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Die Erfindung betrifft eine Einrichtung
zum Dispensieren und Beobachten der Lumineszenz von Einzelproben
in Multiprobenanordnungen, insbesondere für die Untersuchung von biologischen,
chemischen oder zellbiologischen Assays mit hohem Probendurchsatz
(HTS und UHTS). Sie ist insbesondere zum Beobachtung von kurz andauernden
Lumineszenzerscheinungen (Flash-Lumineszenz) unmittelbar nach Dispensierung
mehrerer Kavitäten
(Wells) von Mikrotitrationsplatten (Mikroplatten) der vorgenannten
Art geeignet.
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Insbesondere in der Biochemie und
Pharmazie kommt es darauf an, in kurzer Zeit möglichst viele verschiedene
Substanzen in Mikrotitrationsplatten (Mikroplatten) durch Zugabe
von Reagenzien oder Zellen auszutesten. Dies geschieht meist in
Form eines Assays, bei dem genau festgelegt ist, in welcher Reihenfolge
zu welchem Zeitpunkt die Mikroplatte mit ihren Proben an welchem
Ort sein muss. Meist werden Reaktionen von lebenden Zellen auf pharmakologisch
interessante Substanzen geprüft.
Die Zellen müssen
dazu in einem Nährmedium
bei spezifischer Temperatur gehalten und mit Substanzen versetzt
werden, wiederum eine definierte Zeit im Wärmeschrank gehalten – inkubiert – werden
usw. Ebenso ist aber auch der umgekehrte Fall, nämlich die Zugabe von Substanzen
in die mit Reagenzien oder Zellen belegten Wells der Mikroplatte,
möglich.
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Am Ende wird in vielen Fällen die
oben geschilderte Vorbehandlung mit einer optischen Lumineszenzmessung
abgeschlossen. Dazu werden den Zellen vor oder in dem Zeitpunkt
der Lichtmessung noch eine oder mehrere Reagenzien zugegeben. Es soll
in möglichst
vielen (oder allen) Wells der Mikroplatte Flüssigkeit zugegeben und außerdem gleichzeitig
beginnend mit der Flüssigkeitszugabe
die Lichtemission gemessen werden. Dabei gibt es mehrere konkurrierende
Forderungen, wenn ein hoher Plattendurchsatz beim automatischen
HTS (High Throughput Screening) oder UHTS (Ultra High Throughput
Screening) erzielt werden soll.
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Da die generierten Lichtsignale teilweise
nur über
wenige Sekunden zu erwarten sind, ist – pro Well – die Intensitätsmessung
mit einer Zeitauflösung im
Sekundenbereich erforderlich. Die Gesamtmesszeit über eine
ganze Mikroplatte soll jedoch kurz sein.
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Wegen der hohen Kosten für die komplexen Verbindungen
der Dispensierreagenzien darf der Probeneinsatz nur einige μl einer verdünnten Lösung sein.
D.h. man benötigt
ein hochempfindliches Detektionssystem (möglichst Photonenzähler, z.B.
SEV bzw. PMT); herkömmliche
Videokamerasysteme sind dafür
nicht empfindlich genug.
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Herkömmlich erfolgt die reproduzierbare
Zugabe definierter Flüssigkeitsmengen
simultan über Pipettierer,
die zur Vermeidung einer Probenverschleppung aufgrund des Eintauchens
in die Probenflüssigkeit
der Wells nach jedem Pipettierschritt in einer Spülstation
zwischengespült
werden müssen. Demzufolge
werden für
einen hohen Mikroplatten-Durchsatz möglichst alle Wells einer Mikroplatte gleichzeitig
pipettiert. Diese Forderung beschränkt die Anwendbarkeit der Einrichtung
auf verschiedene Mikroplatten-Typen oder erfordert erhebliche Mehraufwände zum
Wechseln der Pipettierköpfe.
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Eine neuerdings für die Dispensierung eingeführte kontaktlose
Methode (
DE 199 11
456 A1 ) erspart zwar eine Zwischenspülung des Dispensierkopfes,
ist jedoch aufgrund einer definierten Pumpensteuerung nur auf eine
beschränkte
Anzahl von Dispensierdüsen
anwendbar, wodurch Verschiebeschritte des Dispensierkopfes gegenüber der
Mikroplatte erforderlich sind, die den Dispensiervorgang für die gesamte
Mikroplatte nicht in einem Schritt erlauben und somit den Vorgang
der Dispensierung verlängern.
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Im Stand der Technik sind zahlreiche
Pipettier- oder Dispensiergeräte
bekannt geworden, die über
eine optische Beobachtungseinrichtung zur Messung von Lumineszenzerscheinungen
infolge der Zugabe eines Reagens verfügen, um bestimmte Inhaltsstoffe
in den Kavitäten
(Wells) der Mikroplatte nachweisen zu können.
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So ist z.B. in dem Patent
US 4 772 453 ein Gerät beschrieben,
das die Messung der Lumineszenz in Mikroplatten gestattet, indem
eine Flüssigkeit zu
einer festen Zeit vor der Messung zugegeben wird und die Messung
sequenziell Well für
Well mit Hilfe eines Photo-Verfielfachers (SEV bzw. PMT) erfolgt. Dabei
wird die Mikroplatte mittels eines x-y-Tisches bewegt. Parallel
zur ablaufenden Messung wird Flüssigkeit
in das nächste
zu messende Well injiziert.
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Nachteil ist hierbei der große Zeitaufwand der
Messung sowie die Tatsache, dass keine Gleichzeitigkeit zwischen
Flüssigkeitszugabe
und Messung erreicht wird, d.h. eine sofortige kurze Lichtreaktion, eine
sogenannte Flash-Lumineszenz, kann nicht verfolgt werden.
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Ähnlich
ist die Lösung
im Patent
US 4 366 118 angelegt,
in dem ebenfalls ein sequentielles Auslesen per PMT beschrieben
wird. Die Zugabe von Substanzen zur Lichtreaktion erfolgt hier direkt über der
Messposition, d.h. simultan zur Messung. Damit besteht, wie bei
US 4 772 453 , der Nachteil
des großen
Zeitaufwandes für
die Messung Well für
Well in gleicher Weise, wenn Messzeiten im Sekundenbereich erforderlich
sind.
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Die europäische Patentanmeldung
EP 0 025 350 beschreibt
eine Lumineszenzvorrichtung, die ein simultanes Dispensieren und
Messen zulässt.
Der Dispensierer besteht aus einer Anzahl von Injektionsröhrchen,
die in einer Art Gabelaufhängung
mit einem unter jedem Röhrchen
befindlichen Detektor mitbewegt werden.
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Nachteilig ist dabei, dass die Detektoren
unterhalb der Töpfe
verbleiben müssen,
um den zeitlichen Verlauf einer kurzen Lumineszenzerscheinung verfolgen
zu können,
nachdem die Wells dispensiert wurden. Erst wenn die Messung beendet
ist, kann zur nächsten
Spalte der Mikroplatte weitergefahren werden. D.h., die Vermessung
einer Mikroplatte dauert sehr lange, weil jeweils nur eine Spalte
der Mikroplatte dispensiert und vermessen werden kann, wenn die Vermessung
der vorherigen Spalte abgeschlossen ist.
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In der WO 01/07896 wird eine Apparatur
offenbart, die die Lumineszenz von oben aus einer Mikroplatte mittels
einer gekühlten
CCD-Kamera ausliest. Infolgedessen erfolgt eine Flüssigkeitszugabe außerhalb
der Messkammer vor der Messung. Außerdem verwendet die eingesetzte
Optik eine spezielle Fresnellinse zur Abbildung. Nachteilig erscheint hier
die gekühlte
CCD-Kamera, die lange Integrationszeiten benötigt, um entsprechende Intensitäten der
Lumineszenz nachzuweisen. Einzelne Photonen sind nicht nachweisbar.
Da die Kamera außerdem nicht
gleichzeitig mit der Flüssigkeitszugabe
misst, können
Flash-Lumineszenzvorgänge
innerhalb weniger Sekunden sowie eine etwaige schnelle Kinetik des
Lumineszenzverlaufs nicht aufgezeichnet werden.
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Die
EP
0 753 734 beinhaltet eine Einrichtung zur Messung von Lumineszenz
unter Zugabe von Flüssigkeiten.
