configurada para acoplar termicamente la fuente de calor por contacto con al menos una parte de un cartucho microflmdico recibido en el compartimento de recepcion. La capa flexible puede tener un grosor de entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 2 milfmetros, y una dureza Shore de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100.
En diversas realizaciones, al menos una bomba de calor puede ser una fuente de calor por radiacion configurada para dirigir calor a una ubicacion distinta de un cartucho microflmdico recibido en el compartimento de recepcion.
En diversas realizaciones, los uno o mas miembros de fuerza estan configurados para aplicar fuerza a al menos una parte de un cartucho microflmdico recibido en el compartimento de recepcion.
En diversas realizaciones, los uno o mas miembros de fuerza pueden estar configurados para aplicar fuerza para acoplar termicamente la al menos una bomba de calor a al menos una parte del cartucho microflmdico. Los uno o mas miembros de fuerza pueden estar configurados para hacer funcionar un miembro mecanico en el cartucho microflmdico, el miembro mecanico seleccionado entre el grupo que consiste en un deposito perforable, una valvula o una bomba.
En diversas realizaciones, los uno o mas miembros de fuerza pueden estar configurados para aplicar fuerza a una pluralidad de ubicaciones en el cartucho microflmdico. La fuerza aplicada por los uno o mas miembros de fuerza puede dar como resultado una presion promedio en una interfaz entre una parte del compartimento de recepcion y una parte del cartucho microflmdico de entre aproximadamente 5 kilopascales y aproximadamente 50 kilopascales, por ejemplo, la presion promedio puede ser de al menos aproximadamente 14 kilopascales. A al menos un miembro de fuerza se le puede hacer funcionar manualmente. Al menos un miembro de fuerza puede acoplarse mecanicamente a una tapa en el compartimento de recepcion, con lo que el funcionamiento de la tapa hace funcionar el miembro de fuerza.
En diversas realizaciones, el aparato puede incluir, ademas, una tapa en el compartimento de recepcion, siendo la tapa accionable para excluir al menos parcialmente la luz ambiente del compartimento de recepcion. La tapa puede ser, por ejemplo, una tapa deslizante. La tapa puede incluir el detector optico. Una cara fundamental de la tapa en el detector optico o en el compartimento de recepcion puede variar desde la planeidad en menos de aproximadamente 100 micrometros, por ejemplo, menos de aproximadamente 25 micrometros. La tapa puede estar configurada para
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ser amovible del aparato. La tapa puede incluir un miembro de sujecion.
En diversas realizaciones, el aparato puede incluir, ademas, al menos un dispositivo de entrada acoplado al procesador.
En diversas realizaciones, el aparato puede incluir, ademas, una fase de calentamiento configurada para ser amovible del aparato, donde al menos una bomba de calor puede estar ubicada en la fase de calentamiento.
En diversas realizaciones, el cartucho puede incluir ademas un puerto de analisis. El puerto de analisis puede estar configurado para permitir que un sistema de muestras externo analice una muestra en el cartucho microflmdico; por ejemplo, el puerto de analisis puede ser un agujero o ventana en el aparato que puede aceptar una sonda de deteccion optica que puede analizar una muestra in situ en el cartucho microflmdico.
En algunas realizaciones, el puerto de analisis puede estar configurado para dirigir una muestra desde el cartucho microflmdico a un sistema de muestras externo; por ejemplo, el puerto de analisis puede incluir un conducto en comunicacion fluida con el cartucho microflmdico que dirige una muestra lfquida a un aparato de cromatograffa, un espectrometro optico, un espectrometro de masas, o similares.
En algunas realizaciones, el aparato puede incluir un compartimento de recepcion configurado para recibir un cartucho microflmdico en una unica orientacion; al menos una fuente de calor por radiacion acoplada termicamente al compartimento de recepcion; al menos dos fuentes de calor por contacto configuradas en el compartimento de recepcion para estar acopladas termicamente a distintas ubicaciones, con lo que las ubicaciones distintas pueden calentarse selectivamente; uno o mas miembros de fuerza configurados para aplicar fuerza a al menos una parte del cartucho microflmdico recibido en el compartimento de recepcion, donde al menos uno de los uno o mas miembros de fuerza puede estar configurado para aplicar fuerza para acoplar termicamente las fuentes de calor por contacto a las ubicaciones distintas, y al menos uno de los uno o mas miembros de fuerza puede estar configurado para hacer funcionar un miembro mecanico en el cartucho microflmdico, el miembro mecanico seleccionado entre el grupo que consiste en un deposito perforable; una tapa en el compartimento de recepcion, siendo la tapa maniobrable para excluir al menos parcialmente la luz ambiente del compartimento de recepcion, comprendiendo la tapa un detector optico configurado para detectar independientemente uno o mas colorantes fluorescentes, que opcionalmente tienen diferentes espectros de emision fluorescentes, donde cada colorante fluorescente corresponde a una sonda polinucleotidica fluorescente o un fragmento de la misma; al menos un dispositivo de entrada seleccionado entre el grupo que consiste en un teclado, una superficie sensible al tacto, un microfono y un raton, al menos un medio de almacenamiento de datos seleccionado entre el grupo que consiste en una unidad de disco duro, una unidad de disco optico, una interfaz de comunicacion seleccionada entre el grupo que consiste en: una conexion en serie, una conexion en paralelo, una conexion en red inalambrica, y una conexion en red por cable, un identificador de muestras seleccionado entre un lector de caracteres opticos, un lector de codigo de barras, y un lector de marcas de radiofrecuencia; al menos una salida seleccionada entre una pantalla, una impresora, un altavoz; y un procesador acoplado al detector, el sensor, las fuentes de calor, la entrada y la salida.
Un cartucho microflmdico puede incluir una red microflmdica y un miembro de retencion en comunicacion fluida con la red microflmdica, siendo el miembro de retencion selectivo para al menos un polinucleotido respecto a al menos un inhibidor de la reaccion en cadena de la polimerasa. En algunas realizaciones, el cartucho microflmdico tambien incluye un miembro de colocacion correcta.
En diversas realizaciones del cartucho microflmdico, el cartucho microflmdico puede incluir, ademas, una valvula de entrada de muestras en comunicacion fluida con la red microflmdica. La valvula de entrada de muestras puede estar configurada para aceptar una muestra a un diferencial de presion en comparacion con una presion ambiente de entre aproximadamente 20 kilopascales y 200 kilopascales, por ejemplo entre aproximadamente 70 kilopascales y 110 kilopascales.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede incluir un filtro en comunicacion fluida con la valvula de entrada de muestras, estando el filtro configurado para separar al menos un componente de una mezcla de muestras introducida en la entrada de muestras.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede incluir al menos una bomba accionada termicamente en comunicacion fluida con la red microflmdica. La bomba accionada termicamente puede incluir un material termoexpansivo seleccionado entre un gas, un lfquido vaporizable a una temperatura entre 25 °C y 100 °C a 1 atmosfera, y un polfmero de expancel.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede incluir al menos una valvula accionada termicamente en comunicacion fluida con la red microflmdica. La valvula accionada termicamente puede incluir un material que tiene una transicion de fase solida a lfquida a una temperatura entre 25 °C y 100 °C a 1 atmosfera.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede incluir al menos un deposito sellado que contiene un reactivo, un tampon o un disolvente. El deposito sellado puede ser, por ejemplo, un envase blister autoperforante configurado
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para poner al reactivo, el tampon o el disolvente en comunicacion fluida con la red microflmdica.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede incluir al menos al menos un orificio de ventilacion hidrofobo.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede incluir al menos un deposito configurado para recibir y contener residuos tales como fluidos y/o material particulado tal como restos celulares.
En diversas realizaciones, el miembro de retencion puede incluir una polialquilenimina o una poliamida policationica, por ejemplo, polietilenimina, poli-L-lisina o poli-D-lisina. El miembro de retencion puede estar en forma de una o mas partfculas. El miembro de retencion puede ser amovible del cartucho microflmdico.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede incluir un reactivo de lisis. El reactivo de lisis puede incluir uno o mas microgranulos liofilizados de tensioactivo, donde la red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto el microgranulo liofilizado de tensioactivo con un lfquido para crear una solucion de reactivo de lisis. La red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto una muestra con el reactivo de lisis para producir una muestra lisada.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede estar configurada para acoplar calor procedente de una fuente de calor externa a la muestra para producir la muestra lisada. Por ejemplo, la red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto el miembro de retencion y la muestra lisada para crear un miembro de retencion cargado de polinucleotidos.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir, ademas, un filtro configurado para separar el miembro de retencion cargado de polinucleotidos del lfquido.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir, ademas, un deposito que contiene un tampon de lavado, donde la red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con el tampon de lavado, por ejemplo, el tampon de lavado puede tener un pH de al menos aproximadamente 10.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir un deposito que contiene un tampon de liberacion, donde el cartucho microflmdico puede estar configurado para poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con el tampon de liberacion para crear una muestra con polinucleotidos liberados.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede estar configurada para acoplar calor procedente de una fuente de calor externa al miembro de retencion cargado de polinucleotidos para crear la muestra con polinucleotidos liberados.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir un deposito que contiene un tampon de neutralizacion, donde la red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto la muestra con polinucleotidos liberados con el tampon de neutralizacion para crear una muestra con polinucleotidos neutralizados.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir una mezcla de reactivos de PCR que comprende una enzima polimerasa y una pluralidad de nucleotidos. La mezcla de reactivos de PCR puede estar en forma de uno o mas microgranulos liofilizados, y la red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto el microgranulo de PCR con lfquido para crear una solucion de mezcla de reactivos de PCR.
En diversas realizaciones, la red microflmdica puede estar configurada para acoplar calor procedente de una fuente de calor externa con la mezcla de reactivos de PCR y la muestra con polinucleotidos neutralizados en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear amplicones de PCR a partir de la muestra con polinucleotidos neutralizados.
En diversas realizaciones, la mezcla de reactivos de PCR puede incluir, ademas, un plasmido de control positivo y una sonda de hibridacion fluorogena selectiva para al menos una parte del plasmido.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir un polinucleotido de control negativo, donde la red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto independientemente cada uno de la muestra con polinucleotidos neutralizados y el polinucleotido de control negativo con la mezcla de reactivos de PCR en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear independientemente amplicones de PCR de la muestra con polinucleotidos neutralizados y amplicones de PCR del polinucleotido de control negativo.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir al menos una sonda que puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos, donde el cartucho microflmdico puede estar configurado para poner en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma con la sonda. La sonda puede ser una sonda de hibridacion fluorogena. La sonda de hibridacion fluorogena puede incluir una secuencia de polinucleotidos acoplada a un colorante informador fluorescente y un colorante extintor de fluorescencia. La mezcla de reactivos de
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PCR puede incluir, ademas, un plasmido de control positivo y una sonda de hibridacion fluorogena de plasmido selectiva para al menos una parte del plasmido y el cartucho microflmdico puede estar configurado para permitir deteccion optica independiente de la sonda de hibridacion fluorogena y la sonda de hibridacion fluorogena de plasmido.
En diversas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos que puede ser caractenstica de un organismo, por ejemplo cualquier organismo que emplee polinucleotidos de acido desoxirribonucleico o acido ribonucleico. De este modo, la sonda puede ser selectiva para cualquier organismo. Los organismos adecuados incluyen mairnferos (incluyendo seres humanos), aves, reptiles, anfibios, peces, animales domesticos, animales de granja, animales salvajes, organismos extintos, bacterias, hongos, virus, plantas, y similares. La sonda tambien puede ser selectiva para componentes de organismos que emplean sus propios polinucleotidos, por ejemplo mitocondrias. En algunas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para microorganismos, por ejemplo, organismos usados en la produccion de alimentos (por ejemplo, levaduras empleadas en productos fermentados, mohos o bacterias empleadas en quesos, y similares) o patogenos (por ejemplo, de seres humanos, mairnferos domesticos o salvajes, aves domesticas o salvajes, y similares). En algunas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para organismos seleccionados entre el grupo que consiste en bacterias gram positivas, bacterias gram negativas, levaduras, hongos, protozoos y virus.
En diversas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos que es caractenstica de Streptococcus del grupo B.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede estar configurado para permitir deteccion optica de la sonda de hibridacion fluorogena.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir, ademas, una etiqueta legible por ordenador. Por ejemplo, la etiqueta puede incluir un codigo de barras, una marca de radiofrecuencia o uno o mas caracteres legibles por ordenador. La etiqueta puede estar formada de un material mecanicamente flexible. Por ejemplo, el material mecanicamente flexible de la etiqueta puede tener un grosor de entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 2 milfmetros y una dureza Shore de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede estar rodeado, ademas, por una bolsita sellada, durante la manipulacion y el almacenamiento, y antes de ser insertado en la camara. El cartucho microflmdico puede estar sellado en la bolsita con un gas inerte. La bolsita sellada tambien puede contener un paquete de desecante. El cartucho microflmdico puede ser desechable.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede contener uno o mas carriles para muestras. Por ejemplo, un carril para muestras puede incluir una bomba accionada termicamente, una valvula accionada termicamente, una valvula de entrada de muestras, un filtro, y al menos un deposito. Los carriles pueden ser independientes entre sf, o pueden ser parcialmente dependientes, por ejemplo, los carriles pueden compartir uno o mas reactivos tales como el reactivo de lisis.
En algunas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir un miembro de colocacion correcta; y una red microflmdica. La red microflmdica incluye, en comunicacion flmdica: al menos una bomba accionada termicamente; al menos una valvula accionada termicamente; una valvula de entrada de muestras configurada para aceptar una muestra a un diferencial de presion en comparacion con una presion ambiente de entre aproximadamente 70 kilopascales y 110 kilopascales; un miembro de retencion selectivo para al menos un polinucleotido respecto a al menos un inhibidor de la reaccion en cadena de la polimerasa, estando el miembro de retencion en forma de una pluralidad de partfculas formadas de una polialquilenimina o una poliamida policationica; un filtro configurado para separar el miembro de retencion cargado de polinucleotidos del lfquido; una pluralidad de depositos, siendo al menos dicho un deposito un deposito de envase blister autoperforante, sellado. La pluralidad de depositos pueden contener entre ellos: un reactivo de lisis, estando la red microflmdica configurada para poner en contacto una muestra introducida en la entrada de muestras con el reactivo de lisis y el miembro de retencion para crear un miembro de retencion cargado de polinucleotidos; un deposito que contiene un tampon de lavado, estando la red microflmdica configurada para poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con el tampon de lavado; un deposito que contiene un tampon de liberacion, estando la red microflmdica configurada para poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con el tampon de liberacion para crear una muestra con polinucleotidos liberados; un tampon de neutralizacion, estando la red microflmdica configurada para poner en contacto la muestra con polinucleotidos liberados con el tampon de neutralizacion para crear una muestra con polinucleotidos neutralizados; una mezcla de reactivos de PCR que comprende una enzima polimerasa, un plasmido de control positivo, una sonda de hibridacion fluorogena selectiva para al menos una parte del plasmido y una pluralidad de nucleotidos; y al menos una sonda que puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos, donde la red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma con la sonda. Ademas, la red microflmdica puede estar configurada para acoplar calor procedente de una fuente de calor externa con la mezcla de reactivos de PCR y la muestra con polinucleotidos neutralizados en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear amplicones de PCR a partir de la muestra con polinucleotidos neutralizados.
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En diversas realizaciones, un sistema de analisis de polinucleotidos puede incluir tanto el cartucho microflmdico como el aparato, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
En diversas realizaciones, un kit de muestras de polinucleotidos puede incluir un cartucho microflmdico que comprende una red microflmdica y un miembro de retencion en comunicacion fluida con la red microflmdica, siendo el miembro de retencion selectivo para al menos un polinucleotido respecto a al menos un inhibidor de la reaccion en cadena de la polimerasa, un recipiente para muestras; y un miembro de transferencia de lfquido tal como una jeringa.
En diversas realizaciones, el kit de muestras de polinucleotidos puede incluir, ademas, instrucciones para emplear el miembro de transferencia de lfquido para transferir una muestra desde el recipiente para muestras hasta la red microflmdica.
En diversas realizaciones, el kit de muestras de polinucleotidos puede incluir, ademas, instrucciones para emplear el miembro de transferencia de lfquido para dirigir una muestra desde el recipiente para muestras, y un volumen de aire al interior de la red microflmdica, estando el volumen de aire entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 5 ml.
En diversas realizaciones, el kit de muestras de polinucleotidos puede incluir, ademas, un filtro, y, por ejemplo, instrucciones para emplear el miembro de transferencia de lfquido para dirigir una muestra desde el recipiente para muestras a traves del filtro al interior de la red microflmdica.
En diversas realizaciones, el kit de muestras de polinucleotidos puede incluir, ademas, al menos una etiqueta legible por ordenador en el recipiente para muestras. La etiqueta puede incluir, por ejemplo, un codigo de barras, una marca de radiofrecuencia o uno o mas caracteres legibles por ordenador. El cartucho microflmdico puede estar sellado en una bolsita con un gas inerte.
En diversas realizaciones, el kit de muestras de polinucleotidos puede incluir, ademas, un miembro de muestreo; un recipiente de transferencia; e instrucciones para poner en contacto el miembro de muestreo con una muestra biologica y para colocar el miembro de muestreo en el recipiente de transferencia.
En diversas realizaciones, el kit de muestras de polinucleotidos puede incluir, ademas, un tampon de muestras, y, por ejemplo, instrucciones para poner en contacto el miembro de muestreo y el tampon de muestras.
En diversas realizaciones, el kit de muestras de polinucleotidos puede incluir, ademas, al menos una sonda que puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos, por ejemplo, la secuencia de polinucleotidos que es caractenstica de un patogeno seleccionado entre el grupo que consiste en bacterias gram positivas, bacterias gram negativas, levaduras, hongos, protozoos y virus.
En algunas realizaciones, el kit de muestras de polinucleotidos puede incluir un cartucho microflmdico que comprende una red microflmdica, un miembro de retencion en comunicacion fluida con la red microflmdica, y una sonda fluorogena, siendo el miembro de retencion selectivo para al menos un polinucleotido respecto a al menos un inhibidor de la reaccion en cadena de la polimerasa, siendo la sonda fluorogena selectiva para una secuencia de polinucleotidos que puede ser caractenstica de un patogeno seleccionado entre el grupo que consiste en bacterias gram positivas, bacterias gram negativas, levaduras, hongos, protozoos y virus; un recipiente para muestras; un miembro de transferencia de lfquido; un miembro de muestreo; un recipiente de transferencia; un tampon de muestras; e instrucciones. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para: emplear el miembro de transferencia de lfquido para transferir una muestra desde el recipiente para muestras hasta la red microflmdica; emplear el miembro de transferencia de lfquido para dirigir una muestra desde el recipiente para muestras y un volumen de aire al interior de la red microflmdica, estando el volumen de aire entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 5 ml; emplear el miembro de transferencia de lfquido para dirigir una muestra procedente del recipiente para muestras a traves de un filtro al interior de la red microflmdica; y poner en contacto el miembro de muestreo con una muestra biologica y para colocar el miembro de muestreo en el recipiente de transferencia.
Un metodo para muestrear un polinucleotido puede incluir las etapas de poner en contacto el miembro de retencion en el cartucho microflmdico con una muestra biologica, comprendiendo la muestra biologica al menos un polinucleotido, produciendo de este modo un miembro de retencion cargado de polinucleotidos en el cartucho microflmdico; separar al menos una parte de la muestra biologica del miembro de retencion cargado de polinucleotidos; y liberar al menos una parte de un polinucleotido del miembro de retencion cargado de polinucleotidos, creando de este modo una muestra con polinucleotidos liberados.
En diversas realizaciones, el metodo puede incluir, ademas, una o mas de las siguientes etapas: colocar el cartucho microflmdico en el compartimento de recepcion del aparato; hacer funcionar el miembro de fuerza en el aparato para aplicar presion en una interfaz entre una parte del compartimento de recepcion y una parte del cartucho microflmdico (por ejemplo, crear una presion entre aproximadamente 5 kilopascales y aproximadamente 50 kilopascales, o en algunas realizaciones, al menos aproximadamente 14 kilopascales); emplear el miembro de fuerza para aplicar
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fuerza a un miembro mecanico en el cartucho microflmdico, el miembro mecanico seleccionado entre el grupo que consiste en un deposito perforable, una valvula o una bomba, para liberar al menos un reactivo, tampon, o disolvente a partir de un deposito en el chip microflmdico; y/o cerrar la tapa para hacer funcionar el miembro de fuerza, donde el miembro de fuerza puede estar acoplado mecanicamente a una tapa en el compartimento de recepcion.
En algunas realizaciones, el metodo puede incluir, ademas, emplear un identificador de muestras para leer una etiqueta en el cartucho microflmdico o una etiqueta en la muestra biologica.
En algunas realizaciones, el metodo puede incluir, ademas, introducir una muestra biologica impura en el cartucho microflmdico y separar la muestra biologica de la muestra biologica impura en el cartucho microflmdico, por ejemplo, usando un filtro en el cartucho, o la muestra biologica puede separarse de una muestra biologica impura antes de introducir la muestra biologica en el cartucho microflmdico.
En algunas realizaciones, el metodo puede incluir, ademas, lisar la muestra biologica, por ejemplo, usando calor, un reactivo de lisis, y similares. En algunas realizaciones, donde el cartucho microflmdico comprende uno o mas microgranulos liofilizados de reactivo de lisis, el metodo puede incluir, ademas, reconstituir el microgranulo liofilizado de tensioactivo con lfquido para crear una solucion de reactivo de lisis.
En diversas realizaciones, el metodo puede incluir, ademas, una o mas de las siguientes: calentar la muestra biologica en el cartucho microflmdico; presurizar la muestra biologica en el cartucho microflmdico en un diferencial de presion en comparacion con presion ambiente de entre aproximadamente 20 kilopascales y 200 kilopascales, o en algunas realizaciones entre aproximadamente 70 kilopascales y 110 kilopascales.
En algunas realizaciones, la parte de la muestra biologica separada del miembro de retencion cargado de polinucleotidos puede incluir al menos un inhibidor de la reaccion en cadena de la polimerasa seleccionado entre el grupo que consiste en hemoglobina, peptido, compuestos fecales, acido humicos, compuestos mucosales, protemas de union a ADN, o un sacarido. En algunas realizaciones, el metodo puede incluir, ademas, separar el miembro de retencion cargado de polinucleotidos de sustancialmente todo el inhibidor de la reaccion en cadena de la polimerasas en la muestra biologica.
En diversas realizaciones, el metodo puede incluir, ademas, una o mas de las siguientes: dirigir un fluido en el cartucho microflmdico haciendo funcionar una bomba accionada termicamente o una valvula accionada termicamente; poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con un tampon de lavado; calentar el miembro de retencion cargado de polinucleotidos a una temperatura de al menos aproximadamente 50 °C (en algunas realizaciones, la temperatura puede ser de 100 °C o menos); calentar el miembro de retencion cargado de polinucleotidos durante menos de aproximadamente 10 minutos; poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con un tampon de liberacion para crear una muestra con polinucleotidos liberados (por ejemplo, en algunas realizaciones, el tampon de liberacion puede tener un volumen de menos de aproximadamente 50 microlitros, el tampon de liberacion puede incluir un detergente, y/o el tampon de liberacion puede tener un pH de al menos aproximadamente 10); y/o poner en contacto la muestra con polinucleotidos liberados con un tampon de neutralizacion para crear una muestra con polinucleotidos neutralizados.
En diversas realizaciones, el metodo puede incluir, ademas, una o mas de las siguientes: poner en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados con una mezcla de reactivos de PCR que comprende una enzima polimerasa y una pluralidad de nucleotidos (en algunas realizaciones, la mezcla de reactivos de PCR puede incluir, ademas, un plasmido de control positivo y una sonda de hibridacion fluorogena selectiva para al menos una parte del plasmido); en algunas realizaciones, la mezcla de reactivos de PCR puede estar en forma de uno o mas microgranulos liofilizados, y el metodo puede incluir, ademas, reconstituir el microgranulo de PCR con lfquido para crear una solucion de mezcla de reactivos de PCR; calentar la mezcla de reactivos de PCR y la muestra con polinucleotidos neutralizados en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear amplicones de PCR a partir de la muestra con polinucleotidos neutralizados; poner en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma con al menos una sonda que puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos; poner en contacto independientemente cada una de la muestra con polinucleotidos neutralizados y un polinucleotido de control negativo con la mezcla de reactivos de PCR en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear independientemente amplicones de PCR de la muestra con polinucleotidos neutralizados y amplicones de PCR del polinucleotido de control negativo; y/o poner en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma y el polinucleotido de control negativo o un amplicon de PCR del mismo con al menos una sonda que es selectiva para una secuencia de polinucleotidos.
En diversas realizaciones, el metodo puede incluir, ademas, una o mas de las siguientes:
determinar la presencia de una secuencia de polinucleotidos en la muestra biologica, correspondiendo la secuencia de polinucleotidos a la sonda, si la sonda es detectada en la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma; determinar un resultado contaminado si la sonda es detectada en el polinucleotido de control negativo o un amplicon de PCR del mismo; y/o en algunas realizaciones, donde la mezcla de reactivos de PCR comprende, ademas, un plasmido de control positivo y una
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sonda plasmndica selectiva para al menos una parte del plasmido, incluyendo, ademas, el metodo determinar que se ha producido una reaccion de PCR si la sonda plasmfdica es detectada.
En diversas realizaciones, el metodo no comprende centrifugado del miembro de retencion cargado de polinucleotidos.
En algunas realizaciones, el metodo para muestrear un polinucleotido puede incluir:
colocar un cartucho microflmdico en el compartimento de recepcion de un aparato; hacer funcionar un miembro de fuerza en el aparato para aplicar presion en una interfaz entre una parte del compartimento de recepcion y una parte del cartucho microflmdico, funcionando la fuerza para liberar al menos un reactivo, tampon, o disolvente a partir de un deposito en el cartucho microflmdico; lisar una muestra biologica en el cartucho microflmdico para crear una muestra biologica lisada; poner en contacto un miembro de retencion en un cartucho microflmdico con la muestra biologica lisada, comprendiendo la muestra biologica al menos un polinucleotido, produciendo de este modo un miembro de retencion cargado de polinucleotidos en el cartucho microflmdico, donde el miembro de retencion esta en forma de una pluralidad de partfculas de una polialquilenimina o una poliamida policationica; poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con un tampon de lavado; calentar el miembro de retencion cargado de polinucleotidos a una temperatura de al menos aproximadamente 50 °C durante menos de aproximadamente 10 minutos; poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con un tampon de liberacion para crear una muestra con polinucleotidos liberados. poner en contacto la muestra con polinucleotidos liberados con un tampon de neutralizacion para crear una muestra con polinucleotidos neutralizados; poner en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados con una mezcla de reactivos de PCR en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear amplicones de PCR a partir de la muestra con polinucleotidos neutralizados, comprendiendo la mezcla de reactivos de PCR una enzima polimerasa, un plasmido de control positivo, una sonda de hibridacion fluorogena selectiva para al menos una parte del plasmido, y una pluralidad de nucleotidos, poner en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma con al menos una sonda fluorogena que puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos, donde la sonda puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos que puede ser caractenstica de un organismo seleccionado entre el grupo que consiste en bacterias gram positivas, bacterias gram negativas, levaduras, hongos, protozoos y virus; y detectar la sonda fluorogena y determinar la presencia del organismo para el que la una sonda fluorogena puede ser selectiva.
En diversas realizaciones, un producto de programa informatico incluye instrucciones legibles por ordenador en el para hacer funcionar el aparato.
En algunas realizaciones, un producto de programa informatico incluye instrucciones legibles por ordenador en el para hacer que el sistema cree una muestra con polinucleotidos liberados a partir de una muestra biologica. Las instrucciones legibles por ordenador pueden incluir instrucciones para poner en contacto el miembro de retencion con la muestra biologica en condiciones adecuadas para producir un miembro de retencion cargado de polinucleotidos; separar al menos una parte de la muestra biologica del miembro de retencion cargado de polinucleotidos; y liberar al menos una parte de un polinucleotido del miembro de retencion cargado de polinucleotidos, creando de este modo una muestra con polinucleotidos liberados.
En diversas realizaciones, el producto de programa informatico puede incluir una o mas instrucciones para hacer que el sistema: emita un indicador de la colocacion del cartucho microflmdico en el compartimento de recepcion; lea una etiqueta de la muestra o una etiqueta de cartucho microflmdico; emita indicaciones para que un usuario introduzca un identificador de muestras; emita indicaciones para que un usuario cargue un miembro de transferencia de muestras con la muestra biologica; emita indicaciones para que un usuario aplique un filtro al miembro de transferencia de muestras; emita indicaciones para que un usuario introduzca la muestra biologica en el cartucho microflmdico; emita indicaciones para que un usuario haga que la muestra biologica entre en contacto con un reactivo de lisis en el cartucho microflmdico; emita indicaciones para que un usuario coloque el cartucho microflmdico en el compartimento de recepcion; emita indicaciones para que un usuario haga funcionar un miembro de fuerza en el aparato para aplicar presion en una interfaz entre una parte del compartimento de recepcion y una parte del cartucho microflmdico; emita indicaciones para que un usuario cierre la tapa para hacer funcionar el miembro de fuerza; y/o emita indicaciones para que un usuario presurice la muestra biologica en el cartucho microflmdico inyectando a la muestra biologica un volumen de aire entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 5 ml.
En diversas realizaciones, el producto de programa informatico puede incluir una o mas instrucciones para hacer que el sistema: lise la muestra biologica; lise la muestra biologica con un reactivo de lisis; reconstituya un microgranulo liofilizado de tensioactivo con lfquido para crear una solucion de reactivo de lisis; caliente la muestra biologica; separe el miembro de retencion cargado de polinucleotidos de al menos una parte de la muestra biologica; separe el miembro de retencion cargado de polinucleotidos de sustancialmente todos los inhibidores de la reaccion en cadena de la polimerasa en la muestra biologica; dirija un fluido en el cartucho microflmdico haciendo funcionar una bomba accionada termicamente o una valvula accionada termicamente; ponga en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con un tampon de lavado; caliente el miembro de retencion cargado de
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polinucleotidos a una temperatura de al menos aproximadamente 50 °C (en algunas realizaciones, la temperatura puede ser de aproximadamente 100 °C o menor); caliente el miembro de retencion cargado de polinucleotidos durante menos de aproximadamente 10 minutos; ponga en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con un tampon de liberacion para crear una muestra con polinucleotidos liberados; y/o ponga en contacto la muestra con polinucleotidos liberados con un tampon de neutralizacion para crear una muestra con polinucleotidos neutralizados.
En diversas realizaciones, el producto de programa informatico puede incluir una o mas instrucciones para hacer que el sistema: ponga en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados con una mezcla de reactivos de PCR que comprende una enzima polimerasa y una pluralidad de nucleotidos; caliente la mezcla de reactivos de PCR y la muestra con polinucleotidos neutralizados en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear amplicones de PCR a partir de la muestra con polinucleotidos neutralizados; ponga en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma con al menos una sonda que puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos; ponga en contacto independientemente cada uno de la muestra con polinucleotidos neutralizados y un polinucleotido de control negativo con la mezcla de reactivos de PCR en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear independientemente amplicones de PCR de la muestra con polinucleotidos neutralizados y amplicones de PCR del polinucleotido de control negativo; ponga en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma y el polinucleotido de control negativo o un
amplicon de PCR del mismo con al menos una sonda que puede ser selectiva para una secuencia de
polinucleotidos; emita una determinacion de la presencia de una secuencia de polinucleotidos en la muestra biologica, correspondiendo la secuencia de polinucleotidos a la sonda, si la sonda es detectada en la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma; y/o emita una determinacion de un resultado contaminado si la sonda es detectada en el polinucleotido de control negativo o un amplicon de PCR del mismo.
En diversas realizaciones, el producto de programa informatico puede incluir una o mas instrucciones para hacer que el sistema lleve a cabo automaticamente una o mas de las etapas del metodo.
En diversas realizaciones, donde la red microflmdica comprende dos o mas carriles para muestras que incluyen, cada uno, una bomba accionada termicamente, una valvula accionada termicamente, una valvula de entrada de
muestras, un filtro, y al menos un deposito, donde las instrucciones legibles por ordenador pueden estar
configuradas para hacer funcionar independientemente cada dicho carril en el sistema.
En algunas realizaciones, el producto de programa informatico incluye instrucciones legibles por ordenador en el para hacer que un sistema cree una muestra con polinucleotidos liberados a partir de una muestra biologica. El sistema puede incluir un cartucho microflmdico que comprende una red microflmdica y un miembro de retencion en comunicacion fluida con la red microflmdica, siendo el miembro de retencion selectivo para al menos un polinucleotido respecto a al menos un inhibidor de la reaccion en cadena de la polimerasa; y un aparato que comprende un compartimento de recepcion configurado para recibir selectivamente el cartucho microflmdico; al menos una bomba de calor configurada para estar acoplada termicamente al cartucho microflmdico en el compartimento de recepcion; un detector; y un procesador programable acoplado al detector y la bomba de calor. Las instrucciones legibles por ordenador pueden incluir instrucciones para: lisar una muestra biologica poniendo en contacto la muestra biologica con un reactivo de lisis y calentar para producir una muestra lisada; poner en contacto el miembro de retencion con la muestra biologica y/o la muestra lisada para producir un miembro de retencion cargado de polinucleotidos; separar al menos una parte de la muestra biologica del miembro de retencion cargado de polinucleotidos; poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con un tampon de lavado; poner en contacto el miembro de retencion cargado de polinucleotidos con un tampon de liberacion y/o calentar para liberar al menos una parte de un polinucleotido a partir del miembro de retencion cargado de polinucleotidos, creando de este modo una muestra con polinucleotidos liberados; poner en contacto la muestra con polinucleotidos liberados con un tampon de neutralizacion para crear una muestra con polinucleotidos neutralizados; poner en contacto independientemente cada uno de la muestra con polinucleotidos neutralizados y un polinucleotido de control negativo con una mezcla de reactivos de PCR en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear independientemente amplicones de PCR, comprendiendo la mezcla de reactivos de PCR una enzima polimerasa, una pluralidad de nucleotidos, un plasmido de control positivo y una sonda plasirndica selectiva para al menos una parte del plasmido; determinar que se ha producido una reaccion de PCR si la sonda plasirndica es detectada; poner en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma y el polinucleotido de control negativo o un amplicon de PCR del mismo con al menos una sonda que es selectiva para una secuencia de polinucleotidos; determinar la presencia de una secuencia de polinucleotidos en la muestra biologica, correspondiendo la secuencia de polinucleotidos a la sonda, si la sonda es detectada en la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma; y determinar un resultado contaminado si la sonda es detectada en el polinucleotido de control negativo o un amplicon de PCR del mismo.
Los detalles de una o mas realizaciones de la tecnologfa se exponen en los dibujos adjuntos y la descripcion a continuacion. Otras caractensticas, objetivos y ventajas de la tecnologfa seran evidentes a partir de la descripcion y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones. Sfmbolos de referencia similares en los diversos dibujos indican elementos similares.
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Descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra una vision general esquematica de un aparato descrito en el presente documento.
Las figuras 2A-2E muestran vistas en perspectiva de un aparato ejemplar, en diversas configuraciones, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
La figura 3 es una vista en despiece ordenado de componentes tipicos de un aparato.
La figura 4 es un diagrama de bloques de un aparato.
La figura 5 es un diagrama de un modulo de deteccion fluorescente.
Las figuras 6A y 6B representan la ubicacion, en diversas realizaciones, de un cartucho microflmdico despues de la instalacion en un aparato.
La figura 7 muestra una vista en perspectiva de un modulo calefactor amovible, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
Las figuras 8A - 8C muestran una vista en planta de circuitos del calefactor adyacentes a una zona de reaccion de PCR; e imagenes termicas de circuitos del calefactor en funcionamiento.
La figura 9 muestra una vista en perspectiva de un cartucho microflmdico, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
La figura 10 es una vista en perspectiva de un dispositivo microflmdico.
La figura 11 es una vista de seccion transversal de una region de procesamiento para retener polinucleotidos y/o separar polinucleotidos de inhibidores.
La figura 12A es una vista en perspectiva de una compuerta.
La figura 12B es una vista en perspectiva de una compuerta flexionada.
La figura 13 es una vista de seccion transversal de un accionador.
La figura 14A es una vista en perspectiva de un cartucho microflmdico.
La figura 14B es una vista de seccion transversal lateral del cartucho microflmdico de las figuras 14A y 14B.
Las figuras 15A y 15B, tomadas conjuntamente, ilustran una vista en perspectiva de una red microflmdica del cartucho microflmdico de las figuras 14A y 14B.
La figura 16 ilustra una serie de fuentes de calor para hacer funcionar componentes del cartucho microflmdico de las figuras 14A y 14B.
Las figuras 17 y 18 ilustran una valvula en los estados abierto y cerrado respectivamente.
Las figuras 19A-19D ilustran una compuerta de mezcla de la red microflmdica de las figuras 6A y 6B y regiones adyacentes de la red.
Las figuras 20A-20C ilustran un deposito con mecanismo de accionamiento.
Las figuras 21A-21C ilustran un deposito con mecanismo de accionamiento.
La figura 22 ilustra un deposito con mecanismo de accionamiento.
Las figuras 23A-23B ilustran un deposito con mecanismo de accionamiento.
Las figuras 24A-24B ilustran un deposito con mecanismo de accionamiento.
La figura 25 ilustra un deposito con mecanismo de accionamiento.
La figura 26 ilustra un deposito con mecanismo de accionamiento.
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Las figuras 27A y 27B ilustran realizaciones de un envase de reactivo con un miembro perforante.
La figura 28 representa un aparato que puede funcionar como un pequeno sistema de analisis de polinucleotidos en tiempo real, de mesa.
La figura 29 representa un kit de muestras que puede usarse con un aparato.
La figura 30 representa una bolsita para componentes de un kit de muestras.
La figura 31 representa un cartucho microflmdico ejemplar.
La figura 32 representa el uso de un lector de codigo de barras para leer un codigo de barras en un cartucho microflmdico.
La figura 33 representa el uso de un lector de codigo de barras para leer un codigo de barras en un recipiente para muestras.
La figura 34 representa la fijacion de un filtro a un deposito de lisis de un cartucho microflmdico mediante una entrada de muestras, con lo que el contenido de la jeringa puede inyectarse en el cartucho microflmdico a traves de un filtro.
La figura 35 representa la adicion de aire a la jeringa con el fin de presurizar el cartucho microflmdico.
La figura 36 representa la colocacion de un cartucho microflmdico en un compartimento de recepcion de un aparato.
Las figuras 37 y 38 representan el cierre de una tapa de un aparato.
Las figuras 39 y 40 representan la retirada de un modulo calefactor/sensor de un aparato.
La figura 41A es un grafico de datos de sensor de calor en tiempo real de un aparato.
La figura 41B es un grafico de datos de detector optico en tiempo real de un aparato.
La figura 42 es una representacion esquematica de diversas camaras y/o subunidades ejemplares en un cartucho microflmdico ejemplar.
La figura 43 es una representacion esquematica de las etapas relativas a la PCR y la deteccion que se pueden realizar en un cartucho microflmdico ejemplar.
