DE29824644U1

DE29824644U1 - Vorrichtung zur Durchführung photometrischer Tests

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Publication number: DE29824644U1
Application number: DE29824644U
Authority: DE
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1997-09-17
Filing date: 1998-09-15
Publication date: 2001-12-06
Anticipated expiration: 2008-09-16

Description

89 231 ul/wa

Vorrichtung zur Durchführung photometrischer Tests BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Vorrichtung zur Durchführung photometrischer Tests, insbesondere biochemischer photometrischer Tests.

Üblicherweise werden photometrische Tests in Mikrotiterplatten durchgeführt, die 96, 384, 864 oder sogar 1.536 Quellen (8 &khgr; 12, 16 &khgr; 24, 24 &khgr; 36 bzw. 32 &khgr; 48) aufweisen. Die Geometrie solcher Platten wurde standardisiert, wodurch es möglich wurde, das photometrische Auslesen auf Grundlage der Prinzipien von Absorbanz, Fluoreszenz, Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Streuung mit einer Plattenlesemaschine auf allen Quellen innerhalb eines Standardformats durchzuführen. Derartige Testsysteme leiden unter dem Nachteil, dass das erforderliche Probenvolumen relativ gross und die Konzentration der zu untersuchenden Substanz relativ hoch sein kann, wodurch die Kosten erhöht werden. Ferner neigen mit zunehmenden Testvolumina solche Systeme, die keine Abdeckung oder keinen Verschluss bereitstellen, in erhöhtem Mass zur Verdampfung.

Es besteht nach wie vor ein Bedarf zur Miniaturisierung photometrischer Testsysteme, damit es möglich wird, Proben mit geringerem Volumen zu untersuchen, während die

Empfindlichkeit und ein angemessenes Signal-zu-Rausch-Verhältnis beibehalten wird.

Wir haben nun eine Vorrichtung erfunden, die die Durchführung photometrischer Tests bei hohe Dichte und geringem Volumen mit signifikant erhöhter Empfindlichkeit als bisher möglich und mit signifikant verringertem Verdampfungsproblem erlaubt. Andere Vorteile unserer Vorrichtung, wie beispielsweise eine verringerte Interferenz zwischen den Signalen von Proben, werden aus der nachfolgenden Darstellung ersichtlich.

Folglich wird erfindungsgemäss eine Vorrichtung zur Durchführung von photometrischen Tests bereitgestellt, die folgendes umfasst:

(1) ein Gehäuse;

(2) eine Mehrzahl lichtdurchlässiger Kapillaren, die jeweils an einem Ende verschlossen sind;

(3) Mittel zur Bewirkung der photonischen Isolation jeder Kapillare von einer benachbarten Kapillare; und

(4) optische Instrumentierung und Schaltkreise, die zum Auslesen einer photonischen Antwort oder eines photonischen Ereignisses in jeder Kapillare ausgelegt sind.

Das Gehäuse kann aus einem beliebigen steifen Material hergestellt sein, wie beispielsweise aus Kunststoffen (z.B. Perspex) oder Metall (z.B. Stahl, Aluminium). Das Gehäuse dient zum Festhalten der Kapillaren in der gewünschten Orientierung zum Auslesen durch die optische Instrumentierung und Schaltkreise.

Vorzugsweise ist die Mehrzahl an lichtdurchlässigen Kapillaren in einer regulären Ausrichtung angeordnet. Beispielsweise können sie in dem Gehäuse in Arrays von 8 &khgr; 12, 16 &khgr; 24, 32 &khgr; 48, 64 &khgr; 96 (insbesondere wenn dies mit dem herkömmlichen Mikroplattenformat übereinstimmt) oder einer beliebigen anderen geometrischen Anordnung angeordnet sein.

Alternativ dazu (obwohl dies nicht bevorzugt ist') können sie dicht gepackt sein, in welchem Fall sie vorzugsweise zu einer regelmässigen Form dicht gepackt sind, wie beispielsweise einem Quadrat, Rechteck, Sechseck oder Kreis. Die dicht gepackte Anordnung kann dann in dem Gehäuse aufgenommen werden.

Die Kapillaren besitzen üblicherweise einen kreisförmigen Querschnitt und haben typischerweise innere und äussere Dimensionen im Bereich von 0,1 bis 4 mm, z.B. 0,8 mm bzw. 1,0 mm. Die Kapillaren haben eine Länge im Bereich von bis 50 mm, z.B. 10 mm.

Die Kapillaren können auch eine andere als eine kreisförmige innere und externe Geometrie aufweisen. Beispielsweise kann ein sechseckiger äusserer Bereich eine für die dichte Packung vorteilhafte Geometrie sein.

Bei der Anordnung der Kapillaren in Arrays werden die Mittel zur photonischen Isolierung jeder Kapillare von einer benachbarten Kapillare dadurch bereitgestellt, dass der Teil des Gehäuses, der die Kapillaren aufnimmt, einen Trägerblock umfasst, worin Löcher eingearbeitet sind, idealerweise in einer regulären Anordnung, wobei jedes Loch geeignet ist, eine einzelne Kapillare aufzunehmen und zu halten.

Das Material zur Herstellung eines Gehäuses sollte nicht signifikant zum Hintergrundsignal des angewandten Testverfahrens beitragen und sollte keine Signalübertragung von einer Kapillare auf die nächste ["Kreuzkopplung (cross-talk)"] in signifikantem Ausmass erlauben.

Vorzugsweise wird der Trägerblock aus einem lichtundurchlässigen, z.B. Kunststoffmaterial hergestellt, wie beispielsweise Perspex oder hochdichtem Polypropylen oder Polytetrafluorethylenmaterial, das schwarz gefärbt sein kann. Das gesamte Gehäuse kann aus dem gleichen Material hergestellt sein.

