JP6681329B2 - フローセルへ試薬を送達するための流体システム - Google Patents

Description

優先権の主張

本願は、同時係属中の２０１３年８月８日に出願された米国仮特許出願第６１／８６３，７９５号明細書の利益を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に援用される。

本開示の実施形態は、一般に、例えば塩基配列決定作業における、試料の流体操作および光学検出のための装置および方法に関する。

ゲノムは、嗜好、才能、罹患性、治療薬剤反応性といった、人それぞれに固有の性質の多くを予測可能にしてくれる設計図を提供する。ヒトゲノムは個々で３０億を超えるヌクレオチド配列を含む。それらのヌクレオチドにおけるほんのわずかな違いにより、人はそれぞれ独特な性質を与えられている。そのような設計図を作り上げている特徴を解明するにあたり、研究コミュニティにおいては目覚ましい進歩が遂げられつつある。それに伴い、各設計図における情報がどのように人間の健康と関係しているのかについてのより完全な理解も深まりつつある。しかしながら、まだその理解は本当に完全といえるにはほど遠く、情報を研究段階から臨床応用へ展開していける段階には到達していない。臨床においていつの日か期待されているのは、私たち全員がおのおの自分個人のゲノムのコピーを所有し、どのような選択を行えば健康的な生活を送ることができ、また適した治療を受けられるのかを医師と決定できるようになることである。

現在、これを妨げているのは処理量と規模の問題である。どの個人の設計図を解明する場合であっても、その基本的な要素は、その個人のゲノムにある３０億対のヌクレオチドについて正確な配列を決定することである。これを決定するための技術は既に種々あるが、それらの技術を使った場合、通常、配列決定に幾日もかかり、また費用も何千ドルもかかってしまう。さらに、個人のゲノム配列の臨床的関連性は、その個人のゲノム配列（すなわち遺伝子型）の独特の特徴を、既知の特性（すなわち表現型）と相関関係にある基準ゲノムと比較することである。規模と処理量の問題は、以下の事実を考慮したときに明らかになる。それは、統計的有効性を確保するために、基準ゲノムは通常何千人もを調査し、その結果判明した遺伝子型と表現型との相関関係に基づいてつくられている、ということである。よって、何十億ものヌクレオチドの配列が、何千人もの個々人のために最終的には決定され、臨床的に関連するあらゆる遺伝子型と表現型との相関関連が確認される。きわめて安価かつ迅速に行える塩基配列決定技術の必要性は、疾患、薬剤反応、およびほかの臨床的関連のある特性の数によりさらに倍増し、今までになく顕著になってきている。

必要とされているのは、塩基配列決定作業におけるコストの削減である。コスト削減が実現すれば、研究科学者たちは大規模な遺伝子相関調査を行うことができ、臨床環境においても塩基配列が入手可能となるため、人生を変えるような決断に迫られている患者それぞれに合わせた治療が可能となる。本明細書に記載の実施形態はこの需要を満たし、同時にほかの利点ももたらす。

本開示は、試薬カートリッジとフローセルの注入口との間で流体連通が達成されるよう構成した複数のチャネルを備える試薬マニホールドと、マニホールドの複数のポートから下方へ伸びる複数の試薬シッパーであって、各試薬シッパーは、試薬カートリッジの試薬リザーバへ挿入され、試薬リザーバからシッパーへ液体試薬が吸い上げられるよう構成した、複数の試薬シッパーと、リザーバとフローセルの注入口との間の流体連通を媒介するよう構成した少なくとも１つのバルブと、を備えた流体システムを提供する。

本開示は、流体システムの複数の試薬シッパーとｚ軸方向に沿って一斉に係合するように構成された複数のリザーバであって、液体試薬が前記試薬リザーバから前記シッパーへ吸い上げられ、前記複数の試薬リザーバはｘおよびｙ軸方向において、上列、中列、下列に並べられ、前記カートリッジの上列および下列沿いの試薬リザーバの深さは、ｚ軸方向において、１つ以上の中列にある試薬リザーバよりも深い、複数の試薬リザーバと、前記流体システムの対応する位置合わせピンと係合するよう構成した、少なくとも２つの接触面スロットと、を備える試薬カートリッジをさらに提供する。

また本開示は、拡散接合された多層試薬マニホールドであって、該マニホールドは少なくとも１０個、１５個、または２０個のポートを備え、各ポートはシッパーを介して別の試薬リザーバから試薬を吸い上げ、前記マニホールド内の流体チャネルを介してフローセルの１つ以上のチャネルと流体連通している、試薬マニホールドも提供する。

本開示は、ａ）液体試薬を試薬リザーバからキャッシュリザーバへ吸い上げるステップであって、該キャッシュリザーバは、試薬リザーバおよびフローセルの少なくとも１つのチャネルと流体連通している、吸い上げるステップと、ｂ）試薬をキャッシュリザーバからフローセルの少なくとも１つのチャネル上へ輸送するステップと、ｃ）フローセルチャネル上の試薬の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％をキャッシュリザーバへ輸送するステップであって、フローセルからの液体試薬は、フローセルと接触後、試薬リザーバへ戻らない、輸送するステップと、ｄ）ステップｂ）とステップｃ）とを繰り返してフローセル上の液体試薬の再利用を達成するステップとを含む試薬を再利用する方法をさらに提供する。

本開示は、（ｉ）光透過性表面を具備するフローセル、（ｉｉ）核酸試料、（ｉｉｉ）配列決定反応のための複数の試薬、および（ｉｖ）前記試薬を前記フローセルに送達する流体システムを備えた流体システムを提供するステップ（ａ）と、（ｉ）ｘおよびｙ次元の画像平面において広視野画像を検出するように構成した対物レンズをそれぞれ具備する複数のミクロ蛍光計、および（ｉｉ）試料ステージを備える検出装置を提供するステップ（ｂ）と、塩基配列決定作業における流体操作をカートリッジ内で実行し、該塩基配列決定作業における検出操作を前記検出装置において実行するステップ（ｃ）であって、（ｉ）前記流体システムによって前記試薬が前記フローセルに送達され、（ｉｉ）前記複数のミクロ蛍光計によって前記核酸のフィーチャーの広視野画像が検出され、（ｉｉｉ）少なくとも一部の試薬が前記フローセルからキャッシュリザーバに取り出される、ステップ（ｃ）とを含む配列決定方法をさらに提供する。

