JP2012055321A - 微小流体サンプルを処理するための一体化システム及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】微小流体用デバイスは、複数のPCR反応室と、これらPCR反応室との間で流体が移動可能な複数の入口(202等)並びに複数の出口(236等)と、入口及び出口とPCR反応室とを遮断するための微小流体用の複数のバルブ(206等)とを備えている。これらバルブによる遮断によって、PCR反応室から及びこれらPCR反応室への液体の移動を阻止することができる。複数のPCR反応室、複数の入口、複数の出口、複数のバルブは、1つの基板上に構成されている。
【選択図】図10
Description
これより、システム、微小流体カートリッジ、キット、方法、及びコンピュータ・プログラム生産物について更に説明する。
ここに記載する分析を実行するシステム981の模式的な全体像を図1に示す。図1に示すシステム981の構成要素の幾何学的配置は、一例であり、限定することは意図していない。マイクロプロセッサのようなプロセッサ980は、図示のようなシステムの種々の構成要素の機能を制御するように構成されており、これによってこのような構成要素の各々と通信する。即ち、プロセッサ980は、分析すべきサンプルに関するデータを、例えば、サンプル・リーダ990からうけとるように構成されている。サンプル・リーダ990は、バーコード・リーダ、光学式キャラクタ・リーダ、又はRFIDスキャナ(無線周波数タグ・リーダ)とすればよい。例えば、サンプル識別器は、ハンドヘルド・バーコード・リーダとすることができる。プロセッサ980は、ユーザ命令や動作条件の選択を入力984から受け入れるように構成されており、このような命令は、サンプルの分析を開始する命令を含むことができる。また、プロセッサ980は、ディスプレイ982と通信するように構成されているので、例えば、分析の結果をディスプレイに送信する。加えて、プロセッサ980は、ディスプレイ982上に表示すべき1つ以上の質問を送信し、ユーザがそれに応答して入力を与えるように促すことができる。つまり、ある種の実施形態では、入力984及びディスプレイ982は、互いに一体化されている。任意に、プロセッサ986は更に分析の結果を、プリンタ、視覚ディスプレイ、又はスピーカ、あるいはその組み合わせのような出力デバイスに送信するように構成されている。任意に、プロセッサ980は更にネットワーク・インターフェースのような通信インターフェースを通じて、コンピュータ・ネットワーク988に接続されている。通信インターフェースは、シリアル接続、パラレル接続、ワイヤレス・ネットワーク接続、及び有線ネットワーク接続から成る一群から選択した1つ以上のインターフェースとすることができる。これによって、システムが相応しくネットワーク上でアドレスされているとき、遠隔ユーザはプロセッサにアクセスし、命令を送信し、データを入力し、データを読み出し、プロセッサと関連のあるメモリ(図示せず)、又はプロセッサと通信するその他の何らかのコンピュータ読み取り可能媒体に格納することができる。
加えて、種々の実施形態では、本装置は、更に、プロセッサ、入力デバイス、及び通信インターフェースの1つ以上からデータを受け取るように構成されているデータ記憶媒体も備えることができ、データ記憶媒体は、ハード・ディスク・ドライブ、光ディスク・ドライブ、フラッシュ・カード、及びDC−Romから成る一群から選択した1つ以上の媒体である。
図2A〜図2Eは、本明細書中で更に説明するシステム例の種々の構成の外部斜視図を示す。図2Aは、微小流体カートリッジ(図示せず)を収容し、カートリッジに導入されたサンプルに種々の処理動作を行わせ、それらの動作を制御するシステム2000の斜視図を示す。システム2000のエレメントは、明示的に示すものに限定されるのではない。例えば、図示しないが、システム2000は、この中で更に説明するように、ハンドヘルド・バーコード・リーダに接続することもできる。
ヒータ・モジュール2020は、好ましくは取り外し可能であり、以下で更に説明する。
着脱式ヒータ・モジュール2020の一例を図7に示す。このモジュールは、局在化した熱を、受容ベイ2014の中に収容されているカートリッジの種々の選択領域に伝達するように構成されている。図7に示すのは、凹陥面2044を有するヒータ・モジュールであり、これが、受容ベイ2014の中にあるときカートリッジを支持するプラットフォームを設ける。一実施形態では、カートリッジは直接表面2044上に載る。表面2044は、図7では、凹陥して示されているが、そうである必要はない。
各ヒータは、ここに記載する装置と共に用いるプロセッサ及び/又は制御回路によって独立して制御することができる。図8Cは、図8A及び図8Bにおけるように構成したヒータによって加熱した場合の、微小流体カートリッジの上面からの熱像を示す。このとき、各ヒータを次のように順番に活性化した。図8Cにおいて、(1)は長い上側のみ、(2)は長い下側のみ、(3)は短い左側のみ、(4)は短い右側のみ、及び(5)は4つのヒータ全てがオン下状態を示している。パネル(6)は、図8Cにおけるその他の画像パネルと同じメモリで、反応ゾーン及びヒータの図を示す。また、図8Cには、温度軸も示されている。
図9は、本明細書に記載するシステムと共に用いる微小流体カートリッジ2060の一例の外見の斜視図を示す。カートリッジ2060の中には、少なくとも1つの試薬パッケージ2062が含まれている。このような試薬カートリッジが4つ示されているが、限定ではなく、1、2、3、5、6、8、10、及び12個というような、その他の数のこのようなパッケージも、用途に応じて可能である。更に、カートリッジ2060は、試薬を収容し、ルアーのような入口2066にはめ込まれるタワー2064を備えている。入口2066を通じて、生物サンプルの一部を導入することができる。また、タワー2064は、バルク・溶解室2065及び廃棄物室2067のような、1つ以上の室も備えることができる。廃棄物室2067は、空気のような気体を放出するためのベント2069を有するとよい。
更に、カートリッジ2060は、ポート2068を備えており、これを通じて検出器が、処理又は増幅中に、信号を直接又は間接的にサンプル内の1つ以上のポリヌクレオチドから受け取り、ユーザにサンプルに対する診断結果を供給することができる。
更に、カートリッジ2060は、受信ベイにおける対応する位置合わせ部材に対して相補的な、機械的キーのような、位置合わせ部材も備えることができる。図9には、位置合わせ部材2071の一例として、カートリッジからの角切欠が示されている。
したがって、本技術は、以下のような属性を有する微小流体カートリッジも備えている。つまり、本技術は、1つ以上のポリヌクレオチドを処理し、例えば、ポリヌクレオチドを終結させる及び/又はポリヌクレオチドの検出及び/又は増幅を妨げる虞れがあるインヒビタ複合体(例えば、ヘモグロビン、ペプチド、糞便複合体、フミン酸、粘性複合体、DNA結合蛋白質、サッカリド)からポリヌクレオチドを分離するように構成されている微小流体カートリッジを含む。
実施形態の中には、本装置が、表面と接触する水溶液を少なくとも約65℃まで加熱するように構成されている熱源を含む場合もある。
実施形態の中には、カートリッジが少なくとも約10(例えば、約10.5以上)のpHを有する液体のリザーバを含む場合もある。カートリッジは、表面を液体と接触させるように構成することができる(例えば、圧力源を作動させて液体を移動させることによって)。
保持部材を第2液体と接触させる際、熱作動式圧力源を作動させて、圧力を台2液体に加えることを含むことができる。保持部材を第2液体と接触させる際、熱作動式弁を開放して、第2液体を保持部材と連通させることを含むことができる。
第2液体は、約50マイクロリットル未満の体積を有し、洗剤(例えば、SDS)を含んでいる。
表面は、ポリリシン(例えば、ポリ−L−リシン及び/又はポリ−D−リシン)又はPEIを含むとよい。
ある種の実施形態では、約10分未満(例えば、約7.5分未満、約5分未満、又は約3分未満)でポリヌクレオチドを保持部材に結合し、放出し、回収することができる。