Für Fluoreszenzanwendungen ist der Trägerblock vorzugsweise undurchlässig für Licht der Emissionswellenlänge, auch wenn er nicht undurchlässig gegenüber Licht der Anregungswellenlänge ist.

Für Fluoreszenzanwendungen hat das Material zur Herstellung des Trägerblocks vorzugsweise eine niedrige intrinsische Fluoreszenz.

Kapillaren können in dem Trägerblock mit einer Dichte von typischerweise 1 bis lO.OOO/cm^ angeordnet werden. Kapillaren, die in Arrays von 96, 384 und 1.536 angeordnet sind, werden üblicherweise mit einem Abstand von 9, 4,5 bzw. 2,25 mm angeordnet.

Das Ende der Kapillare, das die Probe enthält, oder dazu vorgesehen ist, kann über den Trägerblock hinausragen oder, innerhalb des Trägerblocks gehalten werden. Vorzugsweise ragt es über den Trägerblock hinaus.

Wir bevorzugen, dass das Ende der Kapillare unter Ausbildung eines verschlossenen Kolbens verschmolzen wird.

Wenn die Kapillare dicht gepackt werden, können die Mittel zur Bereitstellung der photonischen Isolation jeder Kapillare von einer benachbarten Kapillare durch Beschichten jeder Kapillare mit einem lichtundurchlässigen Material bereitgestellt werden. Alternativ können sie mit einer Beschichtung versehen werden, die nach innen hochreflektiv ist, wie beispielsweise eine Silber- oder Aluminiumbeschichtung.

Üblicherweise ist die Beschichtung eine Kunststoffbeschichtung. Die Beschichtung sollte ausreichend dick und dicht sein, und das Material weist Eigenschaften auf, die für die Anwendung geeignet sind. Für Fluoreszenzanwendungen besitzt sie vorzugsweise eine niedrige intrinsische Fluoreszenz. Oft ist die Beschichtung aus einem schwarzen Kunststoffmaterial.

Es ist ferner vorgesehen, dass die mit einem lichtundurchlässigen Material beschichteten Kapillaren in einem Gehäuse gehalten werden, das einen Trägerblock umfasst, der nicht aus einem lichtundurchlässigen Material hergestellt sein muss.

In einer alternativen Ausführungsform, worin die Kapillaren in Arrays angeordnet sind, können die Mittel zur photonischen Isolierung jeder Kapillare von einer benachbarten Kapillare einen Luftraum umfassen. Die Kapillaren sind nichtsdestotrotz durch das Gehäuse miteinander verbunden, wodurch sie in der gewünschten Orientierung gehalten werden, obwohl diese Verbindungen nicht dergestalt sind, dass es zu einer signifikanten "Kreuzkopplung" kommt.

In einer Verbesserung dieser Ausführungsform können die Kapillaren als in einem Trägerblock gehalten angesehen werden, in dem Sinne, dass der Trägerblock sie fest in einer fixierten Orientierung hält, ausser dass derjenige Teil der Kapillare, der eine flüssige Probe enthält oder dafür vorgesehen ist, nicht innerhalb des Trägerblockes gehalten wird, sondern von einem Luftraum umgeben ist.

Die Mittel zur photonischen Isolierung jeder Kapillare von einer benachbarten Kapillare kann ferner einen Luftraum zusammen mit einer Kapillarbeschichtung aus einem lichtundurchlässigen Material umfassen.

Die Durchführung eines Tests beinhaltet die Zuführung von Flüssigkeit in eine oder mehrere Kapillaren. Das kann manuell durchgeführt werden, wird jedoch vorzugsweise durch ein automatisiertes System durchgeführt.

Regelmässig ist es erforderlich, eine zu untersuchende Probe von kleinerem Volumen und ein Testreagens in grösserem Volumen abzugeben, es kann jedoch ebenso erforderlich sein, eine Probe mit grösserem Volumen abzugeben. In jedem Fall kann die in die Kapillare abzugebende Flüssigkeit in einem oder mehreren Aliquots abgegeben werden, die hinsichtlich des Volumens von klein (nl- bis pl-Bereich) bis gross (&mgr;&Igr;-Bereich) sein können.

Jedes Aliquot kann durch Standard-Kontaktabgabeverfahren durchgeführt werden, z.B. eine Spritzennadel, eine Pipettenspitze oder eine Übertragungsnadel. Eine Probe kann unter Verwendung einer Mikroinjektionsnadel auf den Grund der Kapillare abgegeben werden, sie wird jedoch vorzugsweise am oberen Ende der Kapillare zugeführt und durch Schwingung unter Ausnutzung von

Oberflächenbeschichtungen oder geometrischen Merkmalen, durch Anwendung von Druckdifferentialen oder vorzugsweise durch Zentrifugation auf den Boden bewegt.

Zentrifugieren hat den weiteren Vorteil, dass es die Probendurchmischung verstärkt.

Das Zentrifugieren kann unter Verwendung herkömmlicher Vorrichtungen durchgeführt werden, z.B. mit einer herkömmlichen Mikroplattenzentrifuge. Die Form des Gehäuses kann so angepasst sein, dass das Zentrifugieren erleichtert wird.

Es können Vorrichtungen (z.B. 96-, 384- oder 1.536-Multikanaldispenser) verwendet werden, die die gleichzeitige Abgabe einer Anzahl von angeordneten Aliquots ermöglichen.

Aliquots können auch durch kontaktfreie Abgabe, z.B. unter Verwendung von piezoelektrischen oder Selenoidventilspendern abgegeben werden. Dieses Verfahren ist zur Abgabe kleinerer Volumina (nl- bis pl-Bereich) besser geeignet.