１つ以上の実施形態の詳細を添付図面および以下に記載する。以下の説明と図面、および請求の範囲から、ほかの特徴、目的、および利点も明らかとなるであろう。

試薬カートリッジと連動している試薬シッパーを有する流体システムを示す図である。 マニホールド内の流体チャネルのレイアウトの例を示す、マニホールドアセンブリの等角図である。 試薬シッパー、バルブ、および位置合わせピンを有するマニホールドアセンブリの正面斜視図である。長さの異なるシッパーも示す図である。 マニホールド内の流体チャネルの可能なレイアウトの１つを示すマニホールドアセンブリの上面図である。 キャッシュラインと非キャッシュ流体チャネルの断面図を含む、マニホールド内のチャネルの断面図である。 試薬ポートと二つのバルブとを連結する種々の接合部の図である。 種々の長さのウェルを有する試薬カートリッジの断面図である。 一実施形態による、マニホールドアセンブリ内のキャッシュラインの簡易上面図である。 キャッシュラインからフローセルへの試薬の流動、それに続くフローセルからのキャッシュラインへの試薬の部分的補充、という試薬の相互流動を利用する方法における、試薬の再利用の種々の段階を示す図である。 試薬ウェルと位置合わせピン用接触面スロットとを有する試薬トレイ接触面の上面図である。 流体システムの流体工学図である。 柔軟シッパーと穿孔シッパーとを含む試薬シッパーの詳細図である。

本開示は、流体システムと、フローセルのようなチャンバーへ試薬を供給する方法とを提供する。特に有用な用途は、固定化した生物試料を検出することである。例えば、本明細書に記載の方法およびシステムは、塩基配列決定の用途に用いることができる。光学的にも非光学的にも検出可能な試料および／または試薬を用いる種々の塩基配列決定技術を用いることができる。これらの技術は、本開示の方法および装置に特に適合するため、本発明の特定の実施形態の種々の利点を際立たせる。これら利点のうちのいくつかを例として以下に記載する。用途として塩基配列決定を例示するが、本開示の利点はほかの用途にも拡大可能である。

本明細書に記載の流体システムは、２０１３年２月１３日に出願された「INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING」と題する、米国特許出願第１３／７６６，４１３号に記載される、各検出装置構造および各塩基配列決定方法と共に用いたとき、特に有用である。該出願の内容は参照により本明細書に完全に援用される。

特定の実施形態においては、検出対象の試料は本明細書に記載の流体システムを用いて検出チャンバーへ供給してもよい。塩基配列決定用途のより具体的な例をとると、流体システムはマニホールドアセンブリを備えており、マニホールドアセンブリは、配列決定用試薬を入れるための１つ以上のリザーバ、試料調製用試薬を入れるための１つ以上のリザーバ、配列決定作業中に発生する廃棄物を入れるための１つ以上のリザーバ、および／またはポンプ、バルブ、およびフローセルを通して流体を移動させることができるほかの部品と流体連通する。

特定の実施形態においては、流体システムは、１つ以上の試薬が再利用可能となるよう構成することができる。例えば、流体システムは、試薬をフローセルへ送達した後、該試薬を該フローセルから取り出し、その後、また該試薬を該フローセルへ再導入するよう構成することができる。試薬を再利用することにより廃棄物の量を減らすことができ、高価な試薬または／および高濃度で（または大量に）送達される試薬を用いる工程のコストを抑えることが可能となる。試薬の再利用は、試薬の消耗はフローセル表面でのみ、またはおもにフローセル表面で起こるため、試薬の大半は使用されておらず再利用も可能である、という知見を利用したものである。

図１Ａに、試薬シッパー１０３および１０４と、バルブ１０２とを備えた例示的な流体システム１００を示す。本システムは、本明細書に記載のいくつかの実施形態により実現される流体システムの利点を活用するものである。流体システム１００は、例えば、試薬シッパー、バルブ、チャネル、リザーバ等、種々の固定部品を備えるマニホールドアセンブリ１０１を含む。試薬カートリッジ４００も存在し、試薬カートリッジ４００は、ｚ軸方向に沿って試薬シッパー１０３および１０４一式と一斉に係合するよう構成した試薬リザーバ４０１および４０２備え、液体試薬は試薬リザーバからシッパーへ吸い上げられる。

図１Ｂに、液体試薬を試薬リザーバからフローセルへ供給する際に用いることができる例示的なマニホールドアセンブリ１０１を示す。マニホールドは、その各ポートからＺ軸方向において下方に伸びる試薬シッパー１０３および１０４を備える。試薬シッパー１０３および１０４は、試薬カートリッジ内の１つ以上の試薬リザーバ（図示しない）に挿入することができる。マニホールドはまた、試薬シッパー１０３をバルブ１０２とバルブ１０９に流体接続するチャネル１０７を備える。試薬シッパー１０３および１０４と、チャネル１０７と、バルブ１０２とで、試薬リザーバとフローセル（図示しない）との間の流体連通を媒介する。バルブ１０２および１０９は、別々または共に、シッパー１０３または１０４を選択し、１０７のようなチャネルを通して、試薬リザーバとフローセル（図示しない）との間の流体連通を媒介する。

図１Ａおよび図１Ｂに示す装置は例示的な装置である。本開示の方法および装置のさらなる例示的実施形態を以下でさらに詳細に記す。それら実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂに示す例に替えて代替的に使ってもよいし追加的に使ってもよい。

図２に、試薬シッパーとバルブとを備える、別の例示的なマニホールドアセンブリを示す。マニホールドは、試薬シッパーと平行な軸方向に沿って該マニホールドから下方に突出する位置合わせピン１０５を備える。位置合わせピン１０５の長さは、ｚ軸方向に沿って試薬シッパーより長いが、代替的実施形態においては、試薬シッパーと同じかまたは短くてもよい。位置合わせピン１０５は、試薬カートリッジ（図示しない）上にある対応する１つ以上の接触面スロットと係合するよう構成する。試薬シッパー１０３および１０４は、マニホールド本体に収納されているポート１０６を介してマニホールドに連結している。試薬シッパー１０４の長さは、試薬シッパー１０３と比較して長い。これは、試薬シッパー１０３および１０４の深さに対応する種々な深さを有する試薬リザーバから液体を吸い上げるためである。代替的な実施形態においては、シッパー１０３および１０４の長さは同じであってもよいし、優勢な長さを取り換えてもよい。