ポリヌクレオチド及びインヒビタを分離するには、一般に、ポリヌクレオチド、インヒビタ、処理領域、及び/又は保持部材を沈殿(例えば、遠心分離)させることを除外する。
種々の実施形態では、PCR試薬混合物は、更に、陽性制御プラスミド(positive control plasmid)及びプラスミドの少なくとも一部のために選択した蛍光原混成プローブを含むことができる。
tosoma)、例えば、S.ジャポニクム(S. japonicum)、S.マンソニ(S. mansoni)、
S.メコンジ(S. mekongi)、S.インターカラツム(S.intercalatum)、S.ヘモトビウム(S. haematobium);パラゴニムス(Paragonimus)、例えば、P.ウェスターマニ(P.Westermani)、P.スキリアビニ(P. Skriabini);クロノーチス・シネンシス(Clonorchis sinensis);ファシオラ・ヘパティカ(Fasciola hepatica);オピストホーチスsp(Opisthorchis sp);ファシオロプシス・バスキ(Fasciolopsis buski);ディフィロボツリウム・ラツム(Diphyllobothrium latum);テニア(Taenia)、例えば、T.サジナタ(T. saginata)、T.ソリウム(T. solium);エキノコッカス(Echinococcus)、例えば、
E.グラヌロスス(E. granulosus)、E.ムルチロクラリス(E. multilocularis);ピコマヴィルセス(Picomaviruses)、リノヴィルーセス・エコヴィルセス(rhinoviruses echoviruses)、コックサキエヴィルセス(coxsackievhuses)、インフルエンザ・ヴィルス(influenza virus);パラミクソヴィルセス(paramyxoviruses)、例えば、タイプ1、
2、3、及び4;アドノヴィムセス(adnovimses);ヘルペスヴィルセス(Herpesviruses)、例えば、HSV−1及びHSV−2;ヴァリセラ−ゾスタ・ヴィルス(varicella-zoster virus);ヒトT−リンファトロフィック・ヴィルス(human T-lymphotrophic virus)(タイプI及びタイプII);アーボヴァイラシス(Arboviruses)及びアレナヴィルセス(Arenaviruses);トガヴィリダエ(Togaviridae)、フラヴィヴィリダエ(Flaviridae)、ブニアヴィリダエ(Bunyaviridae)、レオヴィリダエ(Reoviridae);フラヴィヴィルス(Flavivirus);ハンタヴィルス(Hantavirus);ウィルス性脳炎(Viral encephalitis)(アルファヴィルセス(alphaviruses)、例えば、ヴェネズレラン・エクイン・エンセファリティス(Venezuelan equine encephalitis)、イースタン・エクイン・エンセファリティス(eastern equine encephalitis)、ウェスタン・エクイン・エンセファリティス(western equine encephalitis);ウィルス性出血熱(Viral hemorrhagic fevers )(フィロヴィルセス(filoviruses)、例えば、エボラ(Eboia)、マーバーグ(Marburg)、及びアレナヴィルセス(arenaviruses)、例えば、ラッサ(Lassa)、マチュポ(Machupo);天然痘(ヴィリオラ(variola));レトロウィルス(retroviruses)、例えば、ヒト免疫不全ウィルス1及び2;ヒト乳頭腫ウィルス(HPV)タイプ6、11、16、18、31、33、及び35から成る一群から選択した有機体の特徴を示すことができるポリヌクレオチド・シーケンスのために選択的とすることができる。
実施形態によっては、凍結乾燥粒子が、PCRを実行するために試薬(例えば、プライマ、制御プラスミド、ポリメラーゼ酵素)を含む場合もある。
リザーバは、当該リザーバ内部の容積を減少させるように操作(例えば、押圧又は押下)することができる壁を含むことができる。例えば、リザーバは、液体を放出するためにリザーバの別の部分(例えば、壁の一部)を裂く穿孔部材(例えば、針状又はそれ以外の、先が尖った又は尖鋭な部材)を含むことができる。穿孔部材は、リザーバの内部にあり、穿孔部材がリザーバの内面(例えば、壁)から外に向かって壁を裂くようにすることができる。
リザーバの可撓壁は、化学薬品の侵出を制限又は防止することができる。リザーバは、微小流体カートリッジとは独立して組み立て、次いで微小流体カートリッジに固着することができる。
ポリヌクレオチドを処理するための微小流体カートリッジの例
微小流体カートリッジ200は、所望通りに製作することができる。通例、層205、207、及び209は、ポリマ材で形成することができる。ネットワーク201の構成要素は、通例、層207、209を成型する(例えば、射出成型する)ことによって形成することができる。層205は、通例、ネットワーク201の構成要素を封止するために層207に固着する(例えば、接着及び/又は熱着)ことができる可撓性ポリマ材(例えば、積層体)とすることができる。層207及び209は、接着剤を用いて互いに接着することができる。本願に適したカートリッジ製作の別の方法が、2006年11月14日に出願した米国仮特許出願第60/859,284号において見出すことができる。その内容全体が、ここで引用したことにより、本願にも含まれるものとする。
ネットワーク201の構成要素の配列例は、米国特許出願公開第2006/0166233号に更に記載されているように、次の通りである。この出願の内容は、ここで引用したことにより、本願にも含まれるものとする。
微小流体ネットワーク201の個々の構成要素について、以下のように更に説明する。
図11も参照すると、処理室220は、第1条件集合(例えば、第1温度及び/又は第1pH)の下ではサンプルのポリヌクレオチドを保持し、第2条件集合(例えば、第2の高い温度、及び/又は第2のアルカリ側のpH)の下ではポリヌクレオチドを放出するように構成されている複数の粒子(例えば、ビーズ、微小球体)218を含む。通例、サンプル内に存在するかもしれないインヒビタと比較して、ポリヌクレオチドを優先的に保持することができる。粒子218は、保持部材216(例えば、カラム)として構成することができ、処理領域220の入口265及び出口267間で移動する場合、サンプル材料(例えば、ポリヌクレオチド)はここを通過しなければならない。
フィルタ219は、通例、粒子218の直径よりも直径が小さい孔を有する。実施形態の一例では、フィルタ219の孔は、平均約8ミクロンの幅を有し、粒子218の平均直径は約10ミクロンである。
実施形態によっては、粒子の少なくとも一部(例えば、全部)が固体であることができる。実施形態によっては、粒子の少なくとも一部(例えば全部)が多孔性であることができる(例えば、粒子は、その内部に少なくとも部分的に達するチャネルを有することができる)。
チャネル
微小流体ネットワーク201のチャネルは、通例、少なくとも1つのミリメートル未満の断面寸法を有する。例えば、ネットワーク201のチャネルの幅及び/又は深さは、約1mm以下(例えば、750ミクロン以下、約500ミクロン以下、約250ミクロン以下)とすることができる。
弁
アクチュエータは、ネットワーク、例えば、ネットワーク201における1つの場所と他の場所との間で材料(例えば、サンプル材料及び/又は試薬材料)を移動させることができる気体圧力を供給する構成要素とすることができる。例えば、図13を参照すると、アクチュエータ244は、内部に熱膨張材料(TEM)の質量体273を有する室272を含む。加熱すると、TEMが膨張して、室272内部の自由容積が減少し、室272内部の質量体273を包囲する気体(例えば、空気)を加圧する。通例、ネットワーク201におけるゲート246及び242のようなゲートを、アクチュエータ244によって作動させることができる。その結果、加圧気体が流体リザーバ279内にある液体を合流部255に向けて送り出す。実施形態によっては、アクチュエータ244が約3psi(例えば、少なくとも約4psi、少なくとも約5psi)の圧力差を、アクチュエータと合流部255との間に発生することができる。