Typische, in eine Kapillare einzuführende Gesamtaliquotvolumina liegen im Bereich von 0,1 bis 10 &mgr;&idiagr;, z.B. 1 &mgr;&idiagr;.

Wenn die Kapillaren in Arrays angeordnet sind, kann jede mit einem Wulstende ausgerüstet sein, das eine grössere Öffnungsgrösse als die Kapillare selbst besitzt, wodurch die Einführung einer Probe erleichtert wird. Wir haben herausgefunden, dass ein sich auf 1,2 mm ausdehnender Wulst sehr geeignet ist, wenn die äussere Abmessung der Kapillare 1,0 mm beträgt.

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Alternativ oder zusätzlich kann jede Kapillare in einem Trägerblock gehalten werden, der mit einer Flüssigkeitszuführvorrichtung ausgerüstet ist, die darauf angepasst ist, Flüssigkeit in jede Kapillare einzutrichtern. Die Trichteranordnung der Flüssigkeitszuführvorrichtung kann einen geformten Konus mit einem offenen Ende von grösserem Durchmesser als dem Innendurchmesser der Kapillare zur Unterstützung der Verteilung der Probe aufweisen. Besonders vorteilhaft ist eine Grosse vergleichbar derjenigen von herkömmlichen Mikrotiterplatten, was den Einsatz von herkömmlichen Verteilungsausrüstungen (z.B. Multikanal-96- oder -384-Verteiler) ermöglicht.

Der Trägerblock kann sowohl in Ausführungsformen, in denen der Teil der Kapillare, der eine flüssige Probe enthält oder dafür vorgesehen ist, in dem Trägerblock gehalten wird, als auch in Ausführungsformen, worin dieser Teil nicht innerhalb des Trägerblockes gehalten, sondern von einem Luftraum umgeben ist, eine Eintrichterungsanordnung bereitstellen.

Wenn eine Kapillare mit einem Wulst zusammen mit einem Trägerblock mit einer Trichteranordnung verwendet wird, kann der Wulst vorteilhafterweise dem weiteren Zweck des Stutzens und Verschliessens der Kapillare in dem Trägerblock dienen.

Die Kapillaren können aus einer Reihe lichtdurchlässiger Materialien hergestellt werden, z.B. aus Kunststoffen (wie beispielsweise Perspex), Gläsern (wie beispielsweise Quarzglas) und Quarz. Es ist bevorzugt, dass die Materialien in dem angewandten optischen Testverfahren ein niedriges Untergrundsignal geben. Gläser und Quarz sind

besonders bevorzugt, insbesondere Quarzglas, das eine niedrige Phosphoreszenz zeigt.

Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, nehmen wir an, dass die Empfindlichkeit der Vorrichtung zu einem grösseren Teil dadurch zunimmt, dass die Kapillarwand als optischer Wellenleiter fungiert, der das Licht sehr effizient koppelt und aus der eingeschlossenen Flüssigkeit hinausleitet. Vorzugsweise wird eine photonische Antwort oder ein Ereignis in jeder Kapillare am verschlossenen Ende ausgelesen, d.h. Licht, z.B. Fluoreszenz oder Lumineszenz) wird vorzugsweise von der Oberfläche des verschlossenen Endes statt von der flüssigen Oberfläche aufgenommen. Wenn das verschlossene Ende einen verschmolzenen Kolben bildet (was bevorzugt ist), so kann dieser als Linse dienen, der zur Konzentrierung und Fokussierung des durch die Kapillarwand hindurchgeleiteten Lichtes geeignet ist, im allgemeinen als deren Spitze oder in einem Fokuspunkt unterhalb von dessen Spitze, vorzugsweise auf eine einzelne oder eine mehrfache Fokusfläche. Der Kolben kann eine Reihe von Geometrien gegenüber der inneren Oberfläche zeigen, z.B. konkav, konvex oder flach.

Ein weiterer Vorteil des Systems ist, dass die Aufnahme der Fokusfläche der Kolben in einem Array die Paralaxen/Schattierungsprobleme eliminiert, die bei der Abbildung herkömmlicher Mikrotiterquellen beobachtet werden. Zusätzlich kann es das Signal-Rausch-Verhältnis (Kontrast) signifikant erhöhen.

Der Zweck der lichtundurchlässigen Barriere zwischen den Kapillaren ist es, die "Kreuzkopplung" oder die Signalinterferenz zwischen einer Kapillare und einer anderen zu eliminieren oder wesentlich zu reduzieren.

Gemäss dem vorstehend Gesagten wird die Anordnung der Mehrzahl an Kapillaren als "Kapillararray" bezeichnet.

Kapillararrays können unter Verwendung herkömmlicher Technologie zur Durchführung von photometrischen Tests ausgelesen werden. Es kann ein beliebiger Test angewandt werden, in dem Lichtphotonen emittiert werden. Typische Tests schliessen Absorbanztests, Fluoreszenztests, Lumineszenztests, Phosphoreszenztests und auf Streuung basierende Tests (z.B. Raman oder Nephelometrie) in teilchenhaltigen Flüssigkeiten ein.

Für Fluoreszenzanwendungen kann das Fluoreszenzsignal durch ein oder mehrere Fluorophore erzeugt werden, die an Targetmolekülen anhaften oder innerhalb von Targetmolekülen (Autofluoreszenz) befindlich sind. Eine derartige Fluoreszenz kann durch Ein- oder Mehrphotonenprozesse induziert werden.

Das Verfahren ist geeignet zur Durchführung aller photometrischen Testtypen, wie beispielsweise biochemischer, chemischer und immunologischer Tests usw..