図２にはまた、異なるｘ−ｙ平面上にあるチャネル１０７Ａおよび１０７Ｂを示す。異なるチャネル１０７Ａおよび１０７Ｂは、もとは単一のチャネルから始まり、のちにＴ接合１０９において二またに分かれ、異なる平面上に複数のチャネルを生成している。マニホールドは、特定のバルブ１０２へ連結するチャネルを、すべて同じ平面Ａに配置するか、または平面Ａ上と平面Ｂ上の組み合わせに配置することにより、液体試薬を１つのシッパーから、１つ以上のバルブへ誘導する。ほかのどのバルブに連結するチャネルも、この共通平面または相互平面の特徴を共有しうる。

図３にマニホールドアセンブリ１０１の上面図を示す。図３には、マニホールド内の流体チャネルの可能なレイアウトの１つを示す。流体チャネル１０７Ａおよび１０７Ｂは、単一ポート１０６から始まって、ポート１０６をバルブ１０２Ａおよび１０２Ｂに連結する。チャネルのうちいくつかはキャッシュリザーバ１０８を備え、それらキャッシュリザーバは、ある量の液体試薬がフローセル（図示せず）からキャッシュリザーバ１０８へ流動することを可能にするのに十分な容積を有する。フローセルからの液体試薬は、フローセルと接触した後は、試薬リザーバ（図示せず）へ戻ることはない。図３にまた、１つ以上の位置合わせピン１０５の例示的な位置を示す。図３に示すマニホールドアセンブリは、共有バッファ用の注入ポート１１１も備える。バルブ１０２Ａおよび１０２Ｂは、各々、各試薬ポート１０６に対応する注入ポートと、フローセルへ流体接続する共用外部ポート１１２および１１０と、廃棄物容器へ流体接続する廃棄物ポート１１３および１０９とを備える。

上記例示的実施形態において示すように、試薬カートリッジからフローセルへ試薬を送達するための流体システムは、試薬カートリッジとフローセルの注入口との間で流体連通が達成されるよう構成した複数のチャネルを備える試薬マニホールドを備えていてもよい。流体システムにおいてマニホールドを用いた場合、チューブのみを用いた場合と比較して、いくつか利点を得られる。例えば、固定されたチャネルを有するマニホールドは、チューブの取り付け場所の誤りや、連結箇所における締め過ぎまたは締め不足といった組立時の誤りを減少させる。加えて、マニホールドは維持が容易であり、時間をかけて個々のラインの試験をしたり交換したりする必要はなく、例えば、ユニット全体を交換可能である。

マニホールドの１つ以上のチャネルは、固体材料を介して流体通路を備えていてもよい。通路はいかなる直径であってもよく、通路を介して、望ましい水準で流体を輸送することができる。通路の内径は、例えば、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、または１０ｍｍより小さくもよい。例えば、通路の形状は直線状または湾曲していてもよい。代替的または追加的に、通路は湾曲部分と直線部分との組み合わせを有していてもよい。通路の断面図は、例えば、正方形、円形、「Ｄ」形状、または通路を通して望ましい水準で流体を輸送できる限りにおいては、他のいかなる形状であってもよい。図４は、マニホールド本体を通る流体通路の例示であり、ある通路３０２の断面図である。図４に示す例示的チャネル３０２は、直径０．６５ｍｍの半円と、別途０．６５ｍｍ×０．３２５ｍｍの0長方形とを融合して形成した、断面「Ｄ」形状を有している。

シッパーとバルブ間のチャネルは、マニホールド本体内部にすべて収納されていてもよい。代替的または追加的に、チャネルは、マニホールドの外部に、その一部分を１つ以上備えていてもよい。例えば、可撓性チューブといったチューブにより、マニホールド上の、流体通路の一部分を該通路の別の一部分と連結してもよい。代替的または追加的に、フローセルを、可撓性チューブにより、システムにおける固定された流体部品、例えば、ポンプ、バルブ、センサ、およびゲージ等に接続してもよい。例として、フローセルまたは本システムのチャネルを、可撓性チューブにより、シリンジポンプまたはぜん動ポンプといったポンプに連結することができる。

マニホールド本体は、その内部の１つ以上のチャネルを支持する限りにおいては、いかなる適した固体材料から作製してもよい。よって、マニホールド本体は、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、DELRIN（登録商標）（ポリオキシメチレン）、HALAR（登録商標）、ＰＣＴＦＥ（ポリクロロトリフルオロエチレン）、PEEK（商標）（ポリエーテルエーテルケトン）、ＰＫ（ポリケトン）、PERLAST（登録商標）、ポリエチレン、ＰＰＳ（ポリフェニレンサルファイド）、ポリプロピレン、ポリスルホン、ＦＥＰ、ＰＦＡ、高純度ＰＦＡ、RADEL（登録商標）R、３１６ステンレススチール、TEFZEL（登録商標）ＥＴＦＥ（エチレンテトラフルオロエチレン）、TPX（登録商標）（ポリメチルペンテン）、チタン、ＵＨＭＷＰＥ（超高分子量ポリエチレン）、ULTEM（登録商標）（ポリエーテルイミド）、VESPEL（登録商標）といった樹脂、または、本明細書に提示する実施形態におけるマニホールドのチャネルを通して輸送する溶剤および流体と適合する限りにおいては、ほかのいかなる適した固体材料からなるものであってもよい。マニホールド本体は、単一片の材料から形成してもよい。代替的または追加的に、マニホールド本体は接合した多層から形成してもよい。接合方法は、例えば、接着材、ガスケット、拡散接合である。チャネルは、固体材料中に、いかなる適した方法で形成してもよい。チャネルは、例えば、穿設、エッチング、またはミリングにより固体材料中に形成してもよい。チャネルは、複数の層を接合する前に、固体材料中に形成してもよい。代替的または追加的に、チャネルは、複数の層をともに接合した後に形成してもよい。

図５に、試薬ポート３０１と２つのバルブを接続する種々の接合部３００を示す。図５に示す各例においては、ポート３０１はチャネル３０２と流体接続しており、チャネル３０２は、２つのチャネル３０２Ａおよび３０２Ｂに分岐する。それら２つのチャネルは、それぞれ、異なるバルブへ接続している。１つ目の構成においては、接合部はポート３０１からの流体の流れを、マニホールドの別々の層上にあるチャネル３０２Ａおよび３０２Ｂへと分けている。図５における２つ目及び３つ目の構成においては、接合部３００は、１つの層内で分かれている角に丸みのある正方形３０３、またはマニホールドの１つの層内で、完全な丸みを帯びている分かれ目３０４を有する。

