WO2018114611A1 - Dosiervorrichtung - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a metering device and a metering system for the parallel delivery of fluids into the wells of a microtiter plate.
- HTS High-throughput screening
- Fluorescence-based tests are probably the most important approaches for HTS due to their high sensitivity and automatability. Besides tracking the change in fluorescence by an enzymatic reaction, one uses labeling techniques to determine protein-protein interactions or ligand binding by fluorescence resonance energy transfer (FRET), bioluminescence resonance energy transfer (BRET), or fluorescence polarization (FP). Many biological processes, especially the binding of small ligands, are characterized by a very rapid kinetics, which requires rapid mixing procedures. However, instruments employing 384 or 1536 well plate formats are often limited in temporal resolution, limiting the determination of fast binding kinetics to low throughput methods.
- FRET fluorescence resonance energy transfer
- BRET bioluminescence resonance energy transfer
- FP fluorescence polarization
- stopped-flow instruments deliver the reactants via two syringes using a pneumatic trigger. After filling the observation cell, the flow is stopped abruptly when the stop syringe hits a stop block. Instruments can routinely reach dead times of a few milliseconds (Dickson, PN, and Margerum, DW (1986) Extension of accessible first-order rate constants and accurate dead-time determinations for stopped-flow spectroscopy, Analytical Chemistry 58, 3153-3158; Nakatani , FL, and Hiromi, K.
- Both continuous-flow and stopped-flow devices are low-throughput methods limited to one cuvette or channel.
- a rapid mixing procedure for testing multiple inhibitors and concentrations is required because the determination of fast binding reactions or enzyme kinetics plays a fundamental role in the identification and development of new drugs.
- a new imaging tool for the detection of fast kinetics has been developed that combines high time resolution with the throughput of a highly parallelized system. This allows, for the first time, the efficient application of fast kinetics to the identification and development of new drugs.
- EP 1 099 480 A2 discloses a microdispensing device in which each individual dosing capillary is assigned its own microvalve.
- This Mikrodispensiervorraum has the disadvantage that a separate supply line is required for each valve and such a valve assembly does not allow a parallel metering in 48 wells of a microtiter plate due to the individual valve diameter.
- the liquid dispensing is controlled by means of a dosing device comprising solenoid valves in conjunction with a pressure vessel or wobble piston pumps.
- a dosing device comprising solenoid valves in conjunction with a pressure vessel or wobble piston pumps.
- the delivery of the liquid via a main liquid channel, which communicates with a liquid reservoir in connection and multiple branches up to the desired number of outlets.
- DE 102 36 029 A1 discloses a linear, symmetrically tree-like structured dispensing comb, which is connected to a controllable pump for metering the amount of liquid to be dispensed.
- DE 102 55 595 A1 discloses a multichannel metering device with a plurality of metering channels, in which each outlet nozzle for liquid is assigned a microvalve.
- the microvalves have at least one feed opening, which is in each case connected to an outlet of a distributor, whose inlet is connected to a liquid reservoir via a flow sensor.
- the flow sensor is used for calibration to compensate for tolerances of the dosing channels with each other.
- the metering device comprises a housing with at least one pressure chamber, a feed opening for the supply of liquid in the pressure chamber and a plurality of passages between the pressure chamber and an outer side of the housing, wherein in each of the passages is a tube which is connected to its first End projects into the pressure chamber and protrudes with its second end on the outside of the housing.
- the pressure chamber preferably has a greater extent in a space dimension than in the two other space dimensions. In the direction of greater expansion, the longitudinal axis of the Pressure chamber. The longitudinal axis of the pressure chamber is parallel to the outside of the housing at the same time. In a preferred embodiment, the pressure chamber is cylindrical or cuboid.
- the passages are located in one of the walls of the pressure chamber, which run parallel to the longitudinal axis of the pressure chamber. Preferably, the passages are arranged parallel to each other. There are at least two passages. The passages may be arranged in one or more rows parallel to the longitudinal axis of the pressure chamber. There are preferably 12, more preferably 24 or 48 passages per row available. Ideally, the number of ports per row is adjusted to the number of wells in a row of the microtiter plate (long side) into which the metering device doses.
- the tubes are preferably capillaries of metal or plastic, capillaries, i. thin tubes in which the effect of capillarity occurs in the fluids used. They should have an inner diameter in the range of 0.1 mm to 0.8 mm, preferably 0.2 mm to 0.6 mm. The outer diameter may be in the range of 0.35 mm to 2 mm, preferably 0.6 mm to 1.1 mm. The length of the tubes is in the range of 6 mm to 15 mm, preferably 8.5 mm to 13 mm, particularly preferably 10 mm to 13 mm.
- the tubes are perpendicular (90 °) or obliquely arranged at an angle in the range of 40 ° to ⁇ 90 ° to the outside of the housing, depending on whether vertically from above liquid is to be discharged into the recess of the microtiter plate or at an angle to the Side wall of the depression to be dispensed or injected.
- tubes which are located on the outside of the housing, they can be encased, preferably with plastic, for example Teflon, be.
- the liquid feed port is in one of the walls, which are perpendicular to the longitudinal axis of the metering chamber.
- the housing may further comprise a ventilation opening from which the air is forced out when filling the metering chamber with liquid. This ventilation opening may be located in one of the walls, which are arranged perpendicular to the longitudinal axis of the metering chamber.
- the pressure chamber may have a cross-sectional area in the range of 60 mm 2 to 300 mm 2 or a diameter in the range of 4 mm to 10 mm, preferably in the range of 5.5 mm to 6.5 mm.
- the housing of the metering device can also have more than one, for example, two, three or four pressure chambers whose longitudinal axes are parallel to each other.
- Each pressure chamber has a separate supply port for the supply of fluid into the pressure chamber and each pressure chamber communicates with a plurality of passages (with the respective tubes) between the pressure chamber and the outside of the housing.
- the passages and tubes of the various pressure chambers are arranged parallel to one another.
- a plurality of housings with one or more pressure chambers can be arranged side by side and parallel to one another.
