WO2018114611A1

WO2018114611A1 - Dosiervorrichtung

Info

Publication number: WO2018114611A1
Application number: PCT/EP2017/082867
Authority: WO
Inventors: Andreas Schade; Mike Küster; Klaus Ochmann; Michael Harnau; Karl-Hermann KOECHING; Nils Burkhardt; Bernd Kalthof; Linn SCHNEIDER; Georg Schmidt
Original assignee: Bayer Pharma Aktiengesellschaft
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-06-28
Also published as: US11628433B2; JP2020502530A; DE102016015700A1; CN110300625B; JP7203733B2; US20200078780A1; CN110300625A; EP3558528A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Dosiervorrichtung aufweisend ein Gehäuse mit mindestens einer Druckkammer (5), einer Zuführöffnung (6) für die Zuführung von Flüssigkeit in die Druckkammer (5) und einer Vielzahl von Durchlässen zwischen der Druckkammer und einer Außenseite des Gehäuses, wobei sich in jedem der Durchlässe ein Röhrchen (4) befindet, das mit seinem ersten Ende in die Druckkammer hinein ragt und mit seinem zweiten Ende an der Außenseite aus dem Gehäuse herausragt.

Description

Dosiervorrichtung

Die Erfindung betrifft eine Dosiervorrichtung und ein Dosiersystem für die parallele Abgabe von Flüssigkeiten in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte.

Die Identifizierung und Entwicklung neuer Arzneistoffe zielt auf die Identifizierung chemischer Verbindungen, die biochemische Prozesse, wie Ligandenbindung, makromolekulare Konformationsänderungen oder enzymatische Reaktionen, modulieren. Üblicherweise verwendet man Hochdurchsatz-Screening (high-throughput Screening, HTS) zum Testen einer großen Zahl von chemischen Strukturen, da die Miniaturisierung einen schnellen, kostengünstigen und effizienten Test sicherstellt.

Fluoreszenz-basierte Tests sind aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und Automatisierbarkeit wahrscheinlich die wichtigsten Ansätze für HTS. Neben dem Verfolgen der Veränderung der Fluoreszenz durch eine enzymatische Reaktion verwendet man Markierungstechniken zur Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen oder Ligandenbindung durch Fluoreszenz- Resonanzenergietransfer (FRET), Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) oder Fluoreszenz- Polarisation (FP). Viele biologische Prozesse, vor allem die Bindung kleiner Liganden, sind durch eine sehr schnelle Kinetik gekennzeichnet, die schnelle Mischverfahren erfordert. Die Instrumente, die Platten-Formate mit 384 oder 1536 Testvertiefungen einsetzen, sind jedoch oft hinsichtlich der zeitlichen Auflösung eingeschränkt, wodurch die Bestimmung schneller Bindungskinetiken auf Methoden mit geringem Durchsatz beschränkt ist. Sogar der Screening-Ansatz von Instrumenten, die mit einem Multidispenser ausgestattet sind (siehe Gonzalez, J. E., and Mäher, M. P. (2002) Cellular Fluorescent Indicators and Voltage/Ion Probe Reader (VIPR TM ): Tools for Ion Channel and Receptor Drag Discovery, Receptors and Channels 8, 283-295; Mori, T., Itami, S., Yanagi, T., Tatara, Y., Takamiya, M., and Uchida, T. (2009) Use of a Real-Time Fluorescence Monitoring System for High-Throughput Screening for Prolyl Isomerase Inhibitors, Journal of Biomolecular Screening 14, 419-424; Schroeder, K. S., and Neagle, B. D. (1996) FLIPR: A New Instrument for Accurate, High Throughput Optical Screening, Journal of Biomolecular Screening 1, 75-80.), was die Zeitauflösung erheblich verbessert, ist hauptsächlich auf den Sekunden-Zeitbereich beschränkt.