疎水ベント(例えば、ベント212)は、気体がチャネルから出ていくことを可能にしつつ、液体がチャネルから出ていくのを制限する(例えば、防止する)構造とすることができる。通例、疎水ベントは、チャネルの壁を定める多孔性疎水材(例えば、Osmonicsからの多孔性疎水メンブレーンのような、多孔性フィルタ)の層を含む。以下で説明するが、疎水ベントは、サンプルの微小液滴をネットワーク201内部の所望の場所に位置付けるために用いることができる。
溶解室を有する微小流体カートリッジの例
空気ベント
空気ベントAViは、ネットワーク304内部における液体の移動によって変位した気体(例えば、空気)を発散させて、圧力の蓄積が液体の所望の移動を妨げないようにすることができる。例えば、空気ベントAV2は、ベントAV2を通過する液体の下流において気体を発散させることによって、液体をチャネルC14に沿ってチャネルC16の中まで移動させる。
弁
アクチュエータ
廃棄物室Wiは、ネットワーク304内部における液体の操作(例えば、移動及び/又は混合)の結果生ずる無駄な(例えば、溢れた)液体を収容することができる。通例、各廃棄物室Wiには、空気ベントが付随しており、液体によって変位され室に入った気体を発散させる。
処理領域
実施形態によっては、1つ以上のポリヌクレオチドの存在を判定するために化合物は、1つ以上の凍結乾燥粒子(例えば、ペレット)として、B2のような処理領域内に蓄積することができる。粒子は、一般に、室温(例えば、約20℃)で少なくとも約6カ月(例えば、少なくとも約12カ月)の保管寿命を有する。第2処理領域B2に入った液体は、凍結乾燥化合物を溶解(例えば、復元)する。
図14に見られるように、試薬リザーバRiは、使用する準備ができるまで、ネットワーク304から分離した液体試薬(例えば、水、緩衝溶液、水酸化溶液)を保持するように構成することができる。リザーバR1は、液体を保持するための封止空間330を規定するエンクロージャ329を含む。各空間330は、エンクロージャ329の下壁によって、試薬ポートRPi及びネットワーク304から分離することができる。キャッピング材341(例えば、積層体、接着剤、又はポリマ層)でエンクロージャの上壁を覆ってもよい。
図20Cを参照すると、穿孔部材342を最大限作動させた場合が示されている。穿孔部材の一部が、液体の対応する体積を封止空間から変位させ、所定の体積の液体を微小流体カートリッジに導入する。
更に別の例として、図24A及び図24Bは、穿孔部材364を含むリザーバを示す。穿孔部材364は、初期状態ではリザーバの上壁366の内部365に固着することができるが、リザーバの作動時に実質的に上壁から分離する(例えば、完全に分離する)。
図14A及び図14Bに示したような溶解室302の一例は、タワー型の外形で示されており、微小流体カートリッジ300の面から突出している。溶解室302は、主要溶解室306と廃棄物室308とに分割することができる。一実施形態では、主要溶解室及び廃棄物室306、308は、互いに分離されているので、材料はこれらの室の一方から他方の室に通り抜け、ネットワーク304の少なくとも一部を通過することはできない。主要溶解室306は、サンプルを室306に導入するサンプル入力ポートSP1、室306をネットワーク304に接続するサンプル出力ポートSP2、及びここに記載するように室306内部でサンプル材料と相互作用する凍結乾燥試薬LPを含む。ポートSP2は、図14Aでは、室302の底面にあるように示されている。図15Bは、微小流体ネットワーク304の残りに対するSP2の位置を示す。入力ポートSP1は、材料(例えば、サンプル材料及び気体)を室306に進入させるが材料がポートSP1を通って室308から出ることは制限する(例えば、防止する)一方向弁を含む。通例、ポートSP1は、気密封止を形成するためにサンプル入力デバイス(例えば、シリンジ)と嵌合するように構成されている取付具(例えば、ルアー取付具(Luer fitting))を含む。主要室306は、通例、約5ミリリットル以下(例えば、約4ミリリットル以下)の容積を有する。使用前に、主要室306は、通例、気体(例えば、空気)で充填することができる。
溶解室302の乾燥凍結試薬粒子LPは、細胞からポリヌクレオチドを放出する(例えば、細胞を溶解することによって)ように構成されている1つ以上の化合物(例えば、試薬)を含む。例えば、粒子LPは、蛋白質(例えば、プロテイナーゼ、プロテーゼ(例えば、プロナーゼ)、トリプシン、プロテイナーゼK、ファージ・リティック酵素(例えば、PlyGBS)、リゾジーム(例えば、ReadyLyseのような改質リゾジーム)、細胞特定酵素(例えば、グループBストリプトコッチを溶解するためのミュタノリシン(mutanolysin))を減少させる(例えば、変性させる)ように構成されている1つ以上の酵素を含むことができる。
通例、粒子LPの平均体積は、約35マイクロリットル以下(例えば、約27.5マイクロリットル以下、約25マイクロリットル以下、約20マイクロリットル以下)である。実施形態によっては、粒子LPの平均直径が、約8mm以下(例えば、約5mm以下、約4mm以下)である場合もある。実施形態の一例では、凍結乾燥粒子はの平均体積は約20マイクロリットルであり、平均直径は約3.5mmである。
使用中、カートリッジ300の種々の構成要素は、次のように動作することができる。ネットワーク304の弁Vi及び弁Vi’は、開放状態に構成することができる。ネットワーク304のゲートGi及び混合ゲートMGiは、閉鎖状態に構成することができる。試薬ポートR1〜R4は、例えば、機械的な力を加えることによって押下して、先に説明したように、液体試薬をネットワーク304に導入することができる。サンプルは、ポートSP1を通じて溶解室302に導入し、主要溶解室306内において凍結乾燥粒子LPと合体することができる。通例、サンプルは、粒子(例えば、細胞)と緩衝溶液との組み合わせを含む。例えば、サンプルの一例は、約2部全血液(2 parts whole blood)から3約部緩衝溶液(3 about parts buffer solution)(例えば、pH8.0の20mMトリス、1mMのEDTA、及び1%SDSの溶液)を含む。別のサンプル例は、グループBストレプトコッチ及び緩衝溶液(例えば、pH8.0の20mMのトリス、1mMのEDTA、及び1%トリトン(Triton)X−100の溶液)を含む。
以下の実施例は、例示であり、限定することは意図していない。
実施例1:ポリヌクレオチド処理装置
この非限定的な実施例では、図28から図40に示すように、装置、システム、微小流体カートリッジ、キット、方法、及びコンピュータ・プログラム生産物の種々の実施形態例について説明する。
この非限定的な実施例では、装置、システム、微小流体カートリッジ、キット、方法、及びコンピュータ・プログラム生産物の種々の実施形態例、特に、方法及びコンピュータ・プログラム生産物の態様例に関する、実施例1に記載した装置800を用いる種々の態様について説明する。