Dabei werden nacheinander zwei verschiedene Reagenzien mit unterschiedlichen
feststehenden Dispensiereinheiten zugegeben, wobei die Mikroplatte
darunter hinwegbewegt wird. In der Position der zweiten Dispensiereinheit
ist unterhalb der Mikroplatte eine Optik zur Übertragung des Lumineszenzlichts
auf eine Videokamera angeordnet. Nachteilig ist hierbei, dass die
erste feststehende Dispensiereinheit nur für Reagenszugaben ohne Lumineszenz
oder mit nicht zeitkritischer Lumineszenz verwendet werden kann,
denn die Flüssigkeitszugabe erfolgt
außerhalb
des Messbereichs der Kamera. Damit ist die Einrichtung nur für bestimmte
Reaktionsabläufe
geeignet. Außerdem
kann (wie bei der
EP 0 025 350 )
nicht gleichzeitig gemessen und weiter dispensiert werden. Das ist
wahrscheinlich aber deshalb nicht vorgesehen, da das Dispensiergerät wegen
des Eintauchens in die Flüssigkeiten
der Wells eine integrierte Waschstation zur Vermeidung von Probenverschleppungen
aufweist, in der die Dispensierspitzen während der andauernden Messung
gespült
werden. Dadurch wird jedoch der Probendurchsatz eines HTS-Regimes
ebenfalls beschränkt.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine
neue Möglichkeit
zum Dispensieren von Multiprobenanordnungen (Mikroplatten) und Beobachten der
Lumineszenz der Einzelproben, insbesondere für die Untersuchung von biologischen,
chemischen oder zellbiologischen Assays mit hohem Probendurchsatz
(HTS), zu finden, die eine sofortige Verlaufsbeobachtung der Lumineszenz
bei gleichzeitig fortgesetzter Dispensierung gestattet, ohne dass
sie auf einen bestimmten Mikroplatten-Typ beschränkt ist.
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Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei einer Einrichtung
zum Dispensieren und Beobachten der Lumineszenz von Einzelproben
in Multiprobenanordnungen, insbesondere für die Untersuchung von biologischen,
chemischen oder zellbiologischen Assays mit hohem Probendurchsatz
(HTS), enthaltend eine Mikroplatte mit einer Vielzahl von in Zeilen
und Spalten angeordneten Kavitäten,
eine Dispensiereinheit mit einer festen Anzahl von Dispensierspitzen,
die über
der Mikroplatte angeordnet ist, ein Tischsystem zum relativen Bewegen
der Mikroplatte gegenüber der
Dispensiereinheit, ein optisches System zur Übertragung von Lumineszenzlicht,
das in den Kavitäten
der Mikroplatte infolge der Dispensierung angeregt wird, auf eine
CCD-Kamera, wobei das optische System und die CCD- Kamera unterhalb
der Mikroplatte angeordnet sind und sich alle vorgenannten Komponenten
in einem lichtdichten Gehäuse
befinden, dadurch gelöst,
dass die Dispensiereinheit wenigstens einen linearen, symmetrisch
baumartig strukturierten Dispensierkamm aufweist, wobei der Dispensierkamm
eine gerade Anzahl von Dispensierdüsen enthält, die einen ganzzahligen
Teiler der Zahl der Kavitäten
in einer Dimension der Mikroplatte darstellt, dass die Dispensierkämme orthogonal
zu deren Längsausdehnung
verschiebbar angeordnet sind, um sukzessive einen vorgewählten Bereich
zu dispensieren, dass jeder Dispensierkamm an eine steuerbare Pumpe
zur Dosierung der zu dispensierenden Flüssigkeitsmenge angeschlossen
ist, um ohne Eintauchen in die Kavitäten der Mikroplatte zu dispensieren,
und dass die CCD-Kamera
mittels des optischen Systems auf einen großflächigen, rechteckigen Bereich
der Unterseite der Mikroplatte gegenüber der Dispensiereinheit ausgerichtet
ist, wobei die Fläche
in einer Dimension an die Längsausdehnung des
Dispensierkammes und in der anderen Dimension an den durch die Verschiebung
des Dispensierkammes überstrichenen
Bereich der Mikroplatte angepasst ist, so dass in jeder der aufeinanderfolgend dispensierten
Spalten von Kavitäten
der Mikroplatte ein zeitlicher Verlauf der Lumineszenz gleichzeitig mit
der fortgesetzten Dispensierung messbar ist.
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Vorteilhaft ist die Anzahl der Düsen eines Dispensierkammes
gleich der Anzahl der Kavitäten (Wells)
in den Spalten der Mikroplatte, wobei der Kamm relativ zur Mikroplatte
dann ausschließlich
in einer Richtung, die orthogonal zur Längsausdehnung des Kammes ist,
kontinuierlich verschoben zu werden braucht.
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Zur Erhöhung der Flexibilität der Dispensierung
verschiedener Mikroplatte ist es zweckdienlich, die Anzahl der Düsen des
Dispensierkammes kleiner als die Anzahl der Wells der Spalten der
Mikroplatte derart zu wählen,
dass die Anzahl der Wells in den Spalten der Mikroplatte ein ganzzahliges
Vielfaches der Anzahl der Dispensierdüsen des Kammes ist, wobei nach
der spaltenweisen Verschiebung des Dispensierkammes quer zu seiner
Längsausdehnung
(in x-Richtung) die Mikroplatte um so viele Zeilenabstände in Längsrichtung
des Kammes (in y-Richtung) verschiebbar ist, wie der Anzahl der
Düsen des
Dispensierkammes entspricht, um danach die Verschiebung des Dispensierkammes
in x-Richtung zu wiederholen.
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Es erweist sich als vorteilhaft,
wenn die Dispensiereinheit mehrere parallel zueinander angeordnete
Dispensierkämme
aufweist, die starr miteinander gekoppelt und jeweils über der
von der CCD-Kamera beobachteten Fläche der Mikroplatte verschiebbar
angeordnet sind.
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Damit können die Dispensierkämme zweckmäßig zur
aufeinanderfolgenden Dispensierung unterschiedlicher Substanzen
in dieselben Wells der Mikroplatte verwendet werden. Dabei kann
es ferner vorteilhaft sein, dass die Dispensiereinheit zusätzlich je
Dispensierkamm steuerbare Ventile zur Umschaltung zwischen verschiedenen
Dispensiersubstanzen aufweist, wobei die Ventile der Pumpe jedes
Kammes vorgeordnet sind. Hierdurch kann die Flexibilität bei der
Zugabe von verschiedenen Reagenzien zu den Proben einer oder verschiedener
Mikroplatten bei laufendem Betrieb weiter erhöht werden. Für diesen
Zweck ist neben der Mikroplatte eine Abfallwanne vorgesehen, in
die nach Umschaltung des Ventils der alte Flüssigkeitsinhalt aus dem Kamm,
der Pumpe und den Verbindungsschläuchen entleert wird.
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In einer weiteren Gestaltung der
Dispensiereinheit mit mehreren gekoppelten Dispensierkämmen sind
die Dispensierkämme
vorteilhaft zur aufeinanderfolgenden Dispensierung ein und derselben Substanz
in unterschiedliche Wells der Mikroplatte vorgesehen.
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Mehrere Dispensierkämme sind
auch dann zweckmäßig anzuwenden,
wenn die Düsen
eines Dispensierkammes den mehrfachen Abstand der Wells der Mikroplatte
aufweisen. Das ist z.B. bei Verwendung von Kämmen mit 4,5-mm-Düsenabstand für eine 1536er
Mikroplatte (mit 2,25 mm Wellabstand) der Fall, wobei dann mit einem
ersten Kamm nur die ungeraden und mit einem zweiten Kamm die geraden
Kavitäten
in den Spalten der Mikroplatte dispensierbar sind. Dadurch können die
für 96er
und 384er Mikroplatte verwendeten Dispensierkämme auch für die derzeit größten Standard-Mikroplatten (mit
1536 Wells) verwendet werden, indem die zwei Dispensierkämme um den
halben Düsenabstand versetzt
parallel zueinander angeordnet sind.
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Das Anpassen von größerem Düsenabstand des
Dispensierkammes gegenüber
einem engeren Raster der Mikroplatten-Wells kann aber auch in anderer
Weise geschehen. Dazu ist zweckmäßig nur ein
Dispensierkamm so angeordnet, dass er entlang seiner Längsausdehnung
relativ zur Mikroplatte um den halben Düsenabstand des Kammes verschiebbar
ist.