Aus dem Stand der Technik bekannte schnelle Mischverfahren sind Continuous- oder Stopped-Flow- Vorrichtungen. Bei Continuous-Flow-Experimenten wird die Reaktion unter Gleichgewichtsflussbedingungen als Funktion der Strecke stromabwärts vom Mischer untersucht. Verbesserungen des Mischer-Designs führten zu Totzeiten im Bereich von 100 μ8 oder sogar noch kürzeren (Regenfuss, P., Clegg, R. M., Fulwyler, M. J., Barrantes, F. J., and Jovin, T. M. (1985) Mixing liquids in microseconds, Rev. Sei. Instrum. 56, 293-290; Shastry, M. C. R., Luck, S. D., and Roder, H. (1998) A Continuous-Flow Capillary Mixing Method to Monitor Reactions on the Microsecond Time Scale, Biophysical Journal 74, 2714-272 l ;Roder, FL, Maki, K., Cheng, FL, and Ramachandra Shastry, M. C. (2004) Rapid mixing methods for exploring the kinetics of protein folding, Methods 34, 15-27.). Zum Erreichen von effizientem Mischen sind jedoch hohe Flussraten und relativ große Kanalabmessungen erforderlich, was große Mengen an Material verbraucht.

Bei handelsüblichen Stopped-Flow-Instrumenten werden die Reaktanten über zwei Spritzen mithilfe eines pneumatischen Auslösers zugeführt. Nach dem Befüllen der Beobachtungszelle wird der Fluss abrupt gestoppt, wenn die Stoppspritze auf einen Anschlagblock trifft. Instrumente können routinemäßig Totzeiten von einigen wenigen Millisekunden erreichen (Dickson, P. N., and Margerum, D. W. (1986) Extension of accessible first-order rate constants and accurate dead-time determinations for stopped- flow spectroscopy, Analytical Chemistry 58, 3153-3158; Nakatani, FL, and Hiromi, K. (1980) Analysis of Signal Amplitude in Stopped-Flow Method for Enzyme -Ligand Systems, Journal of Biochemistry 87, 1805-1810; Peterman, B. F. (1979) Measurement of the dead time of a fluorescence stopped-flow Instrument, Analytical Biochemistry 93, 442-444).

Sowohl Continuous-Flow- als auch Stopped-Flow-Geräte sind Methoden mit niedrigem Durchsatz, der sich auf eine Küvette oder einen Kanal beschränkt. Ein schnelles Mischverfahren zum Testen mehrerer Inhibitoren und Konzentrationen ist jedoch erforderlich, da die Bestimmung schneller Bindungsreaktionen oder Enzymkinetiken eine grundlegende Rolle bei der Identifizierung und Entwicklung neuer Arzneistoffe spielt. Damit man schnelle Kinetiken in Mikrotiterplatten beobachten kann, wurde ein neues bildgebendes Instrument zur Detektion schneller Kinetiken entwickelt, das hohe Zeitauflösung mit dem Durchsatz eines stark parallelisierten Systems kombiniert. Dies ermöglicht zum ersten Mal die effiziente Anwendung von schneller Kinetik auf die Identifizierung und Entwicklung neuer Arzneistoffe .

Ein wichtiger Bestandteil des neuen Instruments ist eine Dosiervorrichtung für die parallele Abgabe von Flüssigkeiten in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte. Solche Dosiervorrichtungen sind aus dem Stand der Technik bekannt. EP 1 099 480 A2 offenbart eine Mikrodispensiervorrichtung, bei der jeder einzelnen Dosierkapillare ein eigenes Mikroventil zugeordnet ist. Diese Mikrodispensiervorrichtung hat den Nachteil, dass für jedes einzelne Ventil eine eigene Zuleitung erforderlich ist und eine solche Ventilanordnung aufgrund der einzelnen Ventildurchmesser eine Paralleldosierung in 48 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte nicht zulässt.

Bei der aus DE 199 11 456 AI bekannten Dosiervorrichtung erfolgt die Steuerung der Flüssigkeitsabgabe über einen Dosierer, der Magnetventile in Verbindung mit einem Druckgefäß oder Taumelkolbenpumpen umfasst. Die Abgabe der Flüssigkeit erfolgt über einen Hauptflüssigkeitskanal, der mit einem Flüssigkeitsreservoir in Verbindung steht und sich mehrfach verzweigt bis zu der gewünschten Anzahl von Auslässen.

DE 102 36 029 AI offenbart einen linearen, symmetrisch baumartig strukturierten Dispensierkamm, der an eine steuerbare Pumpe zur Dosierung der zu dispensierenden Flüssigkeitsmenge angeschlossen ist.

DE 102 55 595 AI offenbart eine Mehrkanaldosiervorrichtung mit mehreren Dosierkanälen, bei der jeder Auslassdüse für Flüssigkeit ein Mikroventil zugeordnet ist. Die Mikroventile weisen wenigstens eine Zuführöffnung auf, die jeweils mit einem Ausgang eines Verteilers verbunden ist, dessen Eingang über einen Flusssensor mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden ist. Der Flusssensor dient der Kalibrierung, um Toleranzen der Dosierkanäle untereinander auszugleichen.