La figura 44 es un esquema de un ensayo de PCR en tiempo real ejemplar basado en el ensayo TaqMan®.
La figura 45 es un esquema de plasmidos de control internos positivos que pueden emplearse.
La figura 46 representa la mezcla de dos fluidos (“A” - azul y “B” - naranja).
Las figuras 47A y 47B representan una bomba accionada termicamente 500 basada en un material de transicion de fase (PTM por sus siglas en ingles) 510, en configuraciones cerrada (figura 47A) y abierta (figura 47B).
Las figuras 47C y 47D muestran otro ejemplo de una bomba 501 con polfmero expancel 511 en la camara 513 que puede accionarse para hacer funcionar la compuerta 515.
La figura 48 representa componentes de un cartucho desechable basado en tecnologfa microflmdica, individual e integrado.
La figura 49 representa perlas de captura de ADN que pueden emplearse.
Las figuras 50A-50J resaltan diversos elementos del cartucho microflmdico mostrado en las figuras 15A y 15B.
La figura 51 es una vista lateral de un conjunto de palanca 1200, con palanca 1210, unidad de engranaje 1212 y miembro de fuerza 1214.
La figura 52 muestra una vista lateral del conjunto de palanca 1200, con un cartucho microflmdico en un compartimento de recepcion.
La figura 53 muestra un primer plano de un compartimento de recepcion.
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La figura 54 muestra un primer plano de la interfaz entre un cartucho microflmdico, conductor termicamente, capa mecanicamente flexible, y una fase termica.
La figura 55 muestra una vista superior del conjunto 1200.
La figura 56 es un primer plano de la figura 55.
Las figuras 57-59 son una serie de fotos de la palanca 1210 en accion. Puede mostrarse, ademas, en el conjunto de engranaje 1212 la leva 1228, que permite que la palanca 1210 aplique fuerza a la placa 1230 acoplada a los miembros de fuerza 1214.
Las figuras 60 y 61 muestran vistas de un cartucho microflmdico con depositos autoperforantes 1228 y miembros mecanicos 1230 para accionar los depositos auto-perforantes.
Las figuras 62 y 63 muestran elementos de elementos detectores opticos 1220 que incluyen fuentes de luz 1232 (por ejemplo, diodos emisores de luz), lentes 1234, detectores de luz 1236 (por ejemplo, fotodiodos) y filtros 1238.
La figura 64 ilustra un dispositivo microflmdico.
La figura 65 es una seccion transversal del dispositivo microflmdico de la figura 64 tomada a lo largo de 5.
FIG. 66 ilustra la retencion de ADN de esperma de arenque.
La figura 67 ilustra la retencion y liberacion de ADN a partir de estreptococos del grupo B;
La figura 68 ilustra la respuesta de PCR de una muestra a partir de la cual se habfan retirado inhibidores y de una muestra a partir de la cual no se habfan retirado inhibidores.
La figura 69 ilustra la respuesta de PCR de una muestra preparada de acuerdo con la tecnologfa descrita en el presente documento y una muestra preparada usando un metodo de extraccion de ADN comercial.
La figura 70A ilustra un diagrama de flujo que muestra etapas realizadas durante un metodo para separar polinucleotidos e inhibidores.
La figura 70B ilustra ADN de muestras sometidas al metodo de la figura 26A.
La figura 71 es un diagrama de flujo que perfila un conjunto de criterios ejemplares que pueden usarse mediante el algoritmo de decision en el aparato 800 para interpretar los resultados, tal como se describe en el ejemplo 13.
Descripcion detallada
Un sistema, cartucho microflmdico, kit, metodos y producto de programa informatico, se describen adicionalmente a continuacion.
El analisis de muestras biologicas a menudo incluye determinar si uno o mas polinucleotidos (por ejemplo, un ADN, ARN, ARNm o ARNr) pueden estar presentes en la muestra. Por ejemplo, se puede analizar una muestra para determinar si un polinucleotido indicativo de la presencia de un patogeno particular (tal como una bacteria o un virus) puede estar presente. El polinucleotido puede ser una muestra de ADN genomico, o puede ser una muestra de ADN mitocondrial. Normalmente, las muestras biologicas pueden ser mezclas complejas. Por ejemplo, una muestra puede proporcionarse como una muestra de sangre, una muestra de tejido (por ejemplo, un frotis de, por ejemplo, tejido nasal, bucal, anal o vaginal), un aspirado de biopsia, un lisado, como hongos, o como bacterias. Los polinucleotidos a determinar pueden estar contenidos dentro de partfculas (por ejemplo, celulas (por ejemplo, globulos blancos y/o globulos rojos), fragmentos de tejido, bacterias (por ejemplo, bacterias gram positivas y/o bacterias gram negativas), hongos, esporas). Uno o mas lfquidos (por ejemplo, agua, un tampon, sangre, plasma sangmneo, saliva, orina, lfquido cefalorraqmdeo, o disolvente organico) pueden ser normalmente parte de la muestra y/o pueden anadirse a la muestra durante una etapa de procesamiento.
Los metodos para analizar muestras biologicas incluyen proporcionar una muestra biologica (por ejemplo, un frotis), liberar polinucleotidos a partir de partfculas (por ejemplo, celulas tales como bacterias) de la muestra, amplificar uno o mas de los polinucleotidos liberados (por ejemplo, mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)), y determinar la presencia (o ausencia) del uno o mas polinucleotidos amplificados (por ejemplo, mediante deteccion de fluorescencia). Las muestras biologicas, sin embargo, normalmente incluyen inhibidores (por ejemplo, compuestos mucosales, hemoglobina, compuestos fecales, y protemas de union a ADN) que pueden inhibir la determinacion de la presencia de polinucleotidos en la muestra. Por ejemplo, dichos inhibidores pueden reducir la eficiencia de amplificacion de polinucleotidos mediante PCR y otras tecnicas enzimaticas para determinar la
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presencia de polinucleotidos. Si la concentracion de inhibidores no se reduce con respecto a los polinucleotidos a determinar, el analisis puede producir resultados falsos negativos. Los metodos y sistemas relacionados en el presente documento para procesar muestras biologicas (por ejemplo, muestras que tienen uno o mas polinucleotidos a determinar) normalmente son capaces de reducir la concentracion de inhibidores con respecto a la concentracion de polinucleotidos a determinar mediante metodos descritos adicionalmente en el presente documento.
Diversos aspectos de un sistema y un cartucho microflmdico se describen en el presente documento. Divulgaciones adicionales de diversos componentes del mismo pueden encontrarse en la solicitud de Estados Unidos n.° de serie 11/580.267 (publicada como US 2007/0184547 A1), y en la solicitud provisional n.° de serie 60/859.284.
Vision general del sistema
Una vision general esquematica de un sistema 981 para llevar a cabo analisis descrito en el presente documento se muestra en la figura 1. La disposicion geometrica de los componentes del sistema 981 mostrados en la figura 1 es ejemplar y no pretende ser limitante. Un procesador 980, tal como un microprocesador, esta configurado para controlar funciones de diversos componentes del sistema tal como se muestra, y esta de este modo en comunicacion con cada componente de este tipo. En particular, el procesador 980 esta configurado para recibir datos sobre una muestra a analizar, por ejemplo, a partir de un lector de muestras 990, que puede ser un lector de codigos de barras, un lector de caracteres opticos, o un escaner de RFID (lector de marcas de radiofrecuencia). Por ejemplo, el identificador de muestras puede ser un lector de codigo de barras de mano. El procesador 980 esta configurado para aceptar instrucciones del usuario desde una entrada 984, donde dichas instrucciones pueden incluir instrucciones para empezar a analizar la muestra, selecciones aridas de condiciones operativas. El procesador 980 tambien esta configurado para comunicarse con una pantalla 982, de modo que, por ejemplo, los resultados de los analisis sean transmitidos a la pantalla. Adicionalmente, el procesador 980 puede transmitir una o mas preguntas que seran visualizadas en la pantalla 982 que urgen al usuario a proporcionar entrada en respuesta a ellas. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la entrada 984 y la pantalla 982 estan integradas entre sf. El procesador 986 esta opcionalmente configurado, ademas, para transmitir resultados de un analisis a un dispositivo de salida tal como una impresora, una pantalla visual, o un altavoz, o una combinacion de los mismos. El procesador 980 esta, ademas, opcionalmente aun conectado mediante una interfaz de comunicacion tal como una interfaz de red a una red informatica 988. La interfaz de comunicacion puede ser una o mas interfaces seleccionadas entre el grupo que consiste en: una conexion en serie, una conexion en paralelo, una conexion en red inalambrica y una conexion en red por cable. De este modo, cuando el sistema esta direccionado adecuadamente en la red, un usuario remoto puede acceder al procesador y transmitir instrucciones, introducir datos o recuperar dados, tales como pueden estar almacenados en una memoria (no mostrada) asociada con el procesador, o en algun otro medio legible por ordenador que este en comunicacion con el procesador.
Aunque no se muestra en la figura 1, en diversas realizaciones, la entrada 984 puede incluir uno o mas dispositivos de entrada seleccionados entre el grupo que consiste en: un teclado, una superficie sensible al tacto, un microfono, un panel tactil, un escaner de retina y un raton.
Adicionalmente, en diversas realizaciones, el aparato puede comprender, ademas, un medio de almacenamiento de datos configurado para recibir datos procedentes de uno o mas del procesador, un dispositivo de entrada, y una interfaz de comunicacion, siendo el medio de almacenamiento de datos uno o mas medios seleccionados entre el grupo que consiste en: una unidad de disco duro, una unidad de disco optico, una tarjeta flash y un CD-Rom.
El procesador 980 esta configurado, ademas, para controlar diversos aspectos del diagnostico de muestras, como sigue en la vision general, y tal como se describe adicionalmente en el presente documento. El sistema esta configurado para funcionar junto con un cartucho complementario 994, tal como un cartucho microflmdico. El cartucho esta configurado, a su vez, tal como se describe adicionalmente en el presente documento, para recibir una muestra biologica 996 en una forma adecuada para pruebas y analisis de diagnostico. El cartucho esta recibido por un compartimento de recepcion 992 en el sistema. El compartimento de recepcion esta en comunicacion con un calefactor 998 que esta, a su vez, controlado por el procesador 980 de tal manera que regiones espedficas del cartucho se calienten en momentos espedficos durante las pruebas de diagnostico y el analisis de una muestra. El procesador esta configurado, ademas, para control un detector 999 que recibe una indicacion de un diagnostico procedente del cartucho 994. El diagnostico puede ser transmitido al dispositivo de salida 986 y/o la pantalla 982, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
Un procesador adecuado 980 puede disenarse y fabricarse de acuerdo con, respectivamente, principios de diseno y metodos de procesamiento e semiconductores conocidos en la tecnica.
El sistema mostrado en un esquema en la figura 1, como con otras realizaciones ejemplares descritas en el presente documento, es ventajoso dado que no requiere ubicaciones dentro del sistema, configuradas adecuadamente para el almacenamiento de reactivos. Tampoco requiere el sistema, u otras realizaciones ejemplares en el presente documento, puertos de entrada o de salida que esten configurados para recibir reactivos procedentes de, por ejemplo, recipientes almacenados externamente tales como frascos, latas, o depositos. Por lo tanto, el sistema en la
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figura 1 esta autonomo y funciona junto con un cartucho microflmdico, donde el cartucho tiene ubicaciones en su interior dedicadas al almacenamiento de reactivos.
El sistema de la figura 1 puede estar configurado para llevar a cabo funcionamiento en una unica ubicacion, tal como un entorno de laboratorio, o puede ser portatil de modo que pueda acompanar, por ejemplo, a un facultativo, u otro profesional sanitario, que puede visitar pacientes en diferentes ubicaciones. El sistema esta dotado normalmente de un cable de alimentacion de modo que pueda aceptar energfa de CA de una red de suministro o generador. Un transformador opcional (no mostrado) incorporado en el sistema, o situado externamente entre una toma de energfa y el sistema, transforma la energfa de entrada de CA en una salida de CC para uso por el sistema. El sistema tambien puede estar configurado para funcionar usando una o mas batenas y, por lo tanto, normalmente esta equipado con un sistema de recarga de batenas, y diversos dispositivos de advertencia que alertan a un usuario si la energfa de la batena se esta volviendo demasiado baja para iniciar o completar de forma fiable un analisis de diagnostico.
El sistema de la figura 1 puede estar configurado ademas, en otras realizaciones, para analisis de muestras multiplexado. En una configuracion de ese tipo, multiples ejemplos de un sistema, tal como se perfila en la figura 1, se hacen funcionar unos junto con otros para aceptar y para procesar multiples cartuchos, donde cada cartucho ha sido cargado con una muestra diferente. Cada componente mostrado en la figura 1 puede estar, por lo tanto, presente tantas veces como muestras haya, aunque los diversos componentes pueden estar configurados en una carcasa comun.
En otra configuracion mas, un sistema esta configurado para aceptar y para procesar multiples cartuchos, pero uno o mas componentes en la figura 1 son comunes a multiples cartuchos. Por ejemplo, un unico dispositivo puede estar configurado con multiples compartimentos de recepcion de cartuchos, pero un procesador comun y una interfaz del usuario configurada adecuadamente para permitir control concurrente, consecutivo o simultaneo de los diversos cartuchos. Es posible, ademas, que dicha realizacion, tambien utilice un unico lector de muestras, y un unico dispositivo de salida.
En otra configuracion mas, un sistema tal como se muestra en la figura 1 esta configurado para aceptar un unico cartucho, pero donde el unico cartucho esta configurado para procesar mas de 1, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6, muestras en paralelo, e independientemente entre su Tecnologfa ejemplar para crear cartuchos que puedan manejar multiples muestras se describe en otra parte, por ejemplo; en la solicitud de Estados Unidos n.° de serie 60/859.284.
Es consecuente, ademas, con la presente tecnologfa que un cartucho pueda estar marcado, por ejemplo, con un codigo de barras molecular indicativo de la muestra, para facilitar el rastreo de la muestra, y para minimizar el riesgo de mezcla de muestras. Metodos para dicho marcado se describen en otra parte, por ejemplo, en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 10/360.854 (publicada como US 2004/0157220 A1).
Sistemas ejemplares
Las figuras 2A - 2E muestran vistas en perspectiva exteriores de diversas configuraciones de un sistema ejemplar, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. La figura 2A muestra una vista en perspectiva de un sistema 2000 para recibir un cartucho microflmdico (no mostrado), y para causar y controlar diversas operaciones de procesamiento a realizar en una muestra introducida en el cartucho. Los elementos del sistema 2000 no estan limitados a aquellos mostrados explfcitamente. Por ejemplo, aunque no se muestra, el sistema 2000 puede estar conectado a un lector de codigos de barras de mano, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
EL sistema 2000 comprende una carcasa 2002, que puede estar hecha de metal, o un plastico endurecido. La forma de la carcasa mostrada en la figura 2A materializa caractensticas de estilo asf como funcionales. Otras realizaciones de la invencion pueden parecer algo diferentes, en su disposicion de los componentes, asf como su aspecto general, en terminos de suavidad de lmeas, y de acabado exterior, y textura. El sistema 2000 comprende, ademas, uno o mas miembros de estabilizacion 2004. En la figura 2A se muestra una pata de estabilizacion, de las cuales varias estan normalmente presentes, ubicadas en diversas regiones del lado inferior del sistema 2000 para proporcionar equilibrio y soporte. Por ejemplo, puede haber tres, cuatro, cinco, seis, u ocho de dichas patas de estabilizacion. Las patas pueden estar moldeadas en y hechas del mismo material que la carcasa 2002, o pueden estar hechas de uno o mas materiales diferentes y unidas al lado inferior del sistema 2000. Por ejemplo, las patas pueden comprender un caucho que hace diffcil que el sistema 2000 se deslice sobre una superficie sobre la que esta situado, y tambien protege la superficie de rayones. El miembro o miembros de estabilizacion pueden asumir formas diferentes de patas, por ejemplo, rieles, correderas, o una o mas almohadillas.
El sistema 2000 comprende, ademas, una pantalla 2006, que puede ser una pantalla de cristal lfquido, tal como matriz activa, una OLEd, o alguna otra forma adecuada. Puede presentar imagenes y otra informacion en color o en blanco y negro. La pantalla 2006 tambien puede ser una pantalla sensible al tacto y, por lo tanto, puede estar configurada para aceptar entrada procedente de un usuario en respuesta a diversos apuntes visualizados. La pantalla 2006 puede tener un revestimiento antirreflectante sobre ella para reducir los brillos y los reflejos de luces
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elevadas en un entorno de laboratorio. La pantalla 2006 tambien puede estar iluminada a partir de, por ejemplo, una luz posterior, para facilitar un visionado mas facil en un laboratorio oscuro.
El sistema 2000, tal como se muestra en la figura 2A, tambien comprende una tapa movil 202, que tiene un asa 2008. La tapa 2010 puede deslizarse atras y adelante. En la figura 2A, la tapa esta en una posicion hacia delante, con lo que esta “cerrada”. En la figura 2B, la tapa se muestra en una posicion hacia atras, donde la tapa esta “abierta” y revela un compartimento de recepcion 2014 que esta configurado para recibir un cartucho microflmdico. Por supuesto, como apreciana un experto en la materia, la tecnologfa descrita en el presente documento no esta limitada a una tapa que se desliza, o una que se desliza atras y adelante. Tambien es posible el movimiento de lado a lado, como es una configuracion donde la tapa esta “abierta” cuando se situa hacia delante en el dispositivo. Tambien es posible que la tapa sea una tapa articulada, o una que es totalmente amovible.
El asa 2008 realiza un papel de permitir a un usuario mover la tapa 2010 desde una posicion a otra, y tambien realiza un papel de hacer que la presion sea empujada hacia abajo sobre la tapa, cuando esta en una posicion cerrada, de modo que pueda aplicarse presion a un cartucho en el compartimento de recepcion 2014. En la figura 2C, el asa 2008 se muestra en una posicion presionada hacia abajo, donde de este modo se aplica fuerza a la tapa 2014, y por lo tanto se aplica presion a un cartucho recibido en el compartimento de recepcion debajo de la tapa.
En una realizacion, el conjunto de asa y tapa tambien esta equipado con un sensor mecanico que no permite que el asa sea presionado hacia abajo cuando no hay ningun cartucho en el compartimento de recepcion. En otra realizacion, el conjunto de asa y tapa esta equipado con un pestillo mecanico que no permite que el asa se eleve cuando un analisis esta en curso.
Una configuracion adicional del sistema 2000 se muestra en la figura 2D, donde una puerta 2012 esta en una posicion abierta. La puerta 2012 se muestra en una posicion cerrada en las figuras. 2A-C. La puerta es un componente opcional que permite a un usuario acceder a un modulo calefactor 2020, y tambien una bandeja de entrada de medio legible por ordenador 2022. El sistema 2000 puede funcionar sin una puerta que cubra el modulo calefactor 2020 y la entrada del medio 2022, pero dicha puerta conlleva comodidad asociada a ella. Aunque la puerta 2012 se muestra articulada en la parte inferior, tambien puede estar articulada en uno de sus lados, o en su borde superior. La puerta 2012 puede ser, como alternativa, una cubierta amovible, en lugar de estar articulada. La puerta 2012, tambien puede estar situada en la parte posterior, o lateral del sistema 2000 por ejemplo, si se desea acceso al modulo calefactor y/o a la entrada del medio legible por ordenador en una cara diferente del sistema. Tambien es consecuente con el sistema en el presente documento que al modulo calefactor, y a la entrada del medio legible por ordenador, se acceda mediante puertas diferentes en el mismo o en diferentes lados del dispositivo, y donde dichas puertas diferentes puedan ser articuladas o amovibles independientemente.
El modulo calefactor 2020 es preferentemente amovible, y se describe adicionalmente a continuacion en el presente documento.
La entrada del medio legible por ordenador 2022 puede aceptar uno o mas de diversos medios. En la figura 2D se muestra una forma ejemplar de entrada 2022, una bandeja de CD-Rom para aceptar un CD, DVD, o mini-CD, o mini- DVD, en cualquiera de los formatos usados habitualmente legibles, legibles-escribibles y escribibles. Tambien es coherente con la descripcion en el presente documento una entrada que pueda aceptar otra forma de medio, tal como un disco flexible, memoria flash tal como lapiz de memoria, flash compacta, tarjeta inteligente de datos, o tarjeta segura de datos, una memoria extrafble portatil, unidad USB portatil, disco zip, y otros. Dicha entrada tambien puede estar configurada para aceptar varias formas diferentes de medios. Dicha entrada 2022 esta en comunicacion con un procesador (tal como se describe en relacion con la figura 1, aunque no mostrada en las figuras 2A-E), que puede leer datos a partir de un medio legible por ordenador cuando se inserta apropiadamente en la entrada.
La figura 2E muestra una vista en planta de una parte posterior del sistema 2000. Se muestran un orificio de ventilacion de aire 2024, para dejar escapar el excedente de calor durante un analisis. Normalmente, en el interior del sistema 2000, y mediante orificio de ventilacion de aire 2024 y no mostrado en la figura 2E, hay un ventilador. Otros puertos mostrados en la figura 2E son los siguientes: una toma de energfa 2026 para aceptar un cable de alimentacion que conectara el sistema 2000 a un suministro de electricidad; una conexion de Ethernet 2028 para enlazar el sistema 2000 a una red informatica tal como una red de area local; una conexion de toma telefonica 2032 para enlazar el sistema 2000 a una red de comunicacion tal como una red telefonica; uno o mas puertos USB 2030, para conectar el sistema 2000 a uno o mas dispositivos perifericos tales como una impresora, o una unidad de disco duro de un ordenador; un puerto de infrarrojos para comunicarse con, por ejemplo, un controlador remoto (no mostrado), para permitir a un usuario controlar el sistema sin usar una interfaz de pantalla tactil. Por ejemplo, un usuario podna enviar de forma remota ordenes de calendarizacion al sistema 2000 para hacer que comience un analisis en un momento espedfico en el futuro.
Caractensticas mostradas en la parte posterior del sistema 2000 pueden estar dispuestas de cualquier manera diferente, dependiendo de una configuracion interna de diversos componentes. Adicionalmente, caractensticas mostradas estando en la parte posterior del sistema 2000, pueden presentarse opcionalmente en otra cara del sistema 2000, dependiendo de la preferencia de diseno. En la figura 2E se muestran conexiones ejemplares. Se
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entendena que diversas caracteiisticas mas, incluyendo entradas, salidas, tomas y conexiones, pueden estar presentes en la cara posterior del sistema 2000, aunque no se muestran, o en otras caras del sistema 2000.
Una vista en despiece ordenado de una realizacion ejemplar del aparato se muestra en la figura 3, que muestra particularmente caractensticas internas del aparato 2000. El aparato 2000 puede comprender un medio legible por ordenador configurado con hardware/firmware que pueden emplearse para impulsar y monitorizar las operaciones en un cartucho usado con el, asf como software para interpretar, comunicar y almacenar los resultados de un analisis de diagnostico realizados en una muestra procesada en el cartucho. Con referencia a la figura 3, se muestran componentes tfpicos del aparato 2000 e incluyen, por ejemplo, componentes electronicos de control 2005, modulo calefactor/sensor amovible 2020, detector 2009 tal como un modulo de deteccion fluorescente, pantalla de visualizacion u opcionalmente pantalla e interfaz del usuario combinadas 2006 (por ejemplo, una pantalla cristal lfquido (LCD) sensible al tacto de calidad medica). En algunas realizaciones, la tapa 2010, el detector 2009, y el asa 2008 pueden denominarse colectivamente modulo deslizante 2007. Componentes adicionales del aparato 2000 pueden incluir uno o mas elementos de fijacion mecanicos tales como el marco 2019 para contener los diversos modulos (por ejemplo, el modulo calefactor/sensor 2020, y/o el modulo deslizante 2007) en alineamiento, y para proporcionar rigidez estructural. El modulo detector 2009 puede estar colocado en rieles para facilitar la apertura y la colocacion del cartucho 2060 en el aparato 2000, y para facilitar el alineamiento de los elementos opticos en el momento del cierre. El modulo calefactor/sensor 2020 tambien puede colocarse sobre rieles para retirada e insercion faciles del conjunto.
Realizaciones del aparato 2000 tambien incluyen software (por ejemplo, para establecer una interfaz con los usuarios, llevar a cabo analisis y/o analizar los resultados del analisis), firmware (por ejemplo, para controlar el hardware durante analisis en el cartucho 812), y una o mas interfaces de comunicacion con perifericos mostradas colectivamente como 2031 para perifericos (por ejemplo, puertos de comunicacion tales como USB/Serie/Ethernet para conectar a almacenamiento tal como disco compacto o disco duro, para conectar dispositivos de entrada tales como un lector de codigo de barras y/o un teclado, para conectar a otros ordenadores o almacenamiento mediante una red, y similares).
Los componentes electronicos de control 840, mostrados esquematicamente en el diagrama de bloques en la figura
4, pueden incluir una o mas funciones en diversas realizaciones, por ejemplo para, control principal 900, multiplexado 902, control de la pantalla 904, control del detector 906 y similares. La funcion de control principal puede servir como el nucleo de los componentes electronicos de control 840 en el aparato 2000 y puede gestionar la comunicacion y el control de las diversas funciones electronicas. La funcion de control principal tambien puede apoyar la interfaz electrica y de comunicaciones 908 con un usuario o un dispositivo de salida tal como una impresora 920, asf como funciones de diagnostico optico y seguridad. Junto con la funcion de control principal 900, la funcion multiplexora 902 puede controlar los datos del sensor 914 y la corriente de salida 916 para ayudar a controlar el modulo calefactor/sensor 2020. La funcion de control de la pantalla 904 puede controlar la salida a y, si es aplicable, interpretar la entrada desde la pantalla tactil LCD 846, que puede proporcionar, de este modo, una interfaz grafica para el usuario en ciertas realizaciones. La funcion del detector 906 puede implementarse en componentes electronicos de control 840 usando circuitos de control y procesamiento tfpicos para recopilar, digitalizar, filtrar y/o transmitir los datos a partir de un detector 2009 tal como uno o mas modulos de deteccion de fluorescencia.
En diversas realizaciones, el modulo de deteccion fluorescente 2009 puede ser un sistema de deteccion de fluorescencia altamente sensible miniaturizado que puede, por ejemplo, ser capaz de analisis en tiempo real de una serial fluorescente que surge de un cartucho microflmdico situado adecuadamente, tal como se muestra en la figura
5. El modulo de deteccion 2009 puede emplear una o mas fuentes de luz 2850 (por ejemplo, diodos emisores de luz (LED)), uno o mas detectores 2852 (por ejemplo, fotodiodos), y uno o mas filtros 2851 y/o lentes 2853. En algunas realizaciones, el modulo de deteccion 2009 puede contener multiples (por ejemplo, seis) elementos de deteccion, donde cada elemento puede detectar una o mas sondas fluorescentes.
En diversas realizaciones, el modulo deslizante 2007 del aparato 2000 puede alojar el modulo de deteccion 2009 (por ejemplo, sistema de deteccion optico) asf como conjunto mecanico/soporte de componentes opticos 856 para presionar hacia abajo sobre el cartucho microflmdico 2020 cuando el asa 2008 del modulo deslizante 2007 es presionado hacia abajo. Las figuras 6A y 6B representan la ubicacion, en diversas realizaciones, del cartucho microflmdico 2060 despues de la insercion en el aparato 2000. El soporte de componentes opticos 856 puede suspenderse desde la cubierta del modulo deslizante 2007 en uno o mas (por ejemplo, 4) puntos. En el momento del cierre del modulo deslizante 2007 y el giro del asa 2008 del aparato 2000 hacia abajo, uno o mas accionadores mecanicos 858 (por ejemplo, cuatro levas) pueden empujar hacia abajo la placa 860 contra uno o mas (por ejemplo, 4) resortes 862. En el momento de la compresion, los resortes 862 pueden suministrar fuerza sobre el modulo detector 2009. Una superficie inferior 864 del modulo detector 2009 puede aplanarse (por ejemplo, dentro de 250 micras, normalmente dentro de 100 micras, mas normalmente dentro de 25 micras), y la superficie 864 puede presionar sobre el cartucho 2060, que puede tener una capa flexible 868 (por ejemplo, dureza Shore de aproximadamente 50-70) con un grosor de 0,1-2,5 mm en ausencia de compresion, normalmente de aproximadamente 1,5 mm de grosor en ausencia de compresion. En consecuencia, la compresion del cartucho 2060, en combinacion con la superficie plana 864, puede hacer a la presion, y por lo tanto el contacto termico, mas o
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menos uniforme sobre el cartucho microflmdico 2060. Uno o mas resortes 862 en el modulo deslizante 2007 pueden suministrar una fuerza (por ejemplo, de 5 - 500 N, normalmente de aproximadamente 200 - 250 N) para generar una presion (por ejemplo, 2 psi) sobre la parte inferior del cartucho microflmdico 2060. La figura 6B tambien muestra que, cuando el modulo deslizante 2007 puede cerrarse, caractensticas mecanicas 863 del modulo deslizante 2007 pueden presionar hacia abajo sobre depositos autoperforantes 866 del cartucho microflmdico 2060, haciendo que el contenido del deposito (por ejemplo, agua DI, reactivos de PCR) se liberen.
Modulo calefactor amovible
Un modulo calefactor amovible ejemplar 2020 se muestra en la figura 7. El modulo esta configurado para suministrar calor localizado a diversas regiones seleccionadas de un cartucho recibido en el compartimento de recepcion 2014. En la figura 7 se muestra un modulo calefactor que tiene una superficie rebajada 2044 que proporciona una plataforma para soportar un cartucho cuando esta en el compartimento de recepcion 2014. En una realizacion, el cartucho descansa directamente sobre la superficie 2044. La superficie 2044 se muestra rebajada, en la figura 7, pero no es necesario que lo este.
El area 2044 esta configurada para aceptar un cartucho microflmdico en una unica orientacion. Por lo tanto, el area 2044 puede estar equipada con un miembro de colocacion correcta tal como una llave mecanica que impide a un usuario colocar un cartucho en el compartimento de recepcion 2014 en la configuracion erronea. En la figura 7 se muestra como llave mecanica ejemplar 2045 una esquina recortada diagonalmente del area 2044 en la que encaja una esquina recortada de forma complementaria de un cartucho microflmdico (vease, por ejemplo, la figura 9). Otros miembros de colocacion correcta son coherentes con el aparato descrito en el presente documento: por ejemplo, una caractenstica disenada en uno o mas bordes de un cartucho incluyendo aunque sin limitarse a: varias, tales como dos o mas, esquinas recortadas, una o mas muescas cortadas en uno o mas bordes del cartucho de la figura 9; o una o mas protuberancias fabricadas en uno o mas bordes del cartucho de la figura 9. Miembros de colocacion correcta alternativos incluyen uno o mas tetones o salientes disenados en un lado inferior de un cartucho, complementarios a una o mas tomas o agujeros rebajados en la superficie 2044. Miembros de colocacion correcta alternativos incluyen una o mas tomas o agujeros rebajados disenados en un lado inferior de un cartucho, complementarios a uno o mas tetones o salientes en la superficie 2044. En general, el patron de caractensticas es tal que el cartucho posee al menos un elemento de asimetna, de modo que solamente pueda insertarse en una unica orientacion en el compartimento de recepcion.
Tambien se muestra en la figura 7 un agarre manual 2042 que facilita la retirada y la insercion del modulo calefactor por un usuario. El recorte 2048 permite a un usuario retirar facilmente un cartucho del compartimento de recepcion 2014 despues de una serie de procesamiento donde, por ejemplo, al pulgar o al dedo de un usuario cuando se agarra la parte superior del cartucho, se le proporciona espacio comodo mediante el recorte 2048. Ambos recortes 2042 y 2048 se muestran como rebajes semicirculares en la realizacion de la figura 7, pero se entendena que no estan limitados de este modo en su forma. Por lo tanto, rebajes rectangulares, cuadrados, triangulares, ovales y de otra forma tambien son coherentes con un modulo calefactor tal como se describe en el presente documento.
En la realizacion de la figura 7, que esta disenada para ser compatible con el sistema de las figuras 2A-E, la parte frontal del modulo calefactor esta a la izquierda de la figura. En la parte posterior del modulo calefactor 2020 hay una conexion electrica 2050, tal como una conexion RS-232, que permite que senales electricas se dirijan a calefactores ubicados en regiones espedficas del area 2044 durante el procesamiento y analisis de muestras, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Por lo tanto, por debajo del area 2044 y no mostrada en la figura 7 puede estar una serie de fuentes de calor, tales como calefactores resistivos, que estan configurados para alinearse con ubicaciones especificadas de un cartucho microflmdico insertado apropiadamente en el compartimento de recepcion. La superficie 2044 es capaz de ser limpiada periodicamente para garantizar que cualesquiera derrames de lfquido que puedan producirse durante la manipulacion de muestras no causen ningun cortocircuito.
Otras caractensticas no esenciales del modulo calefactor 2020 son las siguientes. Uno o mas orificios de ventilacion de aire 2052 pueden estar situados en uno o mas lados (tales como parte frontal, parte posterior o flancos) o caras (tales como parte superior o parte inferior) del modulo calefactor 2020, para permitir que el exceso de calor escape, cuando los calefactores debajo de la compartimento de recepcion 2014, estan en funcionamiento. La configuracion de los orificios de ventilacion de aire en la figura 7 es ejemplar y se entendena que otros numeros y formas de los mismos son coherentes con la fabricacion y el uso rutinarios de un modulo calefactor. Por ejemplo, aunque se muestran 5 orificios de ventilacion de aire cuadrados, otros numeros tales como 1, 2, 3, 4, 6, 8 o 10 orificios de ventilacion de aire son posibles, dispuestos en un lado, o distribuidas en dos o mas lados y/o caras del modulo calefactor. En realizaciones adicionales, los orificios de ventilacion de aire pueden ser circulares, rectangulares, ovales, triangulares, poligonales y tener vertices curvos o cuadrados, u otras formas mas, incluyendo formas irregulares.
El modulo calefactor 2020 puede comprender, ademas, uno o mas miembros de guiado 2047 que facilitan la insercion del modulo calefactor en un aparato tal como se describe adicionalmente en el presente documento para una realizacion en la que el modulo calefactor 2020 es amovible por un usuario. El modulo calefactor es ventajosamente amovible, dado que permite que el sistema 2000 se reconfigure facilmente para un tipo de analisis
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diferente, tal como empleando un cartucho diferente con un miembro de colocacion correcta y/o red microflmdica diferente, junto con la misma o una secuencia diferente de operaciones de procesamiento. En otras realizaciones, el modulo calefactor 2020 esta disenado para estar fijado y ser amovible solamente, por ejemplo, para limpieza, sustitucion o mantenimiento, por el fabricante o un agente de mantenimiento autorizado, y no de forma rutinaria por el usuario. Los miembros de guiado pueden desempenar uno o mas papeles de garantizar que el modulo calefactor esta alineado correctamente en el aparato, y garantizar que el modulo calefactor establece un encaje estrecho y no se mueve significativamente durante el procesamiento y analisis de una muestra, o durante el transporte del aparato. Los miembros de guiado mostrados en la realizacion de la figura 7 estan en cualquier lado de compartimento de recepcion 2044 y se estiran a lo largo de una fraccion sustancial de la longitud del modulo 2020. Otros miembros de guiado son coherentes con el uso en el presente documento, e incluyen, aunque sin limitarse a, otros numeros de miembros de guiado tales como 1, 3, 4, 5, 6 u 8, y otras posiciones de los mismos, incluyendo situadas en el area 2051 del modulo 2020. Los miembros de guiado 2047 se muestran teniendo un grosor no constante a lo largo de sus longitudes. Es coherente en el presente documento que otros miembros de guiado puedan tener grosores esencialmente constantes a lo largo de sus longitudes.
Adyacente al compartimento de recepcion 2014 hay un elemento calefactor no de contacto 2046, tal como una lampara, instalada en un area rebajada 2053. El area rebajada 2053 tambien puede estar configurada con un reflector, o un revestimiento reflectante, de modo que tanta energfa termica y optica procedente del elemento calefactor no de contacto 2046 como sea posible se dirija hacia fuera, hacia el compartimento de recepcion 2014. El elemento 2046 es una lampara termica en ciertas realizaciones. El elemento 2046 esta configurado para recibir energfa electrica y, de este modo, calentarse a partir de los efectos de una resistencia electrica. El elemento 2046 proporciona una manera de calentar una region elevada de un cartucho recibido en el compartimento de recepcion 2014. La region elevada del cartucho (vease, por ejemplo, la figura 9) puede contener una camara de lisis, y la aplicacion de calor procedentes del elemento calefactor no de contacto 2046 puede tener el efecto de lisar celulas dentro de la camara de lisis.
En la figura 7 tambien se muestra una region optica del material fluorescente, tal como material opticamente fluorescente, 2049 en el area 2051 del modulo calefactor 2020. La region del material fluorescente esta configurada para ser detectada por un sistema de deteccion descrito adicionalmente en el presente documento. La region 2049 se usa para verificar el estado de los componentes opticos en el sistema de deteccion antes del procesamiento y el analisis de muestras y, por lo tanto, actua como un control, o un patron. Por ejemplo, en una realizacion una tapa del aparato (vease, por ejemplo, la figura 2A) cuando esta en una posicion abierta permite que la luz ambiente alcance la region 2049 y, de este modo, haga que el material fluorescente emita una frecuencia o espectro de luz caractenstico que pueda medirse por el detector para, por ejemplo, fines de estandarizacion o calibracion. En otra realizacion, en lugar de depender de la luz ambiente para hacer que el material fluorescente emita fluorescencia, se usa la fuente de luz del propio sistema de deteccion, tal como uno o mas LED. La region 2049 esta situada, por lo tanto, para alinearse con una posicion de un detector. La region 2049 se muestra como rectangular, pero puede estar configurada en otras formas tal como cuadrada, circular, elfptica, triangular, poligonal y teniendo vertices curvos o cuadrados. Se entendera, tambien, que la region 2049 puede estar situada en otros lugares en el modulo calefactor 2020, de acuerdo con la conveniencia y con el fin de ser complementaria al sistema de deteccion desplegado.
El modulo calefactor 2020 tambien comprende una serie de calefactores, situados debajo del area 2044 y no mostrados en la figura 7. Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, dichos calefactores pueden ser calefactores resistivos, configurados para calentar espedficamente y en momentos espedficos, de acuerdo con senales electricas recibidas.
En particular y no mostrado en la figura 7, el modulo calefactor/sensor 2020 puede incluir, por ejemplo, una funcion de multiplexado 902 en una placa de circuitos de multiplexado discreta (placa MUX), uno o mas calefactores (por ejemplo, un microcalefactor), uno o mas sensores de temperatura (opcionalmente combinados entre sf como una unica unidad calefactora/sensora con uno o mas microcalefactores respectivos, por ejemplo, como fabricados de forma fotolitografica en sustratos de sflice fundida), y un elemento calefactor no de contacto 2046. Los microcalefactores y el elemento calefactor no de contacto pueden proporcionar energfa termica que puede accionar diversos componentes microflmdicos en un cartucho microflmdico situado adecuadamente. Un sensor (por ejemplo, como un sensor de temperatura resistivo (RTD)) puede permitir monitorizacion en tiempo real de los microcalefactores y el uno o varios calefactores no de contacto 2046, por ejemplo a traves de un mecanismo basado en retroalimentacion para permitir el control de la temperatura. Uno o mas microcalefactores pueden alinearse con componentes microflmdicos correspondientes (por ejemplo, valvulas, bombas, compuertas, camaras de reaccion) a calentar en un cartucho microflmdico situado adecuadamente. Un microcalefactor puede estar disenado para ser ligeramente mas grande que el uno o varios componentes microflmdicos correspondientes en el cartucho microflmdico de modo que, incluso aunque el cartucho pueda estar ligeramente mal alineado, tal como descentrado, del calefactor, los componentes individuales puedan calentarse eficazmente.