ここに提示するマニホールドアセンブリは、液体試薬を試薬カートリッジからフローセルへ送達するために構成した。よって、マニホールドは、試薬シッパーと連結するポートをいくつ有していてもよい。より具体的には、ポートの数は、試薬カートリッジ中の試薬リザーバの数および構成に対応していてもよい。いくつかの実施形態においては、マニホールドが備えるポートの数は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または３０個であり、各ポートは、試薬シッパーとチャネルとを、少なくとも１つのバルブを用いて、流体連通するよう接続する。

本明細書に提示する流体システムはまた、マニホールドのポートからｚ軸方向に沿って下方へ伸びるシッパーチューブの配列を備えていてもよい。各試薬シッパーは、試薬カートリッジの試薬リザーバへ挿入され、試薬リザーバからシッパーへ液体試薬が吸い上げられるよう構成される。試薬シッパーは、例えば、近位端と遠位端とを有するチューブ体を備えていてもよい。遠位端の先端を鋭く先細りさせ、試薬カートリッジの試薬リザーバを覆うシールとして用いるフィルム層またはフォイル層に穴を開けられるよう構成する。図１０に種々の例示的シッパー先端を示す。試薬シッパーは、例えば、チューブ体を遠位端から近位端へ通る単一の内腔を備えていてもよい。該内腔は、シッパーの一端側である試薬カートリッジとシッパーの他端側である試薬マニホールドとの間の流体連通を可能にするよう設けもよい。図２に例示するように、試薬シッパー１０３および１０４は、マニホールド本体に収納されたポート１０６を介してマニホールドに結合する。

いくつかの実施形態においては、図２に例示するように、一部の試薬シッパーの長さは、それ以外の試薬シッパーの長さよりも短い。例えば、その一部のシッパーの長さは、少なくとも、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．３ｍｍ、１．４ｍｍ、１．５ｍｍ、１．６ｍｍ、１．７ｍｍ、１．８ｍｍ、１．９ｍｍ、または２．０ｍｍだけ、それ以外の試薬シッパーより短い。マニホールドと試薬シッパーは、試薬カートリッジをｚ軸方向に沿って双方向的に移動させる昇降機構を有するデバイスにおいて用いてもよい。そのようなデバイスにおいて、試薬シッパーは、試薬カートリッジの対応するウェルまたはリザーバに挿入される。ある実施形態においては、試薬ウェルは保護フォイルで覆われていてもよい。よって、種々の長さのシッパーを用いることにより、昇降機構が要する力の量を減少させることができ、試薬カートリッジが穿孔シッパーと接触する際に、フォイルを穿孔する力を供与できる。シッパーの長さの違いは試薬カートリッジの試薬ウェルの深さと有利に対応する。ゆえに、シッパーとカートリッジが完全に係合する位置にくるとき、各シッパーは、その対応する試薬ウェルにおいて、望ましい深さに達することができる。

シッパーは、内腔を通る流体輸送を可能にし、本明細書に提示する実施形態におけるマニホールドのチャネルを通して輸送する溶剤および流体と適合する限りにおいては、いかなる適した材料から形成してもよい。シッパーは単一のチューブから形成してもよい。

いくつかの実施形態においては、少なくとも１つの試薬シッパーは、その先端が試薬カートリッジの試薬ウェルの底部に突き当たったとき屈曲するよう構成した柔軟な先端部を備える。柔軟な先端部が屈曲または変形するため、シッパーの内腔は試薬ウェルの底部に十分に近づくかまたは接触さえ可能になる。よって、試薬ウェル内の退避体積を減少またはなくすことさえ可能となる。先端部に柔軟性があると、小容量の試料または試薬を吸い上げる際に特に有利である。または、試薬リザーバ内のほぼすべてまたはすべての液体を吸い上げることが望ましい場合にも特に有利である。柔軟な先端部を有するシッパーの本体部はすべて、先端部と同じ可撓性材料により作製してもよい。代替的または追加的に、シッパー本体部は先端部とは異なる材料により作製してもよい。柔軟な先端部は、試薬リザーバの底部に押し付けられ接触したときに、変形したり撓んだりする材料であれば、いかなる適した材料により作製してもよい。適した材料としては、ポリウレタンのような熱可塑性重合体を含む、重合発泡体および／または合成発泡体、ゴム、シリコンおよび／またはエラストマーが挙げられる。

本明細書に提示の流体システムはまた、例えば、リザーバとフローセルの注入口との間の流体連通を制御するために代替的に動作可能なポンプおよびバルブを備える。図２および図３に示すマニホールドアセンブリにおいて例示するように、マニホールド側チャネル注入口は、１つ以上のバルブ側の対応する注入ポートと接続するよう構成してもよい。これにより、各試薬チャネルがバルブ側の注入ポートと流体連通する。よって、マニホールドの試薬チャネルを介して、１つ以上の各注入ポートが試薬シッパーと流体連通可能となる。各１つ以上のバルブは、フローセル上の１つ以上のレーンの注入口に流体接続する共通外部ポート（１１０、１１２）を備える。代替的または追加的に、各１つ以上のバルブは、１つ以上の廃棄物容器に流体接続する廃棄物ポート（１０９、１１３）を備える。

流体システムが第１のバルブと第２のバルブとを少なくとも備える実施形態においては、各バルブが、各々、フローセルの第１のチャネルと第２のチャネルに別々の試薬を同時に送達するよう構成してもよい。よって、第１のバルブにより１つの試薬が第１のフローセルチャネルに送達され、同時に、第２のバルブにより異なる試薬が第２のフローセルチャネルに送達される。図９の例示的な実施形態に示すように、バルブＡ（ＶＡ）はフローセルの注入口Ｖ１と流体接続しており、該フローセルはマニホールドであり、レーン１とレーン３とへ試薬を送達する。同様に、バルブＢ（ＶＢ）は、フローセルの対向端に位置する注入口Ｖ２と流体接続しており、該フローセルはレーン２とレーン４とへ試薬を送達する。注入口Ｖ１およびＶ２は、フローセルにおける対向端に位置しており、試薬の流れる方向は、レーン１およびレーン３と、レーン２およびレーン４とでは逆方向である。

