EP0008357B1 - Mikropipette zur berührungslosen, strichförmigen Auftragung eines abgemessenen Volumens einer Suspension - Google Patents

Mikropipette zur berührungslosen, strichförmigen Auftragung eines abgemessenen Volumens einer Suspension Download PDF

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EP0008357B1
EP0008357B1 EP79102426A EP79102426A EP0008357B1 EP 0008357 B1 EP0008357 B1 EP 0008357B1 EP 79102426 A EP79102426 A EP 79102426A EP 79102426 A EP79102426 A EP 79102426A EP 0008357 B1 EP0008357 B1 EP 0008357B1
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Bernhard Hugemann
Günter Dr. Von Sengbusch
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0241—Drop counters; Drop formers
    • B01L3/0244—Drop counters; Drop formers using pins
    • B01L3/0248—Prongs, quill pen type dispenser
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids
    • B01L3/0217—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids of the plunger pump type

Definitions

  • the invention relates to a micropipette for the contactless, line-shaped application of a measured volume of a suspension containing cells or particles, a plunger being arranged in the pipette in a liquid-tight manner and the outlet opening of the pipette being closable by the plunger.
  • the invention relates to a micropipette with which a certain amount of a cell or particle suspension in the form of a line with a defined length and width can be deposited on a suitable carrier.
  • suspensions are routinely made and prepared.
  • a standard method is the flat preparation of cell suspensions on microscope slides.
  • the cell suspension is distributed over the entire surface of the slide using a second slide or applied in a thin layer.
  • This method has the disadvantage that the cells and the liquid adhere to the auxiliary slide with which the suspension is distributed. Part of the cell suspension is therefore lost. For this reason, it is no longer possible to count the cells in proportion to the volume.
  • the cell distribution is flat and partly uneven.
  • Micropipettes have already been described for the removal and deposition of small volumes of liquid (E. Stahl, Thin Layer Chromatography, Springer-Verlag 1967, 64-66). However, such pipettes can be used for automatic, line-shaped preparation of cell suspensions with a defined volume and a line width that is smaller than that Diameter of the microscope field of view at 250 x magnification, not done. Even the use of a brush-like brush, which is inserted into the pipette tip, does not allow the streak-like preparation of cell suspensions, since the brush captures cells or particles due to its great capillary force, which means that only the liquid is written and part of the liquid remains in the brush there dries up or is dragged into the next sample.
  • Hand-operated dosing and pipetting devices are also not suitable for the preparation of cell suspensions (DE-A1-2 541 642, US-A-3 606 086 and FR-A-927 862).
  • the glass tongue serves the complete equality of the drops stuck to their drops. If you were to use such a pipette for cell suspensions, cell deposits could not be avoided.
  • Devices which enable a linear application of the test substance on a support and an automatic evaluation of the material to be examined (e.g. DE-A-19 00 808).
  • the suspension is deposited in the form of a line on a band-shaped carrier without completely touching it, and the width of the line is adapted to the diameter of the field of view of the microscope.
  • the deposition is carried out with a pull-out spring formed by two metal tongues of variable spacing, between which the suspension volume to be deposited has to be placed. When writing out, the slide must be lightly touched by the tips of the metal tongues to allow the suspension to flow out. This causes permanent wear.
  • volume-precise, volume-proportional depositing of particles from suspensions in the form of a line with a defined width and length at a given time and writing speed is not possible with such a device, since both liquid and particles on the surfaces of the metal tongues that are touched by the suspension, get stuck and the outflow rate of the suspension is dependent on both its surface tension and the wetting properties of the specimen carrier.
  • Another major disadvantage is that the system has to be cleaned before each sample change in order to prevent cell carryover.
  • the replacement of the metal tongue writing device by a micropipette in which a piston is arranged in a liquid-tight manner in a capillary tube in such a way that it can be moved in the axial direction in the direction of the capillary outlet opening by means of a miniature electric motor with a reduction gear in accordance with the volume to be absorbed and then rejected during writing, and after the process has ended the capillary is flush, does not meet the requirements, particularly for larger suspension volumes (eg> 1 pl) with a preselectable line width.