Die Nachteile dieser bekannten Dosiervorrichtungen sind die großen Kapillarlängen und, konstruktionsbedingt, unterschiedliche Kapillarradien, welche zu einem hohen und zusätzlich noch für jede Kapillare unterschiedlichen Druckverlust und damit unterschiedlichen Dosiervolumen führen.

Die Lösung des angegebenen Problems besteht in der nachfolgend beschriebenen Dosiervorrichtung.

Die erfindungsgemäße Dosiervorrichtung weist ein Gehäuse mit mindestens einer Druckkammer, einer Zuführöffnung für die Zuführung von Flüssigkeit in die Druckkammer und einer Vielzahl von Durchlässen zwischen der Druckkammer und einer Außenseite des Gehäuses auf, wobei sich in jedem der Durchlässe ein Röhrchen befindet, das mit seinem ersten Ende in die Druckkammer hinein ragt und mit seinem zweiten Ende an der Außenseite aus dem Gehäuse herausragt.

Die Druckkammer hat bevorzugt in eine Raumdimension eine größere Ausdehnung als in die beiden anderen Raumdimensionen. In Richtung der größeren Ausdehnung verläuft die Längsachse der Druckkammer. Die Längsachse der Druckkammer verläuft gleichzeitig parallel zur Außenseite des Gehäuses. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Druckkammer zylindrisch oder quaderförmig.

Die Durchlässe befinden sich in einer der Wände der Druckkammer, die parallel zur Längsachse der Druckkammer verlaufen. Bevorzugt sind die Durchlässe parallel zueinander angeordnet. Es sind mindestens zwei Durchlässe vorhanden. Die Durchlässe können in einer oder mehrerer Reihen parallel zur Längsachse der Druckkammer angeordnet sein. Dabei sind bevorzugt 12, besonders bevorzugt 24 oder 48 Durchlässe pro Reihe vorhanden. Idealerweise ist die Zahl der Durchlässe pro Reihe an die Zahl der Vertiefungen in einer Reihe der Mikrotiterplatte (lange Seite), in die durch die Dosiervorrichtung dosiert wird, angepasst.

Bei den Röhrchen handelt es sich bevorzugt um Kapillaren aus Metall oder Kunststoff, Kapillaren, d.h. dünne Röhren, in denen bei den verwendeten Flüssigkeiten der Effekt der Kapillarität auftritt. Sie sollten einen inneren Durchmesser im Bereich von 0,1 mm bis 0,8 mm, bevorzugt 0,2 mm bis 0,6 mm haben. Der Außendurchmesser kann im Bereich von 0,35 mm bis 2 mm, bevorzugt 0,6 mm bis 1,1 mm liegen. Die Länge der Röhrchen liegt im Bereich von 6 mm bis 15 mm, bevorzugt 8,5 mm bis 13 mm, besonders bevorzugt 10 mm bis 13 mm.

Die Röhrchen sind senkrecht (90°) oder schräg in einem Winkel im Bereich von 40° bis < 90° zur Außenseite des Gehäuses angeordnet, je nachdem, ob senkrecht von oben Flüssigkeit in die Vertiefung der Mikrotiterplatte abgegeben werden soll oder unter einem Winkel auf die Seitenwand der Vertiefung abgegeben bzw. eingespritzt werden soll.

Zur Vergrößerung der Hydrophobizität der Röhrchen, die sich auf der Außenseite des Gehäuses befinden, können diese ummantelt, bevorzugt mit Kunststoff, zum Beispiel Teflon, sein.

In einer Ausführungsform befindet sich die Zuführöffnung für die Flüssigkeit in einer der Wände, die senkrecht zur Längsachse der Dosierkammer angeordnet sind. Das Gehäuse kann weiterhin eine Belüftungsöffnung aufweisen, aus der beim Befüllen der Dosierkammer mit Flüssigkeit die Luft herausgedrängt wird. Diese Belüftungsöffnung kann sich in einer der Wände, die senkrecht zur Längsachse der Dosierkammer angeordnet sind, befinden.