Für Absorbanztests ist es üblich, die Oberfläche der Flüssigkeit in jeder Kapillare mit Licht zu bestrahlen, und das an der Oberfläche des verschlossenen Endes der Kapillare oder, wenn das Ende einen Linseneffekt zeigt, am Brennpunkt unterhalb des verschlossenen Endes transmittierte Licht zu messen. Die Messung besteht aus der Messung der Anzahl der bei einer bestimmten Wellenlänge transmittierten Photonen. Alternativ dazu können Absorbanzspektren über einen Bereich von Wellenlängen gemessen werden.

Für Fluoreszenztests ist eine mögliche Anordnung ähnlich
der oben für Absorbanztests beschriebenen, d.h. die
Flüssigkeit wird mit Licht einer festgelegten Wellenlänge bestrahlt, und das emittierte Licht wird von der
Oberfläche des verschlossenen Endes der Kapillare oder in dessen Brennpunkt gemessen. Die Messung besteht aus der
Messung der Anzahl von Photonen, die bei einer
festgelegten Wellenlänge emittiert werden, die im
allgemeinen eine andere Wellenlänge ist als diejenige des Anregungslichtes. Alternativ dazu kann die Anzahl der
Photonen, die über einen Bereich von Wellenlängen
emittiert werden, gemessen werden.

Die Anregung der Probe kann im Prinzip durch Beleuchtung
der Probe aus einem beliebigen Winkel erzielt werden. Im
allgemeinen bevorzugen wir die Beleuchtung der Oberfläche der in der Kapillare eingeschlossenen Flüssigkeit vom
offenen Ende, obwohl die Probe auch durch Beleuchtung des verschlossenen Endes der Kapillare anstelle der flüssigen Oberfläche angeregt werden kann.

Es ist vorstellbar, obwohl nicht bevorzugt, dass die Probe von der Seite bestrahlt wird, z.B. durch einen
Trägerblock, der aus einem lichtdurchlässigen Material
hergestellt ist oder ein solches umfasst. In einer
möglichen Anordnung (wie oben angemerkt) kann der
Trägerblock aus einem Material hergestellt sein, das
gegenüber Licht der Emissionswellenlänge undurchlässig
ist, aber Licht der Anregungswellenlänge durchlässt,
wodurch es möglich wird, die Probe von der Seite zu
beleuchten und gleichzeitig die "Kreuzkopplung" zu
minimieren oder zu eliminieren. Die Probe kann auch durch eine Anordnung, die einen Lichtleiter einschliesst, von
der Seite beleuchtet werden.

Die Messung von Fluoreszenzlicht kann unmittelbar nach der Anregung oder nach einer zeitlichen Verzögerung erfolgen. Da die meisten Hintergrundsignale kurzlebig sind, erlaubt die Verwendung von Fluoreszenzlabels mit einer langen Lebensdauer von z.B. 10 bis 1.000 ns eine zeitaufgelöste Detektion zur Verringerung der Hintergrundinterferenz.

Die beschriebene Kapillaranordnung kann nützlich sein zur Ermöglichung der Miniaturisierung von Testmethoden, die zeitaufgelöste Fluoreszenz anwenden (einschliess'lich Lebensdauer-Fluoreszenz), z.B. Packard Biosciences homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF) oder Wallac Lanthanidchelat-Anregungstechnologie (LANCE).

Für Lumineszenztests wird die Lumineszenz üblicherweise durch chemische oder biologische Mittel erzeugt. Für Chemilumineszenzanwendungen stammt das gemessene Licht aus einer chemischen Reaktion, wie beispielsweise der Wechselwirkung einer radioaktiven Substanz mit einem Szintillator. Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist ein Szintillationsnaherungstest. Im allgemeinen wird das meiste oder das gesamte emittierte Licht aufgefangen; gemessen wird das Licht, das an der Oberfläche des verschlossenen Endes der Kapillare oder in dessen Brennpunkt emittiert wird. Der Szintillator kann in Form eines Kügelchens vorliegen, und die Wechselwirkung mit der radioaktiven Substanz kann unterstützt werden durch Verbinden des Kügelchens mit einem Antikörper mit einer Affinität zu der radioaktiven Substanz.

In einer besonders vorteilhaften Anordnung zur Durchführung eines Szintilationsnäherungstests kann der Szintillator auf die innere Oberfläche der Kapillare aufgeschichtet sein, und das emittierte Licht kann mit

besonders hoher Effizienz durch die Kapillarwand zum verschlossenen Ende geleitet werden.

Die Beschichtung kann mit beliebigen bekannten Mitteln erzielt werden, beispielsweise durch Langmuir Blodgettselbstaufbauende Monolayer.

Die Oberfläche der Kapillare kann auch zur Bereitstellung gewünschter Eigenschaften beschichtet oder behandelt sein, z.B. zur Veränderung der Benetzungseigenschaften der Kapillare oder durch Aufbringen einer Gewebekulturbehandlung auf die innere Oberfläche, wodurch die Zelladhäsion verbessert wird.

Für Biolumineszenzanwendungen kann das Licht durch eine Enzymreaktion erzeugt werden, z.B. durch Reaktion von Luciferase.

Durch Kopplung eines Reaktionsereignisses an ein lichterzeugendes Ereignis auf Basis von chemischen oder biologischen Prinzipien kann ein weiter Bereich an Lumineszenztests durchgeführt werden.

Für Phosphoreszenztests sind die für Fluoreszenztests beschriebenen Anordnungen geeignet, ausser dass emittierte Lichtphotonen für einen Zeitraum von z.B. 0,1 bis 10 ms aufgefangen und gemessen werden.