- the invention further relates to a metering system comprising the metering device described above and a liquid reservoir which is connected via a line to the feed opening of the metering device. Pressure on the liquid reservoir causes liquid to be pumped from the liquid reservoir into the pressure chamber of the metering device.
- the liquid reservoir is pressure-sealed from the surrounding atmosphere and connected to a pump which builds up the necessary pressure.
- the supply port of each pressure chamber may be connected to the same or different reservoir of fluid.
- the amount of liquid that enters the pressure chamber in each switching cycle (passage open / closed) and is output via the individual tubes can be controlled.
- the switching time of the valve and the pressure through the pump are adjusted so that the dispensing volume of the metering device is in the range 0.3 and 300 ⁇ per capillary, preferably between 1 and 30 ⁇ .
- the advantage of the metering device according to the invention or of the metering system is that due to the large volume of the pressure chamber combined with the short tube, which protrude into the pressure chamber, no pressure gradient arises and thus a very fast and quantitatively accurate delivery of the liquid is possible. This enables a parallel, precise and rapid dosage in the ⁇ range in, for example, 384 or 1536 microtiter plates.
- Fig. 1 two metering devices with two metering chambers in a perspective view
- FIG. 7 Imaging measuring instrument (single-channel detection)
- FIG. 10 A-C Measurement of the kinetics of ANS binding to BSA with the imaging instrument
- Fig. 1 shows two parallel arranged metering devices 10 according to the invention, each with two pressure chambers in a perspective view. Further views of a metering device are shown in FIGS. 2 to 5.
- Each metering device 10 has a cuboid housing 2 with two tubular bores of 4-10 mm diameter and 120-140mm in length. These bores form two parallel pressure chambers 5.
- Each bore has an open end which forms the circular feed opening 6. The opposite end is open for system filling and emptying and tightly closed in dosing mode.
- the outlet or vent 3 is open for system filling and emptying and tightly closed in dosing mode.
- the housing 2 are with the side at which the feed opening 6 is mounted on a holder 7 so that they project horizontally from the holder 7.
- the holder 7 has a recess for each feed opening 6.
- On the underside of the projecting housing 2 is a series of up to 48 passages between each pressure chamber 5 and the underside of the housing 2, wherein in each of the passages, a capillary tube 4 preferably Stainless steel is located, which protrudes with its first end into the pressure chamber 5 and protrudes with its second end at the bottom of the housing 2.
- the capillary tubes have an inner diameter of 0.1 - 0.8 mm and are arranged vertically.
- the portions of the tubes, which protrude from the bottom of the housing 2 are hydrophobic (preferably coated with Teflon).
- FIG. 3 shows the metering device 10 in a rear view with a view of the two feed openings 6.
- Fig. 4 shows the metering device 10 in side view.
- the circular section A is shown enlarged in FIG.
- Fig. 5 it can be seen that the capillary tube 4 to half the height of Protruding pressure chamber in this. This has proven to be particularly advantageous for uniform dosing for all 48 capillaries.
- Fig. 6 shows the dosing system according to the invention.
- the pressure chamber 5 (not visible in the housing 2) of the metering device 10 is connected via a line 71, a valve 72 and another line 70 with a liquid contained in a storage vessel.
- a diaphragm pump 66 and a pressure line 68 room air is introduced under a pressure of 0.8 bar in the storage vessel.
- another gas such as N2 can be used.
- another pressure supply system can be used.
- suitable valves solenoid valves with low dead space volume and short switching time have proven, as they are marketed, for example, by Parker Hannifin Corp., Cleveland, OH 44124 USA.
- the liquid 65 containing the reactant to be examined is pumped via a valve 72 from a storage vessel 64 into the pressure chamber 5 (not visible) of the metering device (FIG. 6).
- the capillary tubes 4 (including the sheath) have an outer diameter of ⁇ 2 mm, so that a parallel dosing in 48 test wells of the microtiter plate is made possible (Fig. 6).
- the orientation of the tube 4 dosing outlets is specifically adapted to microtiter plates with 384 and 1536 test wells. Best mixing results for microtiter plates with 384 test wells were achieved by dispensing the reactant diagonally onto the microtiter plate walls.
- a precise microtiter plate holder 62 ensured the exact alignment of the dosing device 10 to the wells of the microtiter plate 60.
- the progress of a reaction is monitored by simultaneously recording the fluorescence intensity from all 48 test wells in a row simultaneously or from all test wells of the microtiter plate. Dispensing from the top of the microtiter plate 60 located on a microtiter plate holder 62 is combined with illumination and detection from the bottom. This allows the observation of the kinetic process during the dosing and mixing time.
- the homogeneous bottom lighting of the microtiter plate 60 is achieved by 2 LED lighting units, each with up to 36 UV or VIS high-power LEDs 80, which in Rows are arranged and aligned diagonally to the plate ( Figures 7 and 8).
- the available LEDs 80 deliver light 92 in the wavelength range of 340 to 800 nm, and extinction filters enhance fluorescence excitation by transmitting a selected wavelength range.
- the emitted fluorescence 94 is detected perpendicularly and / or at an angle of 90 ° by a fast and highly sensitive back-illuminated electron multi- plying charge coupled (EMCCD) or ICCD (intensified charge coupled device) camera 82.
- ECCD electron multi- plying charge coupled
- ICCD intensified charge coupled device
- the cameras 82 are equipped with interference filters 84 and can additionally be equipped with polarizing filters 85. Extending the adjustable camera setup to dual fluorescence detection (FIG. 8) enables the simultaneous detection of two emission signals, such as those required for measurements for Förster resonance energy transfer (FRET), bioluminescence resonance energy transfer (BRET) or fluorescence polarization (FP) ,
- FRET Förster resonance energy transfer
- BRET bioluminescence resonance energy transfer
- FP fluorescence polarization
- the false color representation of the emission of a microtiter plate with 1536 wells containing fluorescent solution is exemplified in FIG.
- Data for the test wells is collected by collecting and visualizing up to 1000 points per second and test well, and processing it through customized data processing software.