Die Druckkammer kann eine Querschnittsfläche im Bereich von 60 mm² bis 300 mm² oder einen Durchmesser im Bereich von 4 mm bis 10 mm bevorzugt im Bereich von 5,5 mm bis 6,5 mm haben. Das Gehäuse der Dosiervorrichtung kann auch mehr als eine, zum Beispiel zwei, drei oder vier Druckkammern aufweisen, deren Längsachsen parallel zueinander verlaufen. Zu jeder Druckkammer gehört eine separate Zuführöffnung für die Zuführung von Flüssigkeit in die Druckkammer und jeder Druckkammer steht in Verbindung mit einer Vielzahl von Durchlässen (mit den entsprechenden Röhrchen) zwischen der Druckkammer und der Außenseite des Gehäuses. Bevorzugt sind die Durchlässe und Röhrchen der verschiedenen Druckkammern parallel zueinander angeordnet. Je nach Bedarf können auch mehrere Gehäuse mit einer oder mehreren Druckkammern nebeneinander und parallel zueinander angeordnet werden. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Dosiersystem aufweisend die oben beschriebene Dosiervorrichtung und ein Flüssigkeitsreservoir, das über eine Leitung mit der Zuführöffnung der Dosiervorrichtung verbunden ist. Druck auf das Flüssigkeitsreservoir bewirkt, dass Flüssigkeit vom Flüssigkeitsreservoir in die Druckkammer der Dosiervorrichtung gepumpt wird. Hierfür ist das Flüssigkeitsreservoir druckdicht von der umgebenden Atmosphäre abgeschlossen und mit einer Pumpe verbunden, die den notwendigen Druck aufbaut. Bei mehreren Druckkammern kann die Zuführöffnung jeder Druckkammer mit demselben oder verschiedenen Reservoirs von Flüssigkeit verbunden sein.

Über die Schaltzeit des Ventils zwischen Flüssigkeitsreservoir und Zuführöffnung in Kombination mit dem Druck der Pumpe kann die Menge der Flüssigkeit, die in jedem Schaltzyklus (Durchlass auf/zu) in die Druckkammer gelangt und über die einzelnen Röhrchen ausgegeben wird, gesteuert werden.

In einer Ausführungsform der Erfindung liegt die Flüssigkeit aus dem Flüssigkeitsreservoir unter einem Druck im Bereich von 0,5 bis 2 bar bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 0,85 bar am Ventil an und das Ventil hat eine Schaltzeit im Bereich von 5 ms bis 200 ms (5-60 ms bei Mikrotiterplatten mit 1536 Vertiefungen, 40-200 ms bei Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen), bevorzugt im Bereich von 5 ms bis 50 ms.

Die Schaltzeit des Ventils und der Druck durch die Pumpe sind so eingestellt, dass das Abgabevolumen der Dosiervorrichtung im Bereich 0,3 und 300 μΐ pro Kapillare liegt, bevorzugt zwischen 1 und 30 μΐ.

Der Vorteil der erfindungsgemäßen Dosiervorrichtung bzw. des Dosiersystems ist, dass wegen des großen Volumens der Druckkammer kombiniert mit den kurzen Röhrchen, die in die Druckkammer hineinragen, kein Druckgradient entsteht und somit eine sehr schnelle und mengenmäßig genaue Abgabe der Flüssigkeit möglich ist. Dadurch wird eine parallele, präzise und schnelle Dosierung im μΐ- Bereich in z.B. 384er- oder 1536er-Mikrotiterplatten ermöglicht. Figuren und Beispiele

Fig. 1 Zwei Dosiervorrichtungen mit zwei Dosierkammern in perspektivischer Ansicht

Fig. 2 Dosiervorrichtung mit zwei Dosierkammern in perspektivischer Ansicht mit

Struktur

Fig. 3 Dosiervorrichtung mit zwei Dosierkammern in Hinteransicht

Fig. 4 Dosiervorrichtung in Seitenansicht

Fig. 5 Vergrößerter Ausschnitt der Dosiervorrichtung in Seitenansicht (ventilseitig)

Fig. 6 Dosiersystem mit Flüssigkeitsreservoir

Fig. 7 Bildgebendes Messinstrument (einkanalige Detektion)

Fig Bildgebendes Messinstrument (zweikanalige Detektion)

Fig Falschfarbenbild der Emission einer Mikrotiterplatte mit 1536 Testvertiefungen