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Einerseits kann die relative Verschiebung des
Dispensierkammes um einen Bruchteil des Düsenabstandes vorteilhaft durch
Verschieben der Mikroplatte zwischen zwei oder mehreren unterschiedlichen
Positionen mittels des Tischsystems in y-Richtung und andererseits
durch Verschieben der Dispensiereinheit zwischen zwei oder mehreren
unterschiedlichen Positionen in y-Richtung bei unveränderter
Lage der Mikroplatte geschehen, wobei jeweils zwischen den Verschiebeschritten
in y-Richtung die fortlaufende x-Verschiebung des Kammes zur Dispensierung
und gleichzeitigen Beobachtung angefahrenen Zeile der Mikroplatten-Wells
erfolgt.
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Für
die optische Messung des schwachen Lumineszenzlichts weist das optische
System der CCD-Kamera zweckmäßig ein
lichtstarkes Objektiv und einen elektronenoptischen Lichtverstärker sowie eine
verkleinernd abbildende Relayoptik auf. Der Lichtverstärker kann
aber bei einer gekühlten CCD-Kamera
möglicherweise
auch entfallen.
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Als lichtstarkes Objektiv des optischen
Systems kann vorteilhaft ein kommerzielles Objektiv, mit dem die
Mikroplatte vollständig
auf den Chip der CCD-Kamera abgebildet wird, eingesetzt werden.
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In besonders vorteilhafter Weise
ist als lichtstarkes optisches System ein telezentrisches Objektiv
mit großer
numerischer Apertur vorgesehen, mit dem vorzugsweise ein rechteckiger
Ausschnitt der Mikroplatte (eine sogenannte Kachel) auf den Chip der
CCD-Kamera abbildbar ist, wobei oberhalb des so definierten Gesichtsfeldes
der CCD-Kamera die Dispensiereinheit angeordnet und deren Verschiebebereich
an das verfügbare
Gesichtsfeld der CCD-Kamera angepasst ist. Dabei wird die Mikroplatte
vorzugsweise in acht gleichgroße
rechteckige Abschnitte (Kacheln) unterteilt, die nacheinander mittels
des x-y-Tischsystems lückenlos
und nicht überlappend
in das Gesichtsfeld der CCD-Kamera einführbar sind, wobei die längere Kante
des Chip der CCD-Kamera in Richtung der kurzen Seite der Mikroplatte
ausgerichtet ist, um die Seitenverhältnisse von CCD und Kachel
der Mikroplatte weitgehend anzugleichen und das Gesichtsfeld der
CCD-Kamera voll auszuschöpfen.
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Zur Anpassung an unterschiedliche
Mikroplatten-Typen ist es vorteilhaft, eine Adapter-Halterung zur
Befestigung auf dem Tischsystem vorzusehen, die bei unterschiedlicher
Plattenhöhe
von Mikroplatten eine konstante Höhe der oberen Oberfläche der
untersuchten Mikroplatte gewährleistet.
Zur Einstellung einer scharfen Abbildung der Wells der Mikroplatte
auf den Chip der CCD-Kamera ist dabei zweckmäßig eine Stelleinheit zum vertikalen
Verschieben des gesamten Optik- und Kamerablocks vorhanden. Es kann
aber auch vorteilhaft eine komplette Autofokuseinheit vorhanden
sein.
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Die Grundidee der Erfindung basiert
auf der Überlegung,
das für
die in der Biochemie oder Pharmakologie erforderlichen massenhaften
Untersuchungen von Assays in einem HTS-Regime die zunehmende Forderung
nach Flexibilität
der Dispensier- und Beobachtungsgeräte daran scheitert, dass zur
Anwendung verschiedener Mikroplatten entweder Dispensierköpfe gewechselt
werden müssen oder
eine Zwischenspülung
erforderlich ist, die bei unterschiedlicher Anzahl von Wells eine
Mehrfachpipettierung der Mikroplatte mit geringerer Anzahl von Dispensierspitzen
gestattet. Außerdem
ist eine sofort mit der Dispensierung der Wells einsetzende Messung
stets ein Problem, wenn pro Mikroplatte in mehreren Schritten dispensiert
wird, wobei die großflächige Beobachtung
aller Wells an der geforderten hohen Nachweisempfindlichkeit für Lumineszenzstrahlung
scheitert und die Einzelbeobachtung der Wells wegen der erforderlichen
Messzeit für
eine Verlaufsbeobachtung die Fortsetzung der Dispensierschritte
behindert. Diese konkurrierenden Phänomene werden gemäß der Erfindung
durch den Einsatz wenigstens eines linearen, symmetrisch baumartig strukturierten
Dispensierkammes, der eine gerade Anzahl von Dispensierdüsen, die
einen ganzzahligen Teiler der Zahl der Wells in einer Dimension
der Mikroplatte darstellt, aufweist, an eine steuerbare Pumpe zur
Dosierung der zu dispensierenden Flüssigkeitsmenge (ohne Eintauchen
in die Wells der Mikroplatte) angeschlossen ist und orthogonal zu
seiner Längsausdehnung
verschiebbar ist, um sukzessive einen vorgewählten Bereich zu dispensieren.
Mindestens dieser vorgewählte
rechteckige Bereich wird auf der Unterseite der Mikroplatte gegenüber der
Dispensiereinheit mit einem sehr lichtstarken Objektiv und ggf.
zusätzlich
durch einen Lichtverstärker
intensivierten CCD-Kamera bei laufender Dispensierung beobachtet,
so dass ein zeitlicher Verlauf der Lumineszenz gemessen werden kann.
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Mit der erfindungsgemäßen Lösung ist
es möglich,
eine Vielzahl von Einzelproben in Multiprobenanordnungen, wie Mikroplatten,
zu dispensieren und gleichzeitig die emittierte Lumineszenz in ihrem zeitlichen
Verlauf zu beobachten sowie dabei einen hohen Probendurchsatz (HTS)
zu realisieren. Die Einrichtung gemäß der Erfindung zeichnet sich
durch hohe Flexibilität
bezüglich
der Vermessung verschiedener Mikroplatten-Typen und -Größen aus
und gestattet ohne wesentliche Verzögerung des HTS-Prozesses die
Anwendung mehrerer verschiedener Dispensiersubstanzen auf eine Mikroplatte
sowie eine unterschiedliche Dosierung von Dispensiersubstanzen in
unterschiedlichen Spalten der Mikroplatte.
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Die Erfindung soll nachstehend anhand
von Ausführungsbeispielen
näher erläutert werden.
Die Zeichnungen zeigen:
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1:
eine Prinzipansicht der erfindungsgemäßen Einrichtung,
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2:
eine Variante des optischen Abtastsystems mit herkömmlicher
lichtstarkem Objektiv,
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3:
eine Variante des optischen Abtastsystems mit einem lichtstarkem
telezentrischen Objektiv,
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4:
eine Prinzipdarstellung der Anpassung der abgebildeten Abschnitte
der Mikroplatte gegenüber
dem Chip der CCD-Kamera mit einem telezentrischen Objektiv,
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5:
eine Prinzipdarstellung der Anpassung der abgebildeten Abschnitte
der Mikroplatte gegenüber
dem Chip der CCD-Kamera mit einer Faserplatte zur optischen Abbildung
anstelle eines Objektivs,
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6:
eine Gestaltung der Dispensiereinheit für die Anwendung zweier versetzter
Dispensierkämme
für Mikroplatten,
die ein engeres Rastermaß als die
Düsen des
Dispensierkammes aufweisen,
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7:
eine Variante der Dispensiereinheit für mehrere unterschiedliche
Dispensierflüssigkeiten,
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8:
eine schematische Darstellung unterschiedlicher MP-Adapter zur Anpassung
an unterschiedliche Bodendicken von Mikroplatten,
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9:
eine schematische Darstellung einer Positioniereinrichtung zur Justierung
der Dispensiereinheit gegenüber
dem Tischsystem.
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Die erfindungsgemäße Einrichtung besteht in ihrem
Grundaufbau – wie
aus 1 zu entnehmen – aus einem
Tischsystem 1 mit zugehöriger
Tischsteuerung 11, einer darauf aufgelegten Mikroplatte (MP) 2,
einer Dispensiereinheit 3 mit Dispensiersteuerung 31,
einem CCD-Kamera-Block 4 mit Kamerasteuerung 41 sowie einem übergeordneten
Rechner 5, der vorzugsweise ein PC zur Ablaufsteuerung
und Koordinierung von Dispensierung, Bildaufnahme, Aufbereitung,
Speicherung und Ausgabe/Anzeige der optischen Messdaten vorgesehen
ist.