- Fig. 10 AC shows the corrected fluorescence kinetics at various B SA concentrations measured in the imaging instrument with the fast kinetics doser of the present invention.
- 1.6 ⁇ M ANS solution was added by capillary valve circuit of 9 ms to 48 test wells of a microtiter plate containing BSA ( Figure 10A).
- the capillary valve circuit is indicated by the gray bar.
- the binding of ANS to BSA results in an increase in ANS fluorescence recorded at 460 nm (bandpass 60 nm) after excitation at 370 nm (bandpass 36 nm).
- the ANS and BSA solutions were prepared in 100 mM potassium phosphate (pH 7.5). Final concentration: 5 ⁇ ANS and 1.9 (open circles), 2.5 (solid circles), 3.4 (inverted triangles), 7.9 (squares) and 10.6 ⁇ (triangles) BSA (Fig. 10A) ,
- the starting time of the binding reaction was determined by double-exponential adjustments and extrapolation of the fluorescence kinetics to the common start time to.
- the fluorescence kinetics (taken from Fig. 10A) were corrected to this initial time to (Fig. 10B). Solid lines show double exponential functions extrapolated to common time to.
- the dead time of the instrument which is implemented by the time period from to to the first correctly determined point on the fitted exponential curve, is based on the dispensing time and mixing artifacts.
- the detected traces of fluorescence show a very low noise level, which indicates the high quality of the kinetic data.
- 10C shows a diagram of the apparent rate constants of the binding, determined from the kinetic traces, as a function of the B SA concentration. It could be a slow (filled circles) and a fast binding phase (open circles) can be detected. The linear dependence of the slow kinetics binding phase on the B SA concentration confirms the accuracy and reliability of the particular tracks.
- the observed rate constants black
- the apparent rate constants and the second-order rate constants determined by the concentration dependence of the slow binding phase. are in excellent agreement with the data obtained by adding in a stopped-flow apparatus in a single cuvette.
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine Dosiervorrichtung aufweisend ein Gehäuse mit mindestens einer Druckkammer (5), einer Zuführöffnung (6) für die Zuführung von Flüssigkeit in die Druckkammer (5) und einer Vielzahl von Durchlässen zwischen der Druckkammer und einer Außenseite des Gehäuses, wobei sich in jedem der Durchlässe ein Röhrchen (4) befindet, das mit seinem ersten Ende in die Druckkammer hinein ragt und mit seinem zweiten Ende an der Außenseite aus dem Gehäuse herausragt.
Description
Dosiervorrichtung
Die Erfindung betrifft eine Dosiervorrichtung und ein Dosiersystem für die parallele Abgabe von Flüssigkeiten in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte.
Die Identifizierung und Entwicklung neuer Arzneistoffe zielt auf die Identifizierung chemischer Verbindungen, die biochemische Prozesse, wie Ligandenbindung, makromolekulare Konformationsänderungen oder enzymatische Reaktionen, modulieren. Üblicherweise verwendet man Hochdurchsatz-Screening (high-throughput Screening, HTS) zum Testen einer großen Zahl von chemischen Strukturen, da die Miniaturisierung einen schnellen, kostengünstigen und effizienten Test sicherstellt.
Fluoreszenz-basierte Tests sind aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und Automatisierbarkeit wahrscheinlich die wichtigsten Ansätze für HTS. Neben dem Verfolgen der Veränderung der Fluoreszenz durch eine enzymatische Reaktion verwendet man Markierungstechniken zur Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen oder Ligandenbindung durch Fluoreszenz- Resonanzenergietransfer (FRET), Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) oder Fluoreszenz- Polarisation (FP). Viele biologische Prozesse, vor allem die Bindung kleiner Liganden, sind durch eine sehr schnelle Kinetik gekennzeichnet, die schnelle Mischverfahren erfordert. Die Instrumente, die Platten-Formate mit 384 oder 1536 Testvertiefungen einsetzen, sind jedoch oft hinsichtlich der zeitlichen Auflösung eingeschränkt, wodurch die Bestimmung schneller Bindungskinetiken auf Methoden mit geringem Durchsatz beschränkt ist. Sogar der Screening-Ansatz von Instrumenten, die mit einem Multidispenser ausgestattet sind (siehe Gonzalez, J. E., and Mäher, M. P. (2002) Cellular Fluorescent Indicators and Voltage/Ion Probe Reader (VIPR TM ): Tools for Ion Channel and Receptor Drag Discovery, Receptors and Channels 8, 283-295; Mori, T., Itami, S., Yanagi, T., Tatara, Y., Takamiya, M., and Uchida, T. (2009) Use of a Real-Time Fluorescence Monitoring System for High-Throughput Screening for Prolyl Isomerase Inhibitors, Journal of Biomolecular Screening 14, 419-424; Schroeder, K. S., and Neagle, B. D. (1996) FLIPR: A New Instrument for Accurate, High Throughput Optical Screening, Journal of Biomolecular Screening 1, 75-80.), was die Zeitauflösung erheblich verbessert, ist hauptsächlich auf den Sekunden-Zeitbereich beschränkt.
Aus dem Stand der Technik bekannte schnelle Mischverfahren sind Continuous- oder Stopped-Flow- Vorrichtungen.
Bei Continuous-Flow-Experimenten wird die Reaktion unter Gleichgewichtsflussbedingungen als Funktion der Strecke stromabwärts vom Mischer untersucht. Verbesserungen des Mischer-Designs führten zu Totzeiten im Bereich von 100 μ8 oder sogar noch kürzeren (Regenfuss, P., Clegg, R. M., Fulwyler, M. J., Barrantes, F. J., and Jovin, T. M. (1985) Mixing liquids in microseconds, Rev. Sei. Instrum. 56, 293-290; Shastry, M. C. R., Luck, S. D., and Roder, H. (1998) A Continuous-Flow Capillary Mixing Method to Monitor Reactions on the Microsecond Time Scale, Biophysical Journal 74, 2714-272 l ;Roder, FL, Maki, K., Cheng, FL, and Ramachandra Shastry, M. C. (2004) Rapid mixing methods for exploring the kinetics of protein folding, Methods 34, 15-27.). Zum Erreichen von effizientem Mischen sind jedoch hohe Flussraten und relativ große Kanalabmessungen erforderlich, was große Mengen an Material verbraucht.