Fig. 10 A-C Messung der Kinetik der ANS-Bindung an BSA mit dem bildgebenden Messinstrument Fig. 1 zeigt zwei parallel angeordnete erfindungsgemäße Dosiervorrichtungen 10 mit jeweils zwei Druckkammern in perspektivischer Ansicht. Weitere Ansichten einer Dosiervorrichtung sind in den Fig. 2 bis 5 gezeigt. Jede Dosiervorrichtung 10 hat ein quaderförmiges Gehäuse 2 mit zwei röhrenförmigen Bohrungen von 4-10 mm Durchmesser und 120-140mm Länge. Diese Bohrungen bilden zwei parallele Druckkammern 5. Jede Bohrung hat ein offenes Ende, das die kreisförmige Zuführöffnung 6 bildet. Das gegenüberliegende Ende ist zur Systembefüllung und -entleerung geöffnet und im Dosierbetrieb dicht verschlossen. Hier befindet sich die Auslauf- bzw. Entlüftungsöffnung 3. Die Gehäuse 2 sind mit der Seite, an der sich die Zuführöffnung 6 befindet, an einer Halterung 7 so befestigt, dass sie waagerecht von der Halterung 7 wegragen. Die Halterung 7 hat eine Aussparung für jede Zuführöffnung 6. Auf der Unterseite des wegragenden Gehäuses 2 befindet sich eine Reihe von bis zu 48 Durchlässen zwischen jeder Druckkammer 5 und der Unterseite des Gehäuses 2, wobei sich in jedem der Durchlässe ein kapillares Röhrchen 4 aus vorzugsweise Edelstahl befindet, das mit seinem ersten Ende in die Druckkammer 5 hinein ragt und mit seinem zweiten Ende an der Unterseite aus dem Gehäuse 2 herausragt. Die kapillaren Röhrchen haben einen inneren Durchmesser von 0,1 - 0,8 mm und sind senkrecht angeordnet. Die Abschnitte der Röhrchen, die aus der Unterseite des Gehäuses 2 hinausragen, sind hydrophob (vorzugsweise mit Teflon) ummantelt.

Fig. 3 zeigt die Dosiervorrichtung 10 in Hinteransicht mit Blick auf die beiden Zuführöffnungen 6.

Fig. 4 zeigt die Dosiervorrichtung 10 in Seitenansicht. Der kreisförmige Ausschnitt A ist in Fig. 5 vergrößert gezeigt. In Fig. 5 ist zu erkennen, dass die kapillaren Röhrchen 4 bis zur halben Höhe der Druckkammer in diese hineinragen. Dies hat sich als besonders vorteilhaft für eine gleichmäßige Dosierung für alle 48 Kapillaren erwiesen.

Fig. 6 zeigt das erfindungsgemäße Dosiersystem. Die Druckkammer 5 (nicht sichtbar im Gehäuse 2) der Dosiervorrichtung 10 ist über eine Leitung 71, ein Ventil 72 und eine weitere Leitung 70 mit einer in einem Vorratsgefäß befindlichen Flüssigkeit verbunden. Über eine Membranpumpe 66 und eine Druckleitung 68 wird Raumluft unter einem Druck von 0.8 bar in das Vorratsgefäß eingeleitet. Statt Raumluft kann auch ein anderes Gas wie N2 verwendet werden. Statt der Membranpumpe kann auch ein anderes Druckversorgungssystem benutzt werden. Als geeignete Ventile haben sich Magnetventile mit geringem Totraumvolumen und kurzer Schaltzeit erwiesen wie sie zum Beispiel von der Fa. Parker Hannifin Corp., Cleveland, OH 44124 USA vertrieben werden.

Im Folgenden wird der Betrieb eines bildgebenden Messinstruments mit dem erfindungsgemäßen Dosiersystem beschrieben.

Die Flüssigkeit 65, die den zu untersuchenden Reaktanten enthält, wird über ein Ventil 72 aus einem Vorratsgefäß 64 in die Druckkammer 5 (nicht sichtbar) der Dosiervorrichtung gepumpt (Fig. 6). Die kapillaren Röhrchen 4 haben (inklusive der Ummantelung) einen Außendurchmesser von < 2 mm, so dass eine parallele Dosierung in 48 Testvertiefungen der Mikrotiterplatte ermöglicht wird (Fig. 6). Zum Erreichen von Mischungsbedingungen mit hoher Turbulenz wird die Ausrichtung der Dosierungsauslässe der Röhrchen 4 speziell an Mikrotiterplatten mit 384 und 1536 Testvertiefungen angepasst. Beste Mischergebnisse für Mikrotiterplatten mit 384 Testvertiefungen wurden durch Dispensieren des Reaktanten diagonal auf die Mikrotiterplattenwände erreicht. Im Gegensatz dazu wird das geringere Dosierungsvolumen, das für Mikrotiterplatten 60 mit 1536 Testvertiefungen erforderlich ist, senkrecht dosiert, wie in Fig. 6 gezeigt. Typische Dosierungszeiten für die erforderlichen Reaktantenvolumina wurden bestimmt, indem die dispensierte Flüssigkeit mit einer bekannten Zeit der Schaltung des Ventils 72 bei einem Druck von 0,8 bar gewichtet wurde.