Für Tests, die auf Lichtstreuung in teilchenhaltigen Flüssigkeiten basieren, sind eine Reihe von Anordnungen möglich, worin das gestreute Licht direkt oder indirekt gemessen werden kann. Beispielsweise kann die Flüssigkeit in jeder Kapillare von der Seite mit Licht beleuchtet werden, und das zum verschlossenen Ende einer Kapillare abgelenkte Licht kann von der Oberfläche des

verschlossenen Endes oder in dessen Brennpunkt aufgefangen und gemessen werden. Die Messung besteht aus der Messung der Anzahl der aufgefangenen Photonen, die das gleiche oder ein anderes Wellenlängenprofil aufweisen, wie das Belichtungslicht. Alternativ dazu kann die Oberfläche der Flüssigkeiten jeder Kapillare vom offenen Ende belichtet werden, und das Licht, das nicht gestreut und zur Quelle zurück abgelenkt wird, wird an der Oberfläche des verschlossenen Endes oder in dessen Brennpunkt aufgefangen und gemessen.

Wie oben diskutiert, wird die Nachweisoptik vorzugsweise auf das verschlossene Ende der Kapillare fokussiert, und falls dieses einen verschmolzenen Kolben bildet, auf dessen Spitze oder dessen Brennpunkt, sofern es den oben beschriebenen Linseneffekt zeigt.

Die Durchführung des Tests kann mit in beliebiger Ausrichtung befindlichem Kapillararray durchgeführt werden. Obwohl es gut sein kann, dass die Durchführung von Tests mit aufrechtem Array bevorzugt ist, können diese gleichermassen gut mit umgedrehtem Array durchgeführt werden, da in diesem Fall die Probe am verschlossenen Ende durch Kapillarwirkung zurückgehalten wird.

Wenn die Geometrie des Kapillararrays die gleiche ist wie diejenige herkömmlicher Mikroplatten (d.h. 8 &khgr; 12, 16 &khgr; und 32 &khgr; 48 Arrays, mit Kapillarabständen von 9 mm, 4,5 mm bzw. 2,25 mm) können herkömmliche Mikroplattenlese- und -abbildungsgeräte mit minimalen Modifikationen verwendet werden.

Ein beispielhaftes Verfahren zur Anregung bei Fluoreszenztests ist mit einer Xenonblitzlichtlampe mit einem geeigneten Anregungsfilter, z.B. einem im Bereich

von 300 bis 700 nm. Eine Filterbandbreite von 10 nm oder weniger ist bevorzugt. Im allgemeinen wird die Messung des nachgewiesenen Lichtes nach Durchtritt des Lichtes durch einen geeigneten Emissionsfilter durchgeführt.

Photonensammlungsmessungen werden im allgemeinen mittels einer Photomultiplierröhre, einer Photodiode oder einer ladungsgekoppelten Vorrichtung durchgeführt.

Im allgemeinen wird die Photonenaufnahme nacheinander für jede Kapillare durchgeführt, was die Bereitstellung von Mitteln zum Bewegen des Detektors oder des Kapillararrays von einem Ort zum anderen beinhaltet. Wenn die Photonenaufnahme mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung durchgeführt wird, kann es jedoch möglich sein, die Photonen in einigen oder allen Kapillaren gleichzeitig aufzunehmen, was hinsichtlich der Aufnahmegeschwindigkeit und der mechanischen Einfachheit offensichtliche Vorteile besitzt. Ein solches System maximiert die erfindungsgemässen Vorteile bezüglich der Fähigkeit, sehr grosse Probenzahlen ohne wesentliche zeitliche Beschränkungen effizient zu messen. Falls der Teil der Kapillare in einem Array, der eine Probe enthält oder dazu vorgesehen ist, von einem Luftraum umgeben ist, kann das Array zur Anwendung thermischer Zyklen in eine Flüssigkeit oder ein Wärmeübertragungsmedium eingetaucht sein.

Als weiterer erfindungsgemässer Aspekt wird ein Kapillararray bereitgestellt, das folgendes umfasst:

(1) eine Mehrzahl an lichtdurchlässigen Kapillaren, die jeweils an einem Ende verschlossen sind; und

(2) Mittel zur Bereitstellung der photonischen Isolierung jeder Kapillare von einer benachbarten Kapillare.

Ferner wird ein solches Kapillararray bereitgestellt, worin die Kapillaren in einem Trägerblock gehalten werden, in den Löchern eingearbeitet sind, idealerweise in einer regelmässigen Anordnung, wobei jedes Loch in der Lage ist, eine einzelne Kapillare aufzunehmen und zu halten.

Ferner wird ein solches Kapillararray bereitgestellt, worin die Kapillaren dicht gepackt sind und in einem · Gehäuse gehalten werden.

Andere Merkmale des Kapillararrays sind aus dem Vorgesagten ersichtlich.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren erläutert, worin:

Fig. 1 vier exemplarische Kapillardesigns zeigt;

Fig. 2a zeigt eine perspektivische Teilansicht eines Kapillararrays gemäss einer erfindungsgemässen Ausführungsform, worin das Kapillardesign (A) gemäss Fig. 1 dargestellt wird;

Fig. 2b zeigt eine Aufsicht auf das Kapillararray gemäss Fig. 2a;

Fig. 2c zeigt einen Schnitt entlang der Linie A-A durch das Kapillararray gemäss Fig. 2a und zeigt vier unterschiedliche Gehäusealternativen, ausser dass Kapillardesign (C) gemäss Fig. 1 anstelle von Kapillardesign (A) in den Ausführungsformen

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(i) bis (iii) dargestellt ist, und Kapillardesign (B) gemäss Fig. 1 anstelle von Kapillardesign (A) in Ausführungsform (iv) dargestellt ist;

Fig. 3a und 3b sind Charts, die die Empfindlichkeit einer erfindungsgemässen Vorrichtung in einem Fluoreszenztest zeigen (lineare bzw. logarithmische Skalierung);

Fig. 4 zeigt einen Vergleich der Verdunstungsneigung einer Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung mit einer herkömmlichen Vorrichtung;

Fig. 5 zeigt einen Fluoreszenzscan von drei Kapillaren in einem erfindungsgemässen 1.536-Kapillarenarray,-

Fig. 6a zeigt einen Vergleich des Fluoreszenzbildes von Fluoresceinproben in einer erfindungsgemässen Ausführungsform mit einer herkömmlichen Mikroplatte;

Fig. 6b zeigt ein Histogramm der Fluoreszenzintensität von Fluoresceinproben in einer erfindungsgemässen Ausführungsform im Vergleich mit einer herkömmlichen Mikroplatte.