Bei handelsüblichen Stopped-Flow-Instrumenten werden die Reaktanten über zwei Spritzen mithilfe eines pneumatischen Auslösers zugeführt. Nach dem Befüllen der Beobachtungszelle wird der Fluss abrupt gestoppt, wenn die Stoppspritze auf einen Anschlagblock trifft. Instrumente können routinemäßig Totzeiten von einigen wenigen Millisekunden erreichen (Dickson, P. N., and Margerum, D. W. (1986) Extension of accessible first-order rate constants and accurate dead-time determinations for stopped- flow spectroscopy, Analytical Chemistry 58, 3153-3158; Nakatani, FL, and Hiromi, K. (1980) Analysis of Signal Amplitude in Stopped-Flow Method for Enzyme -Ligand Systems, Journal of Biochemistry 87, 1805-1810; Peterman, B. F. (1979) Measurement of the dead time of a fluorescence stopped-flow Instrument, Analytical Biochemistry 93, 442-444).
Sowohl Continuous-Flow- als auch Stopped-Flow-Geräte sind Methoden mit niedrigem Durchsatz, der sich auf eine Küvette oder einen Kanal beschränkt. Ein schnelles Mischverfahren zum Testen mehrerer Inhibitoren und Konzentrationen ist jedoch erforderlich, da die Bestimmung schneller Bindungsreaktionen oder Enzymkinetiken eine grundlegende Rolle bei der Identifizierung und Entwicklung neuer Arzneistoffe spielt. Damit man schnelle Kinetiken in Mikrotiterplatten beobachten kann, wurde ein neues bildgebendes Instrument zur Detektion schneller Kinetiken entwickelt, das hohe Zeitauflösung mit dem Durchsatz eines stark parallelisierten Systems kombiniert. Dies ermöglicht zum ersten Mal die effiziente Anwendung von schneller Kinetik auf die Identifizierung und Entwicklung neuer Arzneistoffe .
Ein wichtiger Bestandteil des neuen Instruments ist eine Dosiervorrichtung für die parallele Abgabe von Flüssigkeiten in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte. Solche Dosiervorrichtungen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
EP 1 099 480 A2 offenbart eine Mikrodispensiervorrichtung, bei der jeder einzelnen Dosierkapillare ein eigenes Mikroventil zugeordnet ist. Diese Mikrodispensiervorrichtung hat den Nachteil, dass für jedes einzelne Ventil eine eigene Zuleitung erforderlich ist und eine solche Ventilanordnung aufgrund der einzelnen Ventildurchmesser eine Paralleldosierung in 48 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte nicht zulässt.
Bei der aus DE 199 11 456 AI bekannten Dosiervorrichtung erfolgt die Steuerung der Flüssigkeitsabgabe über einen Dosierer, der Magnetventile in Verbindung mit einem Druckgefäß oder Taumelkolbenpumpen umfasst. Die Abgabe der Flüssigkeit erfolgt über einen Hauptflüssigkeitskanal, der mit einem Flüssigkeitsreservoir in Verbindung steht und sich mehrfach verzweigt bis zu der gewünschten Anzahl von Auslässen.
DE 102 36 029 AI offenbart einen linearen, symmetrisch baumartig strukturierten Dispensierkamm, der an eine steuerbare Pumpe zur Dosierung der zu dispensierenden Flüssigkeitsmenge angeschlossen ist.
DE 102 55 595 AI offenbart eine Mehrkanaldosiervorrichtung mit mehreren Dosierkanälen, bei der jeder Auslassdüse für Flüssigkeit ein Mikroventil zugeordnet ist. Die Mikroventile weisen wenigstens eine Zuführöffnung auf, die jeweils mit einem Ausgang eines Verteilers verbunden ist, dessen Eingang über einen Flusssensor mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden ist. Der Flusssensor dient der Kalibrierung, um Toleranzen der Dosierkanäle untereinander auszugleichen.
Die Nachteile dieser bekannten Dosiervorrichtungen sind die großen Kapillarlängen und, konstruktionsbedingt, unterschiedliche Kapillarradien, welche zu einem hohen und zusätzlich noch für jede Kapillare unterschiedlichen Druckverlust und damit unterschiedlichen Dosiervolumen führen.
Die Lösung des angegebenen Problems besteht in der nachfolgend beschriebenen Dosiervorrichtung.
Die erfindungsgemäße Dosiervorrichtung weist ein Gehäuse mit mindestens einer Druckkammer, einer Zuführöffnung für die Zuführung von Flüssigkeit in die Druckkammer und einer Vielzahl von Durchlässen zwischen der Druckkammer und einer Außenseite des Gehäuses auf, wobei sich in jedem der Durchlässe ein Röhrchen befindet, das mit seinem ersten Ende in die Druckkammer hinein ragt und mit seinem zweiten Ende an der Außenseite aus dem Gehäuse herausragt.
Die Druckkammer hat bevorzugt in eine Raumdimension eine größere Ausdehnung als in die beiden anderen Raumdimensionen. In Richtung der größeren Ausdehnung verläuft die Längsachse der
Druckkammer. Die Längsachse der Druckkammer verläuft gleichzeitig parallel zur Außenseite des Gehäuses. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Druckkammer zylindrisch oder quaderförmig.
Die Durchlässe befinden sich in einer der Wände der Druckkammer, die parallel zur Längsachse der Druckkammer verlaufen. Bevorzugt sind die Durchlässe parallel zueinander angeordnet. Es sind mindestens zwei Durchlässe vorhanden. Die Durchlässe können in einer oder mehrerer Reihen parallel zur Längsachse der Druckkammer angeordnet sein. Dabei sind bevorzugt 12, besonders bevorzugt 24 oder 48 Durchlässe pro Reihe vorhanden. Idealerweise ist die Zahl der Durchlässe pro Reihe an die Zahl der Vertiefungen in einer Reihe der Mikrotiterplatte (lange Seite), in die durch die Dosiervorrichtung dosiert wird, angepasst.