El calefactor no de contacto 2046 tambien puede servir como fuente de calor por radiacion para calentar una seccion de un cartucho microflmdico situado adecuadamente. Por ejemplo, una lampara de xenon de 20 W puede usarse como elemento calefactor no de contacto 2046. En diversas realizaciones, el modulo calefactor/sensor 2020 puede
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ser espedfico de disenos de cartucho particulares y puede ser facilmente sustituible a traves del panel frontal del aparato 800. El modulo calefactor/sensor 2020 puede estar configurado para permitir la limpieza de la superficie de calentamiento 2044 con agentes de limpieza comunes (por ejemplo, una solucion de ^a al 10 %).
Con referencia a las figuras 8A y 8B, se muestra un conjunto de calefactores ejemplar configurado para calentar, dclicamente, la zona de reaccion de PCR 1001. Debe entenderse que configuraciones de calefactor para accionar otras regiones de un cartucho microflmdico tales como otras compuertas, valvulas y accionadores, pueden estar disenadas y desplegadas de acuerdo con principios similares a los que rigen los calefactores mostrados en las figuras 8A y 8B. Una zona de reaccion de PCR ejemplar 1001, normalmente una camara o canal que tiene un volumen ~1,6 |il, esta configurada con un lado largo y un lado corto, cada uno con un elemento calefactor asociado. Una zona de reaccion de PCR tambien puede denominarse como un reactor de PCR, en el presente documento. El aparato, por lo tanto, preferentemente incluye cuatro calefactores dispuestos a lo largo de los lados de, y configurados para calentar, una zona de reaccion de PCR dada, tal como se muestra en la realizacion ejemplar de la figura 8A: calefactor superior largo 1005, calefactor inferior largo 1003, calefactor izquierdo corto 1007, y calefactor derecho corto 1009. El espacio pequeno entre el calefactor superior largo 1005 y el calefactor inferior largo 1003 da como resultado un gradiente de temperatura despreciable (menos de 1 °C a traves de la anchura del canal de PCR en cualquier punto a lo largo de la longitud de la zona de reaccion de PCR) y por lo tanto una temperatura eficazmente uniforme por toda la zona de reaccion de PCR. Los calefactores en los bordes cortos del reactor de PCR proporciona calor para contrarrestar el gradiente creado por los dos calefactores largos desde el centro del reactor hasta el borde del reactor.
Sena entendido por un experto en la materia que aun otras configuraciones de uno o mas calefactores situados alrededor de una zona de reaccion de PCR son coherentes con los metodos y aparatos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un lado “largo” de la zona de reaccion puede estar configurado para ser calentado por dos o mas calefactores. Se usan orientaciones y configuraciones espedficas de calefactores para crear zonas de calentamiento uniformes incluso en sustratos que tienen mala conductividad termica debido a la mala conductividad termica del vidrio, o el cuarzo, o se utilizan sustratos de sflice fundida para ayudar al funcionamiento independiente de diversos componentes microflmdicos tales como valvulas y el funcionamiento independiente de los diversos carriles de PCR. Sena entendido, ademas, por un experto en la materia, que los principios que subyacen en la configuracion de calefactores alrededor de una zona de reaccion de PCR son aplicables de forma similar a la disposicion de calefactores adyacentes a otros componentes del cartucho microflmdico, tales como accionadores, valvulas y compuertas.
En ciertas realizaciones, cada calefactor tiene un sensor de temperatura asociado. En la realizacion de la figura 8A, se usa un unico sensor de temperatura 1011 para ambos calefactores largos. Un sensor de temperatura 1013 para el calefactor izquierdo corto, y un sensor de temperatura 1015 para el calefactor derecho corto tambien se muestran. El sensor de temperatura en el medio del reactor se usa para proporcionar retroalimentacion y controlar la cantidad de energfa suministrada a los dos calefactores largos, mientras que cada uno de los calefactores cortos tienen un sensor de temperatura dedicado colocado adyacente a el con el fin de controlarlo. Los sensores de temperatura estan configurados preferentemente para transmitir informacion acerca de la temperatura en sus inmediaciones al procesador en momentos tales que los calefactores no estan recibiendo corriente que hace que se calienten. Esto puede conseguirse con el control apropiado de los ciclos de corriente.
Con el fin de reducir el numero de elementos sensores o calefactores requeridos para controlar un calefactor de PCR, se pueden usar los calefactores para detectar asf como para calentar, y de este modo obviar la necesidad de tener un sensor dedicado diferente para cada calefactor. En otra realizacion, cada uno de los cuatro calefactores puede estar disenado para tener un vataje apropiado, y conectar los cuatro calefactores en serie o en paralelo para reducir el numero de elementos controlables electronicamente de 4 a solamente 1, reduciendo de este modo la carga sobre los circuitos electronicos asociados.
La figura 8B muestra vistas expandidas de calefactores y sensores de temperatura usados junto con una zona de reaccion de PCR de la figura 8A. Los sensores de temperatura 1001 y 1013 estan disenados para tener una resistencia a temperatura ambiente de aproximadamente 200-300 ohmios. Este valor de resistencia se determina controlando el grosor de la capa de metal depositada (por ejemplo, un sandwich de 400 A TiW / 3.000A Au / 400 A TiW), y grabando qmmicamente la lmea de metal de bobinado para tener una anchura de aproximadamente 10-25 |im y 20-40 mm de longitud. El uso de metal en este capa le da un coeficiente de resistividad de temperatura del orden de 0,5 - 20 °C/ohmios, preferentemente en el intervalo de 1,5 - 3 °C/ohmios. Medir la resistencia a temperaturas mas altas permite la determinacion de la temperatura exacta de la ubicacion de estos sensores.
La configuracion para calentamiento uniforme, mostrada en la figura 8A para una unica zona de reaccion de PCR, tambien puede aplicarse a un cartucho de PCR multicarril en el que se producen multiples reacciones de PCR independientes.
Cada calefactor puede estar controlado independientemente por un procesador y/o circuitos de control usados junto con el aparato descrito en el presente documento. La figura 8C muestra imagenes termicas, desde la superficie superior de un cartucho microflmdico cuando es calentado por calefactores configurados como en las figuras 8A y
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8B, cuando cada calefactor es activado, a su vez, de la siguiente manera: (A): superior largo solamente; (B) inferior largo solamente; (C) izquierdo corto solamente; (D) derecho corto solamente; y (E) los cuatro calefactores encendidos. El panel (F) muestra una vista de la zona de reaccion y los calefactores a la misma escala que los otros paneles de imagen en la figura 8C. En la figura tambien se muestra una barra de temperatura.
Cartucho microflu^dico
La figura 9 muestra una vista en perspectiva de un exterior de un cartucho microflmdico ejemplar 2060 para uso junto con el sistema descrito en el presente documento. Presente en el cartucho 2060 esta al menos un envase de reactivos 2062. Se muestran cuatro de dichos envases de reactivos, aunque otros numeros de dichos envases, tales como aunque sin limitarse a uno, dos, tres, cinco, seis, ocho, diez y doce, son posibles, dependiendo de la aplicacion. El cartucho 2060 comprende, ademas, una torre 2064 que contiene reactivos, y esta equipada con una entrada 2066, tal como un Luer, a traves de la cual puede introducirse una parte de una muestra biologica. La torre 2064 tambien puede comprender una o mas camaras tales como una camara de lisis a granel 2065 y una camara de residuos 2067. La camara de residuos 2067 puede tener un orificio de ventilacion 2069 para liberar gases tales como aire.
Aparte de la torre 2064, el cartucho 2060 es sustancialmente plano, de modo que pueda ser manipulado facilmente por un operador y pueda ser emparejado facilmente con un compartimento de recepcion complementaria de un aparato, tal como se muestra en la figura 1.
El cartucho 2060 comprende, ademas, un puerto 2068 a traves del cual un detector puede recibir una senal directa o indirectamente a partir de uno o mas polinucleotidos en la muestra, durante el procesamiento o la amplificacion, con el fin de proporcionar a un usuario un resultado de diagnostico sobre la muestra.
El cartucho 2060 puede comprender, ademas, un miembro de colocacion correcta tal como una llave mecanica, complementaria a un miembro de colocacion correcta correspondiente en el compartimento de recepcion. En la figura 9 se muestra un miembro de colocacion correcta ejemplar 2071, una esquina recortada del cartucho.
El sistema integrado, tal como se describe en el presente documento, comprende un aparato configurado para recibir un cartucho microflmdico, y un cartucho microflmdico. Este es coherente con el sistema descrito en el presente documento ya que una serie de diferentes configuraciones de cartucho microflmdico, y propositos del mismo, son compatibles con aparatos configurados adecuadamente. De este modo, por ejemplo, aunque se describen beneficios donde un unico cartucho es capaz de aceptar una muestra biologica recogida, preparar la muestra, incluyendo lisar celulas para liberar y recoger polinucleotidos contenidos en su interior, aplicar etapas preparatorias preamplificacion a los polinucleotidos, amplificar los polinucleotidos, y hacer que los polinucleotidos amplificados sean detectados, tambien es coherente con las descripciones en el presente documento que pueden usarse otros cartuchos microflmdicos. Dichos otros cartuchos pueden estar configurados para llevar a cabo menos, tales como una o mas, de las etapas mencionadas anteriormente y, de forma correspondiente, el aparato para uso con ellos esta configurado para hacer que se lleven a cabo menos de dichas etapas. Debe entenderse por lo tanto, que cuando se presentan diversas configuraciones ejemplares de cartucho microflmdico en el presente documento, los diversos componentes del mismo pueden usarse de forma intercambiable (por ejemplo, una valvula ejemplar descrita en relacion con un cartucho tambien puede usarse en una red descrita en relacion con otro cartucho) ambos sin modificacion, y con ajustes o modificaciones adecuadas de geometna o tamano, segun sea apropiado.
Aspectos de cartuchos microflu^dicos
Por consiguiente, la tecnologfa en el presente documento tambien comprende un cartucho microflmdico que tiene los siguientes atributos. Por lo tanto, la tecnologfa incluye un cartucho microflmdico que esta configurado para procesar uno o mas polinucleotidos, por ejemplo, para concentrar el uno o varios polinucleotidos y/o para separar el uno o varios polinucleotidos de compuestos inhibidores, (por ejemplo, hemoglobina, peptidos, compuestos fecales, acidos humicos, compuestos mucosales, protemas de union a ADN, o un sacarido) que podnan inhibir la deteccion y/o la amplificacion de los polinucleotidos.
El cartucho microflmdico puede estar configurado para poner en contacto los polinucleotidos y un compuesto relativamente inmovilizado que preferentemente se asocia con (por ejemplo, retiene) los polinucleotidos en oposicion a los inhibidores. Un compuesto ejemplar es una poliamida poli-cationica (por ejemplo, poli-L-lisina y/o poli-D-lisina), o polietilenimina (PEI), que puede unirse a una superficie (por ejemplo, superficies de una o mas partfculas). El compuesto retiene los polinucleotidos, de modo que los polinucleotidos y los inhibidores puedan separarse, tal como lavando la superficie a la que el compuesto y los polinucleotidos asociados estan unidos. En el momento de la separacion, la asociacion entre el polinucleotido y el compuesto puede alterarse para liberar (por ejemplo, separar) los polinucleotidos del compuesto y la superficie.
En algunas realizaciones, la superficie (por ejemplo, superficies de una o mas partfculas) puede modificarse con una sustancia policationica tal como una poliamida o PEI, que puede unirse covalentemente a la superficie. La poliamida policationica puede incluir al menos uno de poli-L-lisina y poli-D-lisina. En algunas realizaciones, la poliamida
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policationica (por ejemplo, la al menos una de la poli-L-lisina y la poli-D-lisina) tiene un peso molecular promedio de al menos aproximadamente 7500 Da. La poliamida policationica (por ejemplo, la al menos una de la poli-L-lisina y la poli-D-lisina) puede tener un peso molecular promedio de menos de aproximadamente 35.000 Da (por ejemplo, un peso molecular promedio de menos de aproximadamente 30.000 Da (por ejemplo, un peso molecular promedio de aproximadamente 25.000 Da)). La poliamida policationica (por ejemplo, la al menos una de la poli-L-lisina y la poli-D- lisina) puede tener una mediana de peso molecular de al menos aproximadamente 15.000 Da. La poliamida policationica (por ejemplo, la al menos una de la poli-L-lisina y la poli-D-lisina) puede tener una mediana de peso molecular de menos de aproximadamente 25.000 Da (por ejemplo, una mediana de peso molecular de menos de aproximadamente 20.000 Da (por ejemplo, una mediana de peso molecular de aproximadamente 20.000 Da). Si el material policationico es PEI, su peso molecular esta, preferentemente, en el intervalo de 600-800 Daltons.
En otras realizaciones, el cartucho microflmdico incluye una superficie que tiene una poliamida policationica o PEI unida a ella y un pasaje de introduccion de muestras en comunicacion con la superficie para poner en contacto la superficie con una muestra flmdica.
En algunas realizaciones, el aparato incluye una fuente de calor configurada para calentar un lfquido acuoso en contacto con la superficie a al menos aproximadamente 65 °C.
En algunas realizaciones, el cartucho incluye un deposito de lfquido que tiene un pH de al menos aproximadamente 10 (por ejemplo, aproximadamente 10,5 o mas). El cartucho puede estar configurado para poner en contacto la superficie con el lfquido (por ejemplo, accionando una fuente de presion para mover el lfquido).
Otro aspecto del cartucho microflmdico se refiere a un miembro de retencion, por ejemplo, una pluralidad de partfculas tales como perlas, que comprenden PEI, o poli-lisina unida, por ejemplo, poli-L-lisina, y metodos y sistemas relacionados. Un metodo ejemplar para procesar una muestra incluye poner en contacto un miembro de retencion con una mezcla que incluye proporcionar una mezcla que incluye un lfquido y una cantidad de polinucleotido. El miembro de retencion puede estar configurado para retener, preferentemente, polinucleotidos en comparacion con el inhibidor de la reaccion en cadena de la polimerasas. Sustancialmente todo el lfquido en la mezcla puede retirarse del miembro de retencion. Los polinucleotidos pueden liberarse del miembro de retencion. El polinucleotido puede tener un tamano de menos de aproximadamente 7,5 Mpb.
El lfquido puede ser un primer lfquido, y retirar sustancialmente todo el lfquido del miembro de retencion puede incluir poner en contacto el miembro de retencion con un segundo lfquido.
Poner en contacto el miembro de retencion con un segundo lfquido puede incluir accionar una fuente de presion accionada termicamente para aplicar una presion al segundo lfquido. Poner en contacto el miembro de retencion con un segundo lfquido puede incluir abrir una valvula accionada termicamente para colocar el segundo lfquido en comunicacion fluida con el miembro de retencion.
El segundo lfquido puede tener un volumen de menos de aproximadamente 50 microlitros, y puede incluir un detergente (por ejemplo, SDS).
El miembro de retencion puede incluir una superficie que tiene un compuesto configurado para unir polinucleotidos, preferentemente, a inhibidores de la reaccion en cadena de la polimerasa (dichos inhibidores incluyendo, por ejemplo, hemoglobina, peptidos, compuestos fecales, acidos humicos, compuestos mucosales, protemas de union a ADN o un sacarido).
La superficie puede incluir una poli-lisina (por ejemplo, poli-L-lisina y/o poli-D-lisina) o PEI.
Liberar polinucleotidos del miembro de retencion puede incluir calentar el miembro de retencion a una temperatura de al menos aproximadamente 50 °C (por ejemplo, a aproximadamente 65 °C). La temperatura puede ser insuficiente para hervir el lfquido en presencia del miembro de retencion durante el calentamiento. La temperatura puede ser de 100 °C o menos (por ejemplo, menos de 100 °C, aproximadamente 97 °C o menos). La temperatura puede mantenerse durante menos de aproximadamente 10 minutos (por ejemplo, durante menos de aproximadamente 5 minutos, durante menos de aproximadamente 3 minutos). La liberacion puede realizarse sin centrifugado del miembro de retencion.
En ciertas realizaciones, los inhibidores de PCR pueden retirarse rapidamente de muestras clmicas para crear una muestra lista para PCR. Los metodos en el presente documento pueden comprender, por lo tanto, la preparacion de una muestra que contiene polinucleotidos que pueden estar sustancialmente libres de inhibidores. Dichas muestras pueden prepararse a partir de, por ejemplo, lisados impuros que resultan de tecnicas de lisado termicas, qmmicas, ultrasonicas, mecanicas, electrostaticas y otras. Las muestras pueden prepararse sin centrifugado. Las muestras pueden prepararse usando otros dispositivos microflmdicos o a mayor escala.
El miembro de retencion puede usarse para preparar muestras de polinucleotidos para procesamiento adicional, tal como amplificacion mediante reaccion en cadena de la polimerasa. En ciertas realizaciones, mas del 90 % de un
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polinucleotido presente en una muestra puede unirse al miembro de retencion, liberarse y recuperarse.
En ciertas realizaciones, un polinucleotido puede unirse al miembro de retencion, liberarse y recuperarse, en menos de aproximadamente 10 minutos (por ejemplo, menos de aproximadamente 7^ minutos, menos de aproximadamente 5 minutos, o menos de aproximadamente 3 minutos).
Un polinucleotido puede unirse a un miembro de retencion, liberarse y recuperarse sin someter al polinucleotido, miembro de retencion y/o inhibidores a centrifugado.
Separar los polinucleotidos e inhibidores generalmente excluye someter a los polinucleotidos, inhibidores, region de procesamiento, y/o miembro de retencion a sedimentacion (por ejemplo, centrifugado).
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir una mezcla de reactivos de PCR que comprende una enzima polimerasa y una pluralidad de nucleotidos. La mezcla de reactivos de PCR puede estar en forma de uno o mas microgranulos liofilizados, y la red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto el microgranulo de PCR con lfquido para crear una solucion de mezcla de reactivos de PCR.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede estar configurado para acoplar calor procedente de una fuente de calor externa con la mezcla de reactivos de PCR y la muestra con polinucleotidos neutralizados en condiciones de ciclado termico adecuada para crear amplicones de PCR a partir de la muestra con polinucleotidos neutralizados.
En diversas realizaciones, la mezcla de reactivos de PCR puede incluir, ademas, un plasmido de control positivo y una sonda de hibridacion fluorogena selectiva para al menos una parte del plasmido.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir un polinucleotido de control negativo, donde la red microflmdica puede estar configurada para poner en contacto independientemente cada uno de la muestra con polinucleotidos neutralizados y el polinucleotido de control negativo con la mezcla de reactivos de PCR en condiciones de ciclado termico adecuadas para crear independientemente amplicones de PCR de la muestra con polinucleotidos neutralizados y amplicones de PCR del polinucleotido de control negativo.
En diversas realizaciones, el cartucho microflmdico puede incluir al menos una sonda que puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos, donde el cartucho microflmdico puede estar configurado para poner en contacto la muestra con polinucleotidos neutralizados o un amplicon de PCR de la misma con la sonda. La sonda puede ser una sonda de hibridacion fluorogena. La sonda de hibridacion fluorogena puede incluir una secuencia de polinucleotidos acoplada a un colorante informador fluorescente y un colorante extintor de fluorescencia. La mezcla de reactivos de PCR puede incluir, ademas, un plasmido de control positivo y una sonda de hibridacion fluorogena de plasmido selectiva para al menos una parte del plasmido y el cartucho microflmdico puede estar configurado para permitir la deteccion optica independiente de la sonda de hibridacion fluorogena y la sonda de hibridacion fluorogena de plasmido.
En diversas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos que puede ser caractenstica de un organismo, por ejemplo cualquier organismo que emplee polinucleotidos de acido desoxirribonucleico o acido ribonucleico. Por lo tanto, la sonda puede ser selectiva para cualquier organismo. Los organismos adecuados incluyen marnfferos (incluyendo seres humanos), aves, reptiles, anfibios, peces, animales domesticos, animales de granja, animales salvajes, organismos extintos, bacterias, hongos, virus, plantas, y similares. La sonda tambien puede ser selectiva para componentes de organismos que emplean sus propios polinucleotidos, por ejemplo mitocondrias. En algunas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para microorganismos, por ejemplo, organismos usados en la produccion de alimentos (por ejemplo, levaduras empleadas en productos fermentados, mohos o bacterias empleadas en quesos, y similares) o patogenos (por ejemplo, de seres humanos, mairnferos domesticos o salvajes, aves domesticas o salvajes, y similares). En algunas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para organismos seleccionados entre el grupo que consiste en bacterias gram positivas, bacterias gram negativas, levaduras, hongos, protozoos y virus.
En diversas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos que puede ser caractenstica de un organismo seleccionado entre el grupo que consiste en Staphylococcus spp., por ejemplo, S. epidermidis, S. aureus, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Staphylococcus resistente a vancomicina; Streptococcus (por ejemplo, a, p o y-hemolfticos, Grupo A, B, C, D o G) tales como S. pyogenes, S. agalactiae; E. faecalis, E. durans, y E. faecium (anteriormente S. faecalis, S. durans, S. faecium); estreptococos del grupo D no enterococicos, por ejemplo, S. bovis y S. equines; Streptococci viridans, por ejemplo, S. mutans, S. sanguis, S. salivarius, S. mitior, A. milleri, S. constellatus, S. intermedius y S. anginosus; S. iniae; S. pneumoniae; Neisseria, por ejemplo, N. meningitides, N. gonorrhoeae, Neisseria sp saprolttica; Erysipelothrix, por ejemplo, E. rhusiopathiae; Listeria spp., por ejemplo, L. monocytogenes, raramente L. ivanovii y L. seeligeri; Bacillus, por ejemplo, B. anthracis, B. cereus, B. subtilis, B. subtilus niger, B. thuringiensis; Nocardia asteroids; Legionella, por ejemplo, L. pneumonophilia, Pneumocystis, por ejemplo, P. carinii; Enterobacteriaceae tales como Salmonella, Shigella, Escherichia (por ejemplo, E. coli, E. coliOl57:H7); Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morganella,
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Providencia, Yersinia, y similares, por ejemplo, Salmonella, por ejemplo, S. typhi S. paratyphi A, B (S. schottmuelleri), y C (S. hirschfeldii), S. dublin S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. heidelberg, S. newport, S. infantis, S. agona, S. montevideo, y S. saint-paul; Shigella, por ejemplo, subgrupos: A, B, C y D, tal como S. flexneri, S. sonnei, S. boydii, S. dysenteriae; Proteus (P. mirabilis, P. vulgaris y P. myxofaciens), Morganella (M. morganii); Providencia (P. rettgeri, P. alcalifaciens y P. stuartii); Yersinia, por ejemplo, Y. pestis, Y. enterocolitica, Haemophilus, por ejemplo, H. influenzae, H. parainfluenzae H. aphrophilus, H. ducreyi; Brucella, por ejemplo, B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis; Francisella, por ejemplo, F. tularensis; Pseudomonas, por ejemplo, P. aeruginosa, P. paucimobilis, P. putida, P. fluorescens, P. acidovorans, Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei, Burkholderia mallei, Burkholderia cepacia y Stenotrophomonas maltophilia; Campylobacter, por ejemplo, C. fetus fetus, C. jejuni, C. pylori (Helicobacter pylori); Vibrio, por ejemplo, V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. alginolyticus, V. hollisae, V. vulnificus, y los vibrios no aglutinables; Clostridia, por ejemplo, C. penfringens, C. tetani, C. difficile, C. botulinum; Actinomyces, por ejemplo, A. israelii; Bacteroides, por ejemplo, B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. distasonis, B. vulgatus, B. ovatus, B. caccae y B. merdae; Prevotella, por ejemplo, P. melaninogenica; genero Fusobacterium; Treponema, por ejemplo T. pallidum subespecie endemicum, T. pallidum subespecie pertenue, T. carateum y T. pallidum subespecie pallidum; genero Borrelia, por ejemplo, B burgdorferi; genero Leptospira; Streptobacillus, por ejemplo, S. moniliformis; Spirillum, por ejemplo, S. minus; Mycobacterium, por ejemplo, M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. avium M. intracellulare, M. kansasii, M. xenopi, M. marinum, M. ulcerans, el complejo M. fortuitum (M. fortuitum y M. chelonei), M. leprae, M. asiaticum, M. chelonei subesp. abscessus, M. fallax, M. fortuitum, M. malmoense, M. shimoidei, M. simiae, M. szulgai, M. xenopi; Mycoplasma, por ejemplo, M. hominis, M. orale, M. salivarium, M. fermentans, M. pneumoniae, M. bovis, M. tuberculosis, M. avium, M. leprae; Mycoplasma, por ejemplo, M. genitalium; Ureaplasma, por ejemplo, U. urealyticum; Trichomonas, por ejemplo, T. vaginalis; Cryptococcus, por ejemplo, C. neoformans; Histoplasma, por ejemplo, H. capsulatum; Candida, por ejemplo, C. albicans; Aspergillus sp; Coccidioides, por ejemplo, C. immitis; Blastomyces, por ejemplo B. dermatitidis; Paracoccidioides, por ejemplo, P. brasiliensis; Penicillium, por ejemplo, P. marneffei; Sporothrix, por ejemplo, S. schenckii; Rhizopus, Rhizomucor, Absidia y Basidiobolus; enfermedades causadas por Bipolaris, Cladophialophora, Cladosporium, Drechslera, Exophiala, Fonsecaea, Phialophora, Xylohypha, Ochroconis, Rhinocladiella, Scolecobasidium y Wangiella; Trichosporon, por ejemplo, T. beigelii; Blastoschizomyces, por ejemplo, B. capitatus; Plasmodium, por ejemplo, P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae; Babesia sp; protozoos del genero Trypanosoma, por ejemplo, T. cruzi; Leishmania, por ejemplo, L. donovani, L. major L. tropica, L. mexicana, L. braziliensis, L. viannia braziliensis; Toxoplasma, por ejemplo, T. gondii; Amebas de los generos Naegleria o Acanthamoeba; Entamoeba histolytica; Giardia lamblia; genero Cryptosporidium, por ejemplo, C. parvum; Isospora belli; Cyclospora cayetanensis; Ascaris lumbricoides; Trichuris trichiura; Ancylostoma duodenale o Necator americanus; Strongyloides stercoralis Toxocara, por ejemplo, T. canis, T. cati; Baylisascaris, por ejemplo, B. procyonis; Trichinella, por ejemplo, T. spiralis; Dracunculus, por ejemplo, D. medinensis; genero Filarioidea; Wuchereria bancrofti; Brugia, por ejemplo, B. malayi, o B. timori; Onchocerca volvulus; Loa loa; Dirofilaria immitis; genero Schistosoma, por ejemplo, S. japonicum, S. mansoni, S. mekongi, S. intercalatum, S. haematobium; Paragonimus, por ejemplo, P. Westermani, P. Skriabini; Clonorchis sinensis; Fasciola hepatica; Opisthorchis sp; Fasciolopsis buski; Diphyllobothrium latum; Taenia, por ejemplo, T. saginata, T. solium; Echinococcus, por ejemplo, E. granulosus, E. multilocularis; Picornavirus, rinovirus ecovirus, coxsackievirus, virus de la gripe; paramixovirus, por ejemplo, tipos 1, 2, 3 y 4; adnovirus; Herpesvirus, por ejemplo, VHS-1 y VHS-2; virus varicella-zoster; virus linfotrofico T humano (tipo I y tipo II); Arbovirus y Arenavirus; Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae; Flavivirus; Hantavirus; encefalitis vmcas (alfavirus por ejemplo, encefalitis equina venezolana, encefalitis equina oriental, encefalitis equina occidental); fiebres hemorragicas vmcas (filovirus, por ejemplo, Ebola, Marburg, y arenavirus, por ejemplo, Lassa, Machupo); Viruela (variola); retrovirus por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2; virus del papiloma humano (VPH) tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33 y 35.
En diversas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos que puede ser caractenstica de un organismo seleccionado entre el grupo que consiste en Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter Baumannii, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecium, enterococos resistentes a vancomicina (VRE), Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA), Streptococcus viridans, Listeria monocytogenes, Enterococcus spp., Streptococcus del Grupo B, Streptococcus del Grupo C, Streptococcus del Grupo G, Streptococcus del Grupo F, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Gardenerella vaginalis, Micrococcus sps., Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrahlis, Salmonella sps., Chlamydia trachomatis, Peptostreptococcus productus, Peptostreptococcus anaerobius, Lactobacillus fermentum, Eubacterium lentum, Candida glabrata, Candida albicans, Chlamydia spp., Camplobacter spp., Salmonella spp., viruela (variola major), Yersinia Pestis, Virus herpes simple I (VHS I), y Virus herpes simple II (VHS II).
En diversas realizaciones, la sonda puede ser selectiva para una secuencia de polinucleotidos que es caractenstica de Streptococcus del grupo B.
La tecnologfa en el presente documento tambien comprende un cartucho microflmdico que tiene un componente para inhibir el movimiento de fluido. El componente comprende un canal, una primera masa de una sustancia termicamente sensible (TRS por sus siglas en ingles) dispuesta en un primer lado del canal, una segunda masa de una TRS dispuesta en un segundo lado del canal opuesto al primer lado del canal, una fuente de presion de gas
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asociada con la primera masa de la TRS. El accionamiento de la fuente de presion de gas impulsa la primera masa del TRS al interior de la segunda masa de la TRS y obstruye el canal.
El cartucho microflmdico puede incluir una segunda fuente de presion de gas asociada con la segunda masa de la TRS. El accionamiento de la segunda fuente de presion de gas impulsa la segunda masa de TRS al interior de la primera masa de TRS. Al menos una (por ejemplo, ambas) de las primera y segunda masas de TRS puede ser una cera.
Otro aspecto del cartucho microflmdico incluye un componente para obstruir un canal de un cartucho microflmdico. Una masa de una TRS puede ser calentada e impulsada por el canal (por ejemplo, mediante presion de gas) al interior de una segunda masa de TRS. La segunda masa de TRS tambien puede ser impulsada (por ejemplo, mediante presion de gas) hacia la primera masa de TRS.
Otro aspecto del cartucho microflmdico es un accionador. El accionador incluye un canal, una camara conectada al canal, al menos un deposito de lfquido encapsulado dispuesto en la camara, y un gas que rodea al deposito dentro de la camara. Calentar la camara expande el deposito de lfquido encapsulado y presuriza el gas. Normalmente el lfquido tiene un punto de ebullicion de aproximadamente 90 °C o menos. El lfquido puede ser un hidrocarburo que tiene aproximadamente 10 atomos de carbono o menos. El lfquido puede estar encapsulado por un polfmero.
Un accionador puede incluir multiples depositos de lfquido encapsulado dispuestos en la camara. Los multiples depositos pueden estar dispersados dentro de un solido (por ejemplo, una cera). Los multiples depositos pueden estar dispuestos dentro de un recinto flexible (por ejemplo, un saco flexible).
Otro aspecto del cartucho microflmdico incluye presurizar un gas dentro de una camara del dispositivo para crear una presion del gas suficiente para mover un lfquido dentro de un canal del dispositivo microflmdico. Presurizar el gas normalmente expande al menos un deposito de lfquido encapsulado dispuesto dentro de la camara. Expandir el al menos un deposito puede incluir calentar la camara. Presurizar el gas puede incluir expandir multiples depositos de lfquido encapsulado.
Otro aspecto de un cartucho microflmdico para uso en el presente documento incluye combinar (por ejemplo, mezclar) primer y segundo volumenes de lfquido. El dispositivo incluye una masa de una sustancia sensible a la temperatura (TRS) que separa primer y segundo canales del dispositivo. El dispositivo puede estar configurado para mover un primer lfquido a lo largo del primer canal de modo que una parte (por ejemplo, una parte central) del primer lfquido pueda ser adyacente a la TRS, y para mover un segundo lfquido a lo largo del segundo canal de modo que una parte (por ejemplo, una parte central) del segundo lfquido pueda ser adyacente a la TRS. Una fuente de calor puede ser accionada para mover la TRS (por ejemplo, fundiendo, dispersando, fragmentando). Las partes centrales de los primer y segundo lfquidos normalmente se combinan sin ser separados por una interfaz gaseosa. Normalmente, solamente un subconjunto del primer lfquido y un subconjunto del segundo lfquido pueden combinarse. Los lfquidos se mezclan tras haberse movido a lo largo de un canal de mezcla. Los lfquidos, cuando estan combinados, deben moverse al menos longitudes de dos gotitas para conseguir una buena mezcla mediante interestratificacion y difusion transversal (perpendicular a la longitud del microcanal) sin tener que depender de la difusion longitudinal sola para la mezcla (vease, tambien, por ejemplo, “Mathematical modeling of drop mixing in 'a slit-type microchannel”, K Handique, y col., J. Micromech. Microeng., 11 548-554, (2001)). Moviendo la gota combinada la longitud de una gota, se hace que el lfquido en el medio de la gota que se aleja se mueva a la parte frontal de la gota delantera y a continuacion hacia la pared del canal. En el extremo posterior de la gota, el lfquido se mueve desde la pared hacia el centro de la gota. Este movimiento de la gota da como resultado interestratificacion entre los dos lfquidos. Interestratificacion adicional puede conseguirse repitiendo el metodo veces adicionales, tal como sobre longitudes de gota adicionales.
El cartucho microflmdico incluye, ademas, una partfcula de reactivo liofilizada. En algunas realizaciones, las partfculas liofilizadas incluyen multiples partfculas mas pequenas que tienen, cada una, una pluralidad de ligandos que preferentemente se asocian con polinucleotidos en comparacion con inhibidores de PCR. Las partfculas liofilizadas tambien pueden (o como alternativa) incluir reactivos de lisis (por ejemplo, enzimas) configurados para lisar celulas para liberar polinucleotidos. Las partfculas liofilizadas tambien pueden (o como alternativa) incluir enzimas (por ejemplo, proteasas) que degradan protemas.
Las celulas pueden lisarse combinando una solucion de las celulas, por ejemplo, en una gotita microflmdica, con las partfculas liofilizadas reconstituyendo de este modo las partfculas. Los reactivos de lisis reconstituidos lisan las celulas. Los polinucleotidos se asocian con ligandos de las partfculas mas pequenas. Durante la lisis, la solucion puede calentarse (por ejemplo, por radiacion usando una lampara tal como una lampara termica, o mediante una fuente de calor por contacto.
En algunas realizaciones, las partfculas liofilizadas incluyen reactivos (por ejemplo, cebadores, plasmidos de control, enzimas polimerasa) para realizar PCR.
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Otro aspecto del cartucho microflmdico incluye un deposito de Kquido capaz de contener un Ifquido (por ejemplo, un disolvente, un tampon, un reactivo, o combinaciones de los mismos). En general, el deposito puede tener una o mas de las siguientes caractensticas, tal como se describe adicionalmente en la publicacion de solicitud internacional n.° WO2006/079082.
El deposito pueden incluir una pared que puede ser manipulada (por ejemplo, presionada o hundida) para reducir un volumen dentro del deposito. Por ejemplo, el deposito puede incluir un miembro perforante (por ejemplo, un miembro similar a una aguja o puntiagudo o afilado de otro modo) que rompe otra parte del deposito (por ejemplo, una parte de la pared) para liberar lfquido. El miembro perforante puede ser interno al deposito, de modo que el miembro perforante rompa la pared desde una superficie interna del deposito (por ejemplo, la pared) hacia fuera.
En general, la pared resiste el paso de lfquido o vapor a su traves. En algunas realizaciones, la pared carece de capacidad de estiramiento. La pared puede ser flexible. La pared puede ser, por ejemplo, una capa metalica, por ejemplo, una capa de papel metalizado, un polfmero, o un laminado que incluye una combinacion de los mismos. La pared puede formarse mediante formacion al vado (por ejemplo, aplicando un vado y calor a una capa de material para estirar la capa contra una superficie de moldeo). La superficie de moldeo puede ser concava de modo que la pared pueda estar dotada de una superficie generalmente convexa.
Lfquidos ejemplares contenidos por el deposito incluyen agua y soluciones acuosas que incluyen una o mas sales (por ejemplo, cloruro de magnesio, cloruro sodico, tampon Tris, o una combinacion de los mismos). El deposito puede retener el lfquido (por ejemplo, sin evaporacion sustancial del mismo) durante un periodo de tiempo (por ejemplo, al menos 6 meses o al menos un ano). En algunas realizaciones, menos del 10 % (por ejemplo, menos de aproximadamente el 5 %) en peso del lfquido se evapora a lo largo de un ano.
El miembro perforante puede ser una parte integrante de una pared del deposito. Por ejemplo, el deposito puede incluir una pared que tiene una proyeccion interna, que puede estar en contacto con lfquido en el deposito. El deposito tambien incluye una segunda pared opuesta al miembro perforante. Durante el accionamiento, el miembro perforante puede ser impulsado a traves de la segunda pared (por ejemplo, de dentro hacia fuera) para liberar el ifquido.
En algunas realizaciones, una cantidad maxima de lfquido retenido por un deposito puede ser menos de aproximadamente 1 ml. Por ejemplo, un deposito puede contener aproximadamente 500 microlitros o menos (por ejemplo, 300 microlitros o menos). En general, un deposito contiene al menos aproximadamente 25 microlitros (por ejemplo, al menos aproximadamente 50 microlitros). El deposito puede introducir dentro aproximadamente el 10 % de la cantidad de lfquido pretendida (por ejemplo, 50 ± 5 |il).
El deposito puede suministrar una cantidad predeterminada de lfquido que puede estar sustancialmente libre de aire (por ejemplo, sustancialmente libre de gas). En el momento de la introduccion del lfquido, el lfquido sustancialmente libre de aire y/o de gas produce pocas o ninguna burbujas lo suficientemente grandes para obstruir el movimiento del lfquido dentro del dispositivo microflmdico. El uso de un miembro perforante interno al deposito puede mejorar una capacidad del deposito para suministrar lfquidos sustancialmente libres de aire y/o gas.
En algunas realizaciones, el deposito puede ser accionado para liberar lfquido presionando (por ejemplo, con el dedo o el pulgar de uno o mediante accionamiento por presion mecanica). La presion puede aplicarse directamente a una pared del deposito o a un embolo que tiene un miembro perforante. En diversas realizaciones, puede requerirse presion minima para accionar el deposito. Puede usarse un sistema automatizado para accionar (por ejemplo, presionar sobre) una pluralidad de depositos simultaneamente o en secuencia.
El accionamiento del deposito puede incluir impulsar un miembro perforante a traves de una pared del deposito. En algunas realizaciones, el deposito no incluye un miembro perforante. En su lugar, la presion interna generada dentro del deposito rompe una pared del deposito permitiendo que el lfquido entre en el dispositivo microflmdico.