本明細書に記載の流体システムは、塩基配列決定作業におけるフローセルチャネルの流体操作を行う際に有利に用いることができる。より具体的には、本明細書に記載の流体システムは、検出装置による、フローセルにおける核酸のフィーチャー検出用の構成において、該検出装置と動作的に関連してもよい。いくつかの実施形態においては、検出装置は複数のミクロ蛍光計を備えていてもよく、各ミクロ蛍光計は、ｘおよびｙ軸次元の画像平面において広視野画像を検出するよう構成した対物レンズを備える。本明細書に記載の流体システムは、２０１３年２月１３日に出願された「INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD ANDFLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING」と題する、米国特許出願第１３／７６６，４１３号に記載される、各検出装置構造と共に用いたとき、特に有用である。該出願の内容は参照により本明細書に完全に援用される。

一例として、塩基配列決定の特定の実施形態においては、複数のチャネルを備えるフローセルは千鳥状に流体操作し光学検出することができる。より具体的には、流体操作は、フローセルの第１のチャネルサブセットに対して行い、光学検出は第２のチャネルサブセットに対して行ってもよい。例えば、一構成においては、フローセルに、少なくとも４つの直線状のチャネルを互いに平行になるよう配置することができる。（例えば、チャネル１からチャネル４は連続する列として並べてもよい。）流体操作は１つおきのチャネル（例えばチャネル１とチャネル３）について行い、検出はそのほかのチャネル（例えばチャネル２とチャネル４）について行ってもよい。この特定の構成は、間隔を空けて配置された検出器を有する読み込みヘッドを用いて実現することができ、フローセルの１つおきのチャネルに対物レンズを誘導する。この場合、検出中のチャネルの検出状態は維持しつつも、各バルブは、塩基配列決定のサイクルための試薬が交互のチャネルに流れるよう誘導するよう作動する。この例においては、交互のチャネルの第１セットは、第１の配列サイクルの流体ステップを通り、交互のチャネルの第２のセットは、第２の配列サイクルの検出ステップを通る。第１のサイクルの流体ステップが完了し、第２のサイクルの検出ステップが完了すると、読み込みヘッドは交互のチャネルの第１セットへ（ｘ軸沿いに）移り、各弁は発動してチャネルの第２セットへ配列試薬を送達する。その後、第１のサイクルのための検出ステップが（チャネルの第１セットにおいて）完了し、第３のサイクルのための流体ステップを（チャネルの第２のセットにおいて）始めることができる。望ましい回数のサイクルを行うまで、または塩基配列決定作業が完了するまで、このような方法でこれらステップを幾度か繰り返すことができる。

上記のように千鳥状に流体ステップと検出ステップを行うことにより、配列決定にかかる全体の作業時間をより短縮できる。上記例では、流体操作に要する時間が検出に要する時間が大体同じであれば、千鳥状にステップを行うことにより（すべてのチャネルを平行して流体操作し、その後すべてのチャネルを平行して検出する場合と比較して）配列決定時間を短縮できる。もちろん、検出ステップのタイミングと流体ステップのタイミングとが同じでない実施形態においては、千鳥状構成を、１つおきからより適切なパターンに変更して、チャネルの１つのサブセットについて平行スキャンを行っている間に、チャネルの別のサブセットは流体ステップ中である、という状態を実現してもよい。

また、流体を逆方向に流動させることにより、個々のミクロ蛍光計の性能を比較する手段を得ることができる。例えば、複数のミクロ蛍光計をフローセルの各レーンに用いると、ミクロ蛍光計の性能が低下した場合、検出器が原因なのか、それともレーンの一端から他端への化学的有効性が減少したせいなのかを判断するのは難しいであろう。流体流動が逆な場合、レーンにまたがるミクロ蛍光計性能を比較できるため、性能の低下はミクロ蛍光計に原因があるのかどうかを効果的に判断できる。

図９に例示的流体システムの流体工学図を示す。フローセル２０２０には４本のレーンがあり、それらレーンは各々、２本の個々の流体ラインＦＶおよびＲＶのうちの１本と流体接続している。流体ラインＦＶおよびＲＶは、注入バルブＶＡおよびＶＢにより個々に動作する。注入バルブＶＡおよび注入バルブＶＢは、試薬マニホールド２０３０内の種々のポートと流体接続している試薬カートリッジまたはトレイ２０３５の試料リザーバ、ＳＢＳ試薬リザーバ、および増幅試薬リザーバからの流体の流動を制御する。

図９のシステムを流れる流体の流動は、２つの別々のシリンジポンプ２０４１および２０４２により動作する。シリンジポンプは、流体を流体システムを通して吸い上げるよう設けられており、各シリンジポンプは個別にバルブ２０５１および２０５２により発動させてもよい。よってフローセルの各チャネルを流れる流体は個別に専用の圧力源により制御することができる。バルブ２０５１および２０５２は、廃棄物リザーバ２０６０へ向かう流体の流動も制御する。

図９においては、下流シリンジポンプの動作により流体が吸い上げられる流体システムを例示する。有用な流体システムであれば、シリンジポンプの代わりにほかの種類のデバイスを用いて流体を動作させられることは理解されたい。そのようなデバイスの例としては、例えば、正圧または負圧、ぜん動ポンプ、膜ポンプ、ギアポンプ、またはアルキメデスポンプ等が挙げられる。さらに、これらおよびほかのデバイスは、フローセルに対して下流域から流体を吸い上げるか、または上流域から流体を送ることができる。

図９に、フローセルの４つのチャネルのための２つのシリンジポンプの利用を例示する。よって、流体システムは、用いるチャネルの数よりも少ない数のポンプを備える。本開示の流体カートリッジにおいて有用な流体システムであれば、ポンプをいくつ備えていてもよいことは理解されたい。例えば、そのポンプ（またはほかの圧力源）の数は、用いるチャネルの数と同じか、またはそれよりも少なくてもよい。例えば、いくつかのチャネルを共用ポンプと流体接続可能であり、バルブはそれぞれのチャネル内に流体の流れを発動させることができる。

図９に例示する流体システムは、バルブＶＡとフローセル注入口Ｖ１との間の流体経路ＲＶ沿いに位置する、気泡検出センサＢＵＢ‐４も備える。追加で、気泡センサＢＵＢ‐３も、バルブＶＢとフローセル注入口Ｖ２との間の流体経路ＦＶ沿いに備える。本開示の流体システムにおいて有用な流体ラインであれば、気泡センサ、圧力計等をいくつ備えていてもよい。センサおよび／または圧力計は、流体システムにおけるいかなる流体経路部分沿いに配置してもよい。例えば、センサまたは圧力計は、バルブのうちの１つとフローセルとの間の流体ライン沿いに配置してもよい。代替的または追加的に、センサまたは圧力計は、試薬リザーバとバルブのうちの１つとの間の流体ライン沿いに配置してもよいし、バルブとポンプとの間の流体ライン沿いに配置してもよいし、または、ポンプと注入口または廃棄物リザーバのようなリザーバとの間の流体ライン沿いに配置してもよい。