In Fig. 1 sind Kapillaren (1) gezeigt, die (A) ein einfach verschlossenes Ende mit konkaver innerer Oberflächengeometrie aufweisen, (B) an einem Ende unter Ausbildung eines verschmolzenen Kolbens mit einer konvexen inneren Oberflächengeometrie (2a) verschlossen sind, (C) einen Wulst (3) am offenen Ende aufweisen können, und (D) an einem Ende unter Ausbildung eines verschmolzenen

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Kolbens mit einer flachen inneren Oberflächengeometrie (2b) verschlossen sind.

In Fig. 2a, 2b und 2c wird jede Kapillare (1) in einem Gehäuse (4) gehalten, das einen Trägerblock umfasst, worin ein Loch (5) zur Aufnahme der Kapillare ausgebildet ist. In Fig. 2c (i) wird der Teil der Kapillare, der dafür vorgesehen ist, eine flüssige Probe zu enthalten, innerhalb des Trägerblocks gehalten. In Fig. 2c (ii) wird der Teil der Kapillare, der dafür vorgesehen ist, eine flüssige Probe zu enthalten, nicht innerhalb des Trägerblocks gehalten, sondern ist von einem Luftraum umgeben. Fig. 2c(iii) zeigt den Trägerblock, der mit einer konischen Flüssigkeitszuführvorrichtung (6) ausgerüstet ist, die darin angepasst ist, Flüssigkeit in jede Kapillare einzutrichtern. Fig. 2c(iv) zeigte eine Modifikation der Ausführungsform gemäss Fig. 2c(iii), worin die Flüssigkeitszuführvorrichtung fehlt und das Kapillardesign (B) gemäss Fig. la verwendet wird.

Die Fig. 3a und 3b zeigen einen Vergleich des Fluoreszenzsignals (relative Fluoreszenzeinheiten), das anhand eines Bereichs von Fluoresceinkonzentrationen (0,01 bis 1.000 ng/ml) erhalten wird, wenn verschiedene Probenvolumina dieser Fluoresceinlösungen in verschiedenen herkömmlichen Mikrotiterplattenguellen gemessen werden (Datensätze 1, 2, 3, 4, 6 und 7) mit dem erfindungsgemässen Kapillararray (Datensatz 5) in einer Ausführungsform, die derjenigen aus Fig. 2c(iv) ähnelt. Alle Mikrotiterplatten hatten Quellen mit opaken schwarzen Wänden und klarer Basis, mit Ausnahme der 864-Platte, die klare Wände und eine klare Basis aufwies.

Die aufgeführten Datensätze repräsentieren den Durchschnitt von 10 Auslesedurchläufen aus den folgenden

herkömmlichen Mikrotiterplattenquellen oder Kapillararrayformaten, zusammen mit dem gemessenen Probenvolumen:

1: 384-Quellen (16 &khgr; 24) Mikrotiterplatte, Probenvolumen 1 &mgr;&idiagr;,

2: 864-Quellen (24 &khgr; 36) Mikrotiterplatte, Probenvolumen

1 &mgr;&idiagr;,

3: 1.536-Quellen (32 &khgr; 48) Mikrotiterplatte,

Probenvolumen 1 &mgr;&idiagr;,
4: 864-Quelle (24 &khgr; 36) Mikrotiterplatte, Probenvolumen

5 &mgr;&idiagr;,
5: erfindungsgemässes 384-Kapillar (16 &khgr; 24)-Array, Probenvolumen 1 &mgr;&idiagr; (Kapillarabmessungen: 1,0 m Aussendurchmesser, 0,1 mm Innendurchmesser, Länge

10 mm),
6: 96-Quellen (8 &khgr; 10) Mikrotiterplatte, Probenvolumen

2 00 &mgr;&idiagr;,

7: 384-Quellen (16 &khgr; 24) Mikrotiterplatte, Probenvolumen 50 &mgr;&idiagr;.

Fig. 3a zeigt, dass in bezug auf das Gesamtsignal, das aus der Apparatur in einem 384-Array mit einem Probenvolumen von 1 &mgr;&idiagr; aufgefangen wurde (Datensatz 5), die Erfindung vergleichbar war mit demjenigen, das erhalten wurde mit einer herkömmlichen 96-Quellen-Mikrotiterplatte mit einem Probenvolumen von 200 &mgr;&idiagr; (Datensatz 7) oder demjenigen, das erhalten wurde mit einer herkömmlichen 384-Mikrotiterplatte mit einem Probenvolumen von 50 &mgr;&idiagr; (Datensatz 6). Alle drei Datensätze (5, 6 und 7) zeigten Fluoreszenzsignale, die mindestens zweimal, in vielen Fällen viermal, grosser waren als 1- oder 5 &mgr;&Igr;-Aliquots in 864- oder 1.536-Mikroplatten (Datensätze 1, 2, 3 und 4).