Tras accionar un deposito para introducir lfquido en el dispositivo microflmdico, el lfquido generalmente no se extrae de vuelta al deposito. Por ejemplo, en el momento del accionamiento, el volumen del deposito puede disminuir a cierto mmimo pero en general no aumenta para extraer lfquido de vuelta al deposito. Por ejemplo, el deposito puede permanecer replegado tras el accionamiento. En dichas realizaciones, la pared flexible puede ser flexible pero carece de histeresis, elasticidad, o capacidad de estiramiento. Como alternativa o en combinacion, el deposito puede captar aire a partir de un orificio de ventilacion sin extraer nada del lfquido.
El deposito preserva la reactividad y la composicion de los reactivos en su interior (por ejemplo, los productos qmmicos dentro del deposito pueden mostrar poco o ningun cambio de reactividad durante 6 meses o un ano).
La pared flexible del deposito puede limitar o impedir la fuga de productos qmmicos a su traves. El deposito puede ensamblarse independientemente de un cartucho microflmdico y a continuacion fijarse al cartucho microflmdico.
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Cartucho microflmdico ejemplar para procesar polinucleotidos
Con referencia a la figura 10, una parte de un cartucho microflmdico ejemplar 200 adecuada para uso con el sistema descrito en el presente documento incluye primera, segunda y tercera capas 205, 207 y 209 que definen una red microflmdica 201 que tiene diversos componentes configurados para procesar una muestra que incluye uno o mas polinucleotidos a detectar. El cartucho 200 normalmente procesa la muestra, entre otros aspectos, incrementando la concentracion de un polinucleotido a determinar y/o reduciendo la concentracion de inhibidores con respecto a la concentracion de polinucleotido a determinar. Las diversas caractensticas del cartucho 200 pueden incorporarse en conjunto, o con una modificacion adecuada, en configuraciones alternativas de cartucho que llevan a cabo procesamiento de polinucleotidos junto con diversas otras operaciones.
Fabricacion del cartucho
El cartucho microflmdico 200 puede fabricarse segun se desee. Normalmente, las capas 205, 207, y 209 pueden estar formadas por un material polimerico. Los componentes de la red 201 pueden estar formados normalmente moldeando (por ejemplo, mediante moldeo por inyeccion) las capas 207, 209. La capa 205 puede ser normalmente un material polimerico flexible (por ejemplo, un laminado) que puede fijarse (por ejemplo, con adhesivo y/o termicamente) a la capa 207 para sellar los componentes de la red 201. Las capas 207 y 209 pueden fijarse entre sf usando adhesivo. Otros metodos de fabricacion de cartuchos adecuados para aplicacion en el presente documento pueden encontrarse descritos en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.° de serie 60/859.284, presentada el 14 de noviembre de 2006.
Red microflu^dica
Una disposicion ejemplar de componentes de la red 201 es la siguiente, tal como se describe adicionalmente en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2006/0166233.
La red 201 incluye una entrada 202 mediante la cual material de muestra puede ser introducido en la red y una salida 236 mediante la cual puede retirarse una muestra procesada (por ejemplo, expulsada por o extrafda de) la red 201. Un canal 204 se extiende entre la entrada 202 y una union 255. Una valvula 206 puede estar situada a lo largo del canal 204. Un canal del deposito 240 se extiende entre la union 255 y un accionador 244. Las compuertas 242 y 246 pueden estar situadas a lo largo del canal 240. Un canal 257 se extiende entre la union 255 y una union 259. Una valvula 208 puede estar situada a lo largo del canal 257. Un canal del deposito 246 se extiende entre la union 259 y un accionador 248. Compuertas 250 y 252 pueden estar situadas a lo largo del canal 246. Un canal 261 se extiende entre la union 259 y una union 263. Una valvula 210 y un orificio de ventilacion hidrofobo 212 pueden estar situados a lo largo del canal 261: Un canal 256 se extiende entre la union 263 y un accionador 254. Una compuerta 258 puede estar situada a lo largo del canal 256.
Un canal 214 se extiende entre la union 263 y una camara de procesamiento 220, que tiene una entrada 265 y una salida 267. Un canal 228 se extiende entre la salida de la camara de procesamiento 267 y un deposito de residuos 232. Una valvula 234 puede estar situada a lo largo del canal 228. Un canal 230 se extiende entre la salida de la camara de procesamiento 267 y la salida 236.
Componentes particulares de la red microflmdica 201 se describen ademas de la siguiente manera.
Camara de procesamiento
Con referencia tambien a la figura 11, la camara de procesamiento 220 incluye una pluralidad de partfculas (por ejemplo, perlas, microesferas) 218 configuradas para retener polinucleotidos de la muestra en un primer conjunto de condiciones (por ejemplo, una primera temperatura y/o un primer pH) y para liberar los polinucleotidos en un segundo conjunto de condiciones (por ejemplo, una segunda temperatura mas elevada y/o un segundo pH mas basico). Normalmente, los polinucleotidos pueden estar retenidos, preferentemente, en comparacion con inhibidores que pueden estar presentes en la muestra. Las partfculas 218 pueden estar configuradas como un miembro de retencion 216 (por ejemplo, una columna) a traves del cual debe pasar el material de muestra (por ejemplo, polinucleotidos) cuando se mueve entre la entrada 265 y la salida 267 de la region de procesamiento 220.
Un filtro 219 impide que las partfculas 218 pasen aguas abajo de la region de procesamiento 220. Un canal 287 conecta el filtro 219 con la salida 267. El filtro 219 tiene un area superficial dentro de la region de procesamiento 220 que puede ser mayor que el area de seccion transversal de la entrada 265. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la relacion del area superficial del filtro 219 dentro de la camara de procesamiento 220 respecto al area de seccion transversal de la entrada 265 (area de seccion transversal que es normalmente aproximadamente el mismo que el area de seccion transversal del canal 214) puede ser al menos aproximadamente 5 (por ejemplo, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30). En algunas realizaciones, el area superficial del filtro 219 dentro de la region de procesamiento 220 puede ser al menos aproximadamente 1 mm2 (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 mm2, al menos aproximadamente 3 mm2). En algunas realizaciones, el area de seccion transversal de la entrada 265 y/o el canal 214 puede ser aproximadamente 0,25 mm2 o menos (por
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ejemplo, aproximadamente 0,2 mm2 o menos, aproximadamente 0,15 mm2 o menos, aproximadamente 0,1 mm2 o menos). El area superficial mas grande presentada por el filtro 219 al material que fluye a traves de la camara de procesamiento 220 ayuda a impedir la coagulacion de la region de procesamiento mientras se evitan incrementos significativos del volumen de vados (descrito a continuacion en el presente documento) de la region de procesamiento.
Las partfculas 218 pueden modificarse con al menos un ligando que retiene polinucleotidos (por ejemplo, preferentemente en comparacion con inhibidores). Normalmente, los ligandos retienen polinucleotidos a partir de ifquidos que tiene un pH de aproximadamente 9,5 o menos (por ejemplo, aproximadamente 9,0 o menos, aproximadamente 8,75 o menos, aproximadamente 8,5 o menos). A medida que una solucion de muestra se mueve a traves de la camara de procesamiento 220, los polinucleotidos pueden estar retenidos mientras el lfquido y otros componentes de la solucion (por ejemplo, inhibidores) pueden estar menos retenidos (por ejemplo, no retenidos) y salir de la region de procesamiento. En general, los ligandos liberan polinucleotidos cuando el pH puede ser de aproximadamente 10 o mayor (por ejemplo, aproximadamente 10,5 o mayor, aproximadamente 11,0 o mayor). En consecuencia, los polinucleotidos pueden liberarse de las partfculas modificadas con ligando al lfquido circundante.
Ligandos ejemplares en partfculas 218 incluyen, por ejemplo, poliamidas (por ejemplo, poliamida policationicas tales como poli-L-lisina, poli-D-lisina, poli-DL-ornitina) y PEl. Otros ligandos incluyen, por ejemplo, intercaladores, poli- intercaladores, poliaminas de union al surco menor (por ejemplo, espermidina), homopolfmeros y copolfmeros que comprenden una pluralidad de aminoacidos, y combinaciones de los mismos En algunas realizaciones, los ligandos tienen un peso molecular promedio de al menos aproximadamente 5.000 Da (por ejemplo, al menos aproximadamente 7.500 Da, de al menos aproximadamente 15.000 Da). En algunas realizaciones, los ligandos tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 50.000 Da o menos (por ejemplo, aproximadamente 35.000, o menos, aproximadamente 27.500 Da o menos). En algunas realizaciones, el ligando puede ser un ligando de polilisina unido a la superficie de la partfcula mediante un enlace amida.
En ciertas realizaciones, los ligandos en las partfculas 218 pueden ser resistentes a degradacion enzimatica, tal como degradacion por enzimas proteasas (por ejemplo, mezclas de endo- y exo-proteasas tales como pronasa) que escinden enlaces peptfdicos. Los ligandos resistentes a proteasa ejemplares incluyen, por ejemplo, poli-D-lisina y otros ligandos que pueden ser enantiomeros de ligandos susceptibles al ataque enzimatico.
Las partfculas 218 pueden estar formadas normalmente por un material al que pueden asociarse los ligandos. Materiales ejemplares a partir de los cuales pueden formarse las partfculas 218 incluyen materiales polimericos que pueden modificarse para unir un ligando. Los materiales polimericos tfpicos proporcionan o pueden modificarse para proporcionar grupos carboxflicos y/o grupos amino disponibles para unir ligandos. Los materiales polimericos ejemplares incluyen, por ejemplo, poliestireno, polfmeros de latex (por ejemplo, latex revestido de policarboxilato), poliacrilamida, oxido de polietileno, y derivados de los mismos. Los materiales polimericos que pueden usarse para formar partfculas 218 se describen en la patente de Estados Unidos N.° 6.235.313 de Mathiowitz y col. Otros materiales incluyen vidrio, sflice, agarosa, y materiales modificados con amino-propil-tri-etoxi-silano (APES).
Partfculas ejemplares que pueden modificarse con ligandos adecuados incluyen partfculas de carboxilato (por ejemplo, perlas magneticas modificadas con carboxilato (perlas magneticas modificadas con carboxilato Sera-Mag, N.° de parte 3008050250, Seradyn) y microesferas modificadas con carboxilato Polybead disponibles de Polyseience, n.° de catalogo 09850). En algunas realizaciones, los ligandos incluyen poli-D-lisina y las perlas comprenden un polfmero (por ejemplo, latex revestido de policarboxilato). En otras realizaciones, los ligandos incluyen PEI.
En general, la relacion de masa de partfculas con respecto a la masa de polinucleotidos retenidos por las partfculas puede ser no mayor de aproximadamente 25 o mas (por ejemplo, no mas de aproximadamente 20, no mas de aproximadamente 10). Por ejemplo, en algunas realizaciones, aproximadamente 1 gramo de partfculas retiene aproximadamente 100 miligramos de polinucleotidos.
Normalmente, el volumen total de la camara de procesamiento 220 (incluyendo partfculas 218) entre la entrada 265 y el filtro 219 puede ser de aproximadamente 15 microlitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 10 microlitros o menos, aproximadamente 5 microlitros o menos, aproximadamente 2,5 microlitros o menos, aproximadamente 2 microlitros o menos). En una realizacion ejemplar, el volumen total de la region de procesamiento 220 puede ser de aproximadamente 2,3 microlitros. En algunas realizaciones, las partfculas 218 ocupan al menos aproximadamente el 10 por ciento (por ejemplo, al menos aproximadamente el 15 por ciento) del volumen total de la region de procesamiento 220. En algunas realizaciones, las partfculas 218 ocupan aproximadamente el 75 por ciento o menos (por ejemplo, aproximadamente el 50 por ciento o menos, aproximadamente el 35 por ciento o menos) del volumen total de la camara de procesamiento 220.
En algunas realizaciones, el volumen de la camara de procesamiento 220 que puede estar libre para ser ocupado por lfquido (por ejemplo, el volumen de vados de la camara de procesamiento 220 que incluye intersticios entre las partfculas 218) puede ser aproximadamente igual al volumen total menos el volumen ocupado por las partfculas. Normalmente, el volumen de vados de la region de procesamiento 220 puede ser de aproximadamente 10
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microlitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 7,5 microlitros o menos, aproximadamente 5 microlitros o menos, aproximadamente 2,5 microlitros o menos, aproximadamente 2 microlitros o menos). En algunas realizaciones, el volumen de vados puede ser de aproximadamente 50 nanolitros o mas (por ejemplo, aproximadamente 100 nanolitros o mas, aproximadamente 250 nanolitros o mas). Por ejemplo, en una realizacion ejemplar, el volumen total de la camara de procesamiento 220 puede ser de aproximadamente 2,3 microlitros, el volumen ocupado por las partfculas puede ser de aproximadamente 0,3 microlitros, y el volumen libre a ocupar por lfquido (volumen de vados) puede ser de aproximadamente 2 microlitros.
Las partfculas 218 normalmente tienen un diametro promedio de aproximadamente 20 micras o menos (por ejemplo, aproximadamente 15 micras o menos, aproximadamente 10 micras o menos). En algunas realizaciones, las partfculas 218 tienen un diametro promedio de al menos aproximadamente 4 micras (por ejemplo, al menos aproximadamente 6 micras, al menos aproximadamente 8 micras).
En algunas realizaciones, un volumen del canal 287 entre el filtro 219 y la salida 267 puede ser sustancialmente mas pequeno que el volumen de vados de la camara de procesamiento 220. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el volumen del canal 287 entre el filtro 219 y la salida 267 puede ser aproximadamente el 35 % o menos (por ejemplo, aproximadamente el 25 % o menos, aproximadamente el 20 % o menos) del volumen de vados. En una realizacion ejemplar, el volumen del canal 287 entre el filtro 219 y la salida 267 puede ser de aproximadamente 500 nanolitros.
La densidad de partfculas puede ser normalmente al menos aproximadamente 108 partfculas por mililitro (por ejemplo, aproximadamente 109 partfculas por mililitro). Por ejemplo, una region de procesamiento con un volumen total de aproximadamente 1 microlitro puede incluir aproximadamente 103 perlas.
El filtro 219 normalmente tiene poros con un diametro mas pequeno que el diametro de las partfculas 218. En una realizacion ejemplar, el filtro 219 tiene poros que tienen una anchura promedio de aproximadamente 8 micras, donde las partfculas 218 tienen un diametro promedio de aproximadamente 10 micras.
En algunas realizaciones, al menos algunas (por ejemplo, todas) de las partfculas pueden ser magneticas. En realizaciones alternativas, pocas (por ejemplo, ninguna) de las partfculas son magneticas.
En algunas realizaciones, al menos algunas de (por ejemplo, todas) las partfculas pueden ser solidas. En algunas realizaciones, al menos algunas (por ejemplo, todas) las partfculas pueden ser porosas (por ejemplo, las partfculas pueden tener canales que se extienden al menos parcialmente dentro de ellas).
Componentes adicionales que pueden encontrarse en la red microflmdica 201 son los siguientes.
Canales
Los canales de la red microflmdica 201 normalmente tienen al menos una dimension de seccion transversal por debajo del milfmetro. Por ejemplo, los canales de la red 201 pueden tener una anchura y/o una profundidad de aproximadamente 1 mm o menos (por ejemplo, aproximadamente 750 micras o menos, aproximadamente 500 micras, o menos, aproximadamente 250 micras o menos).
Valvulas
Una valvula puede ser un componente que tiene un estado normalmente abierto que permite al material pasar a lo largo de un canal desde una posicion en un lado de la valvula (por ejemplo, aguas arriba de la valvula) hasta una posicion en el otro lado de la valvula (por ejemplo, aguas abajo de la valvula). En el momento del accionamiento, la valvula cambia a un estado cerrado que impide que el material pase a lo largo del canal desde un lado de la valvula al otro. Por ejemplo, en la figura 10, la valvula 206 incluye una masa 251 de una sustancia termicamente sensible (TRS) que puede ser relativamente inmovil a una primera temperatura y mas movil a una segunda temperatura (por ejemplo, un material de transicion de fase (PTM) de un punto de fusion conocido, normalmente aproximadamente 60 °C, o aproximadamente 75 °C, o aproximadamente 90 °C, tal como una cera de parafina, soldadura, etc.). Una camara 253 puede estar en comunicacion gaseosa con la masa 251. Tras calentar el gas (por ejemplo, aire) en la camara 253 y calentar la masa 251 de TRS a la segunda temperatura, la presion de gas dentro de la camara 253 mueve la masa 251 al interior del canal 204 obstruyendo el paso del material a lo largo del mismo. Otras valvulas de la red 201 tienen una estructura similar y funcionan de manera similar a la valvula 206.
Una masa de TRS puede ser una masa esencialmente solida o una aglomeracion de partfculas mas pequenas que cooperan para obstruir el paso. Ejemplos de TRS incluyen una aleacion eutectica (por ejemplo, una soldadura), cera (por ejemplo, una olefina), polfmeros, plasticos, y combinaciones de los mismos. Las primera y segunda temperaturas pueden ser insuficientemente elevadas para danar materiales, tales como capas de polfmero del cartucho 200. Generalmente, la segunda temperatura puede ser menos de aproximadamente 90 °C y la primera temperatura puede ser menor que la segunda temperatura (por ejemplo, aproximadamente 70 °C o menos).
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Una compuerta puede ser un componente que puede tener un estado cerrado que no permite que el material pase a lo largo de un canal desde una posicion en un lado de la compuerta a otro lado de la compuerta, y un estado abierto que permite que el material pase a lo largo de un canal desde una posicion en un lado de la compuerta a otro lado de la compuerta. El accionamiento de una compuerta abierta puede hacer cambiar a la compuerta a un estado cerrado en el que no se permite pasar al material desde un lado de la compuerta (por ejemplo, aguas arriba de la compuerta) al otro lado de la compuerta (por ejemplo, aguas abajo de la compuerta). Tras el accionamiento, una compuerta cerrada puede cambiar a un estado abierto en el que se permite al material pasar de un lado de la compuerta (por ejemplo, aguas arriba de la compuerta) al otro lado de la compuerta (por ejemplo, aguas abajo de la compuerta). Por ejemplo, la compuerta 242 en la figura 10 incluye una masa 271 de TRS situada para obstruir el paso de material entre la union 255 y el canal 240. Tras calentar la masa 271 a una segunda temperatura, la masa cambia de estado (por ejemplo, mediante fusion, mediante dispersion, mediante fragmentacion y/o disolucion) para permitir el paso de material entre la union 255 y el canal 240.
En diversas realizaciones, una red microflmdica 201 puede incluir una compuerta estrecha 380 tal como se muestra en la figura 12A donde un canal de carga de compuerta 382 usado para cargar cera desde un agujero de carga de cera 384 hasta una union de compuerta 386 puede ser mas estrecho (por ejemplo, aproximadamente 150 |im de ancho y 100 micras de profundidad). Un canal aguas arriba 388 asf como un canal aguas abajo 390 de la union de compuerta 386 pueden hacerse anchos (por ejemplo, ~500 |im) y profundos (por ejemplo, ~500 |im) para ayudar a garantizar que la cera se detienen en la union de compuerta 386. La cantidad de material de compuerta fundido y movido fuera de la union de compuerta 386 puede minimizarse para apertura optima de la compuerta 380. Dado que puede usarse un calefactor externo al cartucho para fundir la sustancia termicamente sensible en la compuerta 380, un alineamiento erroneo del calefactor podna hacer que la cera en el canal de carga de compuerta 382 se funda tambien. Por lo tanto, estrechar la dimension del canal de carga puede incrementar la fiabilidad de la apertura de compuerta. En el caso de cantidades excesivas de cera fundida en la union de compuerta 386 y el canal de carga de compuerta 382, el area de seccion transversal incrementada del canal aguas abajo 390 adyacente a la union de compuerta 386 puede impedir que la cera atasque el canal aguas abajo 390 durante la apertura de la compuerta 380. Las dimensiones del canal aguas arriba 388 en la union de compuerta 386 pueden hacerse similares al canal aguas abajo 390 para garantizar la correcta carga de cera durante la fabricacion de la compuerta.
En diversas realizaciones, la compuerta puede estar configurada para minimizar el area efectiva o espacio ocupado por la compuerta dentro de la red, tal como la compuerta doblada 392 tal como se muestra en la figura 12B. Minimizar el area efectiva o espacio ocupado por la compuerta dentro de la red puede incrementar la densidad de una red microflmdica dada y puede reducir, de este modo, el coste por parte, proporcionar una red mas compacta, minimizar la longitud o el volumen de canales de la red, o similares. Otras configuraciones mas son posibles, aunque no se muestran explfcitamente en los dibujos, de acuerdo con disposiciones espedficas de la red microflmdica.
En el cartucho microflmdico de la figura 10, la parte de canal 240 entre las compuertas 242 y 246 forma un deposito de fluido 279 configurado para contener un lfquido (por ejemplo, agua, un lfquido organico, o combinacion de los mismos). Durante el almacenamiento, las compuertas 242 y 246 limitan (por ejemplo, impiden) la evaporacion de lfquido dentro del deposito de fluido. Durante el funcionamiento del cartucho 200, el lfquido del deposito 279 puede usarse normalmente como lfquido de lavado para retirar inhibidores de la region de procesamiento 220 mientras se dejan polinucleotidos asociados con partfculas 218 (figura 11). Normalmente, el lfquido de lavado puede ser una solucion que tiene uno o mas componentes adicionales (por ejemplo, un tampon, quelante, tensioactivo, un detergente, una base, un acido, o una combinacion de los mismos). Soluciones ejemplares incluyen, por ejemplo, una solucion de Tris 10-50 mM a pH 8,0, EDTA 0,5-2 mM, y SDS al 0,5 % - 2 %, una solucion de Tris 10-50 mM a pH 8,0, EDTA de 0,5 a 2 mM, y Triton X-100 al 0,5 % - 2 %.
La parte de canal 247 entre las compuertas 250 y 252 forma un deposito de fluido 281 configurado como el deposito 279 para contener un lfquido (por ejemplo, una solucion) con evaporacion limitada o ninguna. Durante el funcionamiento del cartucho 200, el lfquido del deposito 281 puede usarse normalmente como lfquido de liberacion en el que polinucleotidos que habfan sido retenidos por las partfculas 218 pueden liberarse. Un lfquido de liberacion ejemplar puede ser una solucion de hidroxido (por ejemplo, una solucion de NaOH) que tiene una concentracion de, por ejemplo, entre aproximadamente 2 mM hidroxido (por ejemplo, NaOH aproximadamente 2 mM) e hidroxido aproximadamente 500 mM (por ejemplo, NaOH aproximadamente 500 mM). En algunas realizaciones, el lfquido en el deposito 281 pueden ser una solucion de hidroxido que tiene una concentracion de aproximadamente 25 mM o menos (por ejemplo, una concentracion de hidroxido de aproximadamente 15 mM).
Los depositos 279, 281 normalmente contienen, cada uno independientemente, al menos aproximadamente 0,375 microlitros de lfquido (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,750 microlitros, al menos aproximadamente 1,25 microlitros, al menos aproximadamente 2,5 microlitros). En algunas realizaciones, los depositos 279, 281 contienen, cada uno independientemente, aproximadamente 7,5 microlitros o menos de lfquido (por ejemplo, aproximadamente 5 microlitros o menos, aproximadamente 4 microlitros o menos, aproximadamente 3 microlitros o menos).
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Accionadores
Un accionador puede ser un componente que proporciona una presion de gas que puede mover material (por ejemplo, material de muestra y/o material de reactivo) entre una ubicacion en una red por ejemplo, la red 201, y otra ubicacion. Por ejemplo, con referencia a la figura 13, el accionador 244 incluye una camara 272 que tiene una masa 273 de material termicamente expansivo (TEM) en su interior. Cuando se calienta, el TEM se expande disminuyendo el volumen libre dentro de la camara 272 y presurizando el gas (por ejemplo, aire) que rodea a la masa 273 dentro de la camara 272. Normalmente, compuertas tales como las compuertas 246 y 242 en la red 201 pueden ser accionadas con el accionador 244. En consecuencia, el gas presurizado impulsa al lfquido en el deposito de fluido 279 hacia la union 255. En algunas realizaciones, el accionador 244 puede generar un diferencial de presion de mas de aproximadamente 3 psi (por ejemplo, al menos aproximadamente 4 psi, al menos aproximadamente 5 psi) entre el accionador y la union 255.
En una realizacion, mostrada en la figura 13, el TEM incluye una pluralidad de depositos de lfquido sellados (por ejemplo, esferas) 275 dispersadas dentro de un portador 277. Normalmente, el lfquido puede ser un lfquido con presion de vapor elevada (por ejemplo, isobutano y/o isopentano) sellando dentro de una cubierta (por ejemplo, una cubierta polimerica formada por monomeros tales como cloruro e vinilideno, acrilonitrilo y metacrilato de metilo). El portador 277 tiene propiedades (por ejemplo, flexibilidad y/o una capacidad de ablandarse (por ejemplo, fundirse) a temperaturas mas elevadas) que permiten la expansion de los depositos 275 sin permitir que los depositos pasen a lo largo del canal 240. En algunas realizaciones, el portador 277 puede ser una cera (por ejemplo, una olefina) o un polfmero con una temperatura de transicion vftrea adecuada. Normalmente, los depositos constituyen al menos aproximadamente el 25 por ciento en peso (por ejemplo, al menos aproximadamente 35 por ciento en peso, al menos aproximadamente 50 por ciento en peso) del TEM. En algunas realizaciones, los depositos constituyen aproximadamente el 75 por ciento en peso o menos (por ejemplo, aproximadamente el 65 por ciento en peso o menos, aproximadamente el 50 por ciento en peso o menos) del TEM. Depositos de lfquido sellados adecuados pueden obtenerse a partir de Expancel (disponible de Akzo Nobel).
Cuando el TEM puede calentarse (por ejemplo, a una temperatura de al menos aproximadamente 50 °C (por ejemplo, a al menos aproximadamente 75 °C, o al menos aproximadamente 90 °C)), el lfquido se vaporiza e incrementa el volumen de cada deposito sellado y de la masa 273. El portador 277 se ablanda permitiendo que la masa 273 se expanda. Normalmente, la TEM puede calentarse a una temperatura de menos de aproximadamente 150 °C (por ejemplo, aproximadamente 125 °Co menos, aproximadamente 110 °Co menos, aproximadamente 100 °C o menos) durante el accionamiento. En algunas realizaciones, el volumen del TEM se expande al menos aproximadamente 5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces).
Orificios de ventilacion
Un orificio de ventilacion hidrofobo (por ejemplo, el orificio de ventilacion 212) puede ser una estructura que permite que el gas salga de un canal mientras limita (por ejemplo, impide) que el lfquido salga del canal. Normalmente, los orificios de ventilacion hidrofobos incluyen una capa de material hidrofobo poroso (por ejemplo, un filtro poroso tal como una membrana hidrofoba porosa de Osmonics) que define una pared del canal. Tal como se describe a continuacion en el presente documento, los orificios de ventilacion hidrofobos pueden usarse para situar una microgotita de muestra en una ubicacion deseada dentro de la red 201.
Los orificios de ventilacion hidrofobos de la presente tecnologfa estan preferentemente construidos de modo que la cantidad de aire que escapa a traves de ellos pueda maximizarse mientras se minimiza el volumen del canal por debajo de la superficie del orificio de ventilacion. Por consiguiente, es preferible que el orificio de ventilacion pueda construirse para tener una membrana hidrofoba de gran area superficial y una seccion transversal poco profunda del microcanal debajo de la superficie del orificio de ventilacion.
Los orificios de ventilacion hidrofobos normalmente tienen una longitud de al menos aproximadamente 2,5 mm (por ejemplo, al menos aproximadamente 5 mm, al menos aproximadamente 7,5 mm) a lo largo de un canal. La longitud del orificio de ventilacion hidrofobo puede ser normalmente al menos aproximadamente 5 veces (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces) mayor que una profundidad del canal dentro del orificio de ventilacion hidrofobo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la profundidad del canal dentro del orificio de ventilacion hidrofobo puede ser de aproximadamente 300 micras o menos (por ejemplo, aproximadamente 250 micras o menos, aproximadamente 200 micras o menos, aproximadamente 150 micras o menos).
La profundidad del canal dentro del orificio de ventilacion hidrofobo puede ser normalmente de aproximadamente el 75 % o menos (por ejemplo, aproximadamente el 65 % o menos, aproximadamente el 60 % o menos) de la profundidad del canal aguas arriba y aguas abajo del orificio de ventilacion hidrofobo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la profundidad del canal dentro del orificio de ventilacion hidrofobo puede ser de aproximadamente 150 micras y la profundidad del canal aguas arriba y aguas abajo del orificio de ventilacion hidrofobo puede ser de aproximadamente 250 micras.
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Una anchura del canal dentro del orificio de ventilacion hidrofobo puede ser normalmente al menos aproximadamente el 25 % mas amplia (por ejemplo, al menos aproximadamente el 50 % mas amplia) que una anchura del canal aguas arriba del orificio de ventilacion y aguas abajo del orificio de ventilacion. Por ejemplo, en una realizacion ejemplar, la anchura del canal dentro del orificio de ventilacion hidrofobo puede ser de aproximadamente 400 micras y la anchura del canal aguas arriba y aguas abajo del orificio de ventilacion puede ser de aproximadamente 250 micras.
En uso, el cartucho 200 puede estar normalmente asociado termicamente con una serie de fuentes de calor configuradas para hacer funcionar diversos componentes (por ejemplo, valvulas, compuertas, accionadores, y region de procesamiento 220) del cartucho. En algunas realizaciones, las fuentes de calor pueden estar controladas por un procesador en un sistema tal como el descrito adicionalmente en el presente documento, que funciona para recibir y para monitorizar el cartucho durante el uso. El procesador (por ejemplo, un microprocesador) esta configurado para accionar las fuentes de calor individualmente y en momentos diferentes, de acuerdo con un protocolo deseado. Procesadores configurados para hacer funcionar cartuchos microflmdicos, adecuados para uso o para modificacion para uso en el presente documento, se describen en la solicitud de estados Unidos n.° 09/819.105, presentada el 28 de marzo de 2001 (ahora patente de Estados Unidos N.° 7.010.391). En otras realizaciones, las fuentes de calor pueden ser integrales con el propio cartucho.
Al cartucho 200 se le puede hacer funcionar de la siguiente manera. Las valvulas de la red 201 pueden fabricarse en un estado abierto. Las compuertas de la red 201 pueden fabricarse en un estado cerrado. Una muestra de fluido, tal como una muestra biologica tal como se describe adicionalmente en el presente documento, que comprende polinucleotidos puede introducirse en la red 201 mediante la entrada 202. Por ejemplo, la muestra puede introducirse con una jeringa que tiene un accesorio Luer. La jeringa proporciona presion para mover inicialmente la muestra dentro de la red 201. La muestra pasa a lo largo de canales 204, 257, 261 y 214 a la entrada 265 de la region de procesamiento 220. La muestra pasa a traves de la region de procesamiento 220, sale mediante la salida 267, y pasa a lo largo del canal 228 hasta la camara de residuos 232. Cuando el borde posterior (por ejemplo, la interfaz ifquido-gas aguas arriba) de la muestra alcanza el orificio de ventilacion hidrofobo 212, la presion proporcionada por el dispositivo de introduccion (por ejemplo, la jeringa) puede liberarse de la red 201 deteniendo el movimiento adicional de la muestra.
Normalmente, la cantidad de muestra introducida puede ser de aproximadamente 500 microlitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 250 microlitros o menos, aproximadamente 100 microlitros o menos, aproximadamente 50 microlitros o menos, aproximadamente 25 microlitros o menos, aproximadamente 10 microlitros o menos). En algunas realizaciones, la cantidad de muestra puede ser de aproximadamente 2 microlitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 0,5 microlitros o menos).
Los polinucleotidos que entran en la region de procesamiento 220 pasan a traves de intersticios entre las partfculas 218. Los polinucleotidos de la muestra contactan con el miembro de retencion 216 y pueden ser retenidos preferentemente en comparacion con lfquido de la muestra, y ciertos otros componentes de la muestra (por ejemplo, inhibidores). Normalmente, el miembro de retencion 220 retiene al menos aproximadamente el 50 % de polinucleotidos (por ejemplo, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %) de los polinucleotidos presentes en la muestra que entro en la region de procesamiento 220. El lfquido de la muestra e inhibidores presentes en la muestra salen de la region de procesamiento 220 mediante la salida 267 y entran en la camara de residuos 232. La region de procesamiento 220 puede estar normalmente a una temperatura de aproximadamente 50 °C o menos (por ejemplo, 30 °C o menos) durante la introduccion de la muestra.
El procesamiento continua lavando el miembro de retencion 216 con lfquido del deposito 279 para separar inhibidores restantes de polinucleotidos retenidos por el miembro de retencion 216. Para lavar el miembro de retencion 216, la valvula 206 puede cerrarse y las compuertas 242, 246 del primer deposito 240 pueden abrirse. El accionador 244 puede ser accionado para mover el lfquido de lavado dentro del deposito 279 a lo largo de los canales 257, 261 y 214, a traves de la region de procesamiento 220, y al interior del deposito de residuos 232. El lfquido de lavado mueve la muestra que puede haber permanecido dentro de los canales 204, 257, 261 y 214 a traves de la region de procesamiento y al interior de la camara de residuos 232. Una vez que el borde posterior del lfquido de lavado alcanza el orificio de ventilacion 212, la presion del gas generada por el accionador 244 puede ser ventilada y el movimiento adicional del lfquido puede detenerse.
El volumen de lfquido de lavado movido por el accionador 244 a traves de la region de procesamiento 220 puede ser normalmente al menos aproximadamente 2 veces el volumen de vacfos de la region de procesamiento 220 (por ejemplo, al menos aproximadamente 3 veces el volumen de vados) y puede ser aproximadamente 10 veces el volumen de vados o menos (por ejemplo, aproximadamente 5 veces el volumen de vados o menos). La region de procesamiento puede estar normalmente a una temperatura de aproximadamente 50 °C o menos (por ejemplo, 30 °C o menos) durante el lavado. Los fluidos de lavado ejemplares incluyen lfquidos descritos con respecto a los depositos 279 y 281, en el presente documento.
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El procesamiento continua liberando polinucleotidos a partir del miembro de retencion 216. Normalmente, el Uquido de lavado procedente del deposito 279 puede sustituirse por lfquido de liberacion (por ejemplo, una solucion de hidroxido) procedente del deposito 281 antes de liberar los polinucleotidos. La valvula 208 puede cerrarse y las compuertas 250, 252 pueden abrirse. El accionador 248 puede accionarse, moviendo de este modo el lfquido de liberacion dentro del deposito 281 a lo largo de los canales 261, 214 y al interior de la region de procesamiento 220 y en contacto con el miembro de retencion 216. Cuando el borde posterior del lfquido de liberacion procedente del deposito 281 alcanza el orificio de ventilacion hidrofobo 212, la presion generada por el accionador 248 puede ventilarse deteniendo el movimiento adicional del lfquido. El volumen de lfquido movido por el accionador 248 a traves de la region de procesamiento 220 normalmente puede ser al menos aproximadamente igual al volumen de vados de la region de procesamiento 220 (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 veces el volumen de vados) y puede ser aproximadamente 10 veces el volumen de vados o menos (por ejemplo, aproximadamente 5 veces el volumen de vados o menos).
Una vez que el miembro de retencion 216 con polinucleotidos retenidos se ha puesto en contacto con lfquido procedente del deposito 281, una etapa de liberacion puede ser realizada normalmente. Normalmente; la liberacion incluye calentar lfquido de liberacion presente dentro de la region de procesamiento 216. Generalmente, el lfquido puede calentarse a una temperatura insuficiente para llevar a ebullicion el lfquido en presencia del miembro de retencion. En algunas realizaciones, la temperatura puede ser de 100 °C o menos (por ejemplo, menos de 100 °C, aproximadamente 97 °C o menos). En algunas realizaciones, la temperatura puede ser de aproximadamente 65 °C o mas (por ejemplo, aproximadamente 75 °C o mas, aproximadamente 80 °C o mas, aproximadamente 90 °C o mas). En algunas realizaciones, la temperatura se mantiene durante aproximadamente 1 minuto o mas (por ejemplo, aproximadamente 2 minutos o mas, aproximadamente 5 minutos o mas, aproximadamente 10 minutos o mas). En algunas realizaciones, la temperatura puede mantenerse durante aproximadamente 30 minutos (por ejemplo, aproximadamente 15 minutos o menos, aproximadamente 10 minutos o menos, aproximadamente 5 minutos o menos). En una realizacion ejemplar, la region de procesamiento 220 puede calentarse a entre aproximadamente 65 y 90 °C (por ejemplo, a aproximadamente 70 °C) durante entre aproximadamente 1 y 7 minutos (por ejemplo, durante aproximadamente 2 minutos). Dichas temperaturas y tiempos vanan de acuerdo con la muestra y pueden seleccionarse en consecuencia por un experto en la materia.
Los polinucleotidos pueden liberarse al lfquido presente en la region de procesamiento 220 (por ejemplo, los polinucleotidos pueden ser normalmente liberados en una cantidad de lfquido de liberacion que tiene un volumen aproximadamente igual que el volumen de vados de la region de procesamiento 220). Normalmente, los polinucleotidos pueden ser liberados en aproximadamente 10 microlitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 5 microlitros o menos, aproximadamente 2,5 microlitros o menos) de lfquido.
En ciertas realizaciones, la relacion del volumen de muestra original movido a traves de la region de procesamiento 220 con respecto al volumen de lfquido al que pueden ser liberados los polinucleotidos puede ser de al menos aproximadamente 10 (por ejemplo, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 1000). En algunas realizaciones, los polinucleotidos procedentes de una muestra que tiene un volumen de aproximadamente 2 ml pueden estar retenidos dentro de la region de procesamiento, y ser liberados en aproximadamente 4 microlitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 3 microlitros o menos, aproximadamente 2 microlitros o menos, aproximadamente 1 microlitro o menos) de lfquido.
El lfquido en el que los polinucleotidos pueden ser liberados normalmente incluye al menos aproximadamente el 50 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %) de los polinucleotidos presentes en la muestra que entro en la region de procesamiento 220. La concentracion de polinucleotidos presentes en el lfquido de liberacion puede ser mayor que en la muestra original dado que el volumen de lfquido de liberacion puede ser normalmente menor que el volumen de la muestra de lfquido original movida a traves de la region de procesamiento. Por ejemplo, la concentracion de polinucleotidos en el lfquido de liberacion puede ser al menos aproximadamente 10 veces mayor (por ejemplo, al menos aproximadamente 25 veces mayor, al menos aproximadamente 100 veces mayor) que la concentracion de polinucleotidos en la muestra introducida en el cartucho 200. La concentracion de inhibidores presentes en el lfquido en el que los polinucleotidos pueden ser liberados puede ser, en general, menor que la concentracion de inhibidores en la muestra de fluido original en una cantidad suficiente para incrementar la eficiencia de amplificacion para los polinucleotidos.
El intervalo de tiempo entre la introduccion de la muestra que contiene polinucleotidos en region de procesamiento 220 y la liberacion de los polinucleotidos al lfquido de liberacion puede ser normalmente de aproximadamente 15 minutos o menos (por ejemplo, aproximadamente 10 minutos o menos, aproximadamente 5 minutos o menos).