図６に例示的な試薬カートリッジの断面図を示す。図６に示す試薬カートリッジ４００は、各ウェル４０２と比較して、ｚ軸方向に沿うさまざまな深さの各ウェル４０１を備える。より具体的には、図６に例示した試薬カートリッジは、対応する試薬シッパー（図示しない）の長さを収容できるよう設計されたウェルを有し、各シッパーは、各シッパーとカートリッジが完全に係合する位置にくるとき、その対応する試薬ウェル内で望ましい深さに達する。図６に例示する試薬カートリッジにおいては、各ウェルは、ｙ軸方向に沿って行または列をなして並んでいる。そこでは、行または列にはないウェル４０１は、行や列にあるウェル４０２と比較して、ｚ軸方向に下に向かって伸びている。いくつか、またはすべてのウェルの深さは異なるものであってもよい。代替的または追加的に、いくつか、またはすべてのウェルの深さが同じであってもよい。各シッパーとカートリッジが完全に係合する位置にくるとき、どのシッパー端の侵入深さ（すなわち、ウェルの底面からシッパー端のさきまでの距離）も、試薬カートリッジのほかのどの所定のウェルの、ほかのどのシッパー端の侵入深さと同じとすることができる。どのシッパー端の侵入深さも、試薬カートリッジのほかのどの所定のウェルの侵入深さと同じでなければいけないという必要性はない。少なくともいくつかの試薬ウェルの深さが異なる場合、そのウェルの深さは、ほかの試薬シッパーよりも、例えば、少なくとも０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１．０ｍｍ、１．２ｍｍ、１．３ｍｍ、１．４ｍｍ、１．５ｍｍ、１．６ｍｍ、１．７ｍｍ、１．８ｍｍ、１．９ｍｍ、または２．０ｍｍ短くてもよい。同様に、各シッパーとカートリッジが完全に係合する位置にくるとき、どのシッパー端の侵入深さでも、試薬カートリッジのほかのどのシッパー端の侵入深さと、少なくとも０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１．０ｍｍ、１．２ｍｍ、１．３ｍｍ、１．４ｍｍ、１．５ｍｍ、１．６ｍｍ、１．７ｍｍ、１．８ｍｍ、１．９ｍｍ、または２．０ｍｍ異なっていてもよい。

試薬ウェルと位置合わせピン用接触面スロットとを有する例示的な試薬トレイの接触面の上面図を図８に示す。図８の例示的な試薬カートリッジ４００に示すように、カートリッジは複数の試薬リザーバ４０１Ａ、４０１Ｂ、４０２Ａ、および４０２Ｂを備える。図８における試薬リザーバは、列をなしてｘ軸方向およびｙ軸方向に並んでいる。また図８に示すように、カートリッジは、マニホールドアセンブリ（図示しない）の対応する位置合わせピンと係合する接触面スロット４０３および４０４を備える。カートリッジはまた、試薬ウェルまたはリザーバをいくつ覆っていてもよい保護フォイルを備え、それらフォイルは、試薬カートリッジが穿孔シッパーと接触する際に、穿孔されうる。

本明細書に提示する試薬カートリッジは、試薬リザーバまたはウェルをいくつ備えていてもよい。試薬リザーバまたはウェルは、ｘ軸方向およびｙ軸方向にそっていかなる形態で並べてもよいが、カートリッジ内での試薬の輸送および保存が容易になるように並べる。代替的または追加的に、試薬リザーバまたはウェルは、ｘ軸方向およびｙ軸方向にそっていかなる形態で並べてもよいが、マニホールドのポートからｚ軸方向に沿って下向きに伸びるシッパーチューブの配列との連動に適するように並べる。より具体的には、試薬リザーバまたはウェルは、マトリクス状に並ぶ試薬シッパーと一斉に係合するのに適した並びであればいかなる形態でもよいが、液体試薬が試薬リザーバからシッパーへ吸い上げられることが可能であるよう並べる。

すべての試薬ウェルが、マニホールドアセンブリのすべてのシッパーチューブと一斉に連動しなければいけない訳ではない。例えば、試薬カートリッジは、ほかのリザーバまたはウェルがシッパーチューブの配列により係合しているときでも、非連動状態のままである１つ以上の試薬リザーバまたはウェルのサブセットを備えることができる。一例として、本明細書に提示するカートリッジは、複数の試薬リザーバに対応する配置をとる複数の洗浄リザーバを備えていてもよい。そのような配置により、試薬シッパーが試薬リザーバと係合しておらず洗浄バッファが洗浄リザーバからシッパーへ吸い上げられるとき、洗浄リザーバは試薬シッパーと一斉に係合する。図８に、試薬ウェル４０１Ａの列を示す例示的実施形態を提示する。カートリッジは、また、対応するウェル４０１Ｂの列も備える。ウェル４０１Ｂは、ｘ軸方向において互いに同じ配置方向を保持するが、ｙ軸方向においてはウェル４０１Ａからオフセットである。各オフセットウェル４０１Ｂは、例えば、１つのカートリッジを使用した後、別のカートリッジを使用する前とにシッパーチューブおよび流体ラインをすすぎ洗いするために設けた洗浄バッファを備えていてもよい。

代替的または追加的に、空のリザーバ、またはバッファ、試料、またはほかの試薬を有するリザーバがカートリッジ上にあってもよい。追加のリザーバはシッパーチューブと連動するする必要性はないが、連動することはできる。例えば、リザーバは、カートリッジを使用する間に、廃棄物、あふれ出た試薬、またはバッファで満たされてもよい。そのようなリザーバには、例えば、シッパーチューブと連動しないポートを介してアクセス可能となりうる。