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Das Tischsystem 1 ist ein
x-y-Tisch, obgleich für
spezielle Anwendungen der erfindungsgemäßen Einrichtung nur eine Bewegung
in y-Richtung zur Zuführung
der MP 2 in die Einrichtung erforderlich ist. Die MP 2 weist
eine Vielzahl von Kavitäten
(Wells) 21 auf, in denen sich die zu dispensierenden und
bezüglich
Lumineszenz zu vermessenden Proben befinden. Die Wells 21 sind
geordnet in Zeilen und Spalten in der MP 2 und in festem
Raster angeordnet, dessen Rastermaß von der Dichte (d.h. der
Anzahl der Wells 21) der MP 2 abhängt. Es
werden derzeit vorrangig standardisierte 96er, 384er und 1536er
Platten verwendet, die in der erfindungsgemäßen Einrichtung in gleicher
Weise bearbeitet, d.h. dispensiert und vermessen, werden können, ohne
dass das geforderte HTS-Regime durch die Anpassung des Dispensier- und
Messregimes an die Anzahl der Wells 21 der MP 2 beeinträchtigt wird.
Die Erfindung ist aber auch leicht an beliebige andere MP-Formate (192er, 864er,
2400er, 3456er, 6144er MP) anpassbar, weil die Anzahl der Wells
je Spalte bzw. je Zeile jeder beliebigen MP stets ein Vielfaches
von 8 bzw. 12 ist und demzufolge lediglich eine
Anpassung der Düsenabstände und/oder
-anzahl der Dispensiereinheit 3 erforderlich ist.
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Üblicherweise
erfolgt die Flüssigkeitszugabe innerhalb
des lichtdichten Gerätes
(nicht dargestellt) über
eine Dispensierpumpe 33 mit einem angeschlossenen Dispensierkamm 32 (wie
auch noch ausführlicher
zu 7 beschrieben). Die
Düsen 321 des
Kamms 32 treffen exakt in die einzelnen Wells 21 einer
MP 2.
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Die in
1 oberhalb
der MP
2 angeordnete Dispensiereinheit
3 hat einen
speziell gestalteten Dispensierkamm
32, der acht linear
angeordnete Dispensierdüsen
321 aufweist.
Der Kamm
32 besitzt eine symmetrische baumartig verzweigte
Struktur, wobei – wie
in
1 angedeutet und
aus der
DE 199 11
456 A1 prinzipiell bekannt – der von einer Pumpe
33 kommende
Zufuhrkanal jeweils symmetrisch paarweise verzweigt und nach jeder
Verzweigung entsprechend verjüngt
ist, so dass an allen Dispensierdüsen
321 derselbe Druck
und der gleiche Volumenstrom auftritt, wenn die Pumpe
33 eine
bestimmte Menge der Dispensierflüssigkeit
fördert.
Die Dispensierdüsen
321 dispensieren
ohne Kontakt zu den vorhandenen Flüssigkeiten in den Wells
21,
d.h. es gibt keine Probenverschleppung. Die abgegebenen Volumina
der einzelner Düsen
321 sind
sehr konstant, da alle Düsen
321 den
gleichen Druck erfahren und da die Pumpe
33 mit einem sehr
genauen Schrittmotor arbeitet. Der gleiche, konstante Druck wird
erreicht durch die interne, symmetrische Kanalstruktur im Kamm
32.
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Mit diesem speziellen Dispensierkamm 32 wird – im Gegensatz
zu den herkömmlichen
Pipettierköpfen,
die in die Wells der MP eintauchen und zu diesem Zweck in z-Richtung
abgesenkt werden müssen – die Dispensierflüssigkeit
definiert abgetropft (d.h. genau genommen gespritzt) und die Dispensiereinheit 3 stets
in derselben Höhe
der z-Koordinate belassen. Die Dispensiereinheit 3 wird
aber orthogonal zu Längsausdehnung
des Kammes 32 in x-Richtung gegenüber der MP 2 (d. h. üblicherweise
gegenüber
der Zeilenrichtung der MP 2) bewegt. Das geschieht einerseits,
um den Mangel der zweiten Dimension des Dispensierkammes 32 zu
kompensieren, aber andererseits vor allem deshalb, um in dem vom
CCD-Kamerablock 4 erfassten
Bildfeld (Gesichtsfeld) jeweils bei kontinuierlich fortschreitender Dispensierung
eine simultane Lumineszenzmessung zu erreichen, die beginnend mit
der Dispensierung für
ein bestimmtes Zeitfenster (im Sekundenbereich bis einige 10 s)
eine Verlaufsmessung der Lumineszenz gestattet.
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Die dargestellte Einrichtung kann
alle bekannten MP-Formate (z.B. MP 2 mit 96, 192, 384, 864,
1536, 2400, 3456, 6144 Wells 21) verarbeiten, obwohl im
Folgenden nur auf die Standard-MP mit 96, 384 oder 1536 Wells eingegangen
werden soll.
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Bei den letztgenannten Standard-MP
existieren in y-Richtung Spalten mit 8, 16 oder 32 Wells,
die sich in x-Richtung mit Zeilen von 12, 24 bzw. 48 Wells kreuzen.
Der größte gemeinsame
Teiler (8 bzw. 12) der Zahl der Wells 21 der
MP 2 in einer ihrer beiden Dimensionen wird als die Anzahl
der Düsen 321 im Dispensierkamm 32 gewählt, um
die Gesamteinrichtung für
alle genannten Standard-MP-Größen einsetzen
zu können.
Wegen der besseren Steuerbarkeit des Druckes in einem Kamm 32 mit
wenigen Düsen 321 ist
die Richtung des Kammes 32 vorzugsweise in der kürzeren Dimension
der MP 2 (in y-Richtung, die üblicherweise in Zufuhrrichtung
= Hauptvorschubrichtung der MP 2 liegt) ausgerichtet.
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Falls der Kamm 32 jedoch
mit 12 Düsen 321 ausgerüstet ist,
so kann er in äquivalenter
Weise in x-Richtung orientiert sein und in y-Richtung verschoben
werden. Die Verschieberichtung der Dispensiereinheit 3 gegenüber der
MP 2 kann also in Abhängigkeit
vom verwendeten Kamm 32 auch anders gewählt werden.
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Stimmt die Anzahl der Dispensierdüsen 321 mit
der Anzahl der Wells 21 in einer der Dimensionen der MP 2 überein,
so ist der Dispensiervorgang für die
gesamte MP 2 in einem Zuge realisierbar, wie es in 1 – ohne Beschränkung der
Allgemeinheit – angedeutet
ist. Für
einen solchen Fall zeigt 2 den
Aufbau eines CCD-Kamerablockes 4,
mit dem (beispielweise bei der Dispensierung einer 96er MP 2 mit
einem mit acht Düsen 321 ausgestatteten
Dispensierkamm 32) die MP 2 komplett in einem
Bild von der CCD-Kamera 42 beobachtet wird. Da eine MP 2 gleichzeitig
zur Beobachtung mit Dispensierflüssigkeit
versehen werden soll, ist der Kamerablock 4 unterhalb der
MP 2 angeordnet, wobei die MP 2 einen transparenten
Boden aufweisen muss. Der Dispensierkamm 32 wird während der
Bildaufnahme kontinuierlich in x-Richtung über die gesamte MP 2 bewegt
und dispensiert spaltenweise mit acht gleichzeitigen „Schüssen" oder „Schusssalven",
d.h. mit einheitlich dosierter und synchroner Flüssigkeitsabgabe (als Strahl
oder sogenannter Jet) aus allen Düsen 321 des Kammes 32,
die Wells 21 der MP 2. Dabei nimmt die CCD-Kamera 42 fortlaufend
Bilder von der gesamten Unterseite der MP 2 auf und legt
synchron mit Beginn der Dispensierung der Wells 21 (spaltenweise)
zugeordnete Beobachtungsfenster an, in denen der zeitliche Verlauf
der durch die Dispensierung ausgelösten Lumineszenz erfasst und
im PC 5 geordnet abgelegt wird. Der PC 5 hat dabei die Mastersteuerungsfunktion
zur Synchronisation der spaltenweisen Dispensierung und der geordneten Auslesung
der Lumineszenzmesswerte. Die Dispensiereinheit 3 mit dem
Kamm 32 ist körperlich über dem
empfindlichsten mittleren Bereich des Gesichtsfeldes der Kamera 42 positioniert.
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Die 12 Spalten einer 96er MP 2 werden
mit einem Verschiebevorgang der Dispensiereinheit 3 abgearbeitet.
Hierbei wird ein Kamm 32 eingesetzt, dessen Düsen 321 einen
Abstand von 9 mm aufweisen, der dem Mittenabstand zweier Wells 21 einer 96er
MP 2 entspricht.