Bei den Röhrchen handelt es sich bevorzugt um Kapillaren aus Metall oder Kunststoff, Kapillaren, d.h. dünne Röhren, in denen bei den verwendeten Flüssigkeiten der Effekt der Kapillarität auftritt. Sie sollten einen inneren Durchmesser im Bereich von 0,1 mm bis 0,8 mm, bevorzugt 0,2 mm bis 0,6 mm haben. Der Außendurchmesser kann im Bereich von 0,35 mm bis 2 mm, bevorzugt 0,6 mm bis 1,1 mm liegen. Die Länge der Röhrchen liegt im Bereich von 6 mm bis 15 mm, bevorzugt 8,5 mm bis 13 mm, besonders bevorzugt 10 mm bis 13 mm.
Die Röhrchen sind senkrecht (90°) oder schräg in einem Winkel im Bereich von 40° bis < 90° zur Außenseite des Gehäuses angeordnet, je nachdem, ob senkrecht von oben Flüssigkeit in die Vertiefung der Mikrotiterplatte abgegeben werden soll oder unter einem Winkel auf die Seitenwand der Vertiefung abgegeben bzw. eingespritzt werden soll.
Zur Vergrößerung der Hydrophobizität der Röhrchen, die sich auf der Außenseite des Gehäuses befinden, können diese ummantelt, bevorzugt mit Kunststoff, zum Beispiel Teflon, sein.
In einer Ausführungsform befindet sich die Zuführöffnung für die Flüssigkeit in einer der Wände, die senkrecht zur Längsachse der Dosierkammer angeordnet sind. Das Gehäuse kann weiterhin eine Belüftungsöffnung aufweisen, aus der beim Befüllen der Dosierkammer mit Flüssigkeit die Luft herausgedrängt wird. Diese Belüftungsöffnung kann sich in einer der Wände, die senkrecht zur Längsachse der Dosierkammer angeordnet sind, befinden.
Die Druckkammer kann eine Querschnittsfläche im Bereich von 60 mm2 bis 300 mm2 oder einen Durchmesser im Bereich von 4 mm bis 10 mm bevorzugt im Bereich von 5,5 mm bis 6,5 mm haben.
Das Gehäuse der Dosiervorrichtung kann auch mehr als eine, zum Beispiel zwei, drei oder vier Druckkammern aufweisen, deren Längsachsen parallel zueinander verlaufen. Zu jeder Druckkammer gehört eine separate Zuführöffnung für die Zuführung von Flüssigkeit in die Druckkammer und jeder Druckkammer steht in Verbindung mit einer Vielzahl von Durchlässen (mit den entsprechenden Röhrchen) zwischen der Druckkammer und der Außenseite des Gehäuses. Bevorzugt sind die Durchlässe und Röhrchen der verschiedenen Druckkammern parallel zueinander angeordnet. Je nach Bedarf können auch mehrere Gehäuse mit einer oder mehreren Druckkammern nebeneinander und parallel zueinander angeordnet werden. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Dosiersystem aufweisend die oben beschriebene Dosiervorrichtung und ein Flüssigkeitsreservoir, das über eine Leitung mit der Zuführöffnung der Dosiervorrichtung verbunden ist. Druck auf das Flüssigkeitsreservoir bewirkt, dass Flüssigkeit vom Flüssigkeitsreservoir in die Druckkammer der Dosiervorrichtung gepumpt wird. Hierfür ist das Flüssigkeitsreservoir druckdicht von der umgebenden Atmosphäre abgeschlossen und mit einer Pumpe verbunden, die den notwendigen Druck aufbaut. Bei mehreren Druckkammern kann die Zuführöffnung jeder Druckkammer mit demselben oder verschiedenen Reservoirs von Flüssigkeit verbunden sein.
Über die Schaltzeit des Ventils zwischen Flüssigkeitsreservoir und Zuführöffnung in Kombination mit dem Druck der Pumpe kann die Menge der Flüssigkeit, die in jedem Schaltzyklus (Durchlass auf/zu) in die Druckkammer gelangt und über die einzelnen Röhrchen ausgegeben wird, gesteuert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung liegt die Flüssigkeit aus dem Flüssigkeitsreservoir unter einem Druck im Bereich von 0,5 bis 2 bar bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 0,85 bar am Ventil an und das Ventil hat eine Schaltzeit im Bereich von 5 ms bis 200 ms (5-60 ms bei Mikrotiterplatten mit 1536 Vertiefungen, 40-200 ms bei Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen), bevorzugt im Bereich von 5 ms bis 50 ms.
Die Schaltzeit des Ventils und der Druck durch die Pumpe sind so eingestellt, dass das Abgabevolumen der Dosiervorrichtung im Bereich 0,3 und 300 μΐ pro Kapillare liegt, bevorzugt zwischen 1 und 30 μΐ.
Der Vorteil der erfindungsgemäßen Dosiervorrichtung bzw. des Dosiersystems ist, dass wegen des großen Volumens der Druckkammer kombiniert mit den kurzen Röhrchen, die in die Druckkammer hineinragen, kein Druckgradient entsteht und somit eine sehr schnelle und mengenmäßig genaue Abgabe der Flüssigkeit möglich ist. Dadurch wird eine parallele, präzise und schnelle Dosierung im μΐ- Bereich in z.B. 384er- oder 1536er-Mikrotiterplatten ermöglicht.