カートリッジのリザーバを対応するシッパーチューブと容易に正確に位置合わせできるように、位置合わせスロットをカートリッジに配置してもよい。例えば、シッパーチューブの列をある１セットのリザーバから取り除き、別の試薬リザーバまたは洗浄リザーバのセットへ移動するという特定の実施形態においては、位置合わせスロットをカートリッジに配置して、試薬シッパーの列を１つまたは両方のリザーバセットと正確に位置合わせすることができる。図８に示すように、例示的なカートリッジは、ｘ軸方向に同じ配置方向を保持する各位置合わせスロット４０４を備えるが、それらスロットは、対応する位置合わせスロット４０３に対してｙ軸方向にオフセットである。本明細書に提示する実施形態のカートリッジは、流体アセンブリの特徴と適合する位置合わせを可能にする位置合わせスロットをいくつ備えていていてもよい。例えば、カートリッジは、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くの位置合わせスロットを備えることができる。位置合わせスロットは、流体システムの対応する位置合わせピンと係合し、流体システムの試薬シッパーは、試薬リザーバおよび／または洗浄リザーバと合致するよう配置可能となる。

特定の実施形態においては、流体システムにおいて１つ以上の試薬が再利用可能である。例えば、流体システムにおいて、試薬をフローセルへ送達し、該フローセルから該試薬を取り除き、該試薬を該フローセルへ再導入するよう構成する。図７に一構成を例示する。図７には、マニホールドアセンブリのキャッシュラインの上面図を示す。図７Ａの上部模式図に示すように、試薬キャッシュは、ほぼ使用済み試薬からほぼ未使用（完全未使用）試薬までの濃度勾配を維持することに用いることができる。いくつかの実施形態においては、キャッシュリザーバは、キャッシュリザーバ内における流体の混合を低減し、フローセルの最近位からフローセルの最遠位までのリザーバの長さに沿って液体試薬の勾配を維持することができる。試薬がキャッシュリザーバからフローセルへ戻し返されると、フローセルをまたいで流れる試薬は、ほぼ使用済み試薬からほぼ未使用（完全未使用）試薬までの勾配を形成するよう、勾配は維持される。

図７Ａの下部図に例示するように、マニホールドの流体工学により、試薬リザーバは、バルブ注入口１８０４を介してフローセル（図示しない）の入力ポートと流体連通する。バルブ１８０４は、フローセル（図示しない）と、ＣＬＭリザーバ、ＳＲＥリザーバ、ＩＭＦリザーバ、およびＬＡＭ１・ＬＰＭ１リザーバとの間の流体の流動を制御する。チャネル１８０２は、ポート１８０１を介して、ＣＬＭリザーバをバルブ注入口１８０４に流体接続する。チャネル１８０２の一部分は、フローセル（図示しない）の一本以上のレーンの容積と同等の容積の試薬を有する試薬キャッシュ１８０３を含む。試薬キャッシュ１８０３の容積が、チャネルのほかの部分１８０２と比較して増加しているため、未使用試薬の蓄えを試薬リザーバに維持しつつも、使用済み試薬を再利用のために保存することできる。よって、試薬リザーバ内の未使用試薬の蓄えが使用済み試薬により汚染されることを回避できる。

図７Ａに示す構成は例示的なものである。 ほかの構成によっても再利用を実現することが可能である。例えば、１つ以上のキャッシュリザーバの容積は、キャッシュリザーバと流体連通しているフローセルチャネルの容積の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１０００％、１５００％、２０００％、２５００％、３０００％、またはそれより大きい。代替的または追加的に、キャッシュリザーバは、１つ以上のフローセルチャネルを流れる液体試薬のある量がキャッシュリザーバへ流動することを可能にするのに十分な容積を有し、フローセルからの液体試薬は、フローセルに接触した後は、試薬リザーバに戻ることはない。例えば、その液体試薬のある量は、１つ以上のフローセルチャネルを流れる液体試薬の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１０００％、１５００％、２０００％、２５００％、３０００％、またはそれより多い。

本明細書に提示するキャッシュリザーバは、キャッシュリザーバ内における流体の混合を低減する。いくつかのそのような実施形態においては、流体の混合が低減することにより、フローセルの最近位からフローセルの最遠位までのリザーバの長さに沿って、液体試薬の勾配を維持することができる。代替的または追加的に、本明細書に提示するキャッシュリザーバは、キャッシュリザーバ内における流体の混合を促進する１つ以上の混合要素を備えていてもよい。任意の適した能動的または受動的な混合要素を、そのような実施形態で用いてもよい。例えば、混合要素はバッフル要素であってもよい。バッフル要素は、流体がキャッシュリザーバを輸送される際に流体の混合を促進するよう構成された、湾曲構造、またはほかの任意の受動的・能動的構造または流体的特徴を有する。代替的または追加的に、任意の適したポンプ、回転子、回転翼、注入口等を、キャッシュリザーバ内での能動的混合に用いることができる。

本明細書に提示するキャッシュリザーバは、その目的に適しているかぎり、いかなる形状、容積、長さであってもよい。特定の実施形態においては、キャッシュリザーバは、１つ以上のフローセルチャネルを流れる液体試薬のある量がキャッシュリザーバへ流動することを可能にするのに十分な容積を有し、フローセルからの液体試薬は、フローセルに接触した後は、試薬リザーバに戻ることがない限り、あらゆる形状、容積、および／または長さのキャッシュリザーバを、本明細書に提示する流体システムに用いることができる。例えば、キャッシュリザーバは蛇行したチャネルであってもよい。別の例としては、キャッシュリザーバは、円柱または非円柱形状であってもよい。さらに、本明細書に提示する流体システム中において、１つ以上のキャッシュリザーバを備える流体チャネルはいくつあってもよい。

本明細書に提示するキャッシュリザーバは、ポンプと流体連通していてもよく、該ポンプは、キャッシュリザーバからフローセルへ液体試薬を移動させ、かつ該フローセルから該キャッシュリザーバへ液体試薬を戻すよう構成される。フローセルへの試薬の進入およびフローセルからの試薬の退出は、フローセルの同じポートを通して行われる。代替的または追加的に、フローセルへの試薬の進入およびフローセルからの試薬の退出は、フローセルの異なるポートを通して行われることもあるが、その場合でも試薬の再利用は達成できる。例えば、本明細書に提示の流体システムは、２０１３年２月１３日に出願された「INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING」と題する、米国特許出願第１３／７６６，４１３号に記載される各装置構造と関連して記載された、あらゆる再利用リザーバおよび構成を利用することができる。該出願の内容は参照により本明細書に完全に援用される。