El lfquido que incluye los polinucleotidos liberados puede retirarse de la region de procesamiento 220 de la siguiente manera. Las valvulas 210 y 234 pueden estar cerradas. Las compuertas 238 y 258 pueden estar abiertas. El accionador 254 puede accionarse para generar presion que mueve el lfquido y los polinucleotidos desde la region de procesamiento 220, al canal 230, y hacia la salida 236. El lfquido con polinucleotidos puede retirarse usando, por ejemplo, una jeringa o dispositivo de muestreo automatizado. Dependiendo del lfquido en contacto con el miembro
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de retencion 216 durante la liberacion de polinucleotidos, la solucion con polinucleotido liberado puede neutralizarse con una cantidad de tampon (por ejemplo, un volumen igual de tampon Tris-HCl 25 - 50 mM pH 8,0).
Aunque la liberacion de los polinucleotidos se ha descrito incluyendo una etapa de calentamiento, los polinucleotidos pueden liberarse sin calentamiento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el lfquido del deposito 281 tiene una fuerza ionica, pH, concentracion de tensioactivo, composicion, o combinacion de los mismos que libera los polinucleotidos del miembro de retencion a temperatura ambiente, sin necesidad de calentamiento adicional.
Aunque los polinucleotidos se han descrito siendo liberados en un unico volumen de lfquido presente dentro de la region de procesamiento 220, pueden usarse otras configuraciones. Por ejemplo, los polinucleotidos pueden liberarse con la introduccion concomitante (por etapas o continua) de fluido en y/o a traves de la region de procesamiento 220. En dichas realizaciones, los polinucleotidos pueden ser liberados al lfquido que tiene un volumen de aproximadamente 10 veces o menos (por ejemplo, aproximadamente 7,5 veces o menos, aproximadamente 5 veces o menos, aproximadamente 2,5 veces o menos, aproximadamente 2 veces o menos) que el volumen de vados de la region de procesamiento 220.
Aunque los depositos 279, 281 se han descrito conteniendo lfquidos entre primera y segunda compuertas, pueden usarse otras configuraciones. Por ejemplo, el lfquido para cada deposito puede estar contenido dentro de una bolsita (por ejemplo, un envase blister, tal como se describe adicionalmente en el presente documento) aislada de la red 201 mediante una membrana generalmente impermeable. La bolsita puede estar configurada de modo que un usuario pueda romper la membrana impulsando ifquido en los depositos 279, 281 donde los accionadores 244, 248 puedan mover el lfquido durante el uso.
Aunque las regiones de procesamiento se han descrito teniendo dimensiones a escala de microlitro, pueden usarse otras dimensiones. Por ejemplo, regiones de procesamiento con superficies (por ejemplo, partfculas) configuradas para retener preferentemente polinucleotidos en oposicion a inhibidores pueden tener grandes volumenes (por ejemplo, muchas decenas de microlitros o mas, al menos aproximadamente 1 mililitro o mas). En algunas realizaciones, la region de procesamiento tiene escala de mesa.
Aunque la region de procesamiento 220 se ha descrito teniendo un miembro de retencion formado por multiples partfculas modificadas en superficie, pueden usarse otras configuraciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la region de procesamiento 220 incluye un miembro de retencion configurado como un miembro poroso (por ejemplo, un filtro, una membrana porosa, o una matriz de gel) que tiene multiples aberturas (por ejemplo, poros y/o canales) a traves de los cuales pasan polinucleotidos. Las superficies del miembro poroso pueden modificarse para retener preferentemente polinucleotidos. Las membranas de filtro disponibles de, por ejemplo, Osmonics, pueden estar formadas por polfmeros que pueden estar modificados en superficie y usarse para retener polinucleotidos dentro de la region de procesamiento 220. En algunas realizaciones, la region de procesamiento 220 incluye un miembro de retencion configurado como una pluralidad de superficies (por ejemplo, paredes o deflectores) a traves de la cual pasa una muestra. Las paredes o deflectores pueden modificarse para retener preferentemente polinucleotidos.
Aunque la region de procesamiento 220 se ha descrito como un componente de una red microflmdica, pueden usarse otras configuraciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el miembro de retencion puede retirarse de una region de procesamiento para procesamiento en otro lugar. Por ejemplo, el miembro de retencion puede ponerse en contacto con una mezcla que comprende polinucleotidos e inhibidores en una ubicacion y a continuacion moverse a otra ubicacion en la que los polinucleotidos pueden retirarse del miembro de retencion.
Aunque los depositos 275 se han mostrado como dispersados dentro de un portador, pueden usarse otras configuraciones. Por ejemplo, los depositos 275 pueden estar encerrados dentro de un recinto flexible (por ejemplo, una membrana, por ejemplo, un recinto tal como un saco). En algunas realizaciones, los depositos pueden estar sueltos dentro de la camara 272. En dichas realizaciones, el accionador 244 puede incluir un miembro poroso que tiene poros demasiados pequenos para permitir el paso de depositos 275 pero suficiente grandes para permitir que el gas salga de la camara 272.
Cartucho microflmdico ejemplar que tiene una camara de lisis
Un cartucho microflmdico adicional con diversos componentes se describen en la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 60/553.553 presentada el 17 de marzo de 2004 de Parunak, y col, y la publicacion de solicitud de patente n.° 2005-0084424.
Aunque se han descrito cartuchos microflmdicos que estan configurados para recibir polinucleotidos ya liberados de celulas, cartuchos microflmdicos para uso en el presente documento tambien pueden estar configurados para liberar polinucleotidos de celulas (por ejemplo, lisando las celulas). Por ejemplo, con referencia a las figuras 14A, 14B, 15A y 15B, un cartucho microflmdico 300 incluye una camara de lisis de muestras 302 en la que las celulas pueden lisarse para liberar polinucleotidos en su interior. El cartucho microflmdico 300 incluye, ademas, capas de sustrato L1-L3, una red microflmdica 304 (de la cual solamente se ven partes en la figura 14A), y depositos de reactivo lfquido R1-R4. Los depositos de reactivo lfquido R1-R4 contienen reactivos lfquidos (por ejemplo, para procesar
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material de muestra) y pueden estar conectado a la red 304 mediante puertos para reactivo RP1-RP4. El cartucho microflmdico 300 puede ser, por lo tanto, un entorno autonomo que comprende todos los reactivos y materiales necesarios para realizar etapas de preparacion, lisis de celulas, aislamiento de polinucleotidos, procesamiento pre- amplificacion, amplificacion, y deteccion de una muestra. En algunas realizaciones, se introduce una muestra que tiene uno o mas de los reactivos requeridos mezclados con ella; en cuyo caso los reactivos restantes se almacenan en el cartucho. Los reactivos y otros materiales pueden almacenarse en el cartucho 300 en depositos de reactivo lfquido R1-R4, canales o camaras microflmdicas en una red microflmdica, y/o en una camara de lisis 302.
La red 304 puede estar sustancialmente definida entre las capas L2 y L3 pero se extiende en parte entre las tres capas L1-L3. La red microflmdica 304 incluye diversos componentes microflmdicos tal como se describe adicionalmente en el presente documento, incluyendo canales Ci, valvulas Vi, valvulas dobles V'i, compuertas Gi, compuertas de mezcla MGi, orificios de ventilacion Hi, accionadores de gas (por ejemplo, bombas) Pi, una primera region de procesamiento B1, una segunda region de procesamiento B2, zonas de deteccion Di, orificios de ventilacion de aire AVi, y zonas de residuos Wi.
Las figuras 15A, 15B, muestran dos mitades complementarias de una red microflmdica ejemplar 304. Sena entendido por un experto en la materia, que la division de la red en dos mitades separadas es arbitraria, y puramente para facilidad de ilustracion. La disposicion de componentes mostrada en las figuras 15A, 15B es ejemplar; sena entendido por un experto en la materia que otras disposiciones de este tipo, tales como diferentes disposiciones geometricas de los mismos componentes, o diferentes disposiciones de diferentes componentes pueden ser construidas por un experto en la materia, para conseguir las etapas descritas en el presente documento.
Los componentes de la red 304 pueden ser normalmente accionados termicamente. Tal como se ve en la figura 16, una red de fuentes de calor ejemplar 312 incluye fuentes de calor (por ejemplo, fuentes de calor resistivas) que tienen ubicaciones que corresponden a diversos componentes accionados termicamente de la red microflmdica 304. Por ejemplo, las ubicaciones de las fuentes de calor HPi corresponden a las ubicaciones de los accionadores Pi, las ubicaciones de las fuentes de calor HGi correspondes a las ubicaciones de las compuertas Gi y las compuertas de mezcla MGi, las ubicaciones de fuentes de calor HVi corresponden a las ubicaciones de las valvulas Vi y valvulas dobles V'i, y las ubicaciones de fuentes de calor HDi corresponden a las ubicaciones de las camaras de procesamiento Di, todas de la red 304. En uso, los componentes del cartucho 300 pueden estar dispuestos en contacto termico con fuentes de calor correspondientes de la red 312, que pueden hacerse funcionar normalmente usando un procesador tal como se ha descrito anteriormente para el cartucho 200. La red de fuentes de calor 312 puede ser integral con o independiente del cartucho 300 tal como se ha descrito para el cartucho 200. Por ejemplo, la red de fuentes de calor 312 puede estar integrada en un modulo calefactor 2020, tal como por debajo del compartimento de recepcion 2014 de una manera que se alinee con una red de un cartucho dispuesto en su interior.
Componentes adicionales del cartucho microflmdico ejemplar 300 son los siguientes.
Orificios de ventilacion de aire
Los orificios de ventilacion de aire AVi pueden permitir que el gas (por ejemplo, aire) desplazado por el movimiento de lfquidos dentro de la red 304 sea ventilado de modo que la acumulacion de presion no inhiba los movimientos deseados de los lfquidos. Por ejemplo, el orificio de ventilacion de aire AV2 permite que el lfquido se mueva a lo largo del canal C14 y al interior del canal C16 ventilando gas aguas abajo del lfquido a traves del orificio de ventilacion AV2.
Valvulas
Las valvulas Vi pueden tener un estado normalmente abierto que permite que el material pase a lo largo de un canal desde una posicion en un lado de la valvula (por ejemplo, aguas arriba de la valvula) hasta una posicion en el otro lado de la valvula (por ejemplo, aguas abajo de la valvula). Las valvulas Vi pueden tener una estructura similar a las valvula del cartucho microflmdico 200, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
Tal como se ve en las figuras 17 y 18, las valvulas dobles V'i tambien pueden tener un estado normalmente abierto que permite que el material pase a lo largo de un canal desde una posicion en un lado de la valvula (por ejemplo, aguas arriba de la valvula) hasta una posicion en el otro lado de la valvula (por ejemplo, aguas abajo de la valvula). Tomando la valvula doble V11' de la figura 17 y 18 como ejemplo, las valvulas dobles Vi' incluyen primera y segunda masas 314, 316 de una TRS (por ejemplo, una aleacion eutectica o cera) separadas entre sf a cada lado de un canal (por ejemplo, el canal C14). Normalmente, las masas de TRS 314, 316 pueden estar desplazadas una con respecto a otra (por ejemplo, una distancia de aproximadamente el 50 % de una anchura de lasa masas de TRS o menos). El material que se mueve a traves de la valvula abierta pasa entre las primera y segunda masas de TRS 314, 316. Cada masa de TRS 314, 316 puede estar asociada con una camara respectiva 318, 320, que normalmente incluye un gas (por ejemplo, aire).
Las masas de TRS 314, 316 y las camaras 318, 320 de la valvula doble Vi' pueden estar en contacto termico con una fuente de calor correspondiente HV11' de la red de fuentes de calor 312. Accionar la fuente de calor HV11' hace
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que las masas de TRS 314, 316 pasen a un segundo estado mas movil (por ejemplo, un estado parcialmente fundido) e incrementa la presion de gas dentro de las camaras 318, 320. La presion del gas impulsa las masas de TRS 314, 316 a traves del canal C11 y cierra la valvula HV11' (figura 18). Normalmente, las masas 314, 316 se combinan al menos parcialmente para formar una masa 322 que obstruye el canal C11.
Volviendo a las figuras 15A, 15B, las compuertas Gi pueden tener un estado normalmente cerrado que no permite que pase material a lo largo de un canal desde una posicion en un lado de la compuerta hasta otro lado de la compuerta. Las compuertas Gi pueden tener una estructura similar a la descrita para las compuertas del cartucho 200.
Tal como se ve en las figuras. 19A-19D para una parte ejemplar de una red microflmdica, compuertas de mezcla MGi pueden permitir que dos volumenes de lfquido se combinen (por ejemplo, se mezclen) dentro de la red 304. Las compuertas de mezcla MGi se describen adicionalmente a continuacion.
Accionadores
Los accionadores Pi pueden proporcionar una presion de gas para mover material (por ejemplo, material de muestra y/o material de reactivo) entre una ubicacion de la red 304 y otra ubicacion. Los accionadores Pi pueden ser de forma similar a los accionadores del cartucho 200. Por ejemplo, cada accionador Pi incluye una camara con una masa 273 de TEM que puede calentarse para presurizar gas dentro de la camara. Cada accionador Pi incluye una compuerta correspondiente Gi (por ejemplo, la compuerta G2 del accionador P1) que impide que el lfquido entre en la camara del accionador. La compuerta puede accionarse normalmente (por ejemplo, abrirse) para permitir que la presion creada en la camara del accionador entre en la red microflmdica.
Camaras de residuos
Las camaras de residuos Wi pueden recibir residuos lfquidos (por ejemplo, de desbordamiento) que resulta de la manipulacion (por ejemplo, movimiento y/o mezcla) de lfquidos dentro de la red 304. Normalmente, cada camara de residuos Wi tiene un orificio de ventilacion de aire asociado que permite que el gas desplazado por el lfquido que entra en la camara se ventile.
Regiones de procesamiento
La primera region de procesamiento B1 de la red 304 puede ser un componente que permite que los polinucleotidos se concentren y/o se separen de inhibidores de una muestra. La region de procesamiento B1 puede estar configurada y operada como la region de procesamiento 220 del cartucho 200. En algunas realizaciones, la primera region de procesamiento B1 incluye un miembro de retencion (por ejemplo, multiples partfculas (por ejemplo, microesferas o perlas), un miembro poroso, multiples paredes) que tienen al menos una superficie modificada con uno o mas ligandos tal como se ha descrito para la region de procesamiento 220. Por ejemplo, el ligando puede incluir una o mas poliamidas (por ejemplo, poliamidas policationicas tales como poli-L-lisina, poli-D-lisina, poli-DL- ornitina), o polietilenimina. En algunas realizaciones, las partfculas del miembro de retencion pueden estar dispuestas en la camara de lisis 302 y pueden moverse a la region de procesamiento B1 junto con el material de muestra.
La segunda region de procesamiento B2 puede ser un componente que permite al material (por ejemplo, material de muestra) combinarse con compuestos (por ejemplo, reactivos) para determinar la presencia de uno o mas polinucleotidos. En algunas realizaciones, los compuestos incluyen uno o mas reactivos de PCR (por ejemplo, cebadores, plasmidos de control, y enzimas polimerasa).
Partculas liofilizadas
En algunas realizaciones, los compuestos para determinar la presencia de uno o mas polinucleotidos pueden almacenarse dentro de una region de procesamiento tal como B2 como una o mas partfculas liofilizadas (por ejemplo, microgranulos). Las partfculas generalmente tienen una vida en almacenamiento a temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20 °C) de al menos aproximadamente 6 meses (por ejemplo, al menos aproximadamente 12 meses). El lfquido que entra en la segunda region de procesamiento B2 disuelve (por ejemplo, reconstituye) los compuestos liofilizados.
Normalmente, las una o varias partfculas liofilizadas de la region de procesamiento B2 tienen un volumen promedio de aproximadamente 5 microlitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 4 microlitros o menos, aproximadamente 3 microlitros o menos, aproximadamente 2 microlitros o menos). En algunas realizaciones, las una o varias partfculas liofilizadas de la region de procesamiento B2 tienen un diametro promedio de aproximadamente 4 mm o menos (por ejemplo, aproximadamente 3 mm o menos, aproximadamente 2 mm o menos) En una realizacion ejemplar, las una o varias partfculas liofilizadas tienen un volumen promedio de aproximadamente 2 microlitros y un diametro promedio de aproximadamente 1,35 mm. En otras realizaciones, las partfculas liofilizadas pueden tener un diametro de aproximadamente 5 mm o menos (por ejemplo, aproximadamente 2,5 mm o menos, aproximadamente
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1,75 mm o menos).
Partfculas liofilizadas para determinar la presencia de uno o mas polinucleotidos normalmente incluyen multiples compuestos. En algunas realizaciones, las partfculas liofilizadas incluyen uno o mas compuestos usados en una reaccion para determinar la presencia de un polinucleotido y/o para incrementar la concentracion del polinucleotido. Por ejemplo, partfculas liofilizadas pueden incluir una o mas enzimas para amplificar un polinucleotido, como mediante PCR.
Las partfculas liofilizadas ejemplares incluyen reactivos ejemplares para la amplificacion de polinucleotidos asociados con bacterias Streptococcus del grupo B (GBS). En algunas realizaciones, las partfculas liofilizadas incluyen uno o mas de un crioprotector, una o mas sales, uno o mas cebadores (por ejemplo, Cebador de GBS F y/o Cebador de GBS R), una o mas sondas (por ejemplo, sonda de GBS - FAM), uno o mas plasmido de control internos, uno o mas controles de especificidad (por ejemplo, ADN de Streptococcus pneumoniae como control para PCR de GBS), uno o mas reactivos de PCR (por ejemplo, dNTP y/o dUTP), uno o mas agentes bloqueantes o de carga (por ejemplo, protemas inespedficas (por ejemplo, albumina de suero bovino (BSA), ARNasaA, o gelatina), y una polimerasa (por ejemplo, Taq Polimerasa libre de glicerol). Por supuesto, otros componentes (por ejemplo, otros cebadores y/o controles de la especificidad) pueden usarse para la amplificacion de otros polinucleotidos.
Los crioprotectores generalmente ayudan a incrementar la estabilidad de las partfculas liofilizadas y ayudan a prevenir el dano a otros compuestos de las partfculas (por ejemplo, impidiendo la desnaturalizacion de enzimas durante la preparacion y/o el almacenamiento de las partfculas). En algunas realizaciones, el crioprotector incluye uno o mas azucares (por ejemplo, uno o mas disacaridos (por ejemplo, trehalosa, melizitosa, rafinosa)) y/o uno o mas polialcoholes (por ejemplo, manitol, sorbitol).
Las partfculas liofilizadas pueden prepararse segun se desee. Un metodo para fabricar partfculas liofilizadas incluye formar una solucion de reactivos de la partfcula y un crioprotector (por ejemplo, un azucar o poli-alcohol). Normalmente, los compuestos de las partfculas liofilizadas pueden combinarse con un disolvente (por ejemplo, agua) para preparar una solucion, que puede colocarse a continuacion (por ejemplo, gota a gota, en alfcuotas discretas (por ejemplo, gotas) tal como mediante una pipeta) sobre una superficie hidrofoba enfriada (por ejemplo, una pelfcula de diamante o una superficie de politetrafluoroetileno). En general, la temperatura de la superficie puede reducirse a cerca de la temperatura del nitrogeno lfquido (por ejemplo, aproximadamente -150 °F o menos, aproximadamente -200 °F o menos, aproximadamente 275 °F o menos), tal como mediante el uso de un bano de refrigeracion de un reactivo criogeno directamente debajo. La solucion puede dispensarse sin poner en contacto el agente criogeno. La solucion se congela como partfculas discretas. Las partfculas congeladas pueden someterse a un vado, normalmente mientras siguen congeladas, para una presion y un tiempo suficientes para retirar el disolvente (por ejemplo, mediante sublimacion) de los microgranulos. Dichos metodos se describen adicionalmente en la publicacion de patente internacional n.°WO 2006/119280 .
En general, las concentraciones de los compuestos en la solucion a partir de la cual se preparan las partfculas pueden ser mayores que cuando se reconstituyen en el cartucho microflmdico. Normalmente, la relacion de la concentracion de la solucion con respecto a la concentracion reconstituida puede ser al menos aproximadamente 3 (por ejemplo, al menos aproximadamente 4,5). En algunas realizaciones, la relacion puede ser aproximadamente 6.
Una solucion ejemplar para preparar microgranulos liofilizados para uso en la amplificacion de polinucleotidos indicativa de la presencia de GBS puede prepararse combinando un crioprotector (por ejemplo, 120 mg de trehalosa en forma de polvo seco), una solucion tampon (por ejemplo, 48 microlitros de una solucion de Tris 1 M a pH 8,4, KCl 2,5 M, y MgCl2 200 mM), un primer cebador (por ejemplo, 1,92 microlitros de Cebador de GBS F 500 micromolar (Invitrogen)), un segundo cebador (por ejemplo, 1,92 microlitros de Cebador de GBS R 500 micromolar (Invitrogen)), una sonda (por ejemplo, 1,92 microlitros de Sonda de GBS - FAM 250 micromolar (IDT/Biosearch Technologies)), una sonda de control (por ejemplo, 1,92 microlitros de Cal Orange 560 250 micromolar (Biosearch Technologies)), un plasmido plantilla (por ejemplo, 0,6 microlitros de una solucion de 105 copias de plasmido por microlitro), un control de especificidad (por ejemplo, 1,2 microlitros de una solucion de 10 nanogramos por microlitro (por ejemplo, aproximadamente 5.000.000 copias por microlitro) de ADN de streptococcus pneumoniae (ATCC)), reactivos de PCR (por ejemplo, 4,8 microlitros de una solucion 100Q milimolar de dNTP (Epicenter) y 4 microlitros de una solucion 20 milimolar de dUTP (Epicenter)), un agente espesante (por ejemplo, 24 microlitros de una solucion de 50 miligramos por mililitro de BSA (invitrogen)), una polimerasa (por ejemplo, 60 microlitros de una solucion de 5 U por microlitro de Taq Polimerasa libre de glicerol (Invitrogen / Eppendorf)) y un disolvente (por ejemplo, agua) para preparar aproximadamente 400 microlitros de solucion. Aproximadamente 200 alfcuotas de aproximadamente 2 microlitros cada una de esta solucion pueden congelarse y desolvatarse tal como se ha descrito anteriormente para preparar 200 microgranulos. Cuando estan reconstituidas, las 200 partfculas componen una solucion de reaccion de PCR que tiene un volumen total de aproximadamente 2,4 mililitros.
Depositos de reactivo
Tal como se ve en la figura 14, los depositos de reactivo Ri pueden estar configurados para contener reactivos lfquidos (por ejemplo, agua, solucion tampon, solucion de hidroxido) separados de la red 304 hasta que esten listos
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para usarlos. Los depositos R1 incluyen un recinto 329 que define un espacio sellado 330 para contener Kquidos. Cada espacio 330 puede estar separado del puerto para reactivos RPi y la red 304 por una pared inferior 333 del recinto 329. Un material de cobertura 341 (por ejemplo, un laminado, adhesivo o capa polimerica) puede recubrir una pared superior del recinto.
Una parte del recinto 329 puede estar formada como un mecanismo de accionamiento (por ejemplo, un miembro perforante 331) orientado hacia la pared inferior 333 de cada recinto. Cuando el cartucho 300 puede usarse, depositos de reactivo Ri pueden ser accionados presionando hacia abajo el miembro perforante 331 para perforar la pared 333. El miembro perforante 331 puede ser presionado hacia abajo por un usuario (por ejemplo, con un pulgar) o por el sistema operativo usado para hacer funcionar el cartucho 300.
La pared 333 puede estar formada normalmente por un material que tiene una velocidad de transmision de vapor baja (por ejemplo, Aclar, un laminado metalizado (por ejemplo aluminio), un plastico, o un laminado de papel metalizado) que puede romperse o perforarse. El deposito 330 contiene una cantidad de lfquido adecuada para el cartucho 300. Por ejemplo, el deposito puede contener hasta aproximadamente 200 microlitros. El miembro perforante 331 puede suponer una parte (por ejemplo, hasta aproximadamente el 25 %) de ese volumen. El material del laminado dentro del blister que puede tocar el reactivo corrosivo tal como hidroxido sodico basico no debe correrse incluso despues de seis a doce meses de exposicion.
En general, los depositos Ri pueden formarse y llenarse segun se desee. Por ejemplo, la pared superior del recinto puede estar sellada a la pared inferior 333 (por ejemplo, mediante adhesivo y/o sellado termico). Puede introducirse ifquido en el deposito mediante, por ejemplo, una abertura en el extremo inferior del miembro perforante 331. Despues del llenado, la abertura puede sellarse (por ejemplo, mediante sellado por calor a traves de la aplicacion localizada de calor o mediante la aplicacion de un material de sellado (por ejemplo, material de cobertura 341)).
Cuando la pared 333 puede ser perforada, fluido procedente del deposito entra en la red 333. Por ejemplo, tal como se ve en las figuras 14 y 15, lfquido procedente del deposito R2 entra en la red 304 por el puerto RP2 y se desplaza a lo largo de un canal C2. La compuerta G3 impide que el lfquido pase a lo largo del canal C8. El exceso de lfquido pasa a lo largo del canal C7 y al interior de la camara de residuos W2. Cuando el borde posterior del lfquido procedente del deposito R2 pasa por el orificio de ventilacion hidrofobo H2, la presion creada dentro del deposito puede ser ventilada deteniendo el movimiento adicional del lfquido. En consecuencia, la red 304 recibe una alfcuota de reactivo lfquido que tiene un volumen definido por el volumen del canal C2 entre una union J1 y una union J2. Cuando el accionador P1 puede ser accionado, esta alfcuota de reactivo puede moverse adicionalmente dentro de la red 304. Los depositos de reactivo R1, R3 y R4 pueden estar asociados con canales, orificios de ventilacion hidrofobos, y accionadores correspondientes.
En la configuracion mostrada, el deposito de reactivo R1 normalmente contiene un lfquido de liberacion (por ejemplo, una solucion de hidroxido tal como se ha descrito anteriormente para el cartucho 200) para liberar polinucleotidos retenidos dentro de la region de procesamiento B1. El deposito de reactivo R2 normalmente contiene un lfquido de lavado (por ejemplo, una solucion tampon tal como se ha descrito anteriormente para el cartucho 200) para retirar compuestos no tratados (por ejemplo, inhibidores) de la region de procesamiento B1 antes de liberar los polinucleotidos. El deposito de reactivo R3 normalmente contiene un tampon de neutralizacion (por ejemplo, tampon Tris-HCl 25 - 50 mM a pH 8,0). El deposito de reactivo R4 normalmente contiene agua desionizada.
Aunque los depositos se han mostrado teniendo un miembro perforante formado por una pared del deposito, otras configuraciones son posibles. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el deposito incluye un miembro perforante similar a una aguja que se extiende a traves de una pared superior del deposito al interior del espacio sellado hacia una pared inferior del deposito. La pared superior del deposito puede estar sellada en el miembro perforante similar a una aguja (por ejemplo, con un adhesivo, una epoxi). En uso, la pared superior puede presionarse hacia abajo impulsando el miembro perforante a traves de la pared inferior empujando al lfquido en el espacio sellado para entrar en una red microflmdica.
Aunque los depositos se han descrito incluyendo un mecanismo de accionamiento (por ejemplo, un miembro perforante), otras configuraciones son posibles. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una pared inferior del espacio sellado del deposito incluye una parte debilitada que recubre una abertura a una red microflmdica. El material de la pared inferior (por ejemplo, laminando, pelfcula polimerica, o papel metalizado) que recubre la abertura puede ser lo suficientemente grueso para impedir la perdida del lfquido dentro del espacio sellado pero lo suficientemente fino para romperse tras la aplicacion de presion al lfquido en su interior. Normalmente, el material que recubre la abertura puede ser mas fino que el material adyacente. Como alternativa o ademas, el material debilitado puede formarse dejando este material relativamente sin soportar en comparacion con el material circundante de la pared inferior.
Aunque los depositos se han descrito teniendo un espacio sellado formado en parte por una pared del espacio sellado, otras configuraciones son posibles. Por ejemplo, con referencia a la figura 20a, un deposito incluye un mecanismo de accionamiento similar a un embolo (por ejemplo, un miembro perforante 342) y un espacio sellado similar a una junta 343 que tiene capas superior e inferior 344, 345 respectivamente (por ejemplo, capas de
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laminado superior e inferior). El Ifquido puede sellarse entre las capas superior e inferior. El espacio sellado puede estar rodeado por una estructura de soporte 346 (por ejemplo, una junta toroidal) que soporta el espacio sellado en sus superficies perifericas superior e inferior.
Con referencia a la figura 20B, el miembro perforante 342 se muestra estando presionado hacia abajo hasta que el miembro perforante 342 ha perforado las capas tanto superior como inferior, poniendo el Kquido en comunicacion con la red microflmdica. Un orificio de ventilacion 346 adyacente al embolo permite al gas atrapado entre el miembro perforante y la capa superior del espacio sellado escapar sin ser empujado al interior de la red microflmdica.
Con referencia a la figura 20C, el miembro perforante 342 se muestra estando completamente accionado. Una parte del miembro perforante ha desplazado un volumen correspondiente de lfquido desde el espacio sellado y ha introducido el volumen de lfquido predeterminado en el cartucho microflmdico.
Aunque los depositos se han descrito teniendo un espacio sellado que puede ser estacionario con respecto a un miembro perforante, otras configuraciones son posibles. Por ejemplo, la figura 21A ilustra un deposito que tiene un espacio sellado 347 que puede fijarse (por ejemplo, ser integral) con respecto a un mecanismo de accionamiento que tiene un miembro movil 348 (por ejemplo, un embolo) y un miembro perforante 349 soportado por un soporte del miembro perforante 350 que puede ser estacionario con respecto al espacio sellado. Normalmente, el espacio sellado puede estar definido por una cavidad dentro del miembro movil y una pared inferior 351 que sella el lfquido dentro del espacio sellado. El miembro perforante puede estar configurado para romper la pared inferior cuando el miembro movil puede ser presionado hacia abajo. El soporte del miembro perforante tiene una forma generalmente complementaria a la cavidad del miembro movil. El soporte del miembro perforante incluye un canal 352 conectado a una red microflmdica para permitir que el fluido liberado del espacio cerrado entre en la red microflmdica.
Con referencia a la figura 21B, el miembro movil ha sido presionado hacia abajo, de modo que el miembro perforante acabe de romper la capa inferior del espacio sellado. Con referencia a la figura 21C, el deposito ha sido presionado hacia abajo completamente sobre el miembro perforante y el soporte del miembro perforante. El volumen de fluido desplazado desde el deposito generalmente corresponde al volumen del soporte del miembro perforante que entra en el espacio cerrado. Un canal 353 permite que el aire desplazado por el miembro movil salga.
Aunque los depositos se han descrito teniendo un miembro perforante que puede fijarse con respecto a alguna parte del deposito, otras configuraciones son posibles. Por ejemplo, con referencia a la figura 22, un deposito incluye un mecanismo de accionamiento 354 (por ejemplo, un miembro perforante tal como un miembro perforante similar a una aguja) que puede no estar fijado con respecto al deposito. Un espacio sellado 355 del deposito puede estar definido por una pared superior 356 e incluye un canal 357 que se extiende a traves de una parte de un sustrato 361 en el que puede estar definida una red microflmdica. Una pared inferior 358 del espacio sellado separa el espacio sellado de un canal 359 de la red microflmdica. El miembro perforante ocupa el canal 357 del espacio sellado, de modo que la punta perforante 360 del miembro perforante descanse contra la pared inferior 358. Hundir la pared superior 356 del deposito impulsa al miembro perforante 354 a traves de la pared inferior y empuja al lfquido dentro del espacio sellado al interior de la red microflmdica.
Como otro ejemplo, las figuras 23A y 23B ilustran un deposito que incluye un mecanismo de accionamiento (por ejemplo, un miembro perforante) que puede fijarse inicialmente a un interior de una pared superior del deposito pero se separa al menos parcialmente de la pared superior tras el accionamiento del deposito.
Como otro ejemplo mas, las figuras 24A y 24B ilustran un deposito que incluye un miembro perforante 364 que puede estar fijado inicialmente a un interior 365 de una pared superior 366 del deposito pero sustancialmente se separa (por ejemplo, se separa completamente) de la pared superior tras el accionamiento del deposito.
Aunque los depositos se han descrito teniendo un espacio cerrado que puede estar fijado o ser integral de otro modo con una parte del deposito, otras configuraciones son posibles. Por ejemplo, con referencia a la figura 25, un deposito incluye un espacio cerrado similar a una capsula 367 definido por una pared externa 368. La pared externa puede estar formada, en general, por un material que tiene una velocidad de transmision de vapor baja. El deposito tambien incluye un mecanismo de accionamiento que tiene un miembro movil 369 con un miembro perforante 370 que perfora el espacio cerrado hasta para liberar el lfquido en su interior. El lfquido pasa a lo largo de un canal 372 que conduce a una red microflmdica. Un canal 371 permite que el gas (por ejemplo, aire) en caso contrario atrapado por el miembro movil, salga.
Aunque los depositos se han descrito recubriendo en general una entrada a una red microflmdica, otras configuraciones son posibles. Por ejemplo, con referencia a la figura 26, un deposito incluye un espacio cerrado 373 en el que el lfquido puede almacenarse y una parte de conexion 374 conectarse a una entrada 376 de una red microflmdica. El espacio cerrado 373 y la parte de conexion 374 pueden estar separadas por una junta rompible 375 (por ejemplo, una junta debil). En general, la junta rompible 375 impide que el lfquido o vapor salga del espacio cerrado. Sin embargo, tras la aplicacion de presion al lfquido (por ejemplo, hundiendo una pared 377 del espacio cerrado), la junta rompible 375 se rompe permitiendo al lfquido pasar a traves de la junta debil hasta la parte de conexion y al interior de la red microflmdica 378.
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Una realizacion adicional mas de un deposito con un miembro perforante se muestra en la figura 27A, que muestra un deposito 2701 que tiene una envuelta externa 2703 y un elemento perforante 2704 que pueden estar, ambos, hechos de la misma pieza de material. Dicha envuelta y elemento perforante combinados pueden formarse a partir de muchos procesos conocidos por un experto en la materia. Procesos especialmente preferidos pueden ser termoformado al vado y moldeo por inyeccion. El elemento perforante 2704 puede ser de forma generalmente conica, con el apice adyacente a una membrana 2702; su apice preferentemente no supera las 0,040". El elemento perforante perforara la membrana 2702 y liberara el lfquido procedente del deposito 2701 cuando la envuelta externa puede presionarse hacia abajo. Dimensiones representativas se muestran en la figura 27A. El deposito puede estar construido de modo que la superficie superior puede estar a nivel, con una pieza protectora plana 2705 que cubre la base de la forma conica del elemento perforante 2704.
Otra realizacion mas de un deposito con un miembro perforante se muestra en la figura 27B, que muestra un deposito 2711 que tiene una envuelta externa de una sola pieza 2712 y el elemento perforante 2714. Dichos envuelta y elemento perforante combinados pueden formarse a partir de muchos procesos conocidos por un experto en la materia. Procesos especialmente preferidos pueden ser termoformado al vado y moldeo por inyeccion. El elemento perforante 2714 puede ser de forma troncoconica, con su lado mas estrecho adyacente a la membrana 2713. Como alternativa, el elemento perforante 2714 puede comprender varios elementos perforantes diferentes, dispuestos dentro de un espacio conico. Preferentemente puede haber cuatro de dichos elementos perforantes donde multiples elementos pueden estar presentes.
Debe entenderse que las dimensiones del deposito, el elemento perforante, la envuelta y el moldeo mostradas en las figuras 27A y 27B como cantidades decimales en pulgadas son ejemplares. En particular, las dimensiones pueden ser tales que la envuelta no se repliegue bajo su propio peso y normalmente no sea tan resistente para prohibir el hundimiento del miembro perforante cuando se requiere durante el funcionamiento del cartucho.
Ademas, los materiales de las diversas realizaciones tambien pueden seleccionarse de modo que el cartucho tenga una vida en almacenamiento de aproximadamente un ano. Por esto, se entiende que el grosor de los diversos materiales puede ser tal que resistan la perdida, a traves de medios tales como difusion, del 10 % del volumen de lfquido contenido en su interior durante un periodo de vida en almacenamiento deseado.
Preferentemente, el volumen del deposito puede ser de aproximadamente 150 |il antes de que una envuelta sea presionada hacia abajo. Tras el hundimiento de una envuelta, el volumen puede deformarse preferentemente a alrededor de la mitad de su volumen original.
Se observara que llenar completamente el envase blister con un reactivo lfquido - sin ningun espacio restante para una burbuja de aire, da como resultado un blister que requiere aplicacion de una fuerza significativamente mayor de lo que es preferible. Por consiguiente, el uno o varios blfsteres se llenan normalmente a aproximadamente el 80 - 95 % de su volumen, reservando de este modo aproximadamente el 5 - 20 %, normalmente el 10 - 15 % del volumen para aire. De este modo, en una realizacion, un blister que tiene un volumen total de 200 |il se llena con 170 |il de ifquido.
Camara de lisis
Una camara de lisis ejemplar 302, tal como se muestra en las figuras 14A y 14B, se muestra en una configuracion de torre, que sobresale desde un plano del cartucho microflmdico 300. La camara de lisis 302 puede dividirse en una camara de lisis primaria 306 y una camara de residuos 308. En una realizacion, las camaras primaria y de residuos 306, 308 estan separadas entre sf de modo que el material no pueda pasar de una de la camaras al interior de la otra camara sin pasar a traves de al menos una parte de la red 304. La camara de lisis primaria 306 incluye un puerto de entrada de muestra SP1 para introducir una muestra en la camara 306, un puerto de salida de muestra SP2 que conecta la camara 306 a la red 304, y reactivo liofilizado LP que interactua con el material de muestra dentro de la camara 306, tal como se describe en el presente documento. El puerto SP2 se muestra en la figura 14A estando en la parte inferior de la camara 302. La figura 15B muestra una posicion del SP2 con respecto al resto de la red microflmdica 304. El puerto de entrada SP1 incluye una valvula de una via que permite que el material (por ejemplo, material de muestra y gas) entre en la camara 306 pero limita (por ejemplo, impide) que el material salga de la camara 308 por el puerto SP1. Normalmente, el puerto SP1 incluye un accesorio (por ejemplo, un accesorio Luer) configurado para acoplarse con un dispositivo de entrada de muestras (por ejemplo, una jeringa) para formar una junta hermetica a gases. La camara primaria 306 normalmente tiene un volumen de aproximadamente 5 mililitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 4 mililitros o menos). Antes del uso, la camara primaria 306 puede llenarse normalmente con un gas (por ejemplo, aire).
La camara de residuos 308 incluye una parte de residuos W6 mediante la cual el lfquido puede entrar en la camara 308 procedente de la red 304 y un orificio de ventilacion 310 mediante el cual el gas desplazado por el lfquido que entra en la camara 308 puede salir.
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Partculas de reactivo de lisis
Las pardculas de reactivo liofilizado LP de la camara de lisis 302 incluyen uno o mas compuestos (por ejemplo, reactivos) configurados para liberar polinucleotidos a partir de celulas (por ejemplo, lisando las celulas). Por ejemplo, las pardculas LP pueden incluir una o mas enzimas configuradas para reducir (por ejemplo, desnaturalizar) protemas (por ejemplo, proteinasas, proteasas (por ejemplo, pronasa), tripsina, proteinasa K, enzimas ltticas de fagos (por ejemplo, PlyGBS)), lisozimas (por ejemplo, una lisozima modificada tal como ReadyLyse), enzimas espedficas de celulas (por ejemplo, mutanolisina para lisar estreptococos del grupo B)).