この非限定的な実施例では、特許請求する装置、システム、微小流体カートリッジ、キット、方法、及びコンピュータ・プログラム生産物の種々の実施形態例について説明する。一実施形態では、図28に示す装置800は、病原菌(例えば、出産前の女性におけるグループBストレプトコッカス(GBS))の迅速かつ正確な診断のための微小流体技術に基づく自己充足型、リアル・タイムPCRデバイスとすることができる。実施形態の一例では、微小流体カートリッジ812(図31)を設置することができる場合、装置800はカートリッジ上の動作を作動させること、PCR増幅の生成物を検出及び分析すること、及び/又は結果をグラフィカル・ユーザ・インターフェースに表示することができる。微小流体カートリッジ812は、複数の室及び/又はサブユニットを含み、ユーザによる介入を抑えて又は介入なしに、種々のタスクを実行することができる。図42は、微小流体カートリッジ812の一例における種々の室及び/又はサブユニットの模式図である。微小流体カートリッジ812は、サンプル入口826を通じて未処理の臨床サンプル(例えば、GBSの場合輸送緩衝液(transport buffer)内に浸漬した膣/直腸スワブ)を受け入れることができる。サンプル入口826は、ルアー型注入ポートとするとよい。ヒト及びバクテリアの細胞及びごみを含有する臨床スワブ・サンプルは、定期的に2mlの輸送緩衝液の中に収集することができる。しかしながら、微小流体デバイス上では、小さい体積(例えば、数マイクロリットル程度)であると、容易に処理することができる。マクロ及びミクロ動作間にインターフェースを組み込むことにより、微小流体技術の臨床診断に適応させることが可能になる。サンプルを注入するとき、カートリッジを装置800内に配すればよく、更に別の動作、例えば、サンプルの準備、試薬の計測/混合、及びPCR増幅/検出は、自動的に手を使わずに行うことができる。
種々の実施形態において、微小流体システム(例えば、微小流体カートリッジ812)は、液体液滴を移動/混合するための微小ポンプ、熱始動生物化学反応を行うための微小リアクタ、及び液体圧送動作の制御を可能とし、更に熱サイクルの間PCR室のようなカートリッジの領域を分離するための微小弁又は微小ゲートというような構成要素を含むことができる。
高精度のリアル・タイムPCRに基づく病原体(例えば、出産前の女性におけるグループBストレプトコッカス(GBS)定着)の診断に用いることができる複数のステップを、図48に示すような、単体の微小流体技術に基づく使い捨てカートリッジに統合した。このようなカートリッジにおいて「サンプル入力;結果出力」型動作で実行することができるステップの例には、一括溶解(bulk lysis)、DNA捕獲、洗浄、及び放出、並びにPCR準備及び実行が含まれる。このカートリッジの種々の実施形態では、サンプル及び試薬は、微小流体カートリッジ812(図31に示すような)自体に収容することができ、通例、例えば、サンプルをデバイスに注入する行為の間を除いて、手作業での動作との相互作用は不要である。処理の間に形成され取り込まれた空気を除去するために、最大限の効果が得られるように位置付けた疎水ベントを含ませることができ、分析に通例用いられる試薬は、カートリッジ内に凍結乾燥ビーズとして収めることができる。復元に必要な液体は、使用時に放出(release)するブリスタ・パウチに貯蔵することができる。
P=Patm(Vchamber - Vsample)/(Vchamber+ Vsample + VextraAair)
この非限定的な例は、前述の装置、システム、微小流体カートリッジ、キット、方法、及びコンピュータ・プログラム生産物の種々の実施形態例のCAD図を示し、更に説明する。
図54は、微小流体カートリッジ1216、熱伝導性、機械的伸展性層1222、及び熱ステージ1224間の界面の至近図を示す。
図55は、アセンブリ1200の上面図を示す。機械的部材1214に加えて、案内部材1226も用いることができる。
図56は、図55の至近図を示す。
図60及び図61は、自己穿孔可能リザーバ1228と、自己穿孔可能リザーバを作動させる機械的部材1230とを含む微小流体カートリッジ1216の図を示す。
濃度が約1011mL−1のカルボキシル表面磁気ビーズ(改質セラ−マグ磁気カルボキシレート、部品番号#3008050250、Seradyn)を、pH6.1の500mMの2−(N−モルフォリニオ)−エタネスルフォン酸(MES:2-(N-Morpholinio)-ethanesulfonic acid)緩衝溶液において、N−ヒドロキシルサクシニミド(NHS:N-hydroxylsuccinimide)及び1−エチル−3−(3−ヂメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)を用いて30分活性化した。活性化したビーズを、3,000Da又は300,000Da平均分子重量のポリ−L−リシン(PLL)によって培養した。未結合PLLを除去するための2回の洗浄の後、ビーズは使用する準備ができた。
図64及び図65を参照すると、ポリヌクレオチドのインヒビタからの分離を実証するために微小流体カートリッジ300を製作した。カートリッジ300は、第1及び第2基板部302’、304’を備えており、これらは、それぞれ、第1及び第2層302a’、302b’及び304a’、304b’を備えている。第1及び第2層302a’、302b’は、入口310’及び出口312’を備えているチャネル306’を規定する。第1及び第2層304a’、304b’は、入口314’及び出口316’を備えているチャネル308’を規定する。接着剤324’を用いて、第1及び第2基板部302’、304’を填め合わせて、出口312’が入口314’と連通し、それらの間にフィルタ318’を位置付けるようにする。出口312’の一部に、先に準備した活性化ビーズを充填にて、保持部材(ビーズ)を備えた処理領域320’を設ける。接着剤326’によって固着したピペット322’(図66)によって、サンプルを導入し易くした。
約1000個のビーズを含む約1μLの容積を有する処理領域を備えている各デバイスを準備することによって、デバイス300’のポリ−L−リシン改質ビーズによるポリヌクレオチドの保持を実証した。約15,000及び30,000Daの間のポリ−L−リシンでビーズを改質した。各処理領域に、ニシン精子DNA(濃度が約20mg/mLのサンプル役20uL)で充填することによって、ビーズ及び液体を接触させた。10分間液体及びビーズが接触した後、液体を各処理領域から除去し、定量的リアル・タイムPCRを実行して、液体内にあるニシン精子DNAの量を判定した。
処理領域を有するデバイスに、3,000Daのポリ−L−リシン改質ビーズを充填した。グループBストレプトコッチ(GBS)から得たポリヌクレオチドを含む液体をビーズと接触させ、ニシン精子DNAについて上述したように、10分間培養した。この液体は、10μlの20mMトリスpH8、1mMのEDTA、1%トリトンX−100緩衝液において、10,000のGBSバクテリアを97℃の熱溶解に3分間かけることによって得た。
頬の裏層からの口腔細胞は、ヒトの遺伝子材料(DNA)源を提供し、単独ヌクレオチド多形性(SNP:single nucleotide polymorphism)検出に用いることができる。口腔細胞を含むサンプルに対して、熱溶解を行い、細胞内部からDNAを放出させた。デバイス300を用いて、前述のような随伴するインヒビタからDNAを分離した。図67の標本E2に対応する洗浄済みサンプルに対して、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。熱溶解から得られた対照(control)又は生サンプルも増幅した。
更なる処理のためのポリヌクレオチド・サンプルの準備には、多くの場合、サンプルに対してプロテーゼ処置を施すことがふくまれ、その場合、プロテーゼがサンプル内の蛋白質のペプチド結合を裂いてしまう。プロテーゼの一例に、生体内及び生体外プロテーゼの混合物である、プロナーゼがある。プロナーゼは、殆どのペプチド結合を裂いてしまう。ポリ−L−リシンのような、ある種の受容体は、プロナーゼ及びその他のプロテーゼによる破壊を受けやすい可能性がある。つまり、結合する受容体がプロテーゼの影響を受けやすい場合、サンプルは、一般に、保持部材が存在する状態でプロテーゼ処置を受けない。
この非限定的な実施例では、操作者の取扱書の形態で、特に、グループBストレプトコッカス(GBS)のような、微小有機体の定量的検出のための微小流体PCR分析を含む単体カートリッジ・システムを対象とする、特許請求する装置、微小流体カートリッジ、キット、方法、及びコンピュータ・プログラム生産物の種々の実施形態について説明する。GBS分析に関する更に詳しい説明は、実施例14において呈示する。
緩衝液及び防腐剤を含有するサンプル小瓶