Fig. 3b zeigt, dass die Fluoresceinkonzentrationen, bei denen noch ein signifikantes Signal gegenüber dem Hintergrund nachgewiesen werden kann (absolute Empfindlichkeit) bei der Vorrichtung mit einem 384-Array und einem Probenvolumen von 1 &mgr;&idiagr; (Datensatz 5) bis hinunter zu 0,01 ng/ml liegen. Eine vergleichbare Empfindlichkeit wurde auch mit einer herkömmlichen 96-Quellen-Mikrotiterplatte mit einem Probenvolumen von 200 &mgr;&idiagr; (Datensatz 7) und mit einer herkömmlichen 384-Mikrotiterplatte mit einem Probenvolumen von 50 &mgr;&idiagr; (Datensatz 6) beobachtet. Alle drei Datensätze (5, 6 und 7) wiesen eine um mindestens eine (Datensatz 4) oder zwei (Datensätze 1, 2 und 3) Grössenordnungen höhere Empfindlichkeit auf als 1- oder 5 &mgr;&Igr;-Aliquots in 864- oder 1.536-Mikroplatten (Datensätze 1, 2, 3 und 4).

Fig. 4 zeigt eine grafische Darstellung der Verdampfungsgeschwindigkeit von &Igr;.&mgr;&idiagr; Wasser aus einer Kapillare mit verschmolzenem Ende im Vergleich zu einer unverschlossenen 1.536-Platte. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz des Startgewichts angegeben und wurden durch wiederholtes Wiegen (auf 0,00001 g) von entweder 10 Kapillaren gemeinsam (die jeweils 1 &mgr;&idiagr; Wasser am Grund der Kapillare enthielten) oder eines Teils einer 1.536-Platte (der 10 separate Aliquots von 1 &mgr;&idiagr; Wasser pro Quelle enthielt) bestimmt. Die Verdunstung wurde bei Raumtemperatur verfolgt und es wurden keine Anstrengungen unternommen, die Kapillaren oder die Quellen abzudecken. Die Ergebnisse zeigen deutlich den Vorteil der Kapillaren bei der Verringerung der Verdampfung, wonach innerhalb von 5 Stunden weniger als 10 % des Wassers aus den Kapillaren verloren wurden, wohingegen die 1 &mgr;&idiagr; Wasser-Aliquots, die in den Quellen der 1.536-Platte gegeben wurden, innerhalb von 3 Stunden vollständig verdunstet waren.

• *

Fig. 5 zeigt die Fluoreszenzspur, die aus 3 benachbarten Kapillaren in einem 1.536 (32 &khgr; 48)-Array mit einem Kapillarabstand von 2,25 mm in einer erfindungsgemässen Ausführungsform, die derjenigen von Fig. 2c(iv) ähnelt, emittiert wurde.

Wie man sieht, ist das Ausmass an Kreuzkopplung in dem Raum zwischen den Kapillaren sehr gering. Die Kapillarabmessungen betrugen 1,0 mm Aussendurchmesser, 0,8 mm Innendurchmesser, Länge 10 mm. Das Kapillararray wurde mit einem Fluoreszenzraster-Abbildungsgerät abgebildet, und die Fluoreszenzintensität (RFU) wurde entlang der Mittellinie von drei benachbarten Kapillaren, die jeweils 1 &mgr;&idiagr; einer 100 ng/ml Fluoresceinlösung enthielten, integriert.

Fig. 6a und 6b zeigen einen Vergleich der Fluoreszenzbilder, die für einen Bereich von Fluoresceinverdünnungen erhalten wurden, wenn 1 &mgr;&idiagr; dieser Lösungen in einer herkömmlichen, dichtschwarzen Mikroplatte im Vergleich zu einem erfindungsgemässen Kapillararray in einer Ausführungsform, die derjenigen von Fig. 2c(iv) ähnelt, gemessen wurden. Sowohl die Mikroplatte als auch das Kapillararray wiesen eine 1.536-Dichte mit 2,25 mm Abstand zwischen den Quellen auf. Die Fluoresceinkonzentration der Verdünnungen betrug 1: 1.000 nM, 2: 333,3 nM, 3: 111,1 nM, 4: 37,0 nM, 5: 12,3 nM, 6: 4,1 nM, 7: 1,37 nM und 8: nur Puffer. Jede Verdünnungsreihe war vierfach vorhanden, wobei Verdünnung 1 im Bild oben erscheint und die Reihe bis zur Verdünnung 8 am Boden des Abbildes durchläuft. In Fig. 6a wurden die Bilder der Mikroplatte und des Kapillararrays unter Verwendung eines Mikroplatten-Abbildungssystems unter identischen Bedingungen erhalten (10 Sekunden Belichtung, 4-fache Verstärkung, 2 &khgr; 2-Binning mit Anregung bei 485 nm

.·· &diams;·&diams;&diams;

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und Emission bei 535 nm). Epifluoreszenzbilder wurden erhalten durch Fokussierung des Abbildungsgeräts auf die obere Mikroplattenoberflache oder das verschmolzene Ende der Kapillaren. Fig. 6b zeigt ein Histogramm der Intensität des Fluoreszenzsignals (OD-Niveaus &khgr; 1.000) entlang der Verdünnungsreihe der schwarzen Mikrotiterplatte oder des Kapillararrays.

Aus den Fig. 6a und 6b ist ersichtlich, dass die herkömmliche schwarze Mikrotiterplatte ein erhebliches Untergrundsignal in der Abbildung zeigt, das hauptsächlich auf Fluoreszenzreflexionen von der Oberfläche der Mikroplatte zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu wird, wenn das Kapillararray in der Brennfläche der Kapillarkolben, die über den Trägerblock hinausragen, abgebildet wird, der Untergrund auf nahezu Null verringert. Im Ergebnis ist das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (Kontrast) des Kapillararrays im Vergleich zur herkömmlichen Mikrotiterplatte signifikant erhöht und es ist möglich, geringere Fluoresceinverdünnungen zu unterscheiden.