Eine präzise Mikrotiterplatten-Halterung 62 stellte die exakte Ausrichtung der Dosiervorrichtung 10 zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatte 60 sicher. Der Fortschritt einer Reaktion wird verfolgt, indem die Fluoreszenzintensität von allen 48 Testvertiefungen in einer Reihe gleichzeitig oder von allen Testvertiefungen der Mikrotiterplatte gleichzeitig aufgezeichnet wird. Dispensierung von der Oberseite der auf einer Mikrotiterplatten- Halterung 62 befindlichen Mikrotiterplatte 60, wird mit Beleuchtung und Detektion von der Unterseite kombiniert. Dies gestattet die Beobachtung des kinetischen Prozesses während der Dosier- und Mischzeit. Die homogene Bodenbeleuchtung der Mikrotiterplatte 60 wird durch 2 LED- Beleuchtungseinheiten mit jeweils bis zu 36-UV bzw. VIS- Hochleistungs-LEDs 80 erreicht, die in Reihen angeordnet und diagonal zu der Platte ausgerichtet sind (Fig. 7 und 8). Die verfügbaren LEDs 80 führen Licht 92 im Wellenlängenbereich von 340 bis 800 nm zu und Extinktionsfilter verbessern die Fluoreszenzanregung, indem sie einen ausgewählten Wellenlängenbereich übertragen. Die emittierte Fluoreszenz 94 wird senkrecht und/oder in einem Winkel von 90° durch eine schnelle und hoch- empfindliche rückwärtig beleuchtete EMCCD (back-illuminated-electron multyplying charge coupled device)- oder ICCD (intensified charge coupled device) Kamera 82 nachgewiesen. Die Kameras 82 sind mit Interferenzfiltern 84 ausgestattet und können zusätzlich mit Polarisationsfiltern 85 ausgestattet werden. Das Erweitern des verstellbaren Kamera- Aufbaus zu dualem Fluoreszenznachweis (Fig. 8) ermöglicht die zeitgleiche Detektion zweier Emissionssignale wie sie z.B. bei Messungen zum Förster- Resonanzenergietransfer (FRET), Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) oder zu Fluoreszenz-Polarisation (FP) notwendig sind.

Eine Erweiterung des in Fig. 7 und 8 gezeigten Meßsystems durch weitere LED-Beleuchtungseinheiten, die unterhalb der gezeigten LED-Einheiten mit geändertem Beleuchtungswinkel angeordnet sind, ist möglich. Wenn diese zusätzlichen LED-Einheiten eine andere Wellenlänge als die ursprünglichen LED- Einheiten aufweisen, kann eine Fluoreszenzanregung in mehreren Wellenlängen gleichzeitig erfolgen.

Die Falschfarbendarstellung der Emission einer Mikrotiterplatte mit 1536 Testvertiefungen, die fluoreszierende Lösung enthalten, ist beispielhaft in Fig. 9 dargestellt. Daten für die Testvertiefungen werden gesammelt, indem bis zu 1000 Punkte pro Sekunde und Testvertiefung erfasst und visualisiert und durch eine maßgeschneiderte Datenverarbeitungssoftware verarbeitet werden.