En algunas realizaciones, las partfculas LP como alternativa o adicionalmente incluyen componentes para retener polinucleotidos en comparacion con inhibidores. Por ejemplo, las partfculas LP pueden incluir multiples partfculas 218 modificadas en superficie con ligandos, tal como se ha descrito anteriormente para la camara de procesamiento del cartucho 200. Las partfculas LP pueden incluir enzimas que reducen polinucleotidos que podnan competir con un polinucleotido a determinar para unirse a sitios en las partfculas modificadas en superficie. Por ejemplo, para reducir ARN que podna competir con ADN a determinar, las partfculas LP pueden incluir una enzima tal como una ARNasa (por ejemplo, ARNasaA ISC BioExpress (Amresco)).
En una realizacion ejemplar, las partfculas LP incluyen un crioprotector, partfculas modificadas con ligandos configurados para retener polinucleotidos en comparacion con inhibidores, y una o mas enzimas.
Normalmente, las partfculas LP tienen un volumen promedio de aproximadamente 35 microlitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 27,5 microlitros o menos, aproximadamente 25 microlitros o menos, aproximadamente 20 microlitros o menos). En algunas realizaciones, las partfculas LP tienen un diametro promedio de aproximadamente 8 mm o menos (por ejemplo, aproximadamente 5 mm o menos, aproximadamente 4 mm o menos) En una realizacion ejemplar, las una o varias partfculas liofilizadas tienen un volumen promedio de aproximadamente 20 microlitros y un diametro promedio de aproximadamente 3,5 mm.
Las partfculas LP pueden prepararse segun se desee. Normalmente, las partfculas pueden prepararse usando un crioprotector y superficie hidrofoba enfriada tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento para otras partfculas de reactivo. Por ejemplo, una solucion para preparar partfculas LP puede prepararse combinando un crioprotector (por ejemplo, 6 gramos de trehalosa), una pluralidad de partfculas modificadas con ligandos (por ejemplo, aproximadamente 2 mililitros de una suspension de partfculas modificadas con carboxilato con ligandos de poli-D-lisina), una proteasa (por ejemplo, 400 miligramos de pronasa), una ARNasa (por ejemplo, 30 miligramos de ARNasaA (actividad de 120 U por miligramo), una enzima que digiere peptidoglucano (por ejemplo, ReadyLyse (por ejemplo, 160 microlitros de una solucion de 30.000 U por microlitro de ReadyLyse)), una enzima espedfica de celulas (por ejemplo, mutanolisina (por ejemplo, 200 microlitros de una solucion de 50 U por microlitro de mutanolisina), y un disolvente (por ejemplo, agua) para preparar aproximadamente 20 militros. Aproximadamente 1.000 alfcuotas de aproximadamente 20 microlitros cada una de esta solucion pueden congelarse y desolvatarse tal como se ha descrito anteriormente para preparar 1.000 microgranulos. Cuando se reconstituyen, los microgranulos pueden usarse normalmente para preparar un total de aproximadamente 200 mililitros de solucion.
Funcionamiento ejemplar del cartucho microflu^dico
En uso, diversos componentes del cartucho 300 pueden hacerse funcionar de la siguiente manera. Las valvulas Vi y Vi' de la red 304 pueden estar configuradas en el estado abierto. Las compuertas Gi y las compuertas de mezcla MGi de la red 304 pueden estar configuradas en el estado cerrado. Los puertos para reactivo R1-R4 pueden ser presionados hacia abajo, por ejemplo, mediante aplicacion de fuerza mecanica, para introducir reactivos lfquidos en la red 304, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Una muestra puede introducirse en la camara de lisis 302 mediante el puerto SP1 y combinarse con partfculas liofilizadas LP dentro de la camara de lisis primaria 306. Normalmente, la muestra incluye una combinacion de partfculas (por ejemplo, celulas) y una solucion tampon. Por ejemplo, una muestra ejemplar incluye aproximadamente 2 partes de sangre completa respecto a aproximadamente 3 partes de solucion tampon (por ejemplo, una solucion de Tris 20 mM a pH 8,0, EDTA 1 mM, y SDS al 1 %). Otra muestra ejemplar incluye estreptococos del grupo B y una solucion tampon (por ejemplo, una solucion de Tris 20 mM a pH 8,0, EDTA 1 mM, y Triton X-100 al 1 %).
En general, el volumen de muestra introducido puede ser mas pequeno que el volumen total de la camara de lisis primaria 306. Por ejemplo, el volumen de muestra puede ser aproximadamente el 50 % o menos (por ejemplo, aproximadamente el 35 % o menos, aproximadamente el 30 % o menos) del volumen total de la camara 306. Una muestra tfpica tiene un volumen de aproximadamente 3 mililitros o menos (por ejemplo, aproximadamente 1,5 mililitros o menos). Un volumen de gas (por ejemplo, aire) puede introducirse, en general, en la camara primaria 306 junto con la muestra. Normalmente, el volumen de gas introducido puede ser de aproximadamente el 50 % o menos (por ejemplo, aproximadamente el 35 % o menos, aproximadamente el 30 % o menos) del volumen total de la camara 306. El volumen de muestra y gas se combinan para presurizar el gas ya presente dentro de la camara 306. La valvula 307 de puerto SP1 impide que el gas salga de la camara 306. Dado que las compuertas G3, G4, G8 y G10 pueden estar en el estado cerrado, se puede impedir que la muestra presurizada entre en la red 304 mediante el puerto SP2.
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La muestra disuelve las partfculas LP en la camara 306. Los reactivos de lisis reconstituidos (por ejemplo, ReadyLyse, mutanolisina) comienzan a lisar celulas de la muestra que liberan polinucleotidos. Otros reactivos (por ejemplo, enzimas proteasas tales como pronasa) comienzan a reducir o desnaturalizar inhibidores (por ejemplo, protemas) dentro de la muestra. Los polinucleotidos procedentes de la muestra comienzan a asociarse con (por ejemplo, unirse a) ligandos de partfculas 218 liberados a partir de partfculas LP. Normalmente, la muestra dentro de la camara 306 puede calentarse (por ejemplo, a al menos aproximadamente 50 °C, a al menos aproximadamente 60 °C) durante un periodo de tiempo (por ejemplo, durante aproximadamente 15 minutos o menos, aproximadamente 10 minutos o menos, aproximadamente 7 minutos o menos) mientras se produce la lisis. En algunas realizaciones, la energfa optica puede usarse al menos en parte para calentar el contenido de la camara de lisis 306. Por ejemplo, el sistema operativo usado para hacer funcionar el cartucho 300 puede incluir una fuente de luz 399 (por ejemplo, una lampara que emite principalmente luz en el infrarrojo) dispuesta en contacto termico y/u optico con la camara 306. Dicha fuente de luz puede ser esa mostrada en conexion con el modulo calefactor 2020, figura 7, numero de referencia 2046. La camara 306 incluye un sensor de temperatura TS usado para monitorizar la temperatura de la muestra dentro de la camara 306. La salida de la lampara puede incrementarse o reducirse basandose en la temperatura determinada con el sensor TS.
Continuando con el funcionamiento del cartucho 300, G2 puede accionarse (por ejemplo, abrirse) proporcionando una trayectoria entre el puerto SP2 de la camara de lisis primaria 306 y el puerto W6 de la camara de residuos de lisis 308. La trayectoria se extiende a lo largo del canal C9, el canal C8, a traves de la region de procesamiento B1, y el canal C11. La presion dentro de la camara 306 impulsa el material de la muestra lisada (que contiene lisado, polinucleotidos unidos a partfculas 218, y otros componentes de la muestra) a lo largo de la trayectoria. La partfculas 218 (con polinucleotidos) pueden ser retenidas dentro de la region de procesamiento B1 (por ejemplo, mediante un filtro) mientras que el lfquido y otros componentes de la muestra fluyen al interior de la camara de residuos 308. Despues de un periodo de tiempo (por ejemplo, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 minutos), la presion en la camara de lisis 306 puede ventilarse abriendo la compuerta G1 para crear una segunda trayectoria entre los puertos SP2 y W6. Las valvulas dobles V1' y V8' pueden cerrarse para aislar la camara de lisis 302 de la red 304.
El funcionamiento del cartucho 300 continua accionando la bomba P1 y abriendo las compuertas G2, G3 y G9. La bomba P1 impulsa el lfquido de lavado en el canal C2 aguas abajo de la union J1 a traves de la region de procesamiento B1 y al interior de la camara de residuos W5. El lfquido de lavado retira inhibidores y otros compuestos no retenidos por las partfculas 218 de la region de procesamiento B1. Cuando el borde posterior del lfquido de lavado (por ejemplo, la interfaz aguas arriba) pasa el orificio de ventilacion hidrofobo H14, la presion procedente del accionador P1 se ventila de la red 304, deteniendo el movimiento adicional del lfquido. Las valvulas dobles V2' y V9' pueden cerrarse.
El funcionamiento continua accionando la bomba P2 y abriendo las compuertas G6, G4 y G8 para mover el lfquido de liberacion desde el deposito de reactivo R1 al interior de la region de procesamiento B1 y en contacto con las partfculas 218. El orificio de ventilacion de aire AV1 ventila presion delante del lfquido de liberacion en movimiento. El orificio de ventilacion hidrofobo H6 ventila presion detras del borde posterior del lfquido de liberacion, deteniendo el movimiento adicional del lfquido de liberacion. Las valvulas dobles V6' y V10' pueden cerrarse.
El funcionamiento continua calentando la region de procesamiento B1 (por ejemplo, calentando las partfculas 218) para liberar los polinucleotidos a partir de las partfculas 218. Las partfculas pueden calentarse tal como se ha descrito anteriormente para el cartucho 200. Normalmente, el lfquido de liberacion incluye aproximadamente hidroxido 15 mM (por ejemplo, solucion de NaOH) y las partfculas pueden calentarse a aproximadamente 70 °C durante aproximadamente 2 minutos para liberar los polinucleotidos a partir de las partfculas 218.
El funcionamiento continua accionando la bomba P3 y abriendo las compuertas G5 y G10 para mover el lfquido de liberacion desde la region de proceso B1 aguas abajo. El orificio de ventilacion de aire AV2 ventila la presion del gas aguas abajo del lfquido de liberacion permitiendo que el lfquido se mueva al interior del canal C16. El orificio de ventilacion hidrofobo H8 ventila presion desde aguas arriba del lfquido de liberacion deteniendo el movimiento adicional. La valvula doble V11' y la valvula V14 pueden cerrarse.
Con referencia a las figuras 19A-19D, la compuerta de mezcla MG11 puede usarse para mezclar una parte del lfquido de liberacion que incluye polinucleotidos liberados a partir de partfculas 218 y tampon de neutralizacion procedente del deposito de reactivo R3. La figura 19A muestra la region de la compuerta de mezcla MG11 antes de presionar hacia abajo el deposito de reactivo R3 para introducir el tampon de neutralizacion en la red 304. La figura 19B muestra la region de la compuerta de mezcla MG11, despues de que el tampon de neutralizacion se ha introducido en los canales C13 y C12. La valvula doble V13' puede cerrarse para aislar la red 304 del deposito de reactivo R3. La valvula doble V12' puede cerrarse para aislar la red 304 de la camara de residuos W3. El tampon de neutralizacion contacta con un lado de una masa 324 de TRS de la compuerta MG11.
La figura 19C muestra la region de la compuerta de mezcla MG11 despues de que el lfquido de liberacion se ha movido al interior del canal C16. Las dimensiones de la red microflmdica 304 (por ejemplo, las dimensiones del canal y la posicion del orificio de ventilacion hidrofobo H8) pueden estar configuradas de modo que la parte de lfquido de liberacion situada entre las uniones J3 y J4 de los canales C16 y C14 corresponda aproximadamente al volumen de
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Ifquido en contacto con las partfculas 218 durante la etapa de liberacion. En algunas realizaciones, el volumen de Ifquido situado entre las uniones J3 y J4 pueden ser menos de aproximadamente 5 microlitros (por ejemplo, aproximadamente 4 microlitros o menos, aproximadamente 2,5 microlitros o menos). En una realizacion ejemplar, el volumen de lfquido de liberacion entre las uniones J3 y J4 puede ser de aproximadamente 1,75 microlitros. Normalmente, el lfquido entre las uniones J3 y J4 incluye al menos aproximadamente el 50 % de polinucleotidos (al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %) de los polinucleotidos presentes en la muestra que entro en la region de procesamiento B1. La valvula V14 puede cerrarse para aislar la red 304 del orificio de ventilacion de aire AV2.
Antes de accionar la compuerta de mezcla MG11, el lfquido de liberacion en la union J4 y el tampon de neutralizacion en la union J6 entre los canales C13 y C12 pueden estar separados por la masa 324 de TRS (por ejemplo, los lfquidos normalmente no estan separados por un volumen de gas). Para combinar el lfquido de liberacion y el tampon de neutralizacion, la bomba P4 y las compuertas G12, G13 y MG11 pueden ser accionadas. La bomba P4 impulsa el volumen de lfquido de neutralizacion entre las uniones J5 y J6 y el volumen de lfquido de liberacion entre las uniones J4 y J3 al interior del canal de mezcla C15 (figura 19D). La masa 324 de TRS normalmente se dispersa y/o se funde permitiendo que los dos lfquidos se combinen. Los lfquidos combinados incluyen una interfaz aguas abajo 335 (formada por la union J3) y una interfaz aguas arriba (formada por la union J5). La presencia de estas interfaces permite una mezcla mas eficiente (por ejemplo, recirculacion del lfquido combinado) que si las interfaces no estuvieran presentes. Tal como se ve en la figura 19D, la mezcla normalmente comienza cerca de la interfaz entre los dos lfquidos. El canal de mezcla C15 puede ser normalmente al menos aproximadamente tan largo (por ejemplo, al menos aproximadamente dos veces tan largo) como una longitud total de los lfquidos combinados dentro del canal.
El volumen de tampon de neutralizacion combinado con el lfquido de liberacion puede determinarse mediante las dimensiones del canal entre las uniones J5 y J6. Normalmente, el volumen de lfquido de neutralizacion combinado puede ser aproximadamente el mismo que el volumen de lfquido de liberacion combinado. En algunas realizaciones, el volumen de lfquido posicionado entre las uniones J5 y J6 puede ser menos de aproximadamente 5 microlitros (por ejemplo, aproximadamente 4 microlitros o menos, aproximadamente 2,5 microlitros o menos). En una realizacion ejemplar, el volumen de lfquido de liberacion entre las uniones J5 y J6 puede ser de aproximadamente 2,25 microlitros (por ejemplo, el volumen total del lfquido de liberacion y el tampon de neutralizacion puede ser de aproximadamente 4 microlitros).
Volviendo a las figuras 15A, 15B, el lfquido de liberacion y tampon de neutralizacion combinados se mueven a lo largo del canal de mezcla C15 y al interior del canal C32 (ventilado aguas abajo por el orificio de ventilacion de aire AV8). El movimiento continua hasta que la interfaz aguas arriba de los lfquidos combinados pasa el orificio de ventilacion hidrofobo H11, que ventila presion procedente del accionador P4 deteniendo el movimiento adicional de los lfquidos combinados.
Continuando con el funcionamiento del cartucho 300, el accionador P5 y las compuertas G14, G15 y G17 pueden ser accionadas para disolver las partfculas de PCR liofilizadas presente en la segunda region de procesamiento B2 en agua procedente del deposito de reactivo R4. El orificio de ventilacion hidrofobo H10 ventila la presion procedente del accionador P5 aguas arriba del agua deteniendo el movimiento adicional. La disolucion de un microgranulo de reactivo de PCR normalmente se produce en aproximadamente 2 minutos o menos (por ejemplo, en aproximadamente 1 minuto o menos). La valvula V17 puede cerrarse.
Continuando con el funcionamiento del cartucho 300, el accionador P6 y la compuerta G16 pueden accionarse para impulsar los compuestos disueltos de la partfcula liofilizada desde la region de procesamiento B2 al interior del canal C31, donde los reactivos disueltos se mezclan para formar una solucion de partfculas liofilizadas disueltas homogeneas. El accionador P6 mueve la solucion al interior de los canales C35 y C33 (ventilados aguas abajo por el orificio de ventilacion de aire AV5). El orificio de ventilacion hidrofobo H9 ventila la presion generada por el accionador P6 aguas arriba de la solucion deteniendo el movimiento adicional. Las valvulas V18, V19, V20' y V22' pueden cerrarse.
Continuando con el funcionamiento del cartucho 300, el accionador P7 y las compuertas G18, MG20 y G22 pueden accionarse para combinar (por ejemplo, mezclar) una parte del lfquido de liberacion neutralizado en el canal 32 entre la compuerta MG20 y la compuerta G22 y una parte de la solucion de partfculas liofilizadas disueltas en el canal C35 entre la compuerta G18 y MG20. Los lfquidos combinados se desplazan a lo largo de un canal de mezcla C37 y al interior de la region de deteccion D2. Un orificio de ventilacion de aire AV3 ventila presion del gas aguas abajo de los lfquidos combinados. Cuando la interfaz aguas arriba de los lfquidos combinados pasa el orificio de ventilacion hidrofobo H13, la presion procedente del accionador P7 puede ser ventilada y los lfquidos combinados pueden situarse dentro de la region de deteccion D2.
El accionador P8 y las compuertas MG2, G23 y G19 pueden accionarse para combinar una parte del agua procedente del deposito de reactivo R4 entre MG2 y la compuerta G23 con una segunda parte de la solucion de partfculas liofilizadas disueltas en el canal C33 entre la compuerta G19 y MG2. Los lfquidos combinados se desplazan a lo largo de un canal de mezcla C41 y al interior de la region de deteccion D1. Un orificio de ventilacion
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de aire AV4 ventila presion del gas aguas abajo de los Kquidos combinados. Cuando la interfaz aguas arriba de los Kquidos combinados pasa el orificio de ventilacion hidrofobo H12, la presion procedente del accionador P8 puede ser ventilada y los lfquidos combinados pueden situarse dentro de la region de deteccion D1.
Continuando con el funcionamiento del cartucho 300, las valvulas dobles V26' y V27' pueden cerrarse para aislar la region de deteccion D1 de la red 304 y las valvulas dobles V24' y V25' pueden cerrarse para aislar la region de deteccion D2 de la red 304. El contenido de cada region de deteccion (lfquido de liberacion neutralizado con polinucleotidos de muestra en la region de deteccion D2 con reactivos de PCR procedentes de la solucion de partfculas liofilizadas disueltas y agua desionizada con reactivos de PCR procedente de la solucion de partfculas liofilizadas disueltas en la region de deteccion D1) puede someterse a etapas de calentamiento y enfriamiento para amplificar polinucleotidos (si estan presentes en la region de deteccion D2). Las valvulas dobles de cada region de deteccion impiden la evaporacion del contenido de la region de deteccion durante el calentamiento. Los polinucleotidos amplificados pueden detectarse normalmente usando deteccion de fluorescencia. Por lo tanto, normalmente por encima de una o ambas de las regiones de deteccion D1, D2, hay una ventana (como, por ejemplo, en la figura 9) que permite la deteccion de fluorescencia procedente de una sustancia fluorescente en la mezcla de reaccion cuando un detector se situa por encima de la ventana.
Aunque los cartuchos para llevar a cabo diversas fases de procesar muestras se han mostrado y descrito en el presente documento teniendo una configuracion generalmente plana, pueden usarse otras configuraciones y son coherentes con un sistema integrado tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un cartucho que tiene una configuracion generalmente similar a un tubo o similar a un vial se describe en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2006-0166233.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Ejemplo 1: Aparato para el procesamiento de polinucleotidos
Este ejemplo no limitante describe diversas realizaciones ejemplares de un aparato, sistema, cartucho microflmdico, kit, metodos, y producto de programa informatico, tal como se muestra en las figuras 28 - 40.
Por ejemplo, la figura 28 es un diagrama de un aparato 800 que puede funcionar como un sistema de analisis de polinucleotidos en tiempo real, de mesa y pequeno. Dicho sistema puede realizar diversos analisis en polinucleotidos, por ejemplo, analizar muestras de pacientes en busca de elementos distintivos de una o mas enfermedades infecciosas. El aparato puede funcionar, por ejemplo, como un sistema de analisis de polinucleotidos en tiempo real para uso en el mercado del diagnostico clmico para ayudar al personal clmico a analizar y tratar pacientes antes de que abandonen el entorno medico. El aparato 800 puede incluir, por ejemplo, una carcasa que tiene una salida de visualizacion 802, una tapa 804 que tiene un asa 805, y un lector de codigo de barras 806. Con referencia a las figuras 28 y 36, el aparato 800 tambien puede incluir un compartimento de recepcion 807, que puede estar cubierto por la tapa 804. En diversas realizaciones, el aparato 800 puede ser portatil, por ejemplo, el aparato 800 puede pesar aproximadamente 10 kg y puede tener dimensiones de aproximadamente 25 cm de ancho por 40 cm de profundo por 33 cm de alto.
El aparato 800 se usara con un kit de muestras 810, mostrado en la figura 29. El kit de muestras 810 puede incluir, por ejemplo, un cartucho microflmdico 812 con una etiqueta opcional 813 (por ejemplo, una etiqueta con codigo de barras), un recipiente para muestras 814 con una etiqueta opcional 815 (por ejemplo, una etiqueta con codigo de barras), un filtro opcional 818, una punta de pipeta opcional 820 y una jeringa opcional 822. Con referencia a la figura 30, uno o mas componentes del kit de muestras 810 (por ejemplo, el cartucho microflmdico 812) pueden envasarse, por ejemplo, en una bolsita sellada 824 que puede estar opcionalmente hermeticamente sellada con un gas inerte tal como argon o nitrogeno.
El cartucho microflmdico 812, tal como se representa en la figura 31, puede incluir una entrada de muestras 826, una pluralidad de depositos autoperforantes 828, un deposito de lisis 830, un deposito de residuos 832, una etiqueta opcional 813 (por ejemplo, un codigo de barras), y un miembro de colocacion correcta 836 (por ejemplo, una esquina biselada). Con referencia a las figuras 31 y 36, el miembro de colocacion correcta 836 puede encajar en una caractenstica de miembro de colocacion correcta complementaria 809 del compartimento de recepcion 907 en el aparato 800, que puede usarse para facilitar la orientacion del cartucho 812 cuando se inserta en el aparato 800. En algunos ejemplos, el cartucho microflmdico 812 puede estar disenado para ser ligeramente mas pequeno (por ejemplo, 50-300 micras, normalmente 200-300 micras) que el pocillo 807 en el modulo calefactor/sensor 842 para facilitar la colocacion y la retirada del cartucho microflmdico 812.
Con referencia a las figuras 32 y 33, las etiquetas, por ejemplo, codigos de barras 813 y 815, en el cartucho microflmdico 812 y/o el recipiente para muestras 814 pueden ser registradas por el aparato 800, normalmente antes de realizar un analisis, por ejemplo, introduciendo el codigo de una etiqueta manualmente usando un lector de codigo de barras 806.
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En preparacion para analizar una muestra, la punta de pipeta 820 del kit 810 puede unirse a la jeringa 822, y puede extraerse una muestra del recipiente para muestras 814 al interior de la jeringa 822. Con referencia a la figura 34, el filtro 818 puede unirse a continuacion al deposito de lisis 830 del cartucho microflmdico 812 mediante la entrada de muestras 826 (por ejemplo, usando un cierre Luer con una valvula de pico de pato en la entrada de muestras 826) y el contenido (por ejemplo, una mezcla de muestra/aire) de la jeringa 822 pueden inyectarse en el cartucho microflmdico 812 a traves del filtro 818. Aire adicional (por ejemplo, 1-3 ml) puede ser extrafdo al interior de la jeringa 822 (tal como se muestra en la figura 35) de modo que el cartucho microflmdico 812 pueda presurizarse (por ejemplo, 5-50 libras por pulgada cuadrada (psi) con respecto a la presion ambiente, normalmente entre 5-25 psi, mas normalmente entre 10-15 psi, con respecto a la presion ambiente). El cartucho microflmdico 812 puede contener tampones, reactivos y similares, por ejemplo, en el deposito de lisis 830 en forma de lfquidos, solidos, microgranulos de reactivo liofilizado, y similares. El cartucho microflmdico 812 puede agitarse para mezclar la muestra inyectada con los tampones, reactivos, etc.
Con referencia a la figura 35, el cartucho microflmdico 812 puede presurizarse usando la jeringa 822 y el filtro 818 con aire anadido. El cartucho microflmdico 812 puede colocarse en el compartimento de recepcion 907 del aparato 800, tal como se muestra en la figura 36, y puede asentarse en una unica orientacion en el compartimento de recepcion 907 del aparato 800 debido a la interaccion entre el miembro de colocacion correcta 836 en el cartucho microflmdico 812 y el miembro de colocacion correcta complementario 809 en el compartimento de recepcion 907.
Tal como se muestra en las figuras. 37 y 38, el cierre de la tapa 804 del aparato 800 puede servir para bloquear la luz ambiente procedente del compartimento de muestras. Adicionalmente, el cierre de loa tapa 804 puede colocar un detector optico contenido en la tapa 804 en posicion con respecto al cartucho microflmdico 812. Ademas, la tapa 804 del aparato puede cerrarse para aplicar presion al cartucho microflmdico 812 para garantizar el contacto termico en el pocillo 807 con el modulo calefactor/sensor 842. Con referencia a las figuras 39 y 40, el modulo calefactor/sensor 842 del aparato 800 puede ser amovible para limpieza, mantenimiento, o para la sustitucion por una fase de calentamiento personalizada para un cartucho microflmdico particular 812.
Ejemplo 2: Aparato para el procesamiento de polmucleotidos
Este ejemplo no limitante describe diversas realizaciones de un aparato, sistema, cartucho microflmdico, kit, metodos, y producto de programa informatico, en particular, diversos aspectos del uso del aparato 800 tal como se describe en el ejemplo 1 relacionados con aspectos ejemplares del metodo y el producto de programa informatico.
Con referencia a las figuras 28-40, el aparato 800 puede incluir o estar configurado con un producto de programa informatico en forma de software de control. El software puede proporcionar al aparato un “MODO PREpARADO” (por ejemplo, modo en espera) cuando no esta siendo usado para el analisis donde el aparato 800 puede enchufarse y puede esperar la entrada por parte del usuario. Un operador puede abrir por deslizamiento la tapa 804 usando el asa 805 hasta su posicion completamente abierta. El software y el aparato 800 pueden estar configurados para indicar, en la salida de visualizacion 802, que la tapa 804 esta abierta y el aparato 800 esta preparado. El software y el aparato 800 pueden estar configurados para realizar un autoanalisis de hardware y/o software. El software y el aparato 800 pueden estar configurados para solicitar la introduccion de una ID de usuario y pantalla de contrasena, por ejemplo, para permitir a un usuario iniciar sesion usando una interfaz de pantalla tactil (por ejemplo, tocando teclas de un teclado emulado en la salida de visualizacion 802), escaneando un codigo de barras que representa al usuario, tal como el que se encuentra en una placa de ID, con el lector de codigo de barras 806, y similares.
Un usuario puede retirar a continuacion el cartucho microflmdico 812 y el recipiente para muestras 814 de la bolsita sellada 824. El software y el aparato 800 pueden estar configurados para solicitar que el codigo de barras 813 en el cartucho microflmdico 812 y/o el codigo de barras 815 en el recipiente para muestras 814 sean escaneados usando el lector de codigo de barras 806, como en las figuras 32 y 33, antes de realizar cualquier analisis. El software y el aparato 800 pueden estar configurados para realizar analisis de cualificacion basados en los codigos de barras (por ejemplo, para determinar si el cartucho microflmdico 812 y el recipiente para muestras 814 procedfan de la misma bolsita sellada 824, si el kit 810 ha superado una fecha de caducidad, si el kit 810 puede estar configurado para usarlo con una secuencia de analisis particular que sera llevada a cabo por el software y el aparato 800 y similares) antes de realizar analisis de acido nucleico. La salida de visualizacion 802 puede avanzar a continuacion a una pantalla que requiere una entrada, tal como un identificador del paciente. El aparato 800 tambien puede permitir que la informacion del paciente sea introducida escaneando un codigo de barras (por ejemplo, en una pulsera de ID medica asignada al paciente) usando el lector de codigo de barras 806. La salida de visualizacion 802 puede proporcionar informacion al usuario respecto, por ejemplo, a resultados de un analisis que se realizo previamente, opciones de seleccion para analisis a realizar, y similares. Los ejemplos de informacion que se puede proporcionar incluyen, aunque sin limitarse a: una determinacion de analisis (por ejemplo, resultado positivo/negativo), un resultado de control interno (por ejemplo, positivo y/o negativo), y/o resultados del paciente. En este ejemplo, tambien se le puede instar al usuario a permitir que el aparato 800 realice tareas adicionales con los datos de analisis, tal como registrar o transmitir los datos a una impresora, dispositivo de almacenamiento, o a un ordenador, y similares.
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Diversas realizaciones del software y el aparato 800 pueden estar configuradas para permitir a un usuario realizar una o mas funciones opcionales (por ejemplo, ajustes al aparato 800 o el software) incluyendo, aunque sin limitarse a: modificar los ajustes del usuario, modificar los ajustes de cierre de sesion, ajustar el reloj del sistema, modificar los ajustes de la pantalla, modificar los requisitos de CC, ajustar las preferencias de notificacion, configurar una impresora conectada, configurar una conexion de red, enviar datos mediante una conexion de red, seleccionar o adaptar protocolos de analisis de datos, o similares.
En diversas realizaciones, el software puede incluir una interfaz del usuario y firmware del dispositivo. El software de la interfaz del usuario puede permitir aspectos de interaccion con el usuario incluyendo, aunque sin limitarse a, introducir informacion sobre el paciente/la muestra, monitorizar el progreso del analisis, advertencias de error, imprimir resultados del analisis, subida de resultados a bases de datos, actualizacion del software, y similares. El firmware del dispositivo puede hacer funcionar el aparato 800 durante los analisis analtticos y puede tener una parte generica que puede ser independiente del analisis y una parte espedfica del analisis que esta siendo realizado. La parte espedfica del analisis (“protocolo”) puede especificar las operaciones microflmdicas y su orden para conseguir el analisis. La figura 41A muestra una captura de pantalla de una interfaz ejemplar que presenta datos del sensor de calor en tiempo real. La figura 41B muestra una captura de pantalla de una interfaz ejemplar que presenta datos del detector optico en tiempo real.
Ejemplo 3: Aparato para el procesamiento de polmucleotidos
Este ejemplo no limitante describe diversas realizaciones del aparato, sistema, cartucho microflmdico, kit, metodos, y producto de programa informatico reivindicados. En una realizacion, el aparato 800, mostrado en la figura 28, puede ser un dispositivo de PCR en tiempo real, autonomo basado en tecnologfa microflmdica para diagnostico rapido y preciso de patogenos (por ejemplo, colonizacion por Streptococcus del grupo B (GBS) en mujeres prenatales). En una realizacion ejemplar, cuando el cartucho microflmdico 812 (figura 31) puede instalarse, el aparato 800 puede accionar operaciones en cartucho, detectar y analizar los productos de una amplificacion por PCR y/o presentar los resultados en una interfaz del usuario grafica. El cartucho microflmdico 812 puede incluir una pluralidad de camaras y/o subunidades, para realizar diversas tareas, con intervencion limitada o ninguna por el usuario. La figura 42 es una representacion esquematica de las diversas camaras y/o subunidades en un cartucho microflmdico ejemplar 812. El cartucho microflmdico 812 puede aceptar muestras clmicas sin procesar (por ejemplo, frotis vaginal/rectal sumergido en tampon de transporte en el caso de GBS) mediante la entrada de muestras 826, que puede ser un puerto de inyeccion de estilo Luer. Las muestras de frotis clmico que contienen celulas y restos humanos y bacterianos pueden recogerse de forma rutinaria en 2 ml de tampon de transporte. Sin embargo, pequenos volumenes (por ejemplo, del orden de unos pocos microlitros) pueden procesarse facilmente en dispositivos microflmdicos. La incorporacion de una interfaz entre macro- y micro-operaciones puede permitir la adaptacion de la tecnologfa microflmdica para el diagnostico clmico. Tras la inyeccion de una muestra, el cartucho puede colocarse en el aparato 800 y operaciones adicionales; por ejemplo, preparacion de muestras, medicion/mezcla de reactivos, y amplificacion/deteccion por PCR, pueden realizarse de manera automatizada y sin manos.
La figura 43 es una representacion esquematica de las etapas relacionadas con PCR y deteccion que pueden realizarse en un cartucho microflmdico ejemplar 812. En diversas realizaciones, las etapas para procesar muestras para deteccion y diagnostico de patogenos basadas en PCR (por ejemplo, GBS a partir de frotis vaginales/rectales) pueden incluir: lisis para liberar ADN (por ejemplo, lisis de celulas de GBS para liberar polinucleotidos), captura y concentracion de aDn, y minimizacion de inhibidores y competidores para limpiar el ADN para compatibilidad con PCR. Los inhibidores presentes en muestras clmicas pueden incrementar el riesgo de un resultado falso negativo para analisis de diagnostico basados en PCR a menos que su influencia pueda mitigarse a traves de limpieza de muestras.
La lisis de celulas puede conseguirse mediante metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, activacion por calor y/o qmmica. En algunas realizaciones, despues de que una muestra de 1,0 +/- 0,2 ml pueda inyectarse en el deposito de lisis 830 mediante la entrada de muestras 826, el aparato 800 puede hacer que la muestra se mezcle con reactivos de lisis procedentes del reactivo de almacenamiento humedo 838 y se caliente (por ejemplo, durante 7 minutos) en el deposito de lisis 830. Usando este protocolo, se ha conseguido mas del 90 % de eficiencia de lisis para GBS y otras celulas bacterianas. Los reactivos de lisis pueden incorporar tambien una matriz de afinidad por ADN basada en perlas de latex de policarbonato - poliestireno modificadas con poliamida cationica (por ejemplo, el miembro de retencion 821) para capturar el ADN cargado negativamente que puede ser liberado durante el proceso lttico. Las perlas de afinidad pueden unirse a ADN cargado negativamente con afinidad muy elevada mientras que potenciales inhibidores de pCr pueden no conseguir unirse o pueden ser retirados durante posteriores etapas de lavado.
En una realizacion ejemplar, el aparato 800 tambien puede automatizar la captura y la limpieza del ADN a partir de lisado de muestra impuro (por ejemplo, lisado de muestra de GBS) para generar ADN “listo para PCR”. El contenido del deposito de lisis 830 (por ejemplo, muestra de 1,0 +/- 0,2 ml y reactivos) puede transferirse a la camara de procesamiento de ADN 840. Perlas de afinidad con ADN unido procedente de la muestra introducida pueden atraparse usando una columna de perlas en lmea (por ejemplo, un filtro con tamano de poro espedfico) y una bomba en cartucho puede usarse para lavar las perlas de afinidad para retirar fracciones unidas inespedficamente,
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asf como inhibidores solubles realizando un intercambio de tampon. El ADN unido puede liberarse mediante metodos conocidos, por ejemplo, calentando las perlas de afinidad (por ejemplo, a 80 °C) y/o usando un tampon de liberacion. El ADN intacto puede recuperarse con esta liberacion de etapa unica en volumen muy pequeno (3-4 |il) consiguiendo de este modo una concentracion significativa del ADN diana original. Otros metodos conocidos en la tecnica pueden ser empleados por el sistema para conseguir lisis de celulas y captura, lavado y liberacion de ADN.
En el ejemplo descrito en este caso, la base para el ensayo de PCR en tiempo real usado es el ensayo TaqMan®, cuyo funcionamiento esquematico es tal como se representa en la figura 44. Sin embargo, pueden usarse otras tecnicas de ensayo conocidas en la tecnica (por ejemplo, fluorescencia de SYBR-Green I). La reaccion de PCR de TaqMan® aprovecha la actividad nucleasa 5' de ciertas polimerasas de ADN para escindir una sonda de TaqMan® durante la PCR. La sonda de TaqMan® contiene un colorante informador en el extremo 5' de la sonda y un colorante extintor en el extremo 3' de la sonda. Durante la reaccion, la escision de la sonda puede separar el colorante informador y el colorante extintor, lo que puede dar como resultado una mayor fluorescencia del informador. La acumulacion de los productos de PCR puede detectarse directamente monitorizando el incremento de fluorescencia del colorante informador. Cuando la sonda esta intacta, la proximidad del colorante informador al colorante extintor puede dar como resultado la supresion del informador (la emision de fluorescencia puede ser mediante transferencia de energfa de tipo Forster). Durante la PCR, si la diana de interes puede estar presente, la sonda puede hibridar entre los sitios de cebador directo e inverso. La ADN polimerasa normalmente puede escindir la sonda entre el informador y el extintor si la sonda hibrida con la diana. Los fragmentos de la sonda pueden desplazarse a continuacion desde la diana, y la polimerizacion de la cadena puede continuar. El extremo 3' de la sonda puede bloquearse para impedir la extension de la sonda durante PCR.
Este proceso puede producirse normalmente, por ejemplo, en cada ciclo termico y no debe interferir en la acumulacion exponencial de producto. El incremento de la senal de fluorescencia puede detectare normalmente si la secuencia diana puede ser complementaria a la sonda y puede amplificarse durante PCR. El ensayo TaqMan® puede ofrecer una rigurosidad de dos veces (el cebador normalmente se une y la sonda normalmente se une a la secuencia diana) y por lo tanto la deteccion de cualquier amplificacion inespedfica puede reducirse o eliminarse.
Conjuntos de cebadores y sonda de PCR en tiempo real para GBS (Streptococcus agalactiae) se han disenado y puestos a prueba usando muestras clmicas. Los reactivos de PCR pueden incluir un par de cebadores de hibridacion espedficos de la parte del gen cfb entre las posiciones 328 y 451 que codifican el factor CAMP (Christie, Atkins y Munch-Petersen, vease, por ejemplo, Boll 1st Sieroter Milan, (Jul.-Ago. de 1955); 34(7-8): 441-52). El factor CAMP es una protema extracelular difundible y es producida por la mayona de GBS. El gen que codifica el factor CAMP, el gen cfb (numero de entrada en el GenBank: X72754), puede estar presente en aislado de GBS y ha sido usado para el desarrollo de una identificacion basada en PCR de GBS (Danbing K., y col., (2000), Clinical Chemistry, 46, 324-331). Ademas, una sonda fluorogena de estilo TaqMan® espedfica tambien se ha disenado y puesto a prueba, en un ejemplo, para reconocer la secuencia amplificada entre los cebadores que permita deteccion en tiempo real usando mediciones de fluorescencia.