図７Ｂにおける模式図に、本明細書に提示する再利用方法の例示的な実例を示す。該方法は試薬の相互流動を利用するものであり、試薬はキャッシュラインからフローセルへ流動し、それに続いて、キャッシュラインはフローセルから部分的補充を受ける。図７Ｂの最上部図に示す状態においては、キャッシュリザーバ１９０３は１００μＬの試薬１９０６を含み、スプリッタ１９０４およびバルブ１９１１を介してフローセルのレーン１９０５と流体連通している。バルブ１９０４は、試薬１９０６がフローセルのレーン１９０５へ流れるよう発動する。同時に、未使用試薬１９０７が試薬リザーバから吸い上げられ、キャッシュリザーバ１９０３の左側の空間を満たす。フローセル上の試薬が使用された後、バルブ１９１１は、使用済み試薬１９０６の一部（７５μＬ）をキャッシュリザーバ１９０３へ戻す。使用済み試薬１９０６の残りの部分（２５μＬ）はバルブ１９１１により廃棄物容器へ移送される。サイクル１が終わると、キャッシュリザーバ１９０３は、キャッシュリザーバの長さにわたって、２５μＬの未使用試薬１９０７と７５μＬの使用済み試薬１９０６とを含む勾配を有する。キャッシュリザーバからフローセルへ、その後またキャッシュリザーバへという試薬の相互流動のサイクルを繰り返す。各サイクルにおいて、バルブ１９１１により、使用済み試薬１９０６の一部（２５μＬ）は廃棄物容器へ移送され、使用済み試薬１９０６の残りの部分はキャッシュリザーバ１９０３へ戻される。そのようなサイクルを４回繰り返すと、キャッシュリザーバ１９０３は、２５μＬの未使用試薬１９１０と、２５μＬの１度使用した試薬１９０９と、２５μＬの２度使用した試薬１９０８と、２５μＬの３度使用した試薬１９０７とを含む。

図７Ａおよび図７Ｂに示す構成は例示的なものである。ほかの構成によっても、特定の工程で用いる１つ以上の試薬を再利用することは可能である。いくつかの試薬を再利用する構成においては、試薬を再利用する流体構成は、特定の工程で用いる試薬サブセットにのみ用いられることは理解されたい。例えば、試薬の第１のサブセットは、強靭ゆえ再利用可能だが、第２のサブセットは、１度使用した後、汚染や劣化、またはほかの望まない影響にさらされ易くなるという場合もある。よって、流体システムは試薬の第１のサブセットを再利用するために構成することができる一方、試薬の第２のセットの流体工学は一度きりの使用のために構成されることとなる。

ある特定の試薬は何度でも再利用でき、特定の工程に適している。例えば、本明細書にて例示した、本明細書にて引用した参照文献に記載された、またはそうでなければ、本明細書に記載の工程で用いる既知の１つ以上の試薬は、少なくとも２回、３回、４回、５回、１０回、２５回、５０回、またはそれよりも多い回数再利用できる。実際、種々の望ましい試薬は、いかなるものでも、少なくとも何度も再利用できる。特定の試薬のどの部分が、再利用のためにキャッシュリザーバへ戻されてもよい。本明細書にて例示した、本明細書にて引用した参照文献に記載された、またはそうでなければ、本明細書に記載の工程で用いる既知の１つ以上の試薬の容積は、１本以上のフローセルのレーン上の、引き続きの再利用のためにキャッシュリザーバへ戻される試薬の容積の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％であってもよい。代替的または追加的に、１本以上のフローセルのレーン上の試薬の容積の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を、廃棄物容器へ移送、またはそうでなければフローセル上の引き続きの利用から取り除いてもよい。

塩基配列決定作業への適用が例示されてはいるが、試薬を再利用するための流体構成および方法は、ほかの作業に適用してもよい。特に、試薬を送達する際、あるサイクルの繰返しを伴う作業に適用してもよい。適用できる例示的な作業としては、ポリペプチド、多糖、または合成高分子のような重合体の配列決定作業やそのような重合体の合成作業が挙げられる。

上記実施形態に示したように、試薬を再利用する方法は、ａ）液体試薬を試薬リザーバからキャッシュリザーバへ吸い上げるステップであって、該キャッシュリザーバは、試薬リザーバおよびフローセルの少なくとも１つのチャネルと流体連通している、吸い上げるステップと、ｂ）試薬をキャッシュリザーバからフローセルの少なくとも１つのチャネル上へ輸送するステップと、ｃ）フローセルチャネル上の試薬の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％をキャッシュリザーバへ輸送するステップであって、フローセルからの液体試薬は、フローセルと接触後、試薬リザーバへ戻らない、輸送するステップと、ｄ）ステップｂ）とステップｃ）とを繰り返し、フローセル上の液体試薬の再利用を達成する、ステップとを含みうる。１つ以上のキャッシュリザーバは、ポンプと流体連通していてもよく、該ポンプは、キャッシュリザーバからフローセルへ液体試薬を移動させ、かつ該フローセルから該キャッシュリザーバへ液体試薬を戻すよう構成する。フローセルへの試薬の進入およびフローセルからの試薬の退出は、フローセルの同じポートを通して行われる。代替的または追加的に、フローセルへの試薬の進入およびフローセルからの試薬の退出は、フローセルの異なるポートを通して行われることもあるが、その場合でも試薬の再利用は達成できる。いくつかの実施形態においては、ステップｃ）において、キャッシュリザーバへ輸送されなかった、フローセルからの試薬を移送してもよい。一例として、キャッシュリザーバへ輸送されなかった、フローセルからの試薬は、廃棄物リザーバへ輸送してもよい。ステップｂ）およびステップｃ）のうちの１つまたは両方のステップにおける試薬の輸送は、キャッシュリザーバとフローセルとを流体接続するバルブを介して行われてもよい。ステップｂ）およびステップｃ）のうちの１つまたは両方のステップにおける試薬の輸送は、例えば、単一方向への流体の流動により行われてもよいし、または相互流動により行われてもよい。

本流体システムおよび方法の諸実施形態は、塩基配列決定技法に特に有用である。例えば、１塩基合成反応（sequencing-by-synthesis：ＳＢＳ）プロトコールに特に適する。ＳＢＳでは、核酸テンプレートに沿って伸長する核酸プライマーを観察して該テンプレート内のヌクレオチド配列を決定する。基本となる化学プロセスは、重合（例えばポリメラーゼ酵素による触媒作用等）またはライゲーション（例えばリガーゼ酵素による触媒作用等）であり得る。ポリメラーゼベースＳＢＳの特定の実施形態では、蛍光標識したヌクレオチドをテンプレートに応じてプライマーに付加し（それによりプライマーを伸長させ）、プライマーに付加したヌクレオチドの順序および