Leistungstest

Ein Verfahren, das routinemäßig zur Untersuchung der Leistung einer schnellen Mischvorrichtung verwendet wird, ist die Beobachtung einer schnellen Testreaktion. Für Fluoreszenzstudien wird geeigneterweise die Bindung des hydrophoben Farbstoffs l-Anilino-8-naphthalinsulfonsäure (ANS) an Rinderserumalbumin (BSA) verfolgt, die mit einer großen Zunahme der Fluoreszenzausbeute einhergeht. Die Fluoreszenzkinetiken für verschiedene B SA-Konzentrationen werden an Exponentialfunktionen angepasst und auf eine gemeinsame Anfangsfluoreszenz extrapoliert. Dieser gemeinsame Punkt liefert die Fluoreszenz von ANS in Abwesenheit von BSA zum Ausgangszeitpunkt (to) der Reaktion. Der Zeitabstand von diesem Punkt bis zum ersten Datenpunkt, der auf die angepasste Exponentialkurve fällt, liefert eine Abschätzung der Totzeit der Messung. Fig. 10 A-C zeigt die korrigierten Fluoreszenzkinetiken bei verschiedenen B SA-Konzentrationen, die in dem bildgebenden Messinstrument mit der erfindungsgemäßen Dosiervorrichtung für schnelle Kinetik gemessen wurden.

Nach 55 ms wurden 1,6 μΐ ANS-Lösung durch eine Kapillarventilschaltung von 9 ms zu 48 Testvertiefungen einer Mikrotiterplatte, die BSA enthielt, hinzugefügt (Fig 10A). Die Kapillarventilschaltung ist über den grauen Balken angedeutet. Die Bindung von ANS an BSA führt zu einer Erhöhung der ANS-Fluoreszenz, die bei 460 nm (Bandpass 60 nm) nach Anregung bei 370 nm (Bandpass 36 nm) aufgezeichnet wird. Die ANS- und BSA-Lösungen wurden in 100 mM Kaliumphosphat (pH 7,5) hergestellt. Endkonzentration: 5 μΜ ANS und 1,9 (offene Kreise), 2,5 (ausgefüllte Kreise), 3,4 (umgekehrte Dreiecke), 7,9 (Quadrate) und 10,6 μΜ (Dreiecke) BSA (Fig. 10A).

Der Ausgangszeitpunkt der Bindungsreaktion wurde ermittelt durch doppelt exponentielle Anpassungen und Extrapolation der Fluoreszenzkinetiken auf die gemeinsame Anfangszeit to. Die (aus Fig. 10 A entnommenen) Fluoreszenzkinetiken wurden auf diese Anfangszeit to korrigiert (Fig. 10 B). Durchgezogene Linien zeigen Doppelexponentialfunktionen, die auf den gemeinsamen Zeitpunkt to extrapoliert wurden.

Es sollte beachtet werden, dass to der Reaktion nicht äquivalent mit dem Zeitpunkt der Ventilschaltung ist, sondern um den Eintritt und die Mischung der Reaktanten in den Testvertiefungen zeitverzögert ist. Die Totzeit des Instruments, die durch den Zeitraum von to bis zum ersten richtig bestimmten Punkt auf der angepassten Exponentialkurve implementiert wird, basiert auf der Dispensierzeit und Mischartefakten. Beim Vorliegen von 3μ1 Flüssigkeit in den Testvertiefungen einer Mikrotiterplatte und Dispensierung eines kleinen Volumens von 1,6 μΐ in die 1536 Testvertiefungen dieser Mikrotiterplatte , kann eine Totzeit von etwa 10 ms erreicht werden, die annähernd der Zeitauflösung von kommerziellen Stopped Flow-Instrumenten von einigen wenigen Millisekunden entspricht.

Die nachgewiesenen Fluoreszenzspuren (Fig.1 OB) zeigen einen sehr niedrigen Rauschpegel, was auf die hohe Qualität der Kinetikdaten hindeutet. Fig.10C zeigt ein Diagramm der aus den Kinetikspuren ermittelten apparenten Ratenkonstanten der Bindung als Funktion der B SA-Konzentration. Es konnte eine langsame (ausgefüllte Kreise) und eine schnelle Bindungsphase (offene Kreise) nachgewiesen werden. Die lineare Abhängigkeit der Bindungsphase mit langsamer Kinetik von der B SA- Konzentration bestätigt die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der bestimmten Spuren. Die beobachteten Ratenkonstanten (schwarz) wurden mit Daten verglichen, die durch eine konventionelle Stopped-Flow- Apparatur erhalten wurden (rot). Die apparenten Ratenkonstanten sowie die Ratenkonstanten zweiter Ordnung, die anhand der Konzentrationsabhängigkeit der langsamen Bindungsphase bestimmt wurden, stimmen ausgezeichnet mit den Daten überein, die durch Zugabe in einer Stopped-Flow-Apparatur in einer einzelnen Küvette erhalten wurden.