Con el fin de evaluar el proceso de limpieza de ADN y monitorizar el rendimiento de los cebadores de la invencion en el tiempo de ejecucion, pueden emplearse plasmidos de control interno positivos (por ejemplo, tal como se representa en la figura 45). En diversas realizaciones, los cebadores de GBS espedficos han sido empleados para construir plasmidos de control interno de la siguiente manera. Un trozo de secuencia de ADN aleatoria flanqueada por los cebadores de PCR espedficos fue generado mediante smtesis de oligonucleotidos. Cualquier posible homologfa entre esta secuencia y otras secuencias de ADN especialmente ADN de Strep. agalactiae, disponible en el Genbank se comprobo cuidadosamente. Una sonda de estilo TaqMan® fluorogena se diseno para reconocer los amplicones generados a partir de esta secuencia y un fluoroforo (Cal Orange 560 o analogo) diferente del usado para ADN de secuencia diana de GBS (FAM o analogo), se uso para deteccion fluorescente de color doble simultanea. En ciertas realizaciones, la cantidad del plasmido de control interno que se incluira en la reaccion de PCR se optimizo para permitir la amplificacion del producto de control interno sin efectos perjudiciales significativos sobre la amplificacion espedfica de GBS. En algunos ejemplos, la especificidad de las sondas para controles internos tambien se analizo y se optimizo por PCR usando el ADN purificado a partir de los patogenos incluidos en la lista de analisis de reactividad cruzada especificada previamente y ADN de GBS.
En una realizacion ejemplar, un sistema robusto para llevar a cabo termociclado rapido usando un volumen microflmdico, se diseno, se desarrollo y se implemento en un formato microflmdico. Los volumenes microflmdicos que pueden acomodarse vanan entre aproximadamente 0,01 |il y aproximadamente 10 |il, donde la limitacion principal en el lfmite inferior es la sensibilidad de deteccion. Los volumenes ejemplares estan en el intervalo de 0,5 - 4,5 |il. Otros volumenes ejemplares mas son 2 |il. Las figuras 41A y 41B muestran capturas de pantalla de la salida de un aparato ejemplar 800 (por ejemplo, tal como se ve en la LCD sensible al tacto 846). La figura 41A muestra un modulo de PCR microflmdico que experimenta termociclado rapido y la figura 41B muestra un ensayo de PCR en tiempo real. Estos datos pueden estar disponibles para el usuario del aparato 800 o pueden estar ocultos. En este caso, los cartuchos de GBS tambien se disenaron para acomodar dos camaras de PCR para permitir incorporar un control negativo incorporado con cada muestra analizada para mejorar la fidelidad del resultado. En algunos ejemplos, la qmmica se ha optimizado y se ha desarrollado un sistema de deteccion compatible para permitir PCR multiple de dos colores, facilitando de este modo el uso de controles positivos internos para comprobar la eficiencia
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de preparacion de muestras y el rendimiento apropiado de la instrumentacion asociada. Debido a masas termicas muy pequenas y algoritmos de control de retroalimentacion eficientes, puede ser posible realizar termociclado ultrarrapido, de modo que una PCR de 50 ciclos tfpica pueda completarse en aproximadamente 20 minutos. El calor requerido para el termociclado puede ser proporcionado por el modulo calefactor/sensor 842 y deteccion multiplexada en tiempo real puede ser llevada a cabo por el modulo optico (por ejemplo, el modulo de deteccion fluorescente 844).
En diversas realizaciones, cualquier numero (por ejemplo, 0, 1, 2 o todos) de los reactivos para realizar la PCR pueden incorporarse en el cartucho en un formato liofilizado. En el momento del uso, los reactivos de PCR liofilizados pueden reconstituirse usando, por ejemplo, agua desionizada, que puede almacenarse en el cartucho microflmdico 812 en un formato de blister (por ejemplo, en un deposito autoperforante 828). Los reactivos de PCR reconstituidos pueden dividirse en alfcuotas en, por ejemplo, dos partes. En diversas realizaciones, ADN listo para PCR (emitido del modulo de preparacion de muestras) puede mezclarse con una alfcuota y enviarse al primer canal de PCR para PCR en tiempo real (PCR de muestra). Agua DI que contiene ADN no diana puede mezclarse con la segunda alfcuota de los reactivos de PCR y puede enviarse a la otra camara de PCR (PCR negativa) para servir como control negativo.
Ejemplo 4: Aparato para el procesamiento de polmucleotidos
En diversas realizaciones, un sistema microflmdico (por ejemplo, el cartucho microflmdico 812) puede incluir componentes tales como microbombas para mover/mezclar gotas de lfquido, microrreactores para realizar reacciones bioqmmicas iniciadas termicamente, y microvalvulas o microcompuertas para permitir el control de las operaciones de bombeo de lfquido, asf como para aislar regiones del cartucho tales como las camaras de PCR durante el termociclado.
En algunas realizaciones, puede usarse un sistema de manipulacion de gotas de lfquido para producir inyeccion y movimiento de muestras de lfquido basandose en bombas accionadas termicamente (por ejemplo bombeo termo- neumatico) que puede ser accionadas electronicamente sin el uso de valvulas mecanicas. Por ejemplo, calentando el aire atrapado dentro de camaras que pueden estar conectadas al canal principal, puede generarse una presion de aire significativa para bombeo termo-neumatico. Incrementar la temperatura del aire puede hacer que la presion dentro de la camara se eleve hasta que la presion pueda ser suficientemente elevada para separar una gota (medir una alfcuota) y moverla a la ubicacion deseada. Esta tecnica puede implementarse como un mecanismo de accionamiento en el cartucho y puede usar, por ejemplo, camaras moldeadas, canales y calefactores. Normalmente, esto puede evitar piezas moviles mecanicas y puede facilitar la fabricacion. La figura 46 muestra fotos de una demostracion que muestra la mezcla de dos fluidos (“A” - azul y “B” - naranja) usando el sistema de manipulacion de gotas descrito anteriormente. Las bombas de presion P1 y P2 pueden activarse de manera controlada con precision, lo que puede empujar a los lfquidos a moverse como gotas discretas rodantes alternas a lo largo del canal M, donde pueden mezclarse, y finalmente situarse en la camara C, donde puede tener lugar la PCR.
En algunas realizaciones, materiales termicamente expansivos tales como gas, lfquido vaporizable facilmente (por ejemplo, vaporizable entre 25 °C y 100 °C a 1 atmosfera), y/o un polfmero que se expande termicamente (por ejemplo, Expancel) pueden introducirse en bombas accionadas termicamente (por ejemplo, camaras de aire termoneumaticas), lo que puede minimizar el tamano de las bombas para generar presiones diferenciales mayores de 5 psi. Estos materiales pueden expandirse, por ejemplo, en mas del 100 % cuando puede alcanzarse una temperatura umbral, haciendo que este llene parcial o completamente la camara termoneumatica causando compresion adicional del aire.
Por ejemplo, las figuras 47A y 47B representan una bomba accionada termicamente 500 basandose en un material de transicion de fase (PTM) 510 (un PTM de un punto de fusion conocido (por ejemplo, 60 °C/ 75 °C/ 90 °C) tal como una cera de parafina, soldadura, Expancel, o similares), en una configuracion cerrada (figura 47A) y una abierta (figura 47B). El PTM 510 puede estar constrenido a una ubicacion espedfica. La ubicacion espedfica puede ser una camara sellada 512 con el PTM 510 (normalmente aproximadamente 50-100 |il) depositado sobre un laminado. Tras calentar la bomba a una temperatura por encima de 120 °C, el PTM 510 se expande de forma irreversible (hasta 40 veces su tamano original), comprimiendo el aire dentro de la camara 512, desplazando el aire de la camara, y haciendo que la compuerta adyacente 514 se abra. Las figuras 47C y 47D muestran otro ejemplo de una bomba 501 con polfmero expancel 511 en la camara 513 que puede ser accionada para hacer funcionar la compuerta 515.
Una muestra clmica ejemplar introducida en el cartucho microflmdico 812 puede tener un volumen de aproximadamente 1 mililitro. Despues de la lisis enzimatica/termica de las celulas, el ADN liberado puede estar unido a microperlas de afinidad. Estas microperlas pueden ser, por ejemplo, del orden de 10 micras de tamano. En diversas realizaciones, una cantidad total de perlas en el intervalo de unos pocos millones puede usarse por cartucho microflmdico 812 para concentracion de ADN. En algunos casos, una presion minima de 10 psi (por ejemplo, 10 psi, 11 psi o 15 psi) puede usarse para concentrar las perlas contra un area de filtro en lmea de unos pocos milfmetros (tamano de poro de 8 micras) en unos pocos minutos (por ejemplo 3 minutos). Esta presion puede generarse, por ejemplo, inyectando aire extra (por ejemplo, 1-3 ml) en la camara de lisis a granel del cartucho microflmdico 812. En algunas realizaciones, una valvula de pico de pato de una via en la entrada Luer puede usarse
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Reactivos que pueden emplearse para la preparacion de muestras y reacciones de PCR pueden bombearse al interior de la red microflmdica presionando hacia abajo las cupulas del blister de reactivo mediante la corredera del instrumento durante el uso del instrumento.
En realizaciones ejemplares, las enzimas empleadas normalmente para lisis celular, capsula de ADN, y para realizar PCR en tiempo real pueden liofilizarse en microgranulos y almacenarse en diferentes ubicaciones del cartucho. El contacto de aire puede minimizarse almacenando los microgranulos en el cartucho microflmdico 812, por ejemplo, en una camara purgada con nitrogeno o en una estructura de canal sellada en ambos extremos del microcanal mediante compuertas termicas. Los tampones empleados normalmente para preparacion de muestras, hidratacion de reactivos y PCR pueden almacenarse en blfsteres para reactivo sellados hermeticamente (por ejemplo, los depositos autoperforantes 828). Los materiales usados para preparar el blister para reactivos pueden tener una barrera al vapor de la humedad elevada y pueden minimizar la perdida de lfquido durante el almacenamiento del cartucho durante un ano. Los residuos generados a partir de la muestra clmica asf como los diversos tampones de lavado pueden almacenarse incorporados en el cartucho en camaras y microcanales (por ejemplo, el deposito de residuos 832, que pueden ser normalmente be resistentes a las fugas).
Ejemplo 5 Aspectos de PCR en tiempo real
Una pluralidad de etapas que pueden usarse para el diagnostico basado en PCR en tiempo real, preciso de patogenos (por ejemplo, colonizacion por Streptococcus del grupo B (GBS) en mujeres prenatales) se integraron en un unico cartucho desechable basado en tecnologfa microflmdica, tal como se muestra en la figura 48. Etapas ejemplares que pueden realizarse en una operacion de estilo “entra una muestra; sale un resultado” en dicho cartucho incluyen: lisis a granel; captura, lavado y liberacion de ADN; y preparacion y ejecucion de PCR. En diversas realizaciones de este cartucho, la muestra y los reactivos pueden estar contenidos incorporados en el cartucho microflmdico 812 (tal como se muestra en la figura 31) y no hay normalmente necesidad de interaccion manual con la operacion excepto, por ejemplo, durante el acto de inyectar la muestra en el dispositivo. Orificios de ventilacion hidrofobos situados estrategicamente pueden estar incluidos para retirar el aire atrapado formado durante el procesamiento y reactivos normalmente empleados para el ensayo pueden envasarse como perlas liofilizadas en el cartucho. Los lfquidos requeridos para reconstitucion pueden almacenarse en bolsitas blister que los liberan en el momento del uso.
En diversas realizaciones, muestras (por ejemplo, muestras de GBS) pueden introducirse a traves de la entrada de muestras 826, que puede tener un accesorio Luer para acomodar una jeringa. Un pre-filtro (por ejemplo, unido a la jeringa) puede usarse para retirar al menos una parte de impurezas en bruto de la muestra y, en algunas realizaciones, la muestra (por ejemplo, 1 ml) puede lisarse en la camara de lisis usando calor y/o enzimas ltticas. Enzimas tales como pronasa, proteinasa K, y ARNasaA pueden usarse (por ejemplo, durante la etapa de lisis) para retirar la materia proteinacea inhibidora y moleculas de ARN competidoras. Con referencia a la figura 49, perlas de captura de ADN tambien pueden estar incluidas en la mezcla maestra. La muestra lfquida lisada (por ejemplo, que contiene los GBS y/o y otro ADN unido a perlas de afinidad) puede retrofluir al interior del cartucho microflmdico desde la salida de la camara de lisis. En algunos ejemplos, las perlas de afinidad con ADN capturado pueden ser retenidas por un filtro en lmea, mientras que los restos no deseados y el exceso de lfquido pueden ser enviados a la camara de residuos. En dichas realizaciones, las perlas usadas pueden ser no magneticas, o magneticas, y el filtro se selecciona para discriminar partfculas por tamano. En otras realizaciones, las perlas son magneticas, y estan concentradas en una ubicacion particular del cartucho microflmdico, tal como una camara o un canal, aplicando un campo magnetico configurado para concentrar lmeas de flujo en la ubicacion en cuestion. El iman empleado puede ser un electroiman, tal como el controlado por el procesador para encenderlo y apagarlo en momentos especificados durante el analisis de muestras. El iman puede ser, como alternativa, un iman permanente, tal como uno que se mueve dentro y fuera del lugar cuando se requiere.
En algunas realizaciones, la camara de residuos esta equipada con un agente antiespumante, tales como simeticona. Puede producirse una vigorosa formacion de burbujas en la camara de residuos, dado que el lfquido entra en ella a alta velocidad y, tras la mezcla con aire en la camara de residuos, forma espuma. Es indeseable que la espuma desborde de la camara de residuos. La presencia de un agente desespumante puede mitigar este fenomeno. El agente desespumante puede estar presente en forma de polvo, comprimido, microgranulo, o partfcula.
En algunas realizaciones, las perlas pueden someterse a lavado para retirar materia no unida y unida inespedficamente y el ADN limpiado puede liberarse en un compartimento de pequeno volumen (~3 |il) y concentrarse (por ejemplo, en un factor de aproximadamente 300). En diversas realizaciones, el ADN concentrado puede mezclarse a continuacion con los reactivos de PCR apropiados y/o ser enviado a un canal de PCR para PCR en tiempo real. Un plasmido de control interno (junto con su sonda analoga) tambien puede incluirse en el primer canal de PCR, que puede actuar como control positivo. En un segundo canal de PCR (si esta presente), agua DI que contiene ADN no diana y el control interno puede mezclarse junto con los reactivos de PCR, para actuar como control negativo.
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Un usuario puede introducir una muestra en la muestra de lisis a granel a traves de una valvula de pico de pato Luer (por ejemplo, la entrada de muestras 826), agitar suavemente para disolver microgranulos del reactivo de lisis, e introducir una cantidad en exceso de aire (por ejemplo, 0,25-0,75 ml) en la camara de lisis para sobrepresurizar la camara de lisis. La presion absoluta (P) generada en la camara de lisis que tiene un volumen de camara, Vcamara, esta relacionada con la cantidad de muestra lfquida inyectada, Vmuestra, y el volumen de aire extra inyectado, Vaire extra, mediante la formula:
P= _______Patm (V camara — V muestra)________________________
(V camara + V muestra + V aire extra)
El cartucho microflmdico 812 puede colocarse a continuacion en el aparato 800 y el modulo deslizante 848 cerrarse. Al cerrarse, el modulo deslizante 848 puede presionar los blfsteres para reactivo (por ejemplo, depositos autoperforantes 828), haciendo que estallen y liberen los reactivos (por ejemplo, tampon de lavado, tampon de liberacion, tampon de neutralizacion y agua) al interior de los canales con reactivos.
En diversas realizaciones, el aparato 800 puede realizar cualquiera o todas de las siguientes etapas. En referencia a las figuras 50A-50J en los sucesivo, diversos elementos tambien pueden estar ubicados con los mismos indicadores en las figuras 15A y 15B. Con referencia a la figura 50A, valvulas (V3, V4, V5, V7, V12, V13, V15, V16, V23) a ambos lados del canal que contiene los 4 reactivos pueden cerrarse y la lampara de lisis a granel puede activarse para calentar la camara de lisis a granel, por ejemplo, a 60 °C durante 7 minutos (por ejemplo, usando el sensor de temperatura L en la figura 50B para retroalimentacion). Con referencia a la figura 50b, la compuerta G1 puede abrirse para drenar, durante una cantidad predeterminada de tiempo (por ejemplo, 2-5 minutos dependiendo del tipo de muestra), el lfquido (que contiene lisado, ADN unido a perlas de afinidad por ADN, etc.) a traves del filtro de captura de perlas al interior de la camara de residuos. Las perlas de ADN pueden quedar atrapadas contra el filtro en lmea mientras que el otro lfquido fluye hasta la camara de residuos. La compuerta G7 puede abrirse para ventilar el exceso de lfquido y/o de presion en la camara de lisis al interior de la camara de residuos. Las valvulas V1 y V8 pueden cerrarse para bloquear la camara de lisis y la camara de residuos, respectivamente.
Con referencia a la figura 50C, en algunos ejemplos, las perlas atrapadas pueden lavarse bombeando tampon de lavado a traves de la columna de perlas usando la bomba E1 y abriendo las compuertas G2, G3 y G9 para situar tampon de lavado aguas abajo del orificio de ventilacion hidrofobo H2. Las valvulas que afslan el canal de tampon de lavado (por ejemplo, V2) y los residuos de tampon de lavado (por ejemplo, V9) pueden cerrarse.
Con referencia a la figura 50D, tampon de liberacion puede bombearse, usando la bomba E2 y abriendo las compuertas G6, G4 y G8 para llenar una columna de perlas y situar el tampon de liberacion aguas abajo del orificio de ventilacion de aire H1. Las valvulas que bloquean el canal de tampon de liberacion (por ejemplo, V6) y el canal aguas abajo de la columna de perlas (por ejemplo, V10) pueden cerrarse y las perlas calentarse a, por ejemplo, 70 °C durante 2 minutos lo que puede liberar el ADN de las perlas de afinidad por ADN.
Con referencia a la figura 50E, el ADN liberado puede bombearse, usando la bomba E3 y abriendo las compuertas G5 y G10 hasta una posicion aguas abajo del orificio de ventilacion hidrofobo H4, momento en el que las valvulas V11 y V14 pueden cerrarse. Con referencia a la figura 50F, una parte del ADN liberado (entre la union G11 y a1) y una parte del tampon de neutralizacion (entre G11 y a2) pueden mezclarse usando la bomba E4 y abriendo las compuertas G12, Gil y G13. La mezcla del tapon de lfquido compuesto entre al y a2 puede ocurrir despues de que pueda ser bombeado a traves del canal de mezcla de neutralizacion y situado aguas abajo del orificio de ventilacion hidrofobo H4. G11 puede ser una compuerta de volumen muerto nulo que lleva dos canales de lfquido cercanos entre sf sin atrapar burbujas de aire durante la combinacion de los dos tapones de lfquido. Las dos valvulas (V21 y V22) en los extremos de la muestra neutralizada pueden cerrarse y, ahora con referencia a la figura 50G, agua DI puede bombearse usando la bomba E5 y abriendo las compuertas Gl4, G15 y G17 para disolver el microgranulo de reactivo de PCR. El lfquido puede situarse usando el orificio de ventilacion hidrofobo H12. Despues de un periodo de tiempo suficientemente largo para la completa disolucion del microgranulo de reactivo de PCR liofilizado (por ejemplo, aproximadamente un minuto) la valvula V17 puede cerrarse.
Con referencia a la figura 50H, enzima disuelta puede bombearse a traves del canal de mezcla de enzimas usando la bomba E6, abriendo la compuerta G16, y usando el orificio de ventilacion hidrofobo H5 para ayudar a la colocacion del fluido. En diversas realizaciones, la enzima mezclada puede distribuirse (por ejemplo, en 2 partes iguales) para multiples reacciones a la seccion de mezcla de PCR de la muestra asf como a la seccion de mezcla de PCR negativa, momento en el cual, las valvulas V18, V20 y V19 pueden cerrarse.
En diversas realizaciones, con referencia a la figura 50I, una parte del ADN neutralizado (entre la union G20 y b1) y una parte de la enzima (entre G20 y b2) pueden mezclarse usando la bomba E7 y abriendo las compuertas G18, G20 y G22. La mezcla del tapon de lfquido compuesto entre al y a2 puede ocurrir despues de que pueda bombearse a traves del canal de mezcla de neutralizacion y situarse aguas abajo del orificio de ventilacion hidrofobo H6. Una parte del agua DI (entre la union G21 y c1) y una parte de la enzima (entre G21 y c2) puede mezclarse usando la bomba E8 y abriendo las compuertas G19, G21 y G23. La mezcla del tapon de lfquido compuesto puede producirse entre ci y c2, despues de que pueda ser bombeada a traves del canal de mezcla de neutralizacion y
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situada agua abajo del orificio de ventilacion hidrofobo H7.
Con referencia a la figura 50J, las valvulas de PCR V24, 25, 26, 27, en algunos ejemplos, pueden cerrarse para realizar PCR de muestras y PCR de control negativo. En diversas realizaciones, luz (por ejemplo, fluorescencia) puede ser detectada usando el sistema optico en la corredera. En algunos ejemplos, el software puede determinar la presencia de diana (por ejemplo, GBS) en la muestra basandose en datos de fluorescencia y puede notificar los resultados.
Ejemplo 6: Aparato para el procesamiento de polinucleotidos
Este ejemplo no limitante muestra vistas CAD de diversas realizaciones ejemplares del aparato, sistema, cartucho microflmdico, kit, metodos y producto de programa informatico, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
La figura 51 muestra una vista lateral de un conjunto de palanca 1200, con palanca 1210, unidad de engranaje 1212 y miembro de fuerza 1214. El conjunto 1200 puede usarse para cerrar la tapa del aparato y (a traves de los miembros de fuerza 1214) aplicar fuerza a un cartucho microflmdico 1216 en el compartimento de recepcion 1217. Un miembro de fuerza es visible en esta vista recortada, pero puede usarse cualquier numero, por ejemplo cuatro. Los miembros de fuerza pueden ser, por ejemplo, un accionador que funciona por resorte manual tal como se muestra, un accionador mecanico automatico, un material con suficiente flexibilidad y rigidez mecanicas (por ejemplo, un tapon elastomerico duro), y similares. La fuerza aplicada al cartucho microflmdico 1216 puede dar como resultado una presion en la superficie del cartucho microflmdico 1216 de al menos aproximadamente 0,7 psi a aproximadamente 7 psi (entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 kilopascales), o en algunas realizaciones aproximadamente 2 psi (aproximadamente 14 kilopascales.
La figura 52 muestra una vista lateral del conjunto de palanca 1200, con el cartucho microflmdico 1216 en el compartimento de recepcion 1217. Una bomba de calor 1219 (por ejemplo, una bombilla de xenon tal como se muestra) puede funcionar como una fuente de calor radiante dirigida en un deposito de entrada de muestras 1218, donde el calor puede lisar las celulas en el deposito 1218. Una capa mecanicamente flexible, conductora termicamente 1222 puede estar en una interfaz entre el cartucho microflmdico 1216 y la fase termica 1224. Normalmente, el cartucho microflmdico 1216 y la fase termica 1224 pueden ser planos en sus respectivas superficies de interfaz, por ejemplo, planas dentro de aproximadamente 100 micras, o mas normalmente dentro de aproximadamente 25 micras. La capa 1222 puede mejorar el acoplamiento termico entre el cartucho microflmdico 1216 y la fase termica 1224. Los elementos detectores opticos 1220 pueden estar dirigidos a la superficie superior del cartucho microflmdico 1216.
La figura 53 muestra un primer plano del compartimento de recepcion 1217.
La figura 54 muestra un primer plano de la interfaz entre el cartucho microflmdico 1216, la capa mecanicamente flexible, conductora termicamente 1222 y la fase termica 1224.
La figura 55 muestra una vista superior del conjunto 1200. Ademas de miembros mecanicos 1214, pueden emplearse miembros gma 1226.
La figura 56 es un primer plano de la figura 55.
Las figuras 57-59 son una serie de fotos de la palanca 1210 en accion. Puede mostrarse ademas en el conjunto de engranaje 1212 la leva 1228, que permite a la palanca 1210 aplicar fuerza a la placa 1230 acoplada a los miembros de fuerza 1214.
Las figuras 60 y 61 muestran vistas del cartucho microflmdico 1216 con depositos autoperforantes 1228 y miembros mecanicos 1230 para accionar los depositos autoperforantes.
Las figuras 62 y 63 muestran elementos de elementos detectores opticos 1220 que incluyen fuentes de luz 1232 (por ejemplo, diodos emisores de luz), lentes 1234, detectores de luz 1236 (por ejemplo, fotodiodos) y filtros 1238. Los filtros pueden ser, por ejemplo, filtros de paso de banda, los filtros en las fuentes de luz correspondientes a la banda de absorcion de una o mas sondas fluorogenas y los filtros en los detectores correspondientes a la banda de emision de las sondas fluorogenas.
Ejemplo 7: Preparacion del miembro de retencion
Perlas magneticas con superficie de carboxilato (Sera-Mag magneticas modificadas carboxilato, n.° de parte 3008050250, Seradyn) a una concentracion de aproximadamente 1011 ml-1 se activaron durante 30 minutos usando N-hidroxilsuccinimida (NHS) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
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(EDAC) en una solucion tampon de acido 2-(N-morfolinio)-etanosulfonico (MES) 500 mM a pH 6,1. Las perlas activadas se incubaron con poli-L-lisina (PLL) de 3.000 Da o 300.000 Da de peso molecular promedio. Despues de 2 lavados para retirar la PLL no unida, las perlas estaban listas para usarlas.
Ejemplo 8: Cartucho microfluidico
Con referencia a las figuras 64 y 65, se fabrico un cartucho microflmdico 300 para demostrar la separacion de polinucleotidos de inhibidores. El cartucho 300 comprende primera y segunda partes de sustrato 302', 304', que comprenden, respectivamente, primera y segunda capas 302a', 302b' y 304a', 304b'. Las primera y segunda capas 302a', 302b' definen un canal 306' que comprende una entrada 310' y una salida 312'. Las primera y segunda capas 304a', 304b' definen un canal 308' que comprende una entrada 314' y una salida 316'. Las primera y segunda partes de sustrato 302', 304' se emparejaron usando adhesivo 324' de modo que la salida 312' comunicaba con la entrada 314' con un filtro 318' situado entre ellas. Una parte de la salida 312' se lleno con las perlas activadas preparadas anteriormente para proporcionar una region de procesamiento 320' que comprende un miembro de retencion (las perlas). Una pipeta 322' (figura 66) fijada mediante adhesivo 326' facilitaba la introduccion de la muestra.
En uso, la muestra introducida mediante la entrada 310' pasaba a lo largo del canal y a traves de la region de procesamiento 320'. El exceso de material de muestra pasaba a lo largo del canal 308' y salfa del dispositivo 300' mediante la salida 316'. Los polinucleotidos fueron retenidos preferentemente por las perlas en comparacion con los inhibidores. Una vez que se habfa introducido la muestra, lfquidos adicionales, por ejemplo, un lfquido de lavado y/o un lfquido para uso para liberar los polinucleotidos retenidos se introdujeron mediante la entrada 326'.
Ejemplo 9: Retencion de ADN
La retencion de polinucleotidos por las perlas modificadas con poli-L-lisina del dispositivo 300' se demostro preparando dispositivos respectivos que comprenden regiones de procesamiento que tienen un volumen de aproximadamente 1 |il que incluye aproximadamente 1000 perlas. Las perlas se modificaron con poli-L-lisina de entre aproximadamente 15.000 y 30.000 Da. Cada region de procesamiento se lleno con un lfquido que comprendfa ADN de esperma de arenque (aproximadamente 20 |il de muestra con una concentracion de aproximadamente 20 mg/ml) colocando de este modo las perlas y el lfquido en contacto. Despues de que el lfquido y las perlas habfan estado en contacto durante 10 minutos, el lfquido se retiro de cada region de procesamiento y se sometio a PCR el tiempo real cuantitativa para determinar la cantidad de ADN de esperma de arenque presente en el lfquido.
Se realizaron dos controles. En primer lugar, una region de procesamiento en caso contrario identica se relleno con perlas sin modificar, es decir, perlas que eran identicas a las perlas de poli-L-lisina excepto por las etapas de activacion y de incubacion de poli-L-lisina. El lfquido que comprendfa ADN de esperma de arenque se puso en contacto con estas perlas, se le dejo reposar durante 10 minutos, se retiro, y se sometio a PCR en tiempo real cuantitativa. En segundo lugar, el lfquido que comprendfa el ADN de esperma de arenque (“el lfquido no procesado”) se sometio a PCR en tiempo real cuantitativa.
Con referencia a la figura 66, los primer y segundo controles mostraban respuestas esencialmente identicas que indicaban la presencia de ADN de esperma de arenque en el lfquido puesto en contacto con las perlas no modificadas y en el lfquido no procesado. El lfquido que se habfa puesto en contacto con las 3.000 perlas de poli-L- lisina mostraba una respuesta inferior indicando que las perlas modificadas habfan retenido sustancialmente todo el ADN de esperma de arenque. La respuesta de PCR del lfquido que se habfa puesto en contacto con las perlas de poli-L-lisina de 300.000 Da mostraba una respuesta de amplificacion que era al menos aproximadamente un 50 % mayor que para las perlas de 3.000 Da, indicando que la modificacion superficial del peso molecular inferior era mas eficiente en la retencion del ADN de esperma de arenque.
Ejemplo 10: Liberacion de ADN a partir de perlas modificadas de Poli-L-lisina
Dispositivos que teman regiones de procesamiento se rellenaron con perlas modificadas de poli-L-lisina de 3.000 Da. El lfquido que contema polinucleotidos obtenidos de estreptococos del grupo B (GBS) se puso en contacto con las perlas y se incubo durante 10 minutos como anteriormente para el ADN de esperma de arenque. Este lfquido se habfa obtenido sometiendo a aproximadamente 10.000 bacterias de GBS en 10 |il de tampon Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1 % a lisis termica a 97 °C durante 3 min.
Despues de 10 minutos, el lfquido en contacto con las perlas se retiro haciendo fluir aproximadamente 10 |il de solucion de lavado (Tris-EDTA pH 8,0 con Triton al 1 % X 100) a traves de la region de procesamiento. Posteriormente, se anadio aproximadamente 1 |il de solucion de NaOH 5 mM a la region de procesamiento. Este proceso dejo la region de procesamiento rellena, llena con la solucion de NaOH en contacto con las perlas. La solucion en contacto con las perlas se calento a 95 °C. Despues de 5 minutos de calentamiento a 95 °C, la solucion en contacto con las perlas se retiro eluyendo la region de procesamiento con un volumen de solucion igual a tres veces el volumen de vacfos de la region de procesamiento.
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Con referencia a la figura 67, cinco almuotas de solucion se sometieron a amplificacion por PCR en tiempo real cuantitativa. Las almuotas E1, E2 y E3 conteman, cada una, aproximadamente 1 |il de Kquido. La almuota L corresponde a lfquido de la muestra original que habfa pasado a traves de la region de procesamiento. La almuota W era Kquido obtenido de solucion de lavado sin calentar. La almuota E1 corresponde al volumen muerto del dispositivo 300, aproximadamente igual al volumen del canal 308. Por lo tanto, el lfquido de la almuota E1 estaba presente en el canal 308 y no en contacto con las perlas durante el calentamiento. Este lfquido habfa pasado a traves de la region de procesamiento antes del calentamiento. La almuota E2 comprende lfquido que estaba presente dentro de la region de procesamiento y en contacto con las perlas durante el calentamiento. La almuota E3 comprende lfquido usado para retirar la almuota E2 de la region de procesamiento.
Tal como se ve en la figura 67, mas del 65 % del ADN de GBS presente en la muestra inicial fue retenido por y liberado de las perlas (almuota E2). La almuota E2 tambien demuestra la liberacion de mas del 80 % del ADN que habfa sido retenido por las perlas. Menos de aproximadamente el 18 % del ADN de GBS pasaba a traves de la region de procesamiento sin ser capturado. La solucion de lavado sin calentamiento comprendfa menos del 5 % del ADN de GBS (almuota W).
Ejemplo 11: Separacion de polinudeotidos e inhibidores
Las celulas bucales del revestimiento de las mejillas proporcionan una fuente de material genetico humano (ADN) que puede usarse para la deteccion de polimorfismo de un solo nucleotido (SNP). Una muestra que contema celulas bucales se sometio a lisis termica para liberar ADN de dentro de las celulas. El dispositivo 300 se uso para separar el ADN de inhibidores concomitantes tal como se ha descrito anteriormente. Una muestra limpiada correspondiente a la almuota E2 de la figura 67 se sometio a reaccion en cadena de la polimerasa. Una muestra de control o impura tal como la obtenida a partir de la lisis termica tambien se amplifico.
Con referencia a la figura 68, la muestra limpiada mostraba una respuesta de PCR sustancialmente mayor en menos ciclos que la muestra de control. Por ejemplo, la muestra de limpieza superaba una respuesta de 20 dentro de 32 ciclos, mientras que la muestra de control requena aproximadamente 45 ciclos para alcanzar la respuesta de muestra.
La sangre actua como una matriz de muestra en diversos analisis de diagnostico incluyendo deteccion de agentes de enfermedades infecciosas, marcadores de cancer y otros marcadores geneticos. La hemoglobina presente en muestras de sangre es un potente inhibidor documentado de PCR. Dos muestras de sangre de 5 ml se lisaron en tampon Tris 20 mM pH 8, EDTA 1 mM, SDS al 1 % y se introdujeron en respectivos dispositivos 300, que se hicieron funcionar tal como se ha descrito anteriormente para preparar dos muestras de limpieza. Una tercera muestra de sangre de 5 ml se liso y se preparo usando un metodo de extraccion de ADN comercial Puregene, Gentra Systems, MN. Las muestras limpiadas respectivas y la muestra sometida al metodo de extraccion comercial se usaron para un analisis de discriminacion alelica (reactivos CYP2D6*4, Applied Biosystems, CA). Cada muestra contema una cantidad de ADN correspondiente a aproximadamente 1 ml de sangre.
Con referencia a la figura 69, las muestras limpiada y extrafda comercialmente mostraban una respuesta de PCR similar, demostrando que la region de procesamiento del dispositivo 300' retiraba de forma eficiente inhibidores de las muestras de sangre.
Ejemplo 12: Miembro de retencion resistente a proteasa
La preparacion de muestras de polinucleotidos para procesamiento adicional a menudo incluye someter a las muestras a tratamiento con proteasa en el que una proteasa escinde enlaces peptfdicos de protemas en la muestra. Una proteasa ejemplar es pronasa, una mezcla de endo- y exo-proteasas. La pronasa escinde la mayona de los enlaces peptfdicos. Ciertos ligandos, tales como poli-L-lisina pueden ser susceptibles a rotura por pronasa y otras proteasas. Por lo tanto, las muestras generalmente no se someten a tratamiento con proteasa en presencia del miembro de retencion si los ligandos unidos a el son susceptibles a las proteasas.
La poli-D-lisina, el enantiomero dextrogiro de poli-lisina resiste la escision por pronasa y otras proteasas. Se estudio la capacidad de un miembro de retencion que comprende poli-D-lisina unida para retener aDn incluso cuando se somete a un tratamiento con proteasa.
Se prepararon ocho (8) muestras. Un primer grupo de 4 muestras conteman 1000 celulas de GBS en 10 |il de tampon. Un segundo grupo de 4 muestras contema 100 celulas de GBS en 10 |il de tampon. Cada una de las 8 muestras se calento a 97 °C durante 3 min para lisar las celulas de GBS. Se crearon cuatro (4) conjuntos de muestras a partir de las muestras calentadas. Cada conjunto de muestras contema 1 muestra de cada uno de los primer y segundo grupos. Las muestras de cada conjunto de muestras se trataron de la siguiente manera.
Con referencia a la figura 70A, las muestras del conjunto de muestras 1 se sometieron a incubacion con pronasa para preparar muestras escindidas con protema respectivas, que se calentaron a continuacion para inactivar las proteasas. Las muestras calentadas, escindidas con protema se pusieron en contacto con miembros de retencion
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respectivos, que comprenden, cada uno, un conjunto de perlas modificadas con poli-L-lisina. Despues de 5 minutos, los conjuntos de perlas respectivos se lavaron con 5 microlitros de una solucion de NaOH 5 mM para separar inhibidores y productos de escision con protema del ADN unido. Los conjuntos de perlas respectivos se pusieron en contacto, cada uno, con una segunda almuota de solucion de NaOH y se calentaron a 80 °C durante 2 minutos para liberar el ADN. Las soluciones con ADN liberado se neutralizaron con un volumen igual de tampon. Las soluciones neutralizadas se analizaron para determinar la eficiencia de recuperacion de ADN. Los resultados se promediaron y se muestran en la figura 70B.
Las muestras del conjunto de muestras 2 se sometieron a incubacion con pronasa para preparar muestras escindidas con protema respectivas, que se calentaron a continuacion para inactivar las proteasas. Las muestras calentadas, escindidas con protema se pusieron en contacto con miembros de retencion respectivos que comprenden, cada uno, un conjunto de perlas modificadas con poli-D-lisina. Despues de 5 minutos, los conjuntos de perlas respectivos se lavaron con 5 microlitros de una solucion de NaOH 5 mM para separar inhibidores y productos de escision de protemas, del ADN unido. Los conjuntos de perlas respectivos se pusieron en contacto, cada uno, con una segunda almuota de solucion de NaOH y se calentaron a 80 (ochenta) °C durante 2 minutos para liberar el ADN. Las soluciones con ADN liberado se neutralizaron con un volumen igual de tampon. Las soluciones neutralizadas se analizaron para determinar la eficiencia de la recuperacion de ADN. Los resultados se promediaron y se muestran en la figura 70B.
Las muestras del conjunto de muestras 3 se sometieron a incubacion con pronasa para preparar muestras escindidas con protema respectivas. Las proteasas no se desactivaron termica o qmmicamente. Las muestras escindidas con protema se pusieron en contacto con miembros de retencion respectivos que comprenden, cada uno, un conjunto de perlas modificadas con poli-L-lisina. Despues de 5 minutos, los conjuntos de perlas respectivos se lavaron con 5 microlitros de una solucion de NaOH 5 mM para separar inhibidores y productos de escision de protemas, del ADN unido. Los conjuntos de perlas respectivos se pusieron en contacto, cada uno, con una segunda almuota de solucion de NaOH y se calentaron a 80 (ochenta) °C durante 2 minutos para liberar el ADN. Las
soluciones con polinucleotidos liberados se neutralizaron, cada una, con un volumen igual de tampon. Las
soluciones neutralizadas se analizaron para determinar la eficiencia de la recuperacion de ADN. Los resultados se promediaron y se muestran en la figura 70B.
Las muestras del conjunto de muestras 4 se sometieron a incubacion con pronasa para preparar muestras escindidas con protema respectivas. Las proteasas no se desactivaron termica o qmmicamente. Las muestras escindidas con protema se pusieron en contacto con miembros de retencion respectivos que comprenden, cada uno, un conjunto de perlas modificadas con poli-D-lisina. Despues de 5 minutos, los conjuntos de perlas respectivos se lavaron con 5 microlitros de una solucion de NaOH 5 mM para separar inhibidores y productos de escision de protemas, del ADN unido. Los conjuntos de perlas respectivos se pusieron en contacto, cada uno, con una segunda almuota de solucion de NaOH y se calentaron a 80 (ochenta) °C durante 2 minutos para liberar el ADN. Las
soluciones con polinucleotidos liberados se neutralizaron, cada una, con un volumen igual de tampon. Las
soluciones neutralizadas se analizaron para determinar la eficiencia de la recuperacion de ADN. Los resultados se promediaron y se muestran en la figura 70B.