  • the cell line width that can be achieved corresponds to the outer diameter of the pipette tip and is only a little wider than the capillary diameter if the tube has a conically pointed shape at the outlet opening.
  • the particle suspension is forced out by moving the piston and can be motorized driven with infinitely variable speed.
  • the capillary is emptied without residue due to the piston seal.
  • a major advantage of such a pipette is that the forced expulsion of the suspension from the pipette means that the tip of the pipette no longer has to touch the carrier, thereby preventing wear of the tip or damage to the carrier surface. There is no carry-over of material into the next sample, the pipette can be cleaned at longer intervals.
  • a 0.3 mm can be used with a liquid quantity of, for example, 0.15 ⁇ l when using a capillary with a tip diameter of 0.3 mm and a capillary diameter of 0.2 mm with a piston stroke of approx. 4.8 mm broad line can be described without contact in the range of 5 to 50 cm in length.
  • the disadvantage of such a pipette is that it can only process volumes in the range of 0.1 to 0.5 yl. For example, in order to process a volume greater than 1.5 .mu.l, the piston travel would have to be longer than 50 mm, resulting in large instabilities which make these arrangements unusable.
  • the present invention is therefore based on the object of eliminating the aforementioned disadvantages and developing a pipette system with which defined predetermined amounts can be taken from a cell or particle suspension and these amounts in the form of a straight or spiral line on a suitable carrier, e.g. Plastic tape or glass plate, can be deposited without contact.
  • a suitable carrier e.g. Plastic tape or glass plate
  • the extension is preferably provided in the direction of the piston path with a slot-shaped recess or a notch, the width of which is smaller than the diameter of the suspended cells or particles in order to prevent deposition. So that the entire volume of the cell suspension can be expelled again, the notch or cutout is connected at the end of the piston path. Ir y this manner, the liquid with the aid of the capillary force is produced in the recess or notch, to flow up to the top of the extension.
  • hydrophilic coating of the extension Compounds that can be used to form hydrophilic coatings are known.
  • the extension can be mounted on the outlet opening of the pipette.
  • the outlet opening of the pipette is preferably shaped on part of its circumference in such a way that an extension is formed.
  • the outlet opening 1 of the pipette 2 has an extension 3.
  • the outlet opening is shaped such that it is flush with the piston when the ejection process has ended.
  • the width of the extension 3 determines the width of the cell track.
  • the extension 3 is provided with a notch 4. Due to the additional capillary force in the notch, the liquid can easily flow to the tip and form a drop. To avoid cell deposits, the width of the notch is smaller than the diameter of the suspended cells or particles.
  • the stroke length can be predetermined in such a way that there is an optimal occupancy density and also distribution of the cells or particles in the stroke.
  • the line width can be adapted to the requirements, e.g. automated microscopic evaluation. If the stroke width e.g. set so that the entire line width is always detected in the field of view of a microscope, all cells or particles can be analyzed one after the other with continuous movement of the line through the field of view, without problems with marginal cells.

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf eine Mikropipette zur berührungslosen, strichförmigen Auftragung eines abgemessenen Volumens einer Suspension, die Zellen oder Partikel enthält, wobei in der Pipette ein Kolben flüssigkeitsdicht angeordnet und die Austrittsöffnung der Pipette durch den Kolben bündig abschließbar ist. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Mikropipette, mit der eine bestimmte Menge einer Zell- oder Partikelsuspension in Form eines Strichs mit definierter Länge und Breite auf einem geeigneten Träger deponiert werden kann.