Claims

1. Vorrichtung zur Durchführung photometrischer Tests, die folgendes umfasst:

1. ein Gehäuse;

2. eine Mehrzahl lichtdurchlässiger Kapillaren, die jeweils an einem Ende verschlossen sind;

3. Mittel zur Bereitstellung der photonischen Isolierung jeder Kapillare von einer benachbarten Kapillare; und

4. optische Instrumentierung und Schaltkreise zum Auslesen einer photonischen Antwort oder eines photonischen Ereignisses in jeder Kapillare.

2. Vorrichtung gemäss Anspruch 1, worin die Mehrzahl an lichtdurchlässigen Kapillaren in regelmässiger Ausrichtung angeordnet sind.

3. Vorrichtung gemäss Anspruch 2, worin die Kapillaren in Arrays angeordnet sind.

4. Vorrichtung gemäss Anspruch 3, worin die Kapillaren in Arrays von 8 × 12, 16 × 24 oder 32 × 48 angeordnet sind.

5. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Kapillaren in einem Trägerblock gehalten werden, der mit Löchern versehen ist, wobei jedes Loch zur Aufnahme einer einzelnen Kapillare in der Lage ist.

6. Vorrichtung gemäss Anspruch 5, worin der Trägerblock aus einem lichtundurchlässigen Material hergestellt ist.

7. Vorrichtung gemäss Anspruch 6, worin das lichtundurchlässige Material ein schwarzes Kunststoffmaterial ist.

8. Vorrichtung gemäss Anspruch 5, worin der Trägerblock aus einem Material hergestellt ist, das eine niedrige intrinsische Fluoreszenz aufweist.

9. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 5 bis 8, worin der Teil der Kapillare, der eine flüssige Probe enthält oder dazu vorgesehen ist, innerhalb des Trägerblocks gehalten wird.

10. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 5 bis 8, worin der Teil der Kapillare, der eine flüssige Probe enthält oder dazu vorgesehen ist, nicht innerhalb des Trägerblocks gehalten wird, sondern durch einen Luftraum umgeben ist.

11. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, worin jede Kapillare mit einem Wulstende versehen ist.

12. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, worin der Trägerblock mit einer Flüssigkeitszuführvorrichtung versehen ist, die daran angepasst ist, Flüssigkeit in jede Kapillare einzutrichtern.

13. Vorrichtung gemäss Anspruch 12, worin die Eintrichterungsanordnung in der Flüssigkeitszuführvorrichtung einen geformten Konus umfasst.

14. Vorrichtung gemäss Anspruch 1, worin die Kapillaren dicht gepackt sind.

15. Vorrichtung gemäss Anspruch 10 oder 12, worin jede Kapillare mit einem lichtundurchlässigen Material beschichtet ist.

16. Vorrichtung gemäss Anspruch 15, worin das lichtundurchlässige Material ein schwarzes Kunststoffmaterial ist.

17. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, worin die Kapillare aus Glas oder Quarz hergestellt ist.

18. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17, worin die optische Antwort oder das optische Ereignis in jeder Kapillare an deren verschlossenem Ende ausgelesen wird.

19. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18, worin das Ende jeder Kapillare unter Ausbildung eines verschmolzenen Kolbens verschlossen ist.

20. Vorrichtung gemäss Anspruch 19, worin der Kolben einen Linseneffekt zeigt, der in der Lage ist, durch die Kapillarwand transmittiertes Licht zu konzentrieren und zu fokussieren.

21. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 20, worin die Kapillaren beschichtet oder oberflächenbehandelt sind.

22. Vorrichtung gemäss Anspruch 21, worin die Oberflächenbehandlung die Anwendung einer Gewebekulturbehandlung auf der Innenoberfläche zur Erhöhung der Adhäsion umfasst.

23. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22, worin die optische Instrumentierung und Schaltkreise daran angepasst sind, die Absorbanz einer in einer Kapillare erhaltenen Flüssigkeit zu messen.

24. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22, worin die optische Instrumentierung und Schaltkreise daran angepasst sind, die Lumineszenz einer in einer Kapillare erhaltenen Flüssigkeit zu messen.

25. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22, worin die optische Instrumentierung und Schaltkreise daran angepasst sind, eine in einer Kapillare enthaltende Flüssigkeit mit Licht anzuregen und das durch Fluoreszenz emittierte Licht zu messen.

26. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22, worin die optische Instrumentierung und Schaltkreise daran angepasst sind, eine in einer Kapillare enthaltene Flüssigkeit mit Licht anzuregen und das durch Phosphoreszenz emittierte Licht zu messen.

27. Vorrichtung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 22, worin die optische Instrumentierung und Schaltkreise daran angepasst sind, eine in einer Kapillare enthaltene Flüssigkeit mit Licht anzuregen und das gestreute Licht direkt oder indirekt zu messen.

28. Kapillarenarray, das folgendes umfasst:

1. eine Mehrzahl lichtdurchlässiger Kapillaren, die jeweils an einem Ende verschlossen sind; und

2. Mittel zur Bereitstellung der photonischen Isolierung jeder Kapillare von einer benachbarten Kapillare.

29. Kapillarenarray gemäss Anspruch 28, worin die Kapillaren in einem Trägerblock gehalten werden, der mit Löchern versehen ist, idealerweise in regelmässiger Anordnung, wobei jedes Loch in der Lage ist, eine einzelne Kapillare aufzunehmen und zu halten.

30. Kapillarenarray gemäss Anspruch 28, worin die Kapillaren dicht gepackt sind und in einem Gehäuse gehalten werden.