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Bei einer 384er MP 2 wird
der x-y-Tisch 1 so verfahren, dass zuerst die ersten acht
Zeilen Spalte für
Spalte der MP 2 durch kontinuierliches Verschieben des
Kammes 32 mit Dispensiersubstanz gefüllt (getropft) werden. Anschließend wird
die MP 2 mittels des Tischsystems 1 in y-Richtung
um acht Zeilen verschoben, um den zweiten Zeilenbereich zu bearbeiten.
Hierfür
wird ein Kamm 32 verwendet, dessen Düsen 321 einen Abstand
entsprechend dem Mittenabstand (4,5 mm) zweier Wells 21 einer
384er MP 2 besitzen.
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Der Einsatz einer CCD-Kamera 42 zur
Messung des Lumineszenzlichtes ist nur deshalb möglich, weil die CCD-Kamera 42 „intensiviert"
ist, d.h. sie ist mit einem sehr lichtstarken kommerziellen Objektiv 44 (z.B.
Leica f#1, f=50 mm, mit objektseitiger numerischer Apertur von NA=0,08)
und einem Restlichtverstärker 43 (Mikrokanalplattenverstärker ähnlich einem
Nachtsichtgerät,
engl.: micro channel plate oder auch image intensifier) ausgerüstet und
hat eine normale Videorate von 25 Bildern pro Sekunde. Damit ist über eine
leicht verkleinernde Relay-Optik 45, die zwischen Restlichtverstärker 43 und
CCD-Kamera 42 angeordnet ist, eine vollständige Abbildung mit
5,5-fachen Verkleinerung der MP 2 auf dem Kamerachip 421 gegeben.
Bei der Abbildung wird das in den einzelnen Wells 21 erzeugte
Lumineszenzlicht von der Unterseite der MP 2, die sich
in der Objektebene des Objektivs 44 befindet, auf den Restlichtverstärker 43,
bestehend aus Faserplatte, Elektronenoptik und Mikrokanalplatte
(nicht einzeln dargestellt), übertragen.
Die Faserplatte nimmt das Lumineszenzlicht auf und leitet es auf
die Katode der Elektronenoptik. Die dort herausgeschlagenen Elektronen
werden beschleunigt und 1:1 auf eine Mikrokanalplatte abgebildet,
die wie eine Vielzahl von Elektronenvervielfachern (PMT) wirkt und
an deren Ausgangsseite die Elektronen auf einen Phosphorschirm treffen.
Pro einfallendem Photon werden hierbei einige Hundert Photonen erzeugt,
die über
die Relay-Optik 45 auf den Kamerachip 421 abgebildet
werden.
-
Eine noch lichtstärkere CCD-Kamera 42 zeigt 3 mit einem weiter modifizierten
Kamerablock 4. Dieses Ausführungsbeispiel ist insbesondere auf
384er und 1536er MP 2 zugeschnitten, da mit zunehmender
Welldichte (und damit abnehmenden Volumen pro Well) der MP 2 eine
lichtstärkere
optischen Abbildung wünschenswert
ist und die größere Anzahl von
Wells 21 – aufgrund
der für
die Tropf-Dispensierung derzeit begrenzen Länge der Dispensierkämme 32 – eine (zumindest
in Zeilenrichtung der MP 2) abschnittsweise Abtastung notwendig
macht.
-
Die vorgenannten Erfordernisse werden durch
Einsatz eines lichtstarken telezentrischen Objektivs 46 im
Zusammenwirken mit einer Unterteilung der MP 2 in mehrere
gleichgroße
rechteckige Abschnitte (nachfolgend Kacheln) 22 erfüllt.
-
Die Dispensiereinheit 3 wird
dabei jeweils nur über
die Breite d (nur in 4 bezeichnet)
einer Kachel 22 verschoben. Die Länge c der Kachel 22 stimmt
mit der Längsausdehnung
des Kammes 32 überein.
Nach dem Verschieben der Dispensiereinheit 3 über eine
Kachel 22 und Abwarten der Messzeit zur Erfassung des Verlaufs
der Lumineszenz (für Flash-Lumineszenz
s 20 Sekunden) bewegt der (nur in 1 dargestellte)
x-y-Tisch 1 die aufliegende MP 2 auf eine neue
Position für
die Dispensierung und Messung der nächsten Kachel 22.
Das Muster der Bewegung des Tischsystem 1 ist dabei beliebig
wählbar.
Die „intensivierte
CCD-Kamera" umfasst in diesem Beispiel den Kamerablock 4 gemäß 3. Die Lichterzeugung erfolgt
entsprechend der Dispensierung in den einzelnen Wells 21 der
angefahrenen Kachel 22 der MP 2. Das lichtstarke
telezentrische Objektiv 46 (z.B. mit einer numerische Apertur
von NA = 0,45 erzeugt ein Bild von 1/8 der MP 2 auf einem Taper 47,
der optisch verbunden ist mit dem Eingang des (bereits im vorherigen
Beispiel beschriebenen) Restlichtverstärkers 43. Dabei nimmt
einee Faserplatte das Licht mit einer Apertur von NA ≈ 0,9 auf und
leitet es – wie
oben beschrieben – innerhalb
des Restlichtverstärkers 43 weiter. Über die
Relay-Optik 45 wird das photonenvervielfachte Bild auf
die CCD-Kamera 42 abgebildet. Es ergibt sich eine Gesamtverkleinerung
von einem Faktor 6 des Gesichtsfeldes von 1/8 der MP 2,
so dass für
das vorgenannte telezentrische Objektiv 46 die MP 2 in
acht Bleichgroße
Kacheln 22 unterteilt wird, um die gleichzeitige Dispensierung
und Vermessung der Lumineszenz vorzunehmen.
-
Zur Anpassung des Gesichtsfeldes
der CCD-Kamera 42 an das Format der Kacheln 22 zeigt 4 noch einmal stilisiert
die Gegebenheiten von 3,
wobei die Abmessungen der gleichgroßen Kacheln 22 mit
c × d
und die Fläche
des Kamerachip 421 mit a × b angegeben sind. Folgende
Kachel-Größen (Zeilen
mal Spalten) werden bei dem jeweiligen MP-Typ abgebildet:
96
er: 4 × 3;
384 er: 8 × 6;
1536er: 16 × 12.
-
Die 96er MP 2 soll an dieser
Stelle nicht ausführlich
behandelt werden, da hier ein Kamm 32 mit nur vier Düsen 321 eingesetzt
wird, der jedoch genauso gehandhabt werden muss, wie in den nachfolgenden
Beispielen die Kämme 32 mit
acht Düsen 321.
-
Die Abarbeitung der größeren MP 2 geschieht
analog wie bereits oben beschrieben. Bei einer 384er MP 2 werden
die sechs Spalten einer Kachel 22 unmittelbar aufeinanderfolgend
dispensiert, während
die CCD-Kamera 42 kontinuierlich Bilder dieser Kachel 22 aufnimmt.
Anschließend
wird die MP 2 insgesamt versetzt (durch den x-y-Tisch 1)
und somit das Gesichtsfeld der CCD-Kamera 42 auf die nächste Kachel 22 gerichtet
und die nächsten
6 Spalten dispensiert.
-
In gleicher Weise wie in 4 ist die Vorgehensweise
der Dispensierung/Abtastung bei 5 vorgesehen.
Unterschiedlich ist aber erneut die optische Realisierung des Kamerablocks 4,
der in diesem Beispiel aus einer parallelen Faserplatte 48 (mit 1:1-Abbildung), einem
Restlichtverstärker 43 und
einem Taper zur Reduzierung der Abbildungsgröße besteht. Die Besonderheit
besteht in der Notwendigkeit eines Kontaktes der Faserplatte 48 mit
dem Boden der MP 2. Die Faserplatte 48 weist nämlich eine
nahezu 90°-Apertur
auf, die die Auflage der MP 2 erforderlich macht. Dazu
ist eine Stelleinheit 49 am Kamerablock 4 vorgesehen,
mit der bei einem Wechsel einer MP 2 gegen die nächste oder
beim Verfahren des Tisches 1 zum Erreichen der nächsten Kachel 22 eine
Absenkung der Optik erfolgt. Nach der Verschiebung der MP 2 wird
dann der Kamerablock 4 erneut mit der MP 2 in
Kontakt gebracht. Gleichwertig könnte
aber auch das x-y-Tischsystem 1 eine Höhenverstellung aufweisen oder
es könnte
eine Kulissenführung
zum Anheben und Absenken der MP 2 im Tisch 1 vorhanden
sein.