患者自身が収集するための指示書が付属する収集スワブ
多数の(例えば、25個)フィルタ付きシリンジ
緩衝液を収容した小瓶
収集小瓶用患者IDラベル
3ccシリンジ
この中で更に説明する微小流体カートリッジ
例えば、脱水形態のGBSバクテリアの検出サンプルの限度を含有する陽性対照スワブ被検物
小瓶上に陽性識別がある緩衝液を含有する小瓶
小瓶上に陰性識別がある緩衝液を含有する小瓶
シリンジ
バーコード・リーダを備えたシステムに、例えば、115V又は220Vの電源コードを差し込む。双方については、ここで更に説明する。
追加の任意選択機器
USB接続を有するプリンタ
病院ネットワーク接続
この実施例における説明は、GBSの存在を調べるためのサンプル検査に適しており、その更に詳しい説明は、実施例14において提示する。
検査アプリケーションの説明
この中で更に説明するように、種々の病原体や微小有機体を検査するために、本装置及び材料を用いることができる。一例は、実施例14において更に説明するが、GBSを検査することである。検査は、実験室の手順にはさほど訓練されていない臨床家によって、患者の近くに設定して行うことができる。GBS検査のために継続して品質保証を行うためにシステムのユーザ・インターフェースにQCルーチンを組み込むことができる。また、検査を依頼した外科医が要求する時間枠以内にサンプル検査が行われるのであれば、検査は中央病院の「stat」実験室で行うこともできる。
GBSに特定的なその他の警告及び注意を実施例14に呈示する。
・実施形態によっては、患者を現在抗生物質で処置している場合、検査は病状の信頼できる指標とはならない場合がある。
・通例、使用期限が切れたカートリッジ/サンプル・キットの使用を避ける。
・通例、以前に開封したカートリッジの使用を避ける。空気及び水分に晒すと、試薬が劣化する可能性がある。サンプルを注入する準備ができる後まで、カートリッジを開封するのを回避する。
・通例、サンプルの準備には新しいシリンジ材料を用いる。
・通例、検査キットの中に用意されているスワブ及び緩衝液を用いる。実施形態によっては、他のブランドの収集スワブでは、検査性能を損なう場合もある。
・被検物を保管しなければならない場合、4℃で24時間までの期間の冷蔵が指示されるのが通例である。
・通例、本システム及び被検物の成分を取り扱う間、保護服及び使い捨て手袋を用いる。
・通例、無菌技法を用いる。検査被検物又は検査材料の汚染を回避するために、新しい使い捨て手袋を用いることは、特に重要となる可能性がある。
・通例、サンプルを高圧で注入することを避ける。緩やかな注入が好ましい。
・通例、潜在的な感染被検物に対する安全病院手順にしたがって、統一予防策を用いて被検物を取り扱う。
・通例、システムを洗浄するときには、推奨された洗浄剤を用いる。
・通例、溢流が起きた場合、いずれの洗浄薬品で検査カートリッジを洗浄することも回避する。必要であれば、液体を除去するためには乾燥した実験室用ティッシュを用いる。
注意:スワブのDacron(商標)端部に指で触るのを避ける。
容器からスワブを取り出す。
過剰な膣分泌物を拭い去る。
スワブを2cm膣(膣)に挿入する。
同じスワブを1cm肛門(直腸)に挿入する。
乾燥させて保管する場合、スワブを輸送用パッケージに入れる。
検査材料及び被検物を取り扱うときは、無菌技法を用いる。
サンプル緩衝液が期限切れでないことを確認する。
1ccの緩衝液を収容する小瓶の中にスワブを20回勢い良く浸す。
スワブを取り出して破棄する。
臨床標準手順で要求されている場合、患者ID及び収集時刻を小瓶に記す。
注意:使用する準備ができるまで、カートリッジのパッケージを開封するのを避ける。内蔵試薬は、光及び水分に感応する可能性がある。
・システム・レディ画面を示すとよい。
・スクリーン・セーバを停止させるために、画面に触る。
・ハンドルを上げ、システムの蓋を開いて、開始する。
・一旦蓋を完全に開いて、「開放」インディケータがある場合、これがオンになると、システムの自己検査を開始することができる。
・以前の検査から残留しているいずれかの使用済みカートリッジがないか、システムを調べる。
・ユーザID及びパスワードを用いて、ログインする。
・サンプル収集小瓶のバーコードを走査する。
・検査カートリッジを開く。カートリッジ・バーコードを走査する。
・材料が期限切れの場合、及び/又は被検物小瓶及び検査材料が相応に一致しない場合、システムはエラー・メッセージを出すとよい。
・患者情報により、サンプルIDを確認する。
・必要であれば、患者ID及びその他の病院識別情報を入力する。
サンプルをカートリッジに転送する命令の一例
・新品の1対の手袋を着用する。
・サンプル小瓶をカウンタ上に置く。
・先端をシリンジに取り付ける。サンプル全体をシリンジに引き込む。加えて、2ccの空気をシリンジに引き込む。
・先端を取り外し、フィルタを取り付ける。
・シリンジを用いて、1ccのサンプル及び追加の2ccの空気をカートリッジに注入する。
・注意:サンプルからの跳ね返りを回避するために、サンプルに注入する際には弱い圧力を用いる。
・検査実行指示の一例は、次の通りである。
・ペレットが溶解するまで、カートリッジを前後にゆっくりと揺する。
・カートリッジをシステム上に置く。
・システムのカバーを閉じる。
・(検査は自動的に開始することができる。)
・結果。
・検査が完了したとき、表示又は印刷のために結果を利用可能とするとよい。
・材料の廃棄。使用したカートリッジ及び収集キットは、生物学的有害物質として取り扱うことができる。
通例、国際規格に記載されているように、カートリッジは生物学的有害物質保護材の中に包装しなければならない。
10%漂白剤(0.5%次亜塩素酸ナトリウム)の溶液、続いて洗浄水濯ぎ洗いを用いて、消毒し、潜在的なDNA汚染を低減することができる。
DNA汚染は、通例、漂白剤又はDNA汚染を解消するのに適した材料で洗浄することによって、遂行することができる。Chemicon(商標)核酸リムーバも、通常の消毒剤での洗浄の後に用いることができる。
通例、アルコール又は通常の衛生布では、計器のDNA汚染は低減しない。
目的−カートリッジ及びサンプル・キット・ロットの評価、並びにシステム性能全体の検証。
推奨:カートリッジ又はサンプル・キットの新しいロットを受け取ったとき、品質管理を実施して、例えば、試薬セットが(1)外部対照(external control)及び(1)陰性外部対照を含むか否か確認することができる。
外部陽性対照は、被検物準備ステップの感度及び分析を監視し較正する役割を果たし、偽りの陰性結果の危険性を最小限に抑えるために用いることができる。検査が失敗した場合、そのカートリッジ群からの結果を無効にすればよく、供給業者に報告すべきである。
目的−サンプル取扱技法の評価を含むシステム性能全体の検証。検査は、ユーザが選択し予め設定した間隔で行うことができる。
推奨:検査を行うとき、(1)陽性外部対照及び(1)陰性外部対照を含むQCセットを実施し、QC検査で予期した結果が得られなかった場合、製造業者に連絡する。
・品質管理画面に移る。
・ユーザIDを入力する。
・画面上で指令される通りに、QC技法検証、新試薬ロット、規則的なQC実行サンプルを選択する。
本システムは、電源を投入するときに、システム起動検査を実行することができる。各患者検査サンプル又はQCサンプルの開始ルーチンとして、システムは、自己検査を実行して、例えば、電子回路、光学系、ヒータ及び温度センサが、意図したように機能しているか否か判断することができる。
分析に用いることができる試薬をカートリッジ上に含めれば、ユーザの取扱誤りや汚染の潜在的可能性を低減することができる。各微小流体カートリッジの中に、2種類のカートリッジ上陽性及び陰性対照方策(strategy)を組み込んで、個々のPCR分析性能を監視することができる。以下に2つの例を示す。