  • Für medizinisch-diagnostische Zwecke, z.B. bei Blut- oder Zell- untersuchungen, werden routinemäßig Suspensionen hergestellt und präpariert. Eine Standardmethode ist die flächige Präparation von Zellsuspensionen auf Mikroskop-Objektträgern. Hierfür wird die Zellsuspension auf der gesamten Oberfläche des Objektträgers mit Hilfe eines zweiten Objektträgers verteilt bzw. in dünner Schicht aufgebracht. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß die Zellen und die Flüssigkeit am Hilfsobjektträger, mit dem die Suspension verteilt wird, haften bleiben. Somit geht ein Teil der Zellsuspension verloren. Aus diesem Grunde ist eine dem Volumen proportionale Zählung der Zellen nicht mehr möglich. Ferner ist die Zellverteilung flächig und zum Teil ungleichmäßig. Bei Anwendung starker mikroskopischer Vergrößerungen, bei der die zu untersuchende Fläche größer ist als das Gesichtsfeld des Mikroskops, ist eine automatische Analyse der Zellen durch auftretende Randzellen erschwert, wodurch eine automatische Auswertung des Prüfstoffes sehr aufwendig wird.
  • Zur Entnahme und Deposition kleiner Flüssigkeitsvolumina sind Mikropipetten bereits beschreiben (E. Stahl, Dünnschichtchromatografie, Springer-Verlag 1967, 64-66), Mit solchen Pipetten kann jedoch eine strichförmige automatische Präparation von Zellsuspensionen mit definiertem Volumen und einer Strichbreite, die kleiner ist als der Durchmesser des Mikroskopgesichtsfeldes bei 250-facher Vergrößerung, nitch erfolgen. Auch die Verwendung einer pinselartigen Bürste, die in die Pipettenspitze gesteckt ist, gestattet nicht die strichförmige Präparation von Zellsuspensionen, da der Pinsel aufgrund seiner großen Kapillarkraft Zellen oder Partikel zurückhält, wodurch nur die Flüssigkeit geschrieben wird und ein Teil der Flüssigkeit im Pinsel verbleibt, dort eintrocknet oder auch in die nächste Probe verschleppt wird. Auch handbetriebene Dosier- und Pipettiergeräte sind zur Präparation von Zellsuspensionen nicht geeignet (DE-A1-2 541 642, US-A-3 606 086 und FR-A-927 862). Ein größeres Glaspipettensystem mit einer geschwungenen Glaszunge, die an der ebenfalls geschwungenen Mündung des Auslaufrohres angebracht ist, ist für den genannten Zweck nicht verwendbar (DE-C-41 515). Die Glaszunge dient der völligen Gleichheit der an ihre hängenbleibenden Tropfen. Würde man eine solche Pipette für Zellsuspensionen verwenden, wären Zellablagerungen nicht zu vermeiden.
  • Es sind Vorrichtungen bekannt, die eine linienförmige Anbringung des Prüfstoffes auf einem Träger und eine automatische Auswertung des zu untersuchenden Materials ermöglichen (z.B. DE-A-19 00 808). Dabei wird die Suspension in Form eines Striches auf einem bandförmigen Träger, ohne diesen vollständig zu berühren, deponiert und die Breite des Striches ist dem Durchmesser des Gesichtsfeldes des Mikroskops angepaßt. Die Deposition erfolgt mit einer durch zwei Metallzungen variablen Abstands gebildeten Ausziehfeder, zwischen die das zur Deposition gelangende Suspensionsvolumen gegeben werden muß. Beim Ausschreiben muß der Präparateträger von den Metallzungenspitzen leicht berührt werden, um ein Ausfließen der Suspension zu ermöglichen. Hierdurch erfolgt eine ständige Abnutzung. Die volumengenaue, volumenproportionale Deponierung von Partikeln aus Suspensionen in Form eines Strichs mit definierter Breite und Länge bei vorgegebener Zeit und Schreibgeschwindigkeit ist mit einer derartigen Vorrichtung nicht möglich, da sowohl Flüssigkeit als auch Parikel an den Flächen der Metallzungen, die von der Suspension berührt werden, hängenbleiben und die Ausflußgeschwindigkeit der Suspension sowohl von ihrer Oberflächenspannung als auch den Benetzungseigenschaften des Präparateträgers abhängig ist. Ein weiterer wesentlicher Nachteil ist die erforderliche Reinigung des Systems vor jedem Probenwechsel, um eine Zellverschleppung auszuschließen.