Figuren und Beispiele
Fig. 1 Zwei Dosiervorrichtungen mit zwei Dosierkammern in perspektivischer Ansicht
Fig. 2 Dosiervorrichtung mit zwei Dosierkammern in perspektivischer Ansicht mit
Struktur
Fig. 3 Dosiervorrichtung mit zwei Dosierkammern in Hinteransicht
Fig. 4 Dosiervorrichtung in Seitenansicht
Fig. 5 Vergrößerter Ausschnitt der Dosiervorrichtung in Seitenansicht (ventilseitig)
Fig. 6 Dosiersystem mit Flüssigkeitsreservoir
Fig. 7 Bildgebendes Messinstrument (einkanalige Detektion)
Fig Bildgebendes Messinstrument (zweikanalige Detektion)
Fig Falschfarbenbild der Emission einer Mikrotiterplatte mit 1536 Testvertiefungen
Fig. 10 A-C Messung der Kinetik der ANS-Bindung an BSA mit dem bildgebenden Messinstrument Fig. 1 zeigt zwei parallel angeordnete erfindungsgemäße Dosiervorrichtungen 10 mit jeweils zwei Druckkammern in perspektivischer Ansicht. Weitere Ansichten einer Dosiervorrichtung sind in den Fig. 2 bis 5 gezeigt. Jede Dosiervorrichtung 10 hat ein quaderförmiges Gehäuse 2 mit zwei röhrenförmigen Bohrungen von 4-10 mm Durchmesser und 120-140mm Länge. Diese Bohrungen bilden zwei parallele Druckkammern 5. Jede Bohrung hat ein offenes Ende, das die kreisförmige Zuführöffnung 6 bildet. Das gegenüberliegende Ende ist zur Systembefüllung und -entleerung geöffnet und im Dosierbetrieb dicht verschlossen. Hier befindet sich die Auslauf- bzw. Entlüftungsöffnung 3. Die Gehäuse 2 sind mit der Seite, an der sich die Zuführöffnung 6 befindet, an einer Halterung 7 so befestigt, dass sie waagerecht von der Halterung 7 wegragen. Die Halterung 7 hat eine Aussparung für jede Zuführöffnung 6. Auf der Unterseite des wegragenden Gehäuses 2 befindet sich eine Reihe von bis zu 48 Durchlässen zwischen jeder Druckkammer 5 und der Unterseite des Gehäuses 2, wobei sich in jedem der Durchlässe ein kapillares Röhrchen 4 aus vorzugsweise Edelstahl befindet, das mit seinem ersten Ende in die Druckkammer 5 hinein ragt und mit seinem zweiten Ende an der Unterseite aus dem Gehäuse 2 herausragt. Die kapillaren Röhrchen haben einen inneren Durchmesser von 0,1 - 0,8 mm und sind senkrecht angeordnet. Die Abschnitte der Röhrchen, die aus der Unterseite des Gehäuses 2 hinausragen, sind hydrophob (vorzugsweise mit Teflon) ummantelt.
Fig. 3 zeigt die Dosiervorrichtung 10 in Hinteransicht mit Blick auf die beiden Zuführöffnungen 6.
Fig. 4 zeigt die Dosiervorrichtung 10 in Seitenansicht. Der kreisförmige Ausschnitt A ist in Fig. 5 vergrößert gezeigt. In Fig. 5 ist zu erkennen, dass die kapillaren Röhrchen 4 bis zur halben Höhe der
Druckkammer in diese hineinragen. Dies hat sich als besonders vorteilhaft für eine gleichmäßige Dosierung für alle 48 Kapillaren erwiesen.
Fig. 6 zeigt das erfindungsgemäße Dosiersystem. Die Druckkammer 5 (nicht sichtbar im Gehäuse 2) der Dosiervorrichtung 10 ist über eine Leitung 71, ein Ventil 72 und eine weitere Leitung 70 mit einer in einem Vorratsgefäß befindlichen Flüssigkeit verbunden. Über eine Membranpumpe 66 und eine Druckleitung 68 wird Raumluft unter einem Druck von 0.8 bar in das Vorratsgefäß eingeleitet. Statt Raumluft kann auch ein anderes Gas wie N2 verwendet werden. Statt der Membranpumpe kann auch ein anderes Druckversorgungssystem benutzt werden. Als geeignete Ventile haben sich Magnetventile mit geringem Totraumvolumen und kurzer Schaltzeit erwiesen wie sie zum Beispiel von der Fa. Parker Hannifin Corp., Cleveland, OH 44124 USA vertrieben werden.
Im Folgenden wird der Betrieb eines bildgebenden Messinstruments mit dem erfindungsgemäßen Dosiersystem beschrieben.
Die Flüssigkeit 65, die den zu untersuchenden Reaktanten enthält, wird über ein Ventil 72 aus einem Vorratsgefäß 64 in die Druckkammer 5 (nicht sichtbar) der Dosiervorrichtung gepumpt (Fig. 6). Die kapillaren Röhrchen 4 haben (inklusive der Ummantelung) einen Außendurchmesser von < 2 mm, so dass eine parallele Dosierung in 48 Testvertiefungen der Mikrotiterplatte ermöglicht wird (Fig. 6). Zum Erreichen von Mischungsbedingungen mit hoher Turbulenz wird die Ausrichtung der Dosierungsauslässe der Röhrchen 4 speziell an Mikrotiterplatten mit 384 und 1536 Testvertiefungen angepasst. Beste Mischergebnisse für Mikrotiterplatten mit 384 Testvertiefungen wurden durch Dispensieren des Reaktanten diagonal auf die Mikrotiterplattenwände erreicht. Im Gegensatz dazu wird das geringere Dosierungsvolumen, das für Mikrotiterplatten 60 mit 1536 Testvertiefungen erforderlich ist, senkrecht dosiert, wie in Fig. 6 gezeigt. Typische Dosierungszeiten für die erforderlichen Reaktantenvolumina wurden bestimmt, indem die dispensierte Flüssigkeit mit einer bekannten Zeit der Schaltung des Ventils 72 bei einem Druck von 0,8 bar gewichtet wurde.