-
Für
eine 1536er MP 2 zeigt 6 eine
Gestaltungsvariante der Erfindung, bei der ebenfalls ein Kamm 32 mit
acht Düsen 321 (mit
4,5 mm Düsenabstand)
eingesetzt werden kann. Dieses Beispiel beschneidet nicht die Möglichkeit,
für eine
1536er MP 2 einen Kamm 32 mit 16 Dispensierdüsen 321 einzusetzen,
sondern soll den Einsatz eines Kammes 32 mit acht Düsen 321 (von
4,5 mm Abstand) als eine Art Standard verwenden.
-
Dazu wird die in 6 dargestellte Doppelkammanordnung eingesetzt,
bei der in der Dispensiereinheit 3 für Kamm 32a und 32b jeweils
eine Pumpe 33 vorhanden ist (nur in 6 gezeigt). Die Kämme 32a und 32b sind
in Richtung ihrer Düsen 321 um
2,25 mm (d.h. den Weltabstand einer 1536er MP) versetzt an der Dispensiereinheit 3 angebracht. Infolge
der Baugröße des Kammkörpers ist
auch in der x-Richtung der MP 2 ein Versatz von wenigstens zwei
Wells 21 vorhanden, der jedoch durch zeitlich versetztes
Beginnen und Beenden des Dispensierens mit den Kämmen 32a und 32b bei
kontinuierlichem Abtasten eines Kachelabbildes mittels der CCD-Kamera 42 sowie
durch geordnetes Ablegen der Lumineszenzmesswerte als fiktiv versetztes
(geschachteltes) Öffnen
und Schließen
von Abtastfenstern nach realer Spaltenzugehörigkeit der Wells 21 einfach
bereinigt werden kann.
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Bei der Gesamtabtastung der MP 2 wird
mit dem vorstehend beschriebenen Modus zuerst eine erste Hälfte der
MP 2 (oder eine Kachel 22 davon) in das Gesichtsfeld
der CCD-Kamera 42 verschoben.
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Dabei werden zweckmäßig zwei
8fach-Kämme 32a und 32b verwendet,
die in einem festen x- und y-Abstand zueinander angeordnet sind.
Jeder Kamm 32a bzw. 32b hat einen festen Düsenabstand von
4,5 mm, so dass nur jedes zweite Well 21 dispensiert werden
kann. Beide Kämme 32a und 32b fahren gemeinsam
mit konstanter Geschwindigkeit über
die MP 2. Damit lassen sich verschiedene Dispensiermodi
durchführen:
- a) Beide Kämme 32a und 32b dispensieren
die gleiche Flüssigkeit.
Die Kämme 32a und 32b müssen nacheinander
an den Rändern
der MP 2 aktiviert und deaktiviert werden. Daraus ergibt sich
der Vorteil eines schnelleren Dispensierens der gesamten MP 2 oder
einer Kachel 22 davon.
- b) Beide Kämme 32a und 32b dispensieren
unterschiedliche Flüssigkeiten.
In diesem Fall weisen beide Kämme 32a und 32b dieselbe
y-Position auf. Hierbei können
sehr schnell hintereinander zwei Dispensiersubstanzen zugegeben
werden, deren gemeinsame Wirkung die Lichtreaktion auslöst. Es wird
allerdings nur jedes zweite Well 21 der Spalten der MP
2 dispensiert, so dass die MP 2 nach Abarbeitung aller Spalten um
einen Wellabstand in y-Richtung versetzt werden muss. Es kann aber
in äquivalenter
Weise auch zusätzlich
ein weiterer Doppelkamm um 2.25 mm parallel versetzt zu den beiden
ersten Kämmen 32a und 32b angeordnet
sein oder es sind zwei Kämme 32a und 32b vorhanden,
deren Düsen 321 den
gleichen Abstand wie die Wells 21 auf der MP 2 aufweisen.
-
Eine andere Variante des vorstehend
beschriebenen Dispensierprinzips, wenn die Dispensiereinheit 3 nur
einen Kamm 321 aufweist, ist leicht aus 6 ableitbar und kann demzufolge äquivalent angewendet
werden. In diesem Fall wird – sehr ähnlich der
Beschreibung zu 6 – eine 1536er
MP 2 abgearbeitet, indem von allen Spalten der MP 2 (von links
nach rechts in positiver x-Richtung) zuerst nur die ungeradzahligen
Zeilen dispensiert werden. Anschließend wird die MP 2 in
y-Richtung um ein
Well 21, d.h. 2,25 mm (Wellabstand einer 1536er MP), versetzt,
damit dann die geraden Zeilen aller Spalten dispensiert werden können. Auf
diese Weise werden alle sechzehn Wells 21 jeder Spalte
betropft. Anschließend
wird der x- y-Tisch
1 in einen zweiten Zeilenbereich verschoben und die gleiche Prozedur
für die
zweiten 16 Zeilen wiederholt.
-
Bei der Vermessung der 1536er MP 2 mit
einem telezentrischen Objektiv 46 (gemäß 3 und 4)
werden entsprechend – wie
oben beschrieben, mit jeweils einem 2,25 mm-Zwischenschritt – die einzelnen
Kacheln 22 in gleicher Weise über das Gesichtsfeld der Kamera 42 verfahren.
Der erfindungsgemäß auch für die 1536er
MP eingesetzte 8fach-Kamm 32 mit 4,5 mm Düsenabstand
wird, da der Wellabstand 2,25 mm beträgt und der Kamm 32 somit
nur jedes zweite Well erreicht, in jeder Kachel 22 zuerst
für die
ungeraden acht Zeilen 1,3,5,...15 benutzt
und danach, wenn die MP 2 um 2,25 mm in y-Richtung verschoben
wurde, werden die geraden Zeilen 2, 4, 6,...16
derselben Kachel dispensiert, bevor die MP 2 zur Dispensierung
und Beobachtung der nächsten
Kachel 22 verschoben wird.
-
Da die Kämme 32 ohne ein Wechseln
der Pumpe 33 leicht austauschbar sind, ist die erfindungsgemäße Einrichtung
an beliebige zu untersuchende MP 2 und jede Dispensiersituation
leicht anzupassen. Dabei wird man vorrangig solche Kammstrukturen
auswählen,
dass der Kamm 32 nach Möglichkeit
nur in x-Richtung verfahren werden muss. Das trifft auch für die 1536er
MP zu, wenn ein Kamm 32 mit entsprechend engen Abständen der
Düsen 321 (2,25
mm) eingesetzt wird.
-
Ihren besonderen Vorzug erreicht
die erfindungsgemäße Einrichtung
mit einer Gestaltung gemäß 7.
-
Die in diesem Aufbau integrierte
Flüssigkeitshandhabung
ermöglicht
es, dass verschiedene Dispensierflüssigkeiten auf eine MP 2 angewendet werden
können.
Das geschieht, wie prinzipiell im Stand der Technik bereits bekannt,
durch zwei Dispensierkämme 32,
die mit zeitlichem Versatz dieselben Spalten von Wells 21 dispensieren.
Zusätzlich besteht
eine Möglichkeit
der Umschaltung aber auch pro Kamm 32, ohne dass ein Waschvorgang
der Kämme 32 erforderlich
wird. Dazu werden die unterschiedlichen Dispensierflüssigkeiten über Zuführungsschläuche 36 einem
zweiwegigen Ventil 35 zugeführt, dass über einen Verbindungsschlauch 34 mit der
jeweiligen Pumpe 33 eines Kammes 32 in Verbindung
steht. Am Ventil 35 kann per Software zwischen den Dispensiersubstanzen
gewählt
werden. Danach fördert
die Pumpe 33, die mit Schrittmotor gesteuert wird, präzise ein
bestimmtes, aber einstellbares Volumen. Die geförderte Dispensiersubstanz wird
in den Dispensierkamm 32 gedrückt, der das Volumen gleichmäßig auf
die (beispielsweise acht) Düsen 321 verteilt.
In der 7 sind zwei Pumpen 33 gezeigt, die
sich – mechanisch
verbunden – mit
konstanter Geschwindigkeit über
die MP 2 bewegen. Dies ist mit dem Doppelpfeil angedeutet.
Zusätzlich
ist die Bewegung der MP 2, wie in den vorherigen Beispielen
beschrieben, möglich
und ebenfalls mit Doppelpfeilen verdeutlicht.