Referenznummern:

10 Dosiervorrichtung

1 Ventil

2 Gehäuse

3 Auslauf- /Entlüftungsöffhun;

4 Röhrchen

5 Druckkammer

6 Zuführöffnung

6a Dichtung

7 Halterung

8 Ummantelung

60 Mikrotiterplatte

62 Plattenhalter

64 Vorratsgefäß

65 Flüssigkeit

66 Pumpe

68 Druckleitung

70 Leitung

71 Leitung

72 Ventil

80 LED-Modul

82 Kamera

84 Emissionsfilter

85 Polarisationsfilter

86 Anregungsfilter

90 Strahlteiler

92 Anregungslicht

94 Fluoreszenzlicht

Claims

Patentansprüche

1. Dosiervorrichtung aufweisend ein Gehäuse mit mindestens einer Druckkammer, einer

Zuführöffnung für die Zuführung von Flüssigkeit in die Druckkammer und einer Vielzahl von Durchlässen zwischen der Druckkammer und einer Außenseite des Gehäuses, wobei sich in jedem der Durchlässe ein Röhrchen befindet, das mit seinem ersten Ende in die Druckkammer hinein ragt und mit seinem zweiten Ende an der Außenseite aus dem Gehäuse herausragt.

2. Dosiervorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Druckkammer in eine Raumdimension eine größere Ausdehnung hat als in die beiden anderen Raumdimensionen und in Richtung der größeren Ausdehnung die Längsachse der Druckkammer verläuft und die Längsachse der Druckkammer parallel zur Außenseite des Gehäuses verläuft.

3. Dosiervorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Durchlässe in einer der Wände der Druckkammer befinden, die parallel zur Längsachse der Druckkammer verläuft und die Durchlässe parallel zueinander angeordnet sind.

4. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die

Druckkammer zylindrisch oder quaderförmig ist.

5. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Durchlässe vorhanden sind.

6. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchlässe in einer oder mehrerer Reihen parallel zur Längsachse der Druckkammer angeordnet sind.

7. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 8, bevorzugt 24 oder 48 Durchlässe pro Reihe vorhanden sind.

8. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Röhrchen um Kapillaren handelt.

9. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhrchen aus Metall sind.

10. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhrchen einen inneren Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 0,8 mm, bevorzugt 0,2 bis 0,6 mm haben.

11. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhrchen im Wesentlichen senkrecht (90°) oder schräg in einem Winkel im Bereich von 40° bis < 90° zur Außenseite des Gehäuses angeordnet sind.

12. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die

Abschnitte der Röhrchen, die sich auf der Außenseite des Gehäuses befinden durch Hülsen, bevorzugt aus Kunststoff ummantelt sind.

13. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Zuführöffnung in einer der Wände, die senkrecht zur Längsachse der Dosierkammer angeordnet sind, befindet.

14. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse eine Belüftungsöffnung aufweist.

15. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Belüftungsöffnung in einer der Wände, die senkrecht zur Längsachse der Dosierkammer angeordnet sind, befindet.

16. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die

Druckkammer eine Querschnittsfläche von 60 bis 300 mm² oder einen Durchmesser von 4 mm bis 10 mm bevorzugt 5,5 - 6,5 mm hat.

17. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse zwei, drei oder vier Druckkammern aufweist, deren Längsachsen parallel verlaufen, wobei zu jeder Druckkammer eine separate Zuführöffnung für die Zuführung von Flüssigkeit gehört.

18. Dosiersystem enthaltend eine Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und ein Flüssigkeitsreservoir, das über eine Leitung mit der Zuführöffnung verbunden ist.

19. Dosiersystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen Flüssigkeitsreservoir und Zuführöffnung ein Ventil befindet.

20. Verwendung des Dosiersystems nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit aus dem Flüssigkeitsreservoir unter einem Druck im Bereich 0,5 bis 2 bar bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 0,85 bar am Ventil anliegt und das Ventil eine Schaltzeit im Bereich von 5 bis 200 ms, bevorzugt im Bereich von 5 bis 50 ms hat.

21. Verwendung des Dosiersystems nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Zugabevolumen in der Öffnungszeit des Ventil im Bereich zwischen 0,3 μΐ/pro Kapillare und 300 μΐ/pro Kapillare, bevorzugt zwischen 1 μΐ/pro Kapillare und 30 μΐ/pro Kapillare beträgt.