Eine präzise Mikrotiterplatten-Halterung 62 stellte die exakte Ausrichtung der Dosiervorrichtung 10 zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatte 60 sicher. Der Fortschritt einer Reaktion wird verfolgt, indem die Fluoreszenzintensität von allen 48 Testvertiefungen in einer Reihe gleichzeitig oder von allen Testvertiefungen der Mikrotiterplatte gleichzeitig aufgezeichnet wird. Dispensierung von der Oberseite der auf einer Mikrotiterplatten- Halterung 62 befindlichen Mikrotiterplatte 60, wird mit Beleuchtung und Detektion von der Unterseite kombiniert. Dies gestattet die Beobachtung des kinetischen Prozesses während der Dosier- und Mischzeit. Die homogene Bodenbeleuchtung der Mikrotiterplatte 60 wird durch 2 LED- Beleuchtungseinheiten mit jeweils bis zu 36-UV bzw. VIS- Hochleistungs-LEDs 80 erreicht, die in
Reihen angeordnet und diagonal zu der Platte ausgerichtet sind (Fig. 7 und 8). Die verfügbaren LEDs 80 führen Licht 92 im Wellenlängenbereich von 340 bis 800 nm zu und Extinktionsfilter verbessern die Fluoreszenzanregung, indem sie einen ausgewählten Wellenlängenbereich übertragen. Die emittierte Fluoreszenz 94 wird senkrecht und/oder in einem Winkel von 90° durch eine schnelle und hoch- empfindliche rückwärtig beleuchtete EMCCD (back-illuminated-electron multyplying charge coupled device)- oder ICCD (intensified charge coupled device) Kamera 82 nachgewiesen. Die Kameras 82 sind mit Interferenzfiltern 84 ausgestattet und können zusätzlich mit Polarisationsfiltern 85 ausgestattet werden. Das Erweitern des verstellbaren Kamera- Aufbaus zu dualem Fluoreszenznachweis (Fig. 8) ermöglicht die zeitgleiche Detektion zweier Emissionssignale wie sie z.B. bei Messungen zum Förster- Resonanzenergietransfer (FRET), Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) oder zu Fluoreszenz-Polarisation (FP) notwendig sind.
Eine Erweiterung des in Fig. 7 und 8 gezeigten Meßsystems durch weitere LED-Beleuchtungseinheiten, die unterhalb der gezeigten LED-Einheiten mit geändertem Beleuchtungswinkel angeordnet sind, ist möglich. Wenn diese zusätzlichen LED-Einheiten eine andere Wellenlänge als die ursprünglichen LED- Einheiten aufweisen, kann eine Fluoreszenzanregung in mehreren Wellenlängen gleichzeitig erfolgen.
Die Falschfarbendarstellung der Emission einer Mikrotiterplatte mit 1536 Testvertiefungen, die fluoreszierende Lösung enthalten, ist beispielhaft in Fig. 9 dargestellt. Daten für die Testvertiefungen werden gesammelt, indem bis zu 1000 Punkte pro Sekunde und Testvertiefung erfasst und visualisiert und durch eine maßgeschneiderte Datenverarbeitungssoftware verarbeitet werden.
Leistungstest
Ein Verfahren, das routinemäßig zur Untersuchung der Leistung einer schnellen Mischvorrichtung verwendet wird, ist die Beobachtung einer schnellen Testreaktion. Für Fluoreszenzstudien wird geeigneterweise die Bindung des hydrophoben Farbstoffs l-Anilino-8-naphthalinsulfonsäure (ANS) an Rinderserumalbumin (BSA) verfolgt, die mit einer großen Zunahme der Fluoreszenzausbeute einhergeht. Die Fluoreszenzkinetiken für verschiedene B SA-Konzentrationen werden an Exponentialfunktionen angepasst und auf eine gemeinsame Anfangsfluoreszenz extrapoliert. Dieser gemeinsame Punkt liefert die Fluoreszenz von ANS in Abwesenheit von BSA zum Ausgangszeitpunkt (to) der Reaktion. Der Zeitabstand von diesem Punkt bis zum ersten Datenpunkt, der auf die angepasste Exponentialkurve fällt, liefert eine Abschätzung der Totzeit der Messung. Fig. 10 A-C zeigt die
korrigierten Fluoreszenzkinetiken bei verschiedenen B SA-Konzentrationen, die in dem bildgebenden Messinstrument mit der erfindungsgemäßen Dosiervorrichtung für schnelle Kinetik gemessen wurden.
Nach 55 ms wurden 1,6 μΐ ANS-Lösung durch eine Kapillarventilschaltung von 9 ms zu 48 Testvertiefungen einer Mikrotiterplatte, die BSA enthielt, hinzugefügt (Fig 10A). Die Kapillarventilschaltung ist über den grauen Balken angedeutet. Die Bindung von ANS an BSA führt zu einer Erhöhung der ANS-Fluoreszenz, die bei 460 nm (Bandpass 60 nm) nach Anregung bei 370 nm (Bandpass 36 nm) aufgezeichnet wird. Die ANS- und BSA-Lösungen wurden in 100 mM Kaliumphosphat (pH 7,5) hergestellt. Endkonzentration: 5 μΜ ANS und 1,9 (offene Kreise), 2,5 (ausgefüllte Kreise), 3,4 (umgekehrte Dreiecke), 7,9 (Quadrate) und 10,6 μΜ (Dreiecke) BSA (Fig. 10A).
Der Ausgangszeitpunkt der Bindungsreaktion wurde ermittelt durch doppelt exponentielle Anpassungen und Extrapolation der Fluoreszenzkinetiken auf die gemeinsame Anfangszeit to. Die (aus Fig. 10 A entnommenen) Fluoreszenzkinetiken wurden auf diese Anfangszeit to korrigiert (Fig. 10 B). Durchgezogene Linien zeigen Doppelexponentialfunktionen, die auf den gemeinsamen Zeitpunkt to extrapoliert wurden.