種々の実施形態では、検査は、臨床サンプルから復元したGBSのcfb遺伝子シーケンスの増幅、及び増幅したDNAの検出のための蛍光原ターゲット特定混成化に、リアル・タイム・ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることができる。cfb遺伝子は、CAMP係数、即ち、典型的にGBS隔離集団に存在する拡散可能な細胞外蛋白質をエンコードする。グループBストレプトコッカス(GBS)検出検査を一体化し、原料−サンプル−結果型の核酸増幅分析とすることができる。TaqMan蛍光原プローブを用いて、PCRアンプリコンを検出することもできる。分析に用いられる試薬は、カートリッジに含ませると、ユーザの取扱謝りや汚染の潜在的可能性を低減することができる。
実施形態によっては、膣及び/又は直腸被検物以外の被検物における、GBS DNAのようなターゲットを特定する適格性がない場合がある。尿及び血液の被検物は適していない場合がある。
実施形態によっては、抗生物質の処置を受けている患者は、この診断検査又はその他の診断検査では正しい診断を得ることができない場合がある。
実施形態によっては、微生物学者によるバクテリアの直接的な識別に適したGBS培養が、本検査から得られない場合もある。実施形態によっては、ペニシリン・アレルギのヒトに対する処置を推奨するために必要な罹患性結果が、本検査からは得られない場合がある。
実施形態によっては、尿及び膣分泌物が大量に存在すると、検査を妨害する可能性がある。
通例、サンプルの血液、胎便、羊水汚染のような汚染物が検査を妨害する可能性はない。
通例、抗生物質以外の薬剤の妨害(膣及び直腸分泌物に存在するような)は、この時点では、PCRを妨害することは知られていない。
図71のフロー・チャートは、結果を解釈するために計器における判断アルゴリズムが用いることができる判断基準集合の一例である。PCR反応(サンプル及び対照)は、問題のターゲットに対して、陽性又は陰性と解釈することができる。サンプルが決定的に陽性又は陰性か、あるいは不確定か判断するために、論理アルゴリズムを用いることができる。
以下の有機体から分離したゲノムDNAを用いて、リアル・タイムPCR(Taqman分析)によって、プライマ及びプローブの特定性を検査することができる。9つのGBSセロタイプ(セロタイプ1a、1b、1c、II、III、IV、V、VI及びVII、American Type Culture Collection and National Center for Streptococcus, Canada)、10個の臨床GBS隔離集団、60個の臨床サンプル、多種多様のグラム−陽性及びグラム−陰性バクテリア菌種、並びに2つのイースト菌種及びRSVタイプ1及び2。
病原体 タイプ
シュードモナ・アエルジノサ(Pseudomones aeruginosa) グラム−バクテリア
プロテウス・ミラビリス( Proteus mirabilis) グラム−バクテリア
キーブシエラ・オキシトカ(Kiebsiella oxytoca) グラム−バクテリア
キーブシエラ・ニューモニエ(Kiebsiella pneumoniae) グラム−バクテリア
エシェリチア・コット( Escherichia cot)(臨床的隔離集団1)グラム−バクテリア
エシェリチア・コリ( Escherichia coli)(臨床的隔離集団2) グラム−バクテリア
アシネトバクテル・バウマンド( Acinetobacter Baumannd) グラム−バクテリア
セラ・マルセセンス(Serra. marcescens) グラム−バクテリア
エンテンバクタ・アエルジェネス(Entembacter aerugenes) グラム+バクテリア
エンテロコッカス・マックリーン(Enterococcus Maclean) グラム−バクテリア
スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)(臨床的隔離集団1)
グラム−バクテリア
スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)(臨床的隔離集団2)
グラム−バクテリア
ストレプトコッカス・ピオジーンズ(Streptococcus pyogenes) グラム−バクテリア
ストレプトコッカス・ヴィリダンス(Streptococcus viridans) グラム−バクテリア
リステナ・モノシトジェネス(Listena monocytogenes) グラム−バクテリア
エンテロコッカスsps.(Enterococcus sps.) グラム−バクテリア
センディダ・グラブラタ(Cendida glabrata) イースト
カンディダ・アルビカンス(Candida albicans) イースト
ストレプトコッカス・グループC(Streptococcus Group C) グラム+バクテリア
ストレプトコッカス・グループ G(Streptococcus Group G) グラム+バクテリア
ストレプトコッカス・グループF(Streptococcus Group F) グラム+バクテリア
エンテロコッカス・フィーカリス(Enterococcus Feecalis) グラム+バクテリア
ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グラム+バクテリア
スタフィロコカス・エピダーニディス(C−)(Staphylococcus epiderrnidis (C-))
グラム+バクテリア
ガルデネレラ・ヴァジナリス(Gardenerella vaginalis) グラム+バクテリア
ミクロコカスsps.(Micrococcus sps.) グラム+バクテリア
ハエモフィルス・インフルエンザ゜(Haemophilus influenza゜) グラム−バクテリア
ネイセリア・ゴノルホエエ(Neisseria gonorrhoeae) グラム−バクテリア
モラクセラ・カタラリス(Moraxella catarrahlis) グラム−バクテリア
サルモネラsps.(Salmonella sps.) グラム−バクテリア
クラミサ・トレコマティス(Chlamytha trechomatis) グラム−バクテリア
ペプトストレプトコッカス生成物(Peptostreptococcus productus)
グラム+バクテリア
ペプトストレプトコッカス・アナエローベ(Peptostreptococcus anaerobe)
グラム+バクテリア
ラクトバシルス・レンネンタム (Lactobacillus lenmentum) グラム+バクテリア
ユーバクテリウム・レンテュム(Eubacterium lentum) グラム+バクテリア
ヘルペス・シンプレクス・ヴィルスI( Herpes Simplex Virus I )(HSV I)
ウィルス
ヘルペス・シンプレクス・ヴィルスII(Herpes Simplex Virus II )(HSV II)
ウィルス
この非限定的実施例では、ユーザ指示の形式で、特に、グループBストレプトコッカスのような微小有機体の定性的検出を含む微小流体PCR分析において用いる微小流体カートリッジを対象として、特許請求する装置、微小流体カートリッジ、キット、方法、及びコンピュータ・プログラム生産物の種々の実施形態について説明する。
種々の実施形態では、GBS検査システムは、膣/直腸サンプルにおけるグループBストレプトコッカス(GBS)DNAのような、臨床サンプルにおける微小有機体の迅速な定性的検出に用いることができる。
疾病管理及び防止センタは、陣痛及び分娩中における予防用抗生物質の必要性を判断するために、妊娠期間35〜37週の全ての女性の膣/直腸GBS定着について全般的な出生前診査を推奨する。現在のCDC推奨は、培養に基づく検査方法(標準的培養方法)であり、通例、48〜72時間で結果が得られるが、それと比較して、本検査では約30分で済む。本検査は、CAMP係数をエンコードする、確立した特定シーケンスであるGBSゲノムにおけるcfb遺伝子を特定するために、自動化したサンプル準備及びリアル・タイムPCRを利用することができる。CAMP係数は、GBS分離菌内に通例存在する余分な細胞蛋白質である。CAMP係数は、培養方法による臨床サンプルにおけるGBSバクテリアの推定特定に用いることができる。この検査は、実験室の手順にはさほど訓練されていない臨床家によって、患者の近くに設定して行うことができる。GBS検査のために継続して品質保証を行うために、ユーザ・インターフェースにQCルーチンを組み込むことができる。また、産科が要求する時間枠以内にサンプル検査が行われるのであれば、検査は中央病院の「stat」実験室で行うこともできる。