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Der Querschnitt der Düsen 321 ist
so klein, dass der über
die Pumpen 33 kurzzeitig angelegte Druck zu einem druckäquivalenten
Ausstoß der
vorgewählten
Flüssigkeitsmenge
und zu einem sauberen Abreißen
von Tropfen oder Strahlen führt.
Die Dispensierflüssigkeit
hat eine hohe Austrittsgeschwindigkeit. Die Anzahl der Düsen 321 ist
wiederum auf acht festgelegt. Der Druck wird von der per Schrittmotor
gesteuerten Pumpe 33 aufgebaut. Jeder Kamm 32 muss
einer eigenen Pumpe 33 zugeordnet sein. Die Zahl der Pumpen 33 ist
in diesem Beispiel auf zwei beschränkt, da die meisten bekannten
biochemischen Lichtreaktionen höchstens
die Zugabe von zwei verschiedenen Dispensierflüssigkeiten benötigen.
-
Die Pumpgeschwindigkeit v muss für eine zu tropfende
Flüssigkeit
optimiert werden. Eine Flüssigkeit
mit höherer
Viskosität
hat ein anderes Abrissverhalten als z.B. destilliertes Wasser. Dieser
Parameter (Pumpgeschwindigkeit v) ist softwaregesteuert. Falls sich
ein Tropfen nicht ablöst,
würde er
unkontrolliert beim nächsten
Dispensiervorgang in das nächste Well 21 oder
auf die Zwischenstege der MP 2 tropfen. Dies muss unbedingt
verhindert werden. Daher kann die Pumpgeschwindigkeit entsprechend
der Viskosität
der Dispensierflüssigkeit
eingestellt werden.
-
Die steuerbaren Ventile 35 und
die Volumeneinstellung sind nicht zeitkritisch, da im HTS für einen Assay
konstante Volumina gefordert und ausgewählt werden. Daher könnten sie
auch per Hand eingestellt werden. Trotzdem ist eine per Software
einstellbare Volumeneinstellung vorgesehen. Dies erhöht die Flexibilität der erfindungsgemäßen Einrichtung,
um auch zukünftige
komplexe Anwendungen erfüllen
zu können,
falls eine MP 2 mehrmals mit verschiedenen Dispensierflüssigkeiten
und -volumina betropft werden soll.
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Mit dem Ventil 35 pro Pumpe 33 kann
jeweils zwischen wenigstens zwei verschiedenen Dispensiersubstanzen
gewählt
werden. Das Ventil 35 hat die Aufgabe, auf unterschiedliche
Zufuhrschläuche 36 umzuschalten.
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Beim Umschalten zwischen den Dispensierflüssigkeiten
muss allerdings die vorher benutzte Flüssigkeit entfernt werden. Dies
geschieht in der Regel nach Abarbeitung einer ganzen MP 2,
da der Kamm 32 und die Verbindungsschläuche 34 erst über einer
Abfallwanne 6 entleert werden müssen. Auch hierfür kann eine
automatische, softwaregesteuerte Version vorgesehen werden. Auf
diese Weise können
komplexere Assays abgearbeitet werden und es erhöht sich somit die Flexibilität des Gerätes.
-
Da das Volumen in der Pumpe 33,
im Kamm 32 und in den Verbindungsschläuchen 34 sehr gering ist
(lediglich 100 bis 200 μl
gegenüber
einer Füllmenge
von einigen Millilitern bei einem herkömmlichen Pipettierkopf für eine 384er
MP), ist die Lösung
gemäß der Erfindung
wesentlich sparsamer im Verbrauch der Dispensierreagenzien. Außerdem erfordert
der Wechsel (das Ausstoßen
der ersten Reagens) kein Waschen und demzufolge nur eine kurze Unterbrechung
der Dispensierung und Messung. Dazu ist – wie in 7 schematisch gezeigt – eine Abfallwanne 6 parallel
zur MP 2 am Ende des Verschiebebereichs der Dispensierkämme 32 als schmaler
Sammelbehälter
angebracht, wobei der Flüssigkeitsrest
der zuletzt benutzten Dispensierflüssigkeit aus Kamm 32,
Pumpe 33 und Verbindungsschlauch 34 ausgestoßen wird,
indem die neue Dispensierflüssigkeit
im Wesentlichen zum Verdängen, aber
auch zum Spülen
verwendet wird.
-
Auf dem Markt gibt es unterschiedliche MP-Formate,
deren Außenmaße zwar
nahezu gleich sind, die je nach unterschiedlichem MP-Typ aber unterschiedliche
Höhen der
transparenten Böden
aufweisen. Dies hat zur Folge, dass sowohl die Optik als auch der
Dispensierkamm 32 höhenverstellbar
sein müsste.
Deshalb ist vorgesehen, dass die Oberkante der MP 2 stets in gleicher
Höhe vorliegt,
damit der Dispensierkamm 32 nicht in der Höhe verstellt
zu werden braucht. Dazu weist der x-y-Tisch 1 – wie in 8 gezeigt – Adapterhalterungen 12 auf
und wird mit auswechselbaren MP-Adaptern 13 bzw. 14 (je nach
Höhe des
Bodens der verwendeten MP 2) bestückt, so dass nur die Optik
an die jeweilige Höhe angepasst
werden muss. Die Anzahl der auszutauschenden Adapter 13 oder 14 richtet
sich nach der Anzahl der verarbeiteten MP 2. In 8 sind nur zwei verschiedene Paare von
Adapter 13 und 14 als austauschbar dargestellt,
wobei für
die dickere MP 2 (obere Darstellung) flachere MP-Adapter 13 und
für dünnere MP-Böden höhere Adapter 14 vorgesehen sind.
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Damit das Abbildungsverhältnis bestehen bleibt,
ist der gesamte Kamerablock 4 in Richtung MP 2 mittels
eines Stellantriebs 49, der Feinantriebs- und Präzisionsführungen
enthält
(nur in 1 und 5 gezeigt), höhenverstellbar.
Es kann aber auch ein Autofokussystem eingesetzt sein.
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Die intensivierte CCD-Kamera 42 hat
im Übrigen
eine kalottenförmige
Empfindlichkeitsverteilung mit einem zentralen Maximum und einem
entsprechenden Randabfall. Deshalb ist es zweckmäßig, eine Kalibrierung vorzunehmen,
um die Empfindlichkeit für
das gesamte Gesichtsfeld der CCD-Kamera 42 durch elektronisch
Korrektur homogen zu gestalten.
-
Der Dispensierkamm 32 fährt mit
konstanter Geschwindigkeit über
das Gesichtsfeld der Kamera 42. Aus den bekannten Daten – Abstand
zweier Spalten einer MP 2, konstante Verfahrgeschwindigkeit des
Kammes 32 und definierte, parametrisierte Beobachtungszeit
der Kamera 42 – ist
das Zeitintervall zwischen zwei aufeinander folgenden Dispensierschritten
leicht zu bestimmen. D.h., mittels einer Software wird berechnet,
wann für
jede dispensierte Spalte das Beobachtungszeitfenster öffnet und
wieder schließt.
Innerhalb des Zeitfensters werden die Signale jedes Wells 21 integriert.
Das Fenster schiebt sich sozusagen mit dem Dispensierkamm 32 über die MP 2.
Die Kinetiken aller Wells 21 können trotz des zeitlichen Versatzes
normiert und übereinander
gelegt dargestellt werden. Der Anwender hat den Eindruck einer gleichzeitigen
Zugabe der Reagenzien in alle Wells 21 einer Kachel 22 oder
einer MP 2, die der Beobachtung unterliegen.
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Das zu dispensierende Volumen ist
ebenfalls von der Software durch entsprechende Ansteuerung eines
Schrittmotors in der bzw. den Pumpen 33 der Dispensiereinheit 3 einstellbar.
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Da der Dispensierkamm 32 vorzugsweise acht
Düsen aufweist,
die linear in Spaltenrichtung der MP 2 ausgerichtet ein
ganzzahliger Teiler der Anzahl der Wells 21 der MP 2 sind,
ergibt sich hieraus eine vorteilhafte Flexibilität. Es können kleinere Bereiche der
MP 2 (z.B. einzelne Spalten oder ggf. auch nur Teile davon)
für Vergleichsmessungen
mit anderen Volumina der Dispensiersubstanz – auch Nullvolumen (keine Zugabe) – dispensiert
werden. Außerdem können per
Software auch nur einzelne Spalten zur Dispensierung ausgewählt werden,
was wiederum die Flexibilität
erhöht
und mit den derzeit verfügbaren Pipettiergeräten nicht
möglich
ist. Das dispensierbare Volumen kann auch beliebig verändert werden,
indem eine bestimmte Anzahl von gleichen Zugabemengen („Schüsse") pro
Well 21 abgetropft bzw. abgeschossen werden. Dies hat den
Vorteil einer gleichmäßigeren
Durchmischung der Flüssigkeiten über die
Breite eines Wells 21 (insbesondere bei Proben- und/oder
Dispensierflüssigkeiten
mit großer
Viskosität).