Tal como se ve en la figura 70B, un promedio de mas del 80 % de ADN de las celulas de GBS se recupero usando el conjunto de muestras 4 en el que las muestras se pusieron en contacto con perlas modificadas con poli-D-lisina y se sometieron a incubacion con pronasa en presencia de las perlas sin inactivacion de proteasa. La eficiencia de recuperacion para el conjunto de muestras 4 puede ser mas de dos veces tan elevada como para cualquiera de las otras muestras. Espedficamente, las eficiencias de recuperacion para los conjuntos de muestras 1,2, 3 y 4, fueron del 29 %, 32 %,14 % y 81,5 %, respectivamente. Las eficiencias demuestran que pueden obtenerse elevadas eficiencias de recuperacion para muestras sometidas a incubacion con proteasa en presencia de un miembro de retencion que retiene ADN.
Ejemplo 13: Manual del operador para aparato para el procesamiento de polinucleotidos
Este ejemplo no limitante describe, en forma de un manual del operador, diversas realizaciones del aparato, cartucho microflmdico, kit, metodos y producto de programa informatico reivindicados, en particular dirigido a un sistema de unico cartucho que incluye un ensayo de PCR microflmdico para la deteccion cualitativa de microorganismos, tales como Streptococcus del grupo B (GBS). Descripciones adicionales pertinentes al analisis de GBS se presentan en el ejemplo 14.
Kit de preparacion de muestras, que puede incluir
Vial de muestras que comprende tampon y conservante
Hisopo de recogida con instrucciones para autorrecogida por el paciente.
Un numero (por ejemplo, 25) de jeringas con filtro
Viales que contienen tampon.
Etiquetas de ID del paciente para los viales de recogida
Jeringas de 3 cc.
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Cartucho microflmdico, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
Kits de muestra de control externa, que pueden incluir
Especimen de frotis de control positivo que contiene muestra en el GBS en forma deshidratada;
Viales que contienen tampon con identificacion POSITIVA en el vial;
Viales que contienen tampon con identificacion NEGATIVA en el vial;
Jeringas.
Equipo:
Sistema con lector de codigo de barras, ambos de los cuales tal como se describe adicionalmente en el presente documento, equipado con, por ejemplo, un cable de alimentacion de 115V o 220 V.
Equipo opcional adicional:
Impresora con conexion USB Conexion a la red del hospital
Uso ejemplar e indicaciones de uso
La descripcion en este ejemplo, es adecuado para analizar muestras para la presencia de GBS, detalles de lo cual se proporcionan en el ejemplo 14.
Explicacion de la aplicacion de analisis
El aparato y los materiales pueden usarse para analizar en busca diversos patogenos y microorganismos, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Un ejemplo es analizar para GBS, tal como se describe adicionalmente en el ejemplo 14. Los analisis pueden ser realizados en el entorno cercano al paciente por facultativos que no esten formados exhaustivamente en procedimientos de laboratorio. Una rutina de CC puede estar incorporada en la interfaz del usuario del sistema para proporcionar Garantfa de Calidad continua para el analisis de GBS. El analisis tambien puede realizarse en un laboratorio de estadfstica de un hospital central, siempre que el analisis de la muestra se produzca dentro del periodo de tiempo requerido por el facultativo que solicita el analisis.
Advertencias y precauciones ejemplares
Otras advertencias y precauciones espedficas de GBS se presentan en el ejemplo 14.
• En algunas realizaciones, si un paciente esta siendo tratado actualmente con antibioticos, el analisis puede ser un indicador no fiable de una patologfa.
Normalmente, evitar el uso del kit de cartucho/muestra mas alla de la fecha de caducidad.
Normalmente, evitar usar un cartucho que se abrio previamente. La exposicion al aire y la humedad puede degradar los reactivos. Evitar abrir el cartucho hasta despues de que la muestra este lista para inyectarla. Normalmente, usar nuevos materiales de jeringa para la preparacion de las muestras.
Normalmente, usar los hisopos y el tampon proporcionados en el kit de analisis. En algunas realizaciones, otras marcas de hisopos de recogida pueden interferir en el rendimiento del analisis
Cuando un especimen debe almacenarse, refrigeracion a 4 °C durante un periodo de hasta 24 horas esta indicada normalmente.
Normalmente, usar prendas protectoras y guantes desechables mientras se manipulan los componentes del sistema y el especimen.
Normalmente, usar una tecnica aseptica. Puede ser especialmente importante usar nuevos guantes desechables para evitar la contaminacion del especimen de analisis o los materiales de analisis.
Normalmente, evitar inyectar la muestra con presion elevada. Se prefiere inyeccion suave.
Normalmente, manipular espedmenes usando precauciones universales de acuerdo con procedimientos hospitalarios seguros para espedmenes potencialmente infecciosos.
Normalmente, usar agentes de limpieza recomendados cuando se limpia el sistema.
Normalmente, evitar limpiar el cartucho de analisis con cualquier producto qmmico de limpieza si se producen derrames. Si fuera necesario, usar un panuelito de laboratorio seco para retirar los lfquidos.
limite de deteccion de, por ejemplo, bacterias y
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Condiciones de almacenamiento y estabilidad tipicas
Descripcion del producto
Condicion de uso/almacenamiento Estabilidad Condicion de transporte
Sistema
15-35 °C, intervalo operativo NA -10 °C a 65 °C
Kits de muestreo de GBS
4-40 °C. No congelar. Fecha de caducidad Temp > 4 °C
Especimen del Paciente o CC en tampon (humedo)
a 15-30 °C 8 horas
Especimen del paciente o CC en tampon (humedo)
a 4 °C 24 horas
Especimen del paciente en recipiente (seco)
a 15-30 °C 24 horas
Especimen del paciente en recipiente (seco)
a 4 °C
GBS cartuchos sin abrir
4-30 °C. No congelar, Fecha de caducidad Temp > 4 °C
GBS cartuchos sin abrir
No usar. 60 minutos maximo
GBS Kits de control
15-30 °C Fecha de caducidad Proteccion TBD
Recogida de espeamenes ejemplar
Precaucion: Evitar tocar el extremo de Dacron® del hisopo con los dedos.
Retirar el hisopo del envase
Limpiar el exceso de secreciones vaginales.
Insertar el hisopo 2 cm en la vagina (pase frontal).
Insertar el mismo hisopo 1 cm en el ano (pase posterior)
Colocar el hisopo en el envase de transporte si se almacena en seco.
Preparacion de especimenes ejemplar
Usar una tecnica aseptica cuando se manipulan materiales de analisis y el especimen.
Confirmar que el tampon de muestra no ha caducado.
Sumergir el hisopo vigorosamente 20 veces en el vial que contiene 1 cc de tampon Retirar y desechar el hisopo.
Etiquetar el vial con la ID del paciente y la hora de recogida, si se requiere mediante procedimiento clmico estandar.
Precaucion: evitar abrir el envase del cartucho hasta estar listo para usarlo. Los reactivos incluidos pueden ser sensibles a la luz y la humedad.
Instrucciones de manejo del sistema ejemplares
• Se puede mostrar la pantalla de sistema preparado.
• Tocar la pantalla para detener el salvapantallas.
• Levantar el asa y abrir la tapa del sistema para comenzar.
• Un autoanalisis del sistema puede comenzar una vez que la tapa esta completamente abierta y un indicador de “abierto”, si esta presente, esta encendido.
• Inspeccionar el sistema para cualesquiera cartuchos usados restantes de un analisis previo.
• Iniciar sesion con la ID de usuario y contrasena.
• Escanear el codigo de barras del vial de recogida de muestras.
• Abrir el cartucho de analisis. Escanear el codigo de barras del cartucho.
• El sistema puede presentar un mensaje de error si los materiales han caducado y/o si el vial de especimen y los materiales de analisis no estan emparejados apropiadamente
• Confirmar la ID de la muestra con informacion del paciente.
• Introducir la ID del paciente y otra informacion identificativa hospitalaria, si se solicita.
Instrucciones ejemplares para transferir la muestra al cartucho:
• Ponerse un nuevo par de guantes.
• Colocar el vial de muestra en el contador.
• Unir la punta a la jeringa. Extraer toda la muestra al interior de la jeringa. Extraer 2 cc adicionales de aire a la jeringa.
• Retirar la punta y unir el filtro.
• Inyectar 1 cc de muestra en el cartucho usando la jeringa y 2 cc adicionales de aire.
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Precaucion: usar presion suave para inyectar la muestra para evitar salpicaduras desde la muestra.
Instrucciones ejemplares para realizar el analisis:
Agitar suavemente el cartucho atras y adelante hasta que los microgranulos se disuelvan.
Colocar el cartucho en el sistema
Cerrar la cubierta del sistema
(El analisis puede comenzar inmediatamente)
Resultados
Cuando el analisis esta completo, los resultados pueden estar disponibles para visualizacion o impresion. Desechado de materiales: El cartucho y el kit de recogida usados pueden tratarse como riesgo biologico
Preparacion de los materiales para el envfo
El cartucho debe envasarse normalmente en materiales protectores contra riesgo biologico tal como se describe mediante las Normas Internacionales.
Procedimiento de limpieza ejemplar para el sistema
Una solucion de lejfa al 10 % (hipoclorito sodico al 0,5 %), seguida por un aclarado con agua limpia puede usarse para desinfectar, asf como para reducir el potencia de contaminacion con ADN.
La contaminacion con ADN puede conseguirse normalmente limpiando con lejfa o materiales adecuados para eliminar la contaminacion con ADN. Tambien pueden usarse eliminadores de acido nucleico Chemicon™ despues de limpiar con desinfectantes ordinarios.
Normalmente, alcohol o toallitas sanitarias ordinarias no reduciran la contaminacion con ADN del instrumento. Verificacion del lote de reactivo ejemplar
Proposito - evaluacion de los lotes del cartucho y el kit de muestra y verificacion del rendimiento total del sistema.
Recomendacion: tras la recepcion de un nuevo lote de cartuchos o kits de muestra, puede ejecutarse un conjunto de control de calidad para confirmar, por ejemplo, si el conjunto de reactivos incluye (1) control externo y (l) control externo negativo.
Rutina de control de calidad ejemplar
El control positivo externo sirve para monitorizar y calibrar la sensibilidad de las etapas de preparacion del especimen y el ensayo, y puede usarse para minimizar el riesgo de resultados falsos negativos. Si el analisis falla, puede invalidar los resultados de ese lote de cartuchos, y se debe notificar la fabricante.
Proposito - verificacion del rendimiento total del sistema que incluye evaluacion de tecnica de manipulacion de la muestra. El analisis puede realizarse a un intervalo preestablecido seleccionado por el usuario.
Recomendacion: cuando se realiza el analisis, ejecutar un conjunto de CC que incluye (1) Control externo positivo y (1) Control externo negativo, si el analisis de CC no consigue proporcionar los resultados esperados, hay que ponerse en contacto con el fabricante.
Instrucciones de rutina de control de calidad ejemplares
■ Ir a la pantalla de control de calidad
■ Introducir la ID del usuario
■ Seleccionar verificacion de la tecnica de CC, Nuevo lote de reactivo, ejecutar CC diario en las muestras tal como se indica en las pantallas.
Autoanalisis del sistema
El sistema puede realizar un analisis de inicio del sistema cuando se le suministra energfa. Como rutina de arranque de cada muestra de analisis del paciente o muestra de CC, el sistema puede ejecutar un autoanalisis para determinar, por ejemplo, que los componentes electronicos, el sistema optico, calefactores y sensores de temperatura estan funcionando como debieran.
Controles internos ejemplares (en el cartucho)
Reactivos que pueden usarse en el ensayo pueden estar incluidos en el cartucho para reducir el potencial de errores de manipulacion del usuario y contaminacion. Dos tipos de estrategias de controles positivo y negativo en el
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cartucho pueden estar incorporadas dentro de cada cartucho microflmdico para monitorizar el rendimiento del ensayo de PCR individual. Dos ejemplos son:
1) Plasmido de control interno positivo (ICP): un plasmido de control interno puede proporcionar un control de la integridad de los reactivos de ensayo de PCR asf como ser un indicador de la presencia de sustancias inhibidoras de PCR en el especimen, es decir puede ser un control para resultados falsos negativos. Durante el termociclado, la amplificacion de esta region puede producir una senal fluorogena distinta en ambos carriles de PCR. El fallo en amplificar la secuencia de control interno, en ausencia de una muestra positiva, puede ser indicativo de un fallo de la mezcla de reactivos o la presencia de inhibidores de PCR en el especimen. Esto puede invalidar los resultados del analisis tal como se indica mediante un codigo de error en el instrumento. “IND” puede visualizarse para notificar un resultado indeterminado.
2) Carril de PCR de control interno negativo: Un carril paralelo puede usarse para ejecutar una segunda PCR con reactivos de la misma mezcla sin ninguna muestra. Esto puede proporcionar un control contra resultados falsos positivos debido a la contaminacion de los reactivos. Un resultado fallido en el carril de control negativo puede invalidar el resultado y puede ser indicado por un codigo de error en el instrumento. “IND” puede visualizarse para notificar un resultado indeterminado.
PCR en tiempo real ejemplar para deteccion de ADN de GBS
En diversas realizaciones, el analisis puede usar reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real para la amplificacion de secuencias de un gen cfb de GBS recuperadas de muestras clmicas e hibridacion espedfica de diana fluorogena para la deteccion del ADN amplificado. El gen cfb codifica el factor CAMP, una protema extracelular difundible que esta presente normalmente en aislados de GBS. El analisis de deteccion de Streptococcus del grupo B (GBS) tambien puede ser un tipo integrado, de muestra sin procesar a resultado, de ensayo de amplificacion de acido nucleico. Una sonda fluorogena TaqMan puede usarse para detectar los amplicones de PCR. Los reactivos usados en el ensayo pueden estar incluidos en el cartucho para reducir el potencial de errores de manipulacion del usuario y contaminacion.
Precauciones potenciales ejemplares
En algunas realizaciones, el sistema de analisis puede no estar cualificado para identificar dianas tales como ADN de GBS, en espedmenes diferentes de espedmenes vaginales y/o rectales. Los espedmenes de orina y sangre pueden no estar cualificados.
En algunas realizaciones, un paciente sometido a un tratamiento con antibioticos puede no ser capaz de obtener un correcto diagnostico con este u otros analisis de diagnostico.
En algunas realizaciones, el analisis puede no producir un cultivo de GBS adecuado para identificacion directa de las bacterias por un microbiologo. En algunas realizaciones, el analisis puede no proporcionar resultados de susceptibilidad que son necesarios para recomendar un tratamiento para personas alergicas a penicilina.
Sustancias interferentes potenciales ejemplares
En algunas realizaciones, orina y secreciones vaginales si estan presentes en cantidades muy grandes, pueden interferir en el analisis.
Normalmente, no es probable que contaminantes de las muestras tales como contaminacion con sangre, meconio, y lfquido amniotico interfieran en el analisis.
Normalmente, en este momento no se conoce que la interferencia por farmacos (tales como los presentes en secreciones vaginal y rectal), diferentes de antibioticos, interfiera en la PCR.
Caracteristicas e interpretacion de rendimiento ejemplares
El diagrama de flujo en la figura 71 perfila un conjunto ejemplar de criterios que pueden ser usados por el algoritmo de decision en el instrumento para interpretar los resultados. Las reacciones de PCR (Muestra y Control) pueden ser interpretadas como positivas o negativas para la diana en cuestion. Un algoritmo logico puede usarse para determinar si la muestra es definitivamente Positiva o Negativa o Indeterminada.
Sustancias que reaccionan de forma cruzada ejemplares
Al especificidad de los cebadores y las sondas puede analizarse con PCR en tiempo real (ensayo Taqman) usando ADN genomicos aislados de los siguientes organismos: nueve serotipos de GBS (serotipo la, 1b, lc, II, III, IV, V, VI y VII; American Type Culture Collection y National Center for Streptococcus, Canada); 10 aislados de GBS clmicos; 60 muestras clmicas; una amplia variedad de cepas bacterianas gram-positivas y gram-negativas asf como dos cepas
de levadura y VRS de tipo 1 y 2.
Microorganismos ejemplares
PATOGENO
Tipo
Pseudomones aeruginosa
Bacterias Gram -
Proteus mirabilis
Bacterias Gram -
Kiebsiella oxytoca
Bacterias Gram -
Kiebsiella pneurnoniae
Bacterias Gram -
Escherichia coli (aislado clrnico 1)
Bacterias Gram -
Escherichia coli (aislado clmico 2)
Bacterias Gram -
Acinetobacter baumannd
Bacterias Gram -
Serra. marcescens
Bacterias Gram -
Entembacter aerugenes
Bacterias Gram +
Enterococcus Maclean
Bacterias Gram +
Staphylococcus aureus (aislado clrnico 1) Bacterias Gram +
Staphylococcus aureus (aislado clrnico
2) Bacterias Gram +
Streptococcus pyogenes
Bacterias Gram +
Streptococcus viridans
Bacterias Gram +
Listena monocytogenes
Bacterias Gram +
Enterococcus sps.
Bacterias Gram +
Cendida glabrata
Levadura
Candida albicans
Levadura
Streptococcus Grupo C
Bacterias Gram +
Streptococcus Grupo G
Bacterias Gram +
Streptococcus Grupo F
Bacterias Gram +
Enterococcus faecalis
Bacterias Gram +
Streptococcus pneumoniae
Bacterias Gram +
Staphylococcus epidermidis (C-)
Bacterias Gram +
Gardenerella vaginalis
Bacterias Gram +
Micrococcus spa
Bacterias Gram +
Haemophilus influenza°
Bacterias Gram -
Neisseria gonorrhoeae
Bacterias Gram -
Moraxella catarrahlis
Bacterias Gram -
Salmonella sps.
Bacterias Gram -
Chlamytha trechomatis
Bacterias Gram -
Peptostreptococcus product.
Bacterias Gram +
Peptostreptococcus anaerobe.
Bacterias Gram +
Lactobacillus lennentum
Bacterias Gram +
Eubacterium lentum
Bacterias Gram +
Virus herpes simple I (VHS I)
Virus
Virus herpes simple II (VHS II)
Virus
5 __________________________Diagrama de solucion de problemas ejemplar
Problema
Posible Causa Posible accion
El control positivo lee un resultado negativo. Ninguna otra indicacion.
Muestra no procesada adecuadamente. Revisar el metodo de muestreo. Analizar de nuevo.
Lisis a granel no realizada, reactivos degradados. Analizar un nuevo lote de cartucho. Revisar la ubicacion de almacenamiento del cartucho (<30C). Contactar con HandyLab.
El control negativo lee un positivo. Ninguna otra indicacion.
Contaminacion Limpiar el Instrumento. Revisar el metodo de muestreo. Analizar de nuevo.
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Problema
Posible Causa Posible accion
Error: IND (resultado indeterminado-fallo de CI)
Fallo de CI, PCR no realizada. Analizar un nuevo lote de cartuchos.
Error: IND (resultado indeterminado)
Resultado limrtrofe - CI superado. Analizar de nuevo con nueva muestra del paciente.
Ejemplo 14: Manual del operador para aparato para el procesamiento de polinucleotidos
Este ejemplo no limitante describe, en forma de instrucciones para el usuario, diversas realizaciones del aparato, cartucho microflmdico, kit, metodos, y producto de programa informatico reivindicados, en particular dirigidos a un cartucho microflmdico para uso en un ensayo de PCR microflmdico que incluye la deteccion cualitativa de microorganismos tales como Streptococcus del grupo B.
La presencia de Estreptococos del grupo B (GBS) sigue siendo una causa principal de infeccion neonatal grave a pesar del gran avance en la prevencion desde los anos 1990 con sepsis, neumoma, y meningitis que afectan al bebe despues del nacimiento. El sistema de analisis de GBS puede usarse para la deteccion cualitativa rapida de ADN de Streptococcus del grupo B (GBS) en muestras vaginales/rectales.
Uso ejemplar e indicaciones para uso
En diversas realizaciones, el sistema de analisis de GBS puede usarse para la deteccion cualitativa y rapida de microorganismos en muestras clmicas, tales como ADN de Streptococcus del grupo B (GBS) en muestras vaginales/rectales.
Las indicaciones para uso rtpicas del analisis de GBS incluyen, por ejemplo, un analisis de cribado rapido en el regimen de atencion prenatal para la paciente de maternidad para determinar la necesidad de tratamiento con antibiotico durante el parto, tal como se describe mediante las directrices del CDC (Centers for Disease Control and Prevention. Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease: Revised Guideline from CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report, 16 de agosto de 2002; 5l (N.° RR-11); 1-24). El analisis puede proporcionar resultados rapidos en el centro de atencion o en un laboratorio central con servicio de entrega de resultado rapida durante la fase de intraparto y preparto del paciente de maternidad. El analisis tambien puede usarse para detectar ADN de GBS en muestras vaginales o rectales de cualquier sujeto del que se sospecha que tiene infeccion por GBS. Vease tambien Mark A. Bums, Brian N. Johnson, Sundaresh N. Brahmasandra, Kalyan Handique, James R. Webster, Madhavi Krishnan, Timothy S. Sammarco, Piu M. Man, Darren Jones, Dylan Heldsinger, Carlos H. Mastrangelo, David T. Burke “An Integrated Nanoliter DNA Analysis Device” Science, Vol. 282, 16 de octubre de 1998.
Explicacion de la aplicacion del analisis
El Centro para el Control y la Prevencion de Enfermedades recomienda cribado prenatal universal para colonizacion por GBS vaginal/rectal de todas las mujeres a las 35-37 semanas de gestacion con el fin de determinar la necesidad de antibioticos profilacticos durante el parto y el alumbramiento. La actual recomendacion del CDC es el metodo de analisis basado en cultivo (Metodo de cultivo estandar), cuyos resultados estan normalmente disponibles en 48-72 horas, en comparacion con aproximadamente 30 minutos para el presente analisis. En analisis puede utilizar preparacion de muestras automatizadas y PCR en tiempo real para identificar el gen cfb en el genoma de GBS que es una secuencia de identificacion establecida que codifica el factor CAMP. El factor CAMP es una protema extracelular normalmente presente en asilados de GBS. El factor CAMP puede usarse para la identificacion crefble de bacterias GBS en muestras clmicas mediante el metodo de cultivo. Este analisis puede realizarse en el entorno cercano al paciente por facultativos que no estan formados exhaustivamente en procedimientos de laboratorio. Una rutina de CC puede incorporarse en la interfaz del usuario para proporcionar Garanrta de Calidad continua para el analisis de gBs. El analisis tambien puede realizarse en un laboratorio estadfstico de hospital central siempre que el analisis de la muestra se produzca dentro del periodo de tiempo requerido por el departamento de maternidad.
Posibles contraindicaciones
El analisis de GBS puede estar contraindicado para personas con alergia al poliester contenido en el hisopo de recogida de espedmenes.
Advertencias y precauciones ejemplares
Las advertencias en el presente documento pueden ser adicionales a las de aplicacion general mostradas en el ejemplo 13, en el presente documento.
• El analisis de GBS puede no proporcionar resultados de susceptibilidad que se recomiendan para mujeres alergicas a la penicilina.
• Puesto que normalmente es necesario empezar con los antibioticos IV al menos 4 horas antes del parto, y en
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ausencia de datos de GBS preparto, puede ser importante recoger muestras y empezar el analisis de GBS en cuanto sea posible despues de que la paciente entra en la zona de Parto y Alumbramiento del hospital.
• En algunas realizaciones, si una paciente esta siendo tratada actualmente con antibioticos, el analisis puede ser un indicador no fiable de patologfa.
• El tampon puede contener azida sodica como conservante. Supone un riesgo para la salud si es ingerida.
• Normalmente, analisis el especimen en el plazo de, por ejemplo, 8 horas desde el muestreo y almacenamiento en el tampon. En la situacion en la que un especimen debe almacenarse, puede usarse refrigeracion a 4 °C durante un periodo de hasta 24 horas.
• Normalmente, evitar el uso de los materiales de analisis mas alla de la fecha de caducidad.
• Normalmente, evitar abrir el cartucho hasta despues de que la muestra esta lista para ser inyectada. Normalmente, evitar usar un cartucho si la bolsa metalizada protectora esta abierta. En algunas realizaciones, la exposicion a la luz, el aire y la humedad puede degradar los reactivos.
• Normalmente, usar hisopos, jeringa y tampon proporcionados en el kit de analisis. En algunas realizaciones, otras marcas de hisopo de recogida de GBS pueden interferir en el rendimiento del analisis.
• Normalmente, los materiales son solamente de un solo uso; reutilizar los materiales pueden dar resultados erroneos.
• Evitar abrir el envase del cartucho hasta estar listo para el analisis. Los reactivos incluidos pueden ser sensibles a la luz y la humedad. Evitar usar si el sello del envase esta roto y la bolsa de papel metalizado ya no esta expandido (hinchada).
Kit de recogida de muestras ejemplar
A. Hisopo
B. Tubos que contienen tampon de recogida de muestras.
C. Puntas de canula
D. Jeringas (por ejemplo, de 3 cc)
E. Filtros de jeringa
F. Cartucho microflmdico de GBS
Instrucciones de recogida de especmenes y suspension en tampon ejemplares
Precaucion: Normalmente, usar solamente el kit de recogida; evitar tocar el extremo del hisopo con los dedos. Retirar el hisopo del envase.
Limpiar el exceso de secreciones vaginales.
Insertar el hisopo 2 cm en la vagina (pase frontal).
Insertar el mismo hisopo 1 cm en el ano (pase posterior).
Confirmar que el vial de tampon de muestra (B) no ha caducado.
Sumergir el hisopo (A) vigorosamente arriba y abajo 20 veces en el vial que contiene tampon.
Retirar y desechar el hisopo.
Etiquetar el vial con informacion de ID del paciente
Preparacion ejemplar de muestras para analisis
• La punta de la canula (C) puede unirse a la jeringa (D)
• Extraer parte o toda la muestra al interior de la jeringa.
• Se puede extraer aire adicional (por ejemplo, 2 ml).
• La punta de la canula (C) puede sustituirse por el filtro (E).
• El envase del cartucho puede abrirse en los puntos de desgarro marcados en el envase.
• Los codigos de barras del vial de muestra (B) y el cartucho (F) pueden escanearse con el escaner del sistema. El sistema puede avisar si los materiales han caducado.
• La informacion de identificacion del paciente puede introducirse, en caso necesario.
• Se puede disponer el cartucho sobre la superficie plana o sostenerlo plano con Luer en posicion vertical. Normalmente, asegurarse de que el cartucho permanece con el lado de la etiqueta hacia arriba durante el procedimiento.
• La muestra (incluyendo el exceso de aire) puede inyectarse en el cartucho usando el conjunto de jeringa/filtro. Puede usarse presion de inyeccion suave para evitar salpicaduras desde la muestra.
• El conjunto de jeringa/filtro puede retirarse del cartucho.
• El cartucho puede agitarse suavemente de un lado a otro aproximadamente 10 veces hasta que los microgranulos dentro de la camara de muestra se disuelvan y se mezclen.
• El cartucho puede colocarse en el sistema
• La cubierta del sistema puede cerrarse y el asa puede bloquearse en posicion baja. (El analisis puede comenzar automaticamente)
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Resultados
Cuando el ensayo esta completo, los resultados pueden visualizarse claramente. Los resultados pueden imprimirse o almacenarse segun lo determinado mediante procedimientos de laboratorio.
Desechado ejemplar de materiales
El cartucho y el kit de recogida deben tratarse como riesgo biologico.
Rutina de control de calidad de laboratorio recomendada ejemplar Verificacion del analisis ejemplar
A intervalos semanales, se pueden ejecutar (1) control externo positivo y (1) control externo negativo. Un conjunto de CC para confirmar el rendimiento total del sistema. Este procedimiento tambien esta recomendado cuando se forman nuevos usuarios.
Indicaciones de rutina de control de calidad ejemplares:
Pueden analizarse muestras tal como se indica en las pantallas de visualizacion. Si un analisis de CC no consigue producir los resultados esperados, se puede contactar con el fabricante.
El control positivo externo puede incluir una alfcuota liofilizada de celulas de Streptococcus agalactiae (GBS) que se reconstituyen en el momento de ejecucion del analisis con tampon de recogida de muestras. El numero de celulas de GBS en el control positivo externo puede ser aproximadamente igual al lfmite mmimo detectable (LMD) del analisis.
Analisis de control de calidad ejemplares tambien incluyen un CC de autoanalisis del sistema, tal como se describe en el ejemplo 14.
Controles internos (en cartucho) ejemplares
Reactivos tfpicos para el ensayo pueden estar incluidos en el cartucho para reducir el potencial de errores de manipulacion del usuario y contaminacion. Dos tipos de estrategias de control positivo y negativo en cartucho pueden estar incorporados dentro de cada cartucho microflmdico, para monitorizar el rendimiento de ensayos de PCR individuales.
Un plasmido de control interno positivo ejemplar para GBS es una molecula de ADN circular bicatenaria que contiene una region de 96 pb compuesta por una unica secuencia de ADN de 39 pb flanqueada por las secuencias directa e inversa del gen cfb, puede estar incluido en la mezcla maestra liofilizada junto con una segunda sonda fluorogena distinta espedfica para esta secuencia unica. El fallo en amplificar la secuencia de control interno, en ausencia de una muestra de GBS positiva, puede ser indicativo de un fallo de la mezcla de reactivos o la presencia de inhibidores de PCR en el especimen.
PCR en tiempo real ejemplar para la deteccion de ADN de GBS
El analisis puede utilizar reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real para la amplificacion de una secuencia del gen cfb de GBS recuperada de muestras clmicas. Una sonda Tacman® espedfica de diana fluorogena puede usarse para la deteccion del ADN amplificado. El gen cfb codifica el factor CAMP, una protema extracelular difundible que normalmente esta presente en aislados de GBS. El analisis de deteccion de Streptococcus del grupo B (GBS) puede ser un tipo integrado, de muestra sin procesar a resultado de ensayo de amplificacion de acido nucleico. Los reactivos tfpicos para el ensayo pueden estar incluidos en el cartucho para reducir el potencial de errores de manipulacion del usuario y contaminacion cruzada.
Posibles limitaciones del analisis ejemplares
En algunas realizaciones, el sistema de analisis puede no estar cualificado para identificar ADN de GBS en espedmenes diferentes de espedmenes vaginales/rectales. Por ejemplo, espedmenes de orina y de sangre pueden no estar cualificados en algunas realizaciones.
En algunas realizaciones, una paciente sometida a tratamiento con antibioticos puede no ser capaz de obtener un correcto diagnostico de GBS.
En algunas realizaciones, el analisis puede no producir un cultivo de GBS adecuado para identificacion directa de las bacterias por un microbiologo.
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Caracteristicas de rendimiento e interpretacion ejemplares
El 10-30 % de las mujeres embarazadas estan colonizadas con GBS. Se determina que el Ifmite de colonizacion de GBS es aproximadamente 1000 copias de ADN/muestra determinadas mediante amplificacion de la secuencia del gen cfb. El usuario es remitido al diagrama de flujo de la figura 71 para aplicacion de criterios ejemplares para interpretacion del resultado, donde la diana en cuestion es GBS y plasmido de CI.
Posibles sustancias interferentes ejemplares
En algunas realizaciones, orina o secreciones vaginales, o moco, si esta presente en grandes cantidades, pueden interferir en el analisis.
En algunas realizaciones, no es probable que la contaminacion de las muestras con sangre, meconio, o lfquido amniotico interfiera en el ensayo.
En algunas realizaciones, en este momento no se conoce que la interferencia por farmacos (tales como los presentes en secreciones vaginal y rectal), diferentes de antibioticos, interfiera en la PCR.
Interpretacion de resultados y valores ejemplares esperados
El 10-30 % de las mujeres embarazadas pueden estar colonizadas con GBS. Se puede determinar que el lfmite de colonizacion por GBS es aproximadamente 1000 copias de ADN/muestra, determinado mediante amplificacion de la secuencia del gen cfb.
Las reacciones de PCR pueden interpretarse como positivas o negativas para GBS y control interno. Un algoritmo logico puede usarse para determinar si la muestra es Positiva o Negativa o Indeterminada.
Informacion de almacenamiento y estabilidad
Descripcion
Condicion de uso/almacenamiento Estabilidad
Especimen de la paciente en tampon (humedo)
a 15-30 °C 8 horas
Especimen de la paciente en tampon (humedo)
a 4 °C 24 horas
Especimen de la paciente (almacenamiento en seco)
a 15-30 °C 24 horas
Cartuchos de GBS -sin abrir
4-30 °C Fecha de caducidad
Cartuchos de GBS -abiertos
No usar. 60 minutos max.
Se han descrito una serie de realizaciones de la tecnologfa. No obstante, se entendera que pueden realizarse diversas modificaciones sin alejarse del alcance de las reivindicaciones. Por consiguiente, otras realizaciones estan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Un aparato (981), que comprende:
    un compartimento de recepcion (992, 2014) configurado parta recibir un cartucho microflmdico multicarril insertable (994), comprendiendo cada carril una zona de reaccion de PCR (1001) configurada para aceptar una muestra que contiene polinucleotidos (996);
    una pluralidad de conjuntos de calefactores, cada conjunto de calefactores acoplado termicamente a una zona de reaccion de PCR en el cartucho multicarril, comprendiendo cada conjunto de calefactores una pluralidad de calefactores (1003, 1005, 1007, 1009) configurados juntos para calentar dclicamente la zona de reaccion de PCR en condiciones de ciclado termico, la pluralidad de calefactores configurados, ademas, para mantener una temperatura sustancialmente uniforme por toda la zona de reaccion de PCR durante cada fase del ciclado termico
    un detector (999, 2009) configurado para detectar la presencia de uno o mas polinucleotidos amplificados en el cartucho multicarril; y
    un procesador (980) configurado para controlar independientemente cada calefactor con el fin de calentar dclicamente cada zona de reaccion de PCR del cartucho multicarril, el procesador configurado, ademas, para realizar reacciones de PCR independientes en muestras que contienen polinucleotidos en las zonas de reaccion de PCR del cartucho multicarril.
  2. 2. El aparato (981) de la reivindicacion 1, donde el detector (999, 2009) es un detector optico que comprende una fuente de luz (2850) configurada para emitir luz en una banda de absorcion de un colorante fluorescente, y donde el detector optico comprende, ademas, un detector de luz (2852) configurado para detectar luz en una banda de emision del colorante fluorescente, donde el colorante fluorescente corresponde a una sonda polinucleotfdica fluorescente o un fragmento de la misma.
  3. 3. El aparato (981) de la reivindicacion 1, donde la pluralidad de calefactores comprenden al menos dos fuentes de calor por contacto, donde las al menos dos fuentes de calor por contacto estan, cada una, configuradas para estar acopladas termicamente de forma independiente a una region seleccionada diferente del cartucho microflmdico (994), con lo que las regiones seleccionadas diferentes se calienten de forma independiente.
  4. 4. El aparato (981) de la reivindicacion 3, que comprende ademas una capa flexible en las al menos dos fuentes de calor por contacto, donde la capa flexible esta configurada para acoplar termicamente las al menos dos fuentes de calor por contacto con una o mas de las regiones seleccionadas del cartucho microflmdico.
  5. 5. El aparato (981) de la reivindicacion 1, que comprende ademas una tapa (2010) en el compartimento de recepcion (992, 2014), siendo la tapa maniobrable para excluir al menos parcialmente luz ambiente del compartimento de recepcion.
  6. 6. El aparato (981) de la reivindicacion 1, que comprende ademas uno o mas miembros de fuerza configurados para aplicar fuerza a al menos una parte del cartucho microflmdico (994).
  7. 7. El aparato de la reivindicacion 6, donde los uno o mas miembros de fuerza (1214) estan configurados para aplicar fuerza para acoplar termicamente las al menos dos fuentes de calor por contacto a al menos una parte del cartucho microflmdico (994).
  8. 8. El aparato (981) de la reivindicacion 1, donde el detector (999, 2009) esta configurado para detectar la presencia de uno o mas polinucleotidos amplificados que se amplifican mediante un metodo seleccionado entre el grupo que consiste en: reaccion en cadena de la polimerasa; TMA; SDA; NASBA; LCR; y amplificaciones por cfrculo rodante.
  9. 9. El aparato (981) de la reivindicacion 1, donde la pluralidad de calefactores comprende cuatro calefactores (1003, 1005, 1007, 1009) configurados para acoplarse termicamente a cuatro lados de la zona de reaccion de PCR (1001).
  10. 10. El aparato (981) de la reivindicacion 9, donde los cuatro calefactores (1003, 1005, 1007, 1009) comprenden un primer calefactor (1005) separado de un segundo calefactor (1003) por un espacio, siendo el espacio suficientemente pequeno para mantener un gradiente de temperatura de menos de 1 °C a traves de la anchura de una zona de reaccion de PCR (1001) en el cartucho multicarril (994) en cualquier punto a lo largo de una longitud de la zona de reaccion de PCR, comprendiendo los cuatro calefactores, ademas, un tercer calefactor (1007) y un cuarto calefactor (1009), siendo la longitud de los tercer y cuarto calefactores menor que la longitud de los primer y segundo calefactores.
  11. 11. El aparato (981) de la reivindicacion 1, donde cada conjunto de calefactores comprende, ademas, uno o mas sensores de temperatura (1011, 1013, 1015) configurados para controlar la energfa suministrada a la pluralidad de calefactores (1003, 1005, 1007, 1009), los uno o mas sensores de temperatura configurados, ademas, para transmitir informacion de temperatura al procesador (980).
    5
    10
    15
    20
    25
  12. 12. El aparato (981) de la reivindicacion 3, donde las al menos dos fuentes de calor por contacto estan configuradas para estar en contacto ffsico directo con una de las zonas de reaccion de PCR (1001) en el cartucho multicarril (994).
  13. 13. El aparato (981) de la reivindicacion 1, que comprende ademas un cartucho (994) en combinacion con el aparato, donde el cartucho comprende: uno o mas componentes microflmdicos configurados para actuar sobre volumenes microflmdicos de muestra que contiene polinucleotidos antes, durante y despues de la amplificacion de uno o mas polinucleotidos a partir de la muestra, estando los uno o mas componentes microflmdicos seleccionados entre el grupo que consiste en: uno o mas canales (204, 214, 228, 230, 240, 246, 256, 257, 261) configurados para permitir el paso de los volumenes microflmdicos; uno o mas accionadores (244, 248, 254) configurados para mover los volumenes microflmdicos; una o mas camaras (220) configuradas para contener los volumenes microflmdicos; y uno o mas componentes (206, 208, 210, 234, 242, 246, 250, 252, 258) configurados para inhibir el movimiento de los volumenes microflmdicos.
  14. 14. El aparato (981) de la reivindicacion 13, donde los uno o mas componentes configurados para inhibir el movimiento de los volumenes microflmdicos comprenden:
    una valvula microflmdica (206, 208, 210, 234) configurada para transformarse de un estado abierto a uno cerrado; y
    una compuerta microflmdica (242, 246, 250, 252, 258) configurada para transformarse de un estado cerrado a uno abierto.
  15. 15. El aparato (981) de la reivindicacion 2, donde el detector optico (999, 2009) esta configurado para detectar de forma independiente una pluralidad de colorantes fluorescentes en una pluralidad de ubicaciones diferentes del cartucho microflmdico (984), donde cada colorante fluorescente corresponde a un polinucleotido fluorescente o un fragmento del mismo.
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