Es sollte beachtet werden, dass to der Reaktion nicht äquivalent mit dem Zeitpunkt der Ventilschaltung ist, sondern um den Eintritt und die Mischung der Reaktanten in den Testvertiefungen zeitverzögert ist. Die Totzeit des Instruments, die durch den Zeitraum von to bis zum ersten richtig bestimmten Punkt auf der angepassten Exponentialkurve implementiert wird, basiert auf der Dispensierzeit und Mischartefakten. Beim Vorliegen von 3μ1 Flüssigkeit in den Testvertiefungen einer Mikrotiterplatte und Dispensierung eines kleinen Volumens von 1,6 μΐ in die 1536 Testvertiefungen dieser Mikrotiterplatte , kann eine Totzeit von etwa 10 ms erreicht werden, die annähernd der Zeitauflösung von kommerziellen Stopped Flow-Instrumenten von einigen wenigen Millisekunden entspricht.
Die nachgewiesenen Fluoreszenzspuren (Fig.1 OB) zeigen einen sehr niedrigen Rauschpegel, was auf die hohe Qualität der Kinetikdaten hindeutet. Fig.10C zeigt ein Diagramm der aus den Kinetikspuren ermittelten apparenten Ratenkonstanten der Bindung als Funktion der B SA-Konzentration. Es konnte eine langsame (ausgefüllte Kreise) und eine schnelle Bindungsphase (offene Kreise) nachgewiesen werden. Die lineare Abhängigkeit der Bindungsphase mit langsamer Kinetik von der B SA- Konzentration bestätigt die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der bestimmten Spuren. Die beobachteten Ratenkonstanten (schwarz) wurden mit Daten verglichen, die durch eine konventionelle Stopped-Flow- Apparatur erhalten wurden (rot). Die apparenten Ratenkonstanten sowie die Ratenkonstanten zweiter Ordnung, die anhand der Konzentrationsabhängigkeit der langsamen Bindungsphase bestimmt wurden,
stimmen ausgezeichnet mit den Daten überein, die durch Zugabe in einer Stopped-Flow-Apparatur in einer einzelnen Küvette erhalten wurden.
Referenznummern:
10 Dosiervorrichtung
1 Ventil
2 Gehäuse
3 Auslauf- /Entlüftungsöffhun;
4 Röhrchen
5 Druckkammer
6 Zuführöffnung
6a Dichtung
7 Halterung
8 Ummantelung
60 Mikrotiterplatte
62 Plattenhalter
64 Vorratsgefäß
65 Flüssigkeit
66 Pumpe
68 Druckleitung
70 Leitung
71 Leitung
72 Ventil
80 LED-Modul
82 Kamera
84 Emissionsfilter
85 Polarisationsfilter
86 Anregungsfilter
90 Strahlteiler
92 Anregungslicht
94 Fluoreszenzlicht
Claims
1. Dosiervorrichtung aufweisend ein Gehäuse mit mindestens einer Druckkammer, einer
Zuführöffnung für die Zuführung von Flüssigkeit in die Druckkammer und einer Vielzahl von Durchlässen zwischen der Druckkammer und einer Außenseite des Gehäuses, wobei sich in jedem der Durchlässe ein Röhrchen befindet, das mit seinem ersten Ende in die Druckkammer hinein ragt und mit seinem zweiten Ende an der Außenseite aus dem Gehäuse herausragt.
2. Dosiervorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Druckkammer in eine Raumdimension eine größere Ausdehnung hat als in die beiden anderen Raumdimensionen und in Richtung der größeren Ausdehnung die Längsachse der Druckkammer verläuft und die Längsachse der Druckkammer parallel zur Außenseite des Gehäuses verläuft.
3. Dosiervorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Durchlässe in einer der Wände der Druckkammer befinden, die parallel zur Längsachse der Druckkammer verläuft und die Durchlässe parallel zueinander angeordnet sind.
4. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die
Druckkammer zylindrisch oder quaderförmig ist.
5. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Durchlässe vorhanden sind.
6. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchlässe in einer oder mehrerer Reihen parallel zur Längsachse der Druckkammer angeordnet sind.
7. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 8, bevorzugt 24 oder 48 Durchlässe pro Reihe vorhanden sind.
8. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Röhrchen um Kapillaren handelt.
9. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhrchen aus Metall sind.
10. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhrchen einen inneren Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 0,8 mm, bevorzugt 0,2 bis 0,6 mm haben.
11. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhrchen im Wesentlichen senkrecht (90°) oder schräg in einem Winkel im Bereich von 40° bis < 90° zur Außenseite des Gehäuses angeordnet sind.
12. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die
Abschnitte der Röhrchen, die sich auf der Außenseite des Gehäuses befinden durch Hülsen, bevorzugt aus Kunststoff ummantelt sind.
13. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Zuführöffnung in einer der Wände, die senkrecht zur Längsachse der Dosierkammer angeordnet sind, befindet.
14. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse eine Belüftungsöffnung aufweist.
15. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Belüftungsöffnung in einer der Wände, die senkrecht zur Längsachse der Dosierkammer angeordnet sind, befindet.
16. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die
Druckkammer eine Querschnittsfläche von 60 bis 300 mm2 oder einen Durchmesser von 4 mm bis 10 mm bevorzugt 5,5 - 6,5 mm hat.
17. Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse zwei, drei oder vier Druckkammern aufweist, deren Längsachsen parallel verlaufen, wobei zu jeder Druckkammer eine separate Zuführöffnung für die Zuführung von Flüssigkeit gehört.
18. Dosiersystem enthaltend eine Dosiervorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und ein Flüssigkeitsreservoir, das über eine Leitung mit der Zuführöffnung verbunden ist.
19. Dosiersystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen Flüssigkeitsreservoir und Zuführöffnung ein Ventil befindet.
20. Verwendung des Dosiersystems nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit aus dem Flüssigkeitsreservoir unter einem Druck im Bereich 0,5 bis 2 bar bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 0,85 bar am Ventil anliegt und das Ventil eine Schaltzeit im Bereich von 5 bis 200 ms, bevorzugt im Bereich von 5 bis 50 ms hat.
21. Verwendung des Dosiersystems nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Zugabevolumen in der Öffnungszeit des Ventil im Bereich zwischen 0,3 μΐ/pro Kapillare und 300 μΐ/pro Kapillare, bevorzugt zwischen 1 μΐ/pro Kapillare und 30 μΐ/pro Kapillare beträgt.
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