GBS検査は、被検物収集スワブに含有するポリエステルに対してアレルギのあるヒトには、禁忌を示す場合がある。
ここの警告は、実施例13に示した一般的な応用のそれらに追加するとよい。
・GBS検査は、ペニシリンにアレルギがある女性に推奨される罹患性結果を与えない場合がある。
・IV抗生物質は通例分娩の少なくとも4時間前に開始する必要があり、そして分娩前GBSデータがない状態では、患者が病院の陣痛及び分娩区域に入ったら直ちにサンプルを収集して、GBS検査を開始することが重要となることがある。
・実施形態によっては、患者が現在抗生物質で治療を受けている場合、検査は疾病状態の指標にしては信頼性が低くなる場合もある。
・緩衝液は、防腐剤としてアジ化ナトリウムを含有する場合がある。摂取すると、健康被害が出る。
・通例、サンプリング及び緩衝液内の蓄積から、例えば、8時間以内に被検物を検査する。被検物を保管しなければならない状況では、4Cにおいて24時間までの期間での冷蔵を用いるとよい。
・通例、有効期限が切れた検査材料の使用を回避する。
・通例、サンプルを注入する準備ができた後まで、カートリッジの開封を回避する。通例、保護用メタライズ・バッグを開封した場合、カートリッジの使用を回避する。実施形態によっては、光、空気、及び水分に晒すと、試薬が劣化する可能性がある。
・通例、検査キットに備えられているスワブ、シリンジ、及び緩衝液を用いる。実施形態によっては、GBS収集スワブの別のブランドでは、検査性能が阻害される可能性がある。
・通例、材料の使用は1回に限る。材料を再利用すると、誤った結果が得られる場合がある。
・検査の準備ができるまで、カートリッジのパッケージを開封するのを回避する。内蔵試薬は、光及び水分に感応する可能性がある。パッケージの封止が破れており、箔パウチがもはや伸びない(膨れている)場合、使用を回避する。
A.スワブ
B.サンプル収集緩衝液を収容するチューブ
C.カニューレ先端
D.シリンジ(例えば、3cc)
E.シリンジ・フィルタ
F.GBS微小流体カートリッジ
・注意:通例、収集キットのみを用いる。スワブの端部に指で触れるのを避ける。
・容器からスワブを取り出す。
・過剰な膣分泌物を拭い去る。
・スワブを2cm膣(膣)に挿入する。
・同じスワブを1cm肛門(直腸)に挿入する。
・サンプル緩衝液(B)の小瓶が期限切れでないことを確認する。
・スワブ(A)を、緩衝液を収容した小瓶の中に浸漬して20回上下に激しく振る。
・スワブを取り出し破棄する。
・患者のID情報を小瓶に記す。
・カニューレ先端(C)をシリンジ(D)に取り付けることができる。
・サンプルの一部又は全部をシリンジの中に引き込む。
・加えて、空気(例えば、2ml)も引き込んでもよい。
・カニューレ先端(C)をフィルタ(E)と交換してもよい。
・パッケージ上に印されている開封箇所から、カートリッジ・パッケージを開封することができる。
・サンプル小瓶(B)及びカートリッジ(F)のバーコードを、システム・スキャナによって走査することができる。材料が期限切れの場合、システムは警告するとよい。
・必要であれば、患者識別情報を入力することができる。
・カートリッジを平坦な表面に置くか、ルアーを用いて直立姿勢で平坦に保持する。通例、手順の間カートリッジのラベル側が上向きになっていることを確認する。
・シリンジ/フィルタ・アセンブリを用いてサンプル(過剰な空気を含む)をカートリッジに注入することができる。弱い注入圧力を用いると、サンプルからの跳ね返りを避けることができる。
・シリンジ/フィルタ・アセンブリをカートリッジから取り外すことができる。
・サンプル室内部にあるペレットが溶解し混合するまで、約10回カートリッジを横に軽く揺することができる。
・カートリッジをシステム上に置くことができる。
・システムのカバーを閉じ、ハンドルを下方位置で固定することができる(検査が自動的に開始してもよい)。
検査が完了したとき、結果を明確に表示するとよい。結果は、実験手順で決定した通りに、印刷又は格納することができる。
カートリッジ及び収集キットは、生物的有害物質として扱わなければならない。
推奨する実験室品質管理ルーチンの例
1週間毎に、(1)陽性外部対照及び(1)陰性外部対照を実行することができる。QCを、システムの総合システム性能を確認するように設定する。この手順は、新たなユーザを訓練する場合にも推奨する。
表示画面上で、指令通りに、サンプルを走らせる(run)ことができる。QC検査で、予期した結果を得ることができなかった場合、製造業者に連絡することができる。
外部陽性対照は、実行時にサンプル収集緩衝液によって復元したストレプトコッカス・アガラクチエ(GBS)細胞の凍結乾燥標本を含むことができる。外部陽性対照内にあるGBS細胞の数は、検査の最大検出可能限界(MDL)にほぼ等しくするとよい。
また、品質管理検査の例には、実施例14において説明した、システム自己検査QCも含む。
分析用の典型的な試薬は、ユーザの取扱謝りや汚染の潜在性を低減するために、カートリッジに含めるとよい。2種類のカートリッジ上陽性及び陰性対照方策を、各微小流体カートリッジ内に組み込み、個々のPCR分析実施過程を監視することができる。
GBS用陽性内部対照プラスミドの一例は、cfb遺伝子からの順方向及び逆方向シーケンスが側面に位置する(flank)一意の39bp人工DNAシーケンスから成る96bp領域を含有する二重鎖円形DNA分子であり、この一意のシーケンスに特定的な第2の別個の蛍光原プローブと共に、凍結乾燥マスタ・ミックス(master mix)に含めることができる。陽性GBSサンプルがない状態で、内部対照シーケンスを増幅できない場合、試薬混合の失敗又は被検物におけるPCRインヒビタの存在を示す可能性がある。
この検査は、臨床サンプルから復元したBGSのcfb遺伝子シーケンスの増幅のために、リアル・タイム・ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用することができる。増幅したDNAの検出には、蛍光原特定Tacman(商標)プローブを用いることができる。cfb遺伝子は、CAMP係数をエンコードし、GBS分離菌の中に通例存在する拡散可能な細胞外蛋白質を分離する。グループBストレプトコッカス(GBS)検出検査は、核酸増幅分析の一体型の、原料−サンプル−結果型とするとよい。この分析のための典型的な試薬をカートリッジに含めれば、ユーザの取扱謝りや相互汚染の潜在性を低減することができる。
実施形態によっては、検査システムは、膣及び/又は直腸被検物以外の被検物におけるGBS DNAを特定する適格性がない場合がある。例えば、実施形態によっては、尿及び血液の被検物は適していない場合がある。
実施形態によっては、抗生物質の治療を受けている患者は、正しいGBS診断が得られない場合もある。
実施形態によっては、微生物学者によるバクテリアの直接的な識別に適したGBS培養が、本検査から得られない場合もある。
妊娠中の女性の10〜30%に、GBSが定着している(colonize)。GBS定着のカットオフ(cut-off)は、cfb遺伝子シーケンスの増幅によって判定したDNA/サンプルの約1000コピーであると定めれらている。結果の解釈のための判断基準例の適用について、ユーザは図71のフロー・チャートを参照すること。この場合、問題のターゲットはGBS及びICプラスミドである。
実施形態によっては、尿又は膣分泌物、あるいは粘液が大量に存在すると、検査を妨害する場合がある。
ある実施形態では、サンプルの血液、胎便、羊水汚染は、通例、検査を妨害する可能性はない。
ある実施形態では、抗生物質以外の薬剤の妨害(膣及び直腸分泌物に存在するような)は、この時点では、通例PCRを妨害することは知られていない。
妊娠中の女性の10〜30%に、GBSが定着している。GBS定着のカットオフ(cut-off)は、cfb遺伝子シーケンスの増幅によって判定したDNA/サンプルの約1000コピーであると定められている。