  • Auch der Ersatz der Metallzungenschreibvorrichtung durch eine Mikropipette, bei der in einem Kapillarrohr flüssigkeitsdicht ein Kolben so angeordnet ist, daß er mittels Miniatureelektromotor mit Untersetzungsgetriebe in axialer Richtung entsprechend dem aufzunehmenden und dann beim Schreiben wieder auszustoßenden Volumen in Richtung Kapillaraustrittsöffnung bewegt werden kann und nach beendetem Vorgang die Kapillare bündig abschließt, erfüllt die gestellten Forderungen insbesondere nicht für größere Suspensionsvolumina (z.B. > 1 pl) bei vorwählbarer Strichbreite.
  • Die erzielbare Zellstrichbreite entspricht dem Außendurchmesser der Pipettenspitze und ist nur wenig breiter als der Kapillardurchmesser, wenn das Rohr an der Austrittsöffnung eine konisch spitze Form hat. Das Ausstoßen der Partikelsuspension erfolgt zwangsweise durch Bewegung des Kolbens und kann motorgetrieben mit stufenlos regelbarer Geschwindigkeit erfolgen. Aufgrund der Kolbendichtung wird die Kapillare rückstandslos geleert. Ein wesentlicher Vorteil einer solchen Pipette ist, daß durch die Zwangsausstoßung der Suspension aus der Pipette die Pipettenspitze den Träger nicht mehr berühren muß, wodurch eine Abnutzung der Spitze bzw. Beschädigung der Trägeroberfläche ausgeschlossen ist. Verschleppung von Material in die nächste Probe entfällt, Reinigung der Pipette kann in größeren Zeitabständen erfolgen. Mit einem solchen System kann mit einer Flüssigkeitsmenge von z.B. 0,15 ,ul bei Vewendung einer Kapillare mit einem Spitzendurchmesser von 0,3 mm und einem Kapillardurchmesser von 0,2 mm bei einem Kolbenhub von ca. 4,8 mm ein 0,3 mm breiter Strich berührungslos im Bereich von 5 bis 50 cm Länge beschrieben werden. Der Nachteil einer solchen Pipette ist jedoch, daß mit ihr nur Volumina im Bereich von 0,1 bis 0,5 yl verarbeitet werden können. Um z.B. ein Volumen von größer als 1,5 ,ul zu verarbeiten, müßte der Kolbenweg länger als 50 mm sein, wodurch große Instabilitäten entstehen, die diese Anordnungen unbrauchbar machen.
  • Auf dem Gebiet der Medizintechnik, speziell bei der Krebsfrüherkennung, ist es erforderlich, daß größere Zellsuspensionsvolumina bis zu mehreren ,ul mit gleiche, vorstehend genannten GenauIgkeiten verarbeitet werden können. In einfacher Weise kann durch Vergrößerung des Kapillardurchmessers eine größere Menge einer Zellsuspensionsprobe. entnommen werden. Die geforderte Strichbreite von 0,3 mm oder kleiner kann jedoch nicht mehr erreicht werden, da diese direkt vom Durchmesser der Kapillarspitze abhängig ist und nicht kleiner als der Kapillardurchmesser sein kann.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die vorgenannten Nachteile zu beseitigen und ein Pipettensystem zu entwickeln, mit dem aus einer Zell- oder Partikelsuspension definierte vorbestimmte Mengen entnommen werden können und diese Mengen in Form eines geradlinigen oder spiralförmigen Striches auf einem geeigneten Träger, z.B. Kunststoffband oder Glasplatte, berührungslos deponiert werden können.
  • Es hat sich nun geziegt, daß diese Aufgabe mit dem erfindungsgemäßen Pipettensystem in technisch fortschrittlicher Weise gelöst werden kann, bei dem die Austrittsöffnung der Pipette an einem Teil ihres Umfangs einen geraden Fortsatz aufweist, dessen Breite unabhängig von dem Pipettendurchmesser die Strichbreite bestimmt, und der senkrecht zur Stirnfläche des Kolbens verläuft.