Außerdem
hat die mehrfache Zugabe konstanter Flüssigkeitsmengen den Vorteil,
auch größere Mengen
als das übliche
Maximalvolumen oder in unterschiedlichen Spalten der MP 2 ein
Mehrfaches z.B. einer „üblichen"
Zugabemenge zu dispensieren. Dabei bleibt das eingestellte Volumen
stets konstant und es reduziert sich der Fehler der Volumeneinstellung.
Eine solche Flexibilität
der Volumeneinstellung haben kommerzielle Vielfachpipettierer (z.B.
Hamamatsu) nicht, da bei letzteren das Dispensiervolumen – so wie
einmal vorgegeben – einheitlich über alle Wells
der gesamten MP abgegeben wird.
-
Bei einer Einrichtung gemäß der Erfindung benötigt man
keinen vertikalen Verfahrmechanismus für den Dispensierkopf und kann
wegen der verwendeten Tropftechnik ohne Probenverschleppung fortlaufend
dispensieren. Das Dispensieren erfolgt auch über mehrere MP 2 ohne
Zwischenspülung
und es entfällt
die sonst übliche
Waschstation, um die Spitzen zu reinigen, da ein Eintauchen in die
Wells 21 der MP 2 nicht erfolgt. Assays, die die
Zugabe von zwei Flüssigkeiten
direkt hintereinander zur Initiierung von Lichtreaktionen erfordern,
können
ohne Einschränkungen
gemessen werden, da die MP gegenüber dem
Gesichtsfeld der Kamera während
der fortlaufenden Dispensierung aufeinander folgender Spalten der
MP 2 nicht verschoben wird, so dass eine vollständige und
kontinuierliche Beobachtung der Kinetik möglich ist. Das kontaktfreie
Dispensieren ist aus Gründen
der erreichbaren Probenreinheit, aus Kostengründen wegen der geringeren Mengen
an benötigter
Dispensierflüssigkeit
und wegen der größeren Flexibilität bei der Änderung
von Art und Volumina der Dispensiersubstanzen einem eintauchendem
Pipettieren wesentlich überlegen.
-
Eine scheinbar längere Dauer des Dispensierens
mit nur acht Düsen
gegenüber
dem vollständigen
Pipettieren aller Wells 21 einer MP 2 lässt sich durch folgende kompensierende
Effekte widerlegen:
- a) die gesamte Messzeit
für eine
Flash-Lumineszenz beträgt
ca. 20 s. Die konstante Geschwindigkeit des Kamms über der
MP erfordert etwa nochmals diese Zeitspanne, so dass sich die gesamte
Verweilzeit der MP im Instrument höchstens verdoppelt.
- b) da eine Spülzeit
oder Spitzenwechselzeit entfällt, kann
die nächste
Platte unmittelbar nachfolgend (ohne weitere Zwischenschritte) gemessen
werden,
- c) wenn mehrere verschiedene Flüssigkeiten zugegeben werden
müssen,
können
entsprechend viele Kämme
mit jeweils einer Pumpe im Gerät
angesteuert werden, so dass diese mit konstantem Abstand hintereinander
dispensieren, während
die Kamera jede Zugabe mit beobachten (d.h. den Verlauf der Lumineszenz
messen) kann.
-
Um zwischen verschiedenen Mikroplatten 2 beliebig
wechseln zu können,
ist eine genaue Anpassung des Verfahrmechanismus und der Dispensiersteuerung 31 der
Dispensiereinheit 3 erforderlich. Für diese Justierungen wird ein
Justierkamm 37 eingesetzt, der an die Stelle der sonst
eingesetzten Dispensierkämme 32 gesteckt
wird. Einen solchen Justierkamm 37 zeigt 9. Der Justierkamm 37 enthält wenigstens
zwei Lichtquellen 371 und zugehörigen Fokussieroptiken 372,
die die Wells 21 entsprechend dem Raster der MP 2 beleuchten.
Gespeist werden die Lichtquellen 371 von einer Spannungsquelle 373 (z.B.
einer Batterie oder einem Akku in Knopfzellenform), wobei diese
mit einem äußeren Schalter 374 in Betrieb
genommen werden. Die Dispensiereinheit 3 und ggf. auch
das Tischsystem werden nun verfahren, um mittels dem CCD-Kamerablock 4 den
Zustand der mittigen Lage des Lichtspots der fokussierten Lichtquellen 371 unter
der MP 2 festzustellen und entsprechenden Steuersignale
zu generieren.
-
Für
die oben beschriebene erfindungsgemäße Einrichtung sind weitere
Ausgestaltungen möglich,
ohne den Rahmen dieser Erfindung zu verlassen. Ausgegangen wurde
in den vorhergehend beschriebenen Beispielen von einer Dispensiereinheit 3 mit
einem Dispensierkamm 32, der eine feste Anzahl von Dispensierdüsen 321,
die der größte gemeinsame
Teiler der Anzahl der Wells 21 in einer der Dimensionen
herkömmlicher
MP 2 ist, aufweist. Dabei sind aber Sonderausführungen
wie z.B. ein versetzt angeordneter Doppelkamm oder ein Kamm mit 16 der 32 Düsen nicht
erfindungsfremd. Es sind insbesondere auch beliebige Mehrfachanordnungen
von starr gekoppelten Kämmen 32,
die eine vollständige
Dispensierung einen ganzen Spalte oder Zeile einer MP 2 gestatten,
gleichfalls klar als innerhalb der erfindungsgemäßen Lehre zu verstehen, solange
sich diese ohne erfinderisches Zutun in entsprechende Abtastfenster
einer Bildabtastung der MP 2 integrieren lassen. Die Einteilung
in eine bestimmte Anzahl von Messabschnitten auf der MP 2 (Kacheln 22)
ordnet sich ausschließlich
dem verwendeten lichtstarken optischen System des Kamerablocks 4 unter
und ist keinesfalls auf acht beschränkt. Ebenso ist die offenbarte
Möglichkeit
des Einsatzes einer Dispensiereinheit 3 mit zwei Dispensierkämmen 32 und
zwei Ventilen 35 zur Umschaltung auf vier verschiedene
Dispensiersubstanzen rein willkürlich
und jederzeit ohne erfinderische Tätigkeit auf beliebige andere
Dispensieranforderungen umstellbar.
-
Selbstverständlich umfasst die Erfindung
neben der vorstehend offenbarten licht- und auflösungsstarken Anordnung mit
einer Aufteilung der MP 2 in acht Beobachtungsabschnitte
(Kacheln) auch beliebige andere Aufteilungen der MP 2,
beispielsweise 4 oder 2 Kacheln. Ebenso sind alle
oben beschriebenen Beispiele mit Aufteilung der MP 2 in
Kacheln bei geeigneter anderer Dimensionierung von Dispensiereinrichtung 3 und
Kamerablock 4 auch auf die ganze MP 2 anwendbar.
-
- 1
- Tischsystem
- 11
- Tischsteuerung
- 12
- Adapterhalter
- 13
- flacher
MP-Adapter
- 14
- hoher
MP-Adapter
- 2
- Mikroplatte
(MP)
- 21
- Well
(Kavität)
- 22
- Kachel
(Abschnitt der MP)
- 3
- Dispensiereinheit
- 31
- Dispensiersteuerung
- 32
- Kamm
- 32a,
32b
- erster,
zweiter Kamm
- 321
- Düsen
- 33
- Pumpe
- 34
- Verbindungsschlauch
- 35
- Ventil
- 36
- Zufuhrschläuche
- 37
- Justierkamm
- 371
- Lichtquellen
- 372
- Fokussieroptik
- 373
- Spannungsquelle
- 374
- Schalter
- 4
- Kamerablock
- 41
- Kamerasteuerung
- 42
- CCD-Kamera
- 43
- Restlichtverstärker
- 44
- lichtstarkes
Objektiv
- 45
- Relay-Optik
- 46
- telezentrisches
Objektiv
- 47
- Taper
- 48
- Faserplatte
- 49
- Stelleinheit
- 5
- Rechner(PC)
- 6
- Abfallwanne