PCR反応は、GBS及び内部対照に対して陽性又は陰性として解釈することができる。サンプルが陽性又は陰性か、あるいは不確定か決定するために、論理アルゴリズムを用いてもよい。
Claims (24)
- 微小流体用の基板であって、
第1のPCR反応室と、
第2のPCR反応室と、
第1のPCR反応室との間で流体が移動可能な第1の入口と、
第2のPCR反応室との間で流体が移動可能な第2の入口と、
第1のPCR反応室との間で流体が移動可能な第1の出口と、
第2のPCR反応室との間で流体が移動可能な第2の出口と、
第1の入口及び出口と第1のPCR反応室とを分離するための微小流体用の第1の組のバルブと、
第2の入口及び出口と第2のPCR反応室とを分離するための微小液滴用の第2の組のバルブと
を備え、
第1及び第2の組のバルブによる分離によって、第1及び第2のPCR反応室から及びこれらPCR反応室への液体の移動を阻止し、
第1及び第2のPCR反応室、第1及び第2の入口、第1及び第2の出口、並びに、第1及び第2の組のバルブは、同一の1つの基板上に構成されている
ことを特徴とする微小流体用基板。 - 請求項1記載の微小流体用基板において、第1及び第2のPCR反応室は、1又は複数のポリヌクレオチドを相互に独立して増幅するよう構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項1又は2記載の微小流体用基板において、第1及び第2の出口はそれぞれ第1及び第2の孔によって構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項1−3いずれかに記載の微小流体用基板において、第1及び第2の入口はピペット・チップからサンプルを受け取るよう構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項1−4いずれかに記載の微小流体用基板において、第1及び第2のPCR反応室の少なくとも一方において、リアル・タイムPCRを実行することができるよう構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項1−5いずれかに記載の微小流体用基板において、第1及び第2の入口は、複数のピペット・ヘッドを有する分配器から同時にサンプルを受け取ることができるように、相互に離間して配置されていることを特徴とする微小液流体用基板。
- 請求項1−6いずれかに記載の微小流体用基板において、第1及び第2の組のバルブは、加熱されると溶解し、第1及び第2のPCR反応室を封鎖する温度反応型の物質で構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 微小流体用のカートリッジであって、請求項1−7いずれかに記載の微小流体用基板を備えていることを特徴とする微小流体用カートリッジ。
- 複数のサンプル・レーンであって、相互に流体が移動可能なネットワークを構成している複数のサンプル・レーンを備えた微小流体用基板であって、サンプル・レーンのそれぞれが、
入口と、
抜け孔と、
第1及び第2のバルブと、
入口から第1のバルブを介してPCR反応室に延びる第1のチャネルと、
PCR反応室から第2のバルブを介して出口孔に延びる第2のチャネルと
を備え、
第1及び第2のバルブは、反応室への流体の移動又は反応室からの流体の移動を阻止するように、入口及び抜け孔と反応室とを分離するよう構成され、
PCR反応室、第1及び第2のバルブ、入口、抜け孔、第1及び第2のチャネルは、同一の1つの基板上に構成されている
ことを特徴とする微小流体用基板。 - 請求項9記載の微小流体用基板において、該基板はさらに、入口からPCR反応室に延び、ゲートが配置されている第3のチャネルを備え、該ゲートは、PCR反応室から流体が入口を介して排出されるように第3のチャネルを解放するよう構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項9又は10記載の微小液適用基板において、複数のサンプル・レーンのそれぞれは、相互に1又は複数のポリヌクレオチドを独立して増幅するよう構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項9−11いずれかに記載の微小流体用基板において、複数のサンプル・レーンのそれぞれは、バブル抜け孔を備えていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項9−12いずれかに記載の微小流体用基板において、入口は、ピペット・チップからサンプルを受け取るよう構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項9−13いずれかに記載の微小流体用基板において、該基板は、少なくとも1つのPCR反応室においてリアル・タイムPCRを実行することが可能に構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項9−14いずれかに記載の微小流体用基板において、複数のサンプル・レーンのそれぞれの入口は、複数のピペット・ヘッドを有する分配器からサンプルを受け取ることができるように、離間して配置されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 請求項9−15いずれかに記載の微小流体用基板において、第1及び第2のバルブは、加熱されると溶解してPCR反応室を封鎖する物質で構成されていることを特徴とする微小流体用基板。
- 微小流体用のカートリッジであって、請求項9−16いずれかに記載の微小流体用基板を備えていることを特徴とする微小流体用カートリッジ。
- 請求項17記載の微小流体用カートリッジにおいて、該カートリッジはさらに、該カートリッジが補助的診断装置によって一方向に受け取られるようにするためのレジストレーション要素を備えていることを特徴とする微小流体用カートリッジ。
- 請求項17又は18記載の微小流体用カートリッジにおいて、基板は、剛体で空気及び液体に耐性を有し、かつ、該微小流体用カートリッジの動作中の空気又は液体の進入又は排出が、入口及び抜け孔のみを介して行われることを特徴とする微小流体用カートリッジ。
- ポリヌクレオチド含有の複数のサンプルに独立してPCRを実行する方法であって、
該複数のサンプルを、相互に独立して熱循環が可能である複数のPCR反応室を備えた微小流体用カートリッジに導入するステップと、
複数のサンプルを複数のPCR反応室にそれぞれ移動するステップと、
複数のPCR反応室を隔離する隔離ステップと、
複数のサンプルに含まれるポリヌクレオチドを、PCR反応室に加熱及び冷却の複数のサイクルを連続して及ぼすことにより、増幅するステップと
からなることを特徴とする方法。 - 請求項20記載の方法において、隔離ステップは、微小流体用の複数のバルブを動作させることによって実行されることを特徴とする方法。
- 請求項21記載の方法において、複数のバルブの動作は、感熱応答物質を加熱することにより、該物質がロード・チャネルからフロー・チャネルに移動してフロー・チャネルを閉鎖することにより行われることを特徴とする方法。
- 微小流体用のバルブであって、
第1のロード・チャネルに接続された第1の室と、
第2のロード・チャネルに接続された第2の室と、
フロー・チャネルと
を備え、
第1及び第2のロード・チャネルは、フロー・チャネルに接続されており、
第1及び第2のロード・チャネルはそれぞれ、感熱応答物質を含み、バルブが駆動されたとき、該感熱物質がフロー・チャネルに移動して該チャネルを閉鎖するよう構成されており、
フロー・チャネルは、第1及び第2のロード・チャネルの一方の側の長手方向に沿って圧縮されている
ことを特徴とする微小流体用バルブ。 - 請求項23記載の微小流体用バルブにおいて、フロー・チャネルの圧縮された部分は、少なくとも1つの曲線部であることを特徴とする微小流体用バルブ。
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