  • Der Fortsatz ist in der Richtung des Kolbenweges vorzugsweise mit einer schlitzförmigen Aussparung bzw. einer Einkerbung versehen, dessen Breite kleiner ist als der Durchmesser der suspendierten Zellen oder Partikel, um eine Ablagerung zu verhindern. Damit das gesamte Volumen der Zellsuspension wieder ausgestoßen werden kann, schließt die Einkerbung bzw. Aussparung am Ende des Kolbenweges an. Iry dieser Weise kann die Flüssigkeit mit Hilfe der Kapillarkraft, die in der Aussparung bzw. Einkerbung entsteht, bis an die Spitze des Fortsatzes fließen. Der gleiche Effekt kann auch durch hydrophile Beschichtung des Fortsatzes erreicht werden. Verbindungen, die zur Bildung hydrophiler Beschichtungen herangezogen werden könne, sind bekannt.
  • Der Fortsatz kann an die Austrittsöffnung der Pipette anmontiert sein. Vorzugsweise ist die Austrittsöffnung der Pipette an einem Teil ihres Umfangs so geformt, daß sich ein Fortsatz bildet.
  • Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich einen Ausführungsweg darstellenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen in schematischer Vereinfachung
    • Figur 1 in perspektivischer Darstellung eine erfindungsgemäße Mikropipette und
    • Figur 2 dieselbe Pipette aus der Seitenansicht.
  • Aus den Figuren geht hervor, daß die Austrittsöffnung 1 der Pipette 2 einen Fortsatz 3 aufweist. Die Austrittsöffnung ist so geformt, daß sie durch den Kolben bündig abgeschlossen wird, wenn der Ausstoßvorgang beendet ist. Die Breite des Fortsatzes 3 bestimmt die Breite der Zellspur. Der Fortsatz 3 ist mit einer Einkerbung 4 versehen. Durch die zusätzlich in der Einkerbung entstehende Kapillarkraft kann die Flüssigkeit leicht bis an die Spitze fließen und einen Tropfen bilden. Zur Vermeidung von Zellablagerungen ist die Breite der Einkerbung kleiner als der Durchmesser der suspendierten Zellen bzw. Partikel.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Pipettensystem kann die Strichlänge so vorbestimmt werden, daß optimale Belegungsdichte wie auch Verteilung der Zellen oder Partikel im Strich gegeben ist. Durch die spezielle Formgebung der Pipettenspitze kann die Strichbreite unabhängig vom Innendurchmesser der Pipette den Erfordernissen, z.B. einer automatisierten mikroskopischen Auswertung, angepaßt werden. Wird die Strichbreite z.B. so eingestellt, daß im Gesichtsfeld eines Mikroskops immer die gesamte Strichbreite erfaßt wird, so können bei kontinuierlicher Bewegung des Striches durch das Gesichtsfeld alle Zellen bzw. Partikel nacheinander analysiert werden, ohne daß Probleme mit randständigen Zellen auftreten.

Claims (4)

1. Mikropipette zur berührungslosen, strichförmigen Auftragung eines abgemessenen Volumens einer Suspension, die Zellen oder Partikel enthält, wobei in der Pipette ein Kolben flüssigkeitsdicht angeordnet und die Austrittsöffnung der Pipette durch den Kolben bündig abschließbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Austrittsöffnung (1) der Pipette an einem Teil ihres Umfanges einen geraden Fortsatz (3) aufweist, dessen Breite unabhängig von dem Pipettendurchmesser die Strichbreite bestimmt und der senkrecht zur Stirnfläche des Kolbens verläuft.
2. Mikropipette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Fortsatz (3) in der Richtung des Kolbenweges mit einer schlitzförmigen Einkerbung (4) versehen ist, die bis in die Spitze des Fortsatzes (3) verläuft.
3. Mikropipette nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Breite der Einkerbung (4) kleiner ist als der Durchmesser der suspendierten Zellen oder Partikel.
4. Mikropipette nach einem der Ansprüche 1 bis'3idadurqh gekennzeichnet, daß der Fortsatz (3) mit einer-hydrophilen Schicht belegt ist.
EP79102426A 1978-08-26 1979-07-13 Mikropipette zur berührungslosen, strichförmigen Auftragung eines abgemessenen Volumens einer Suspension Expired EP0008357B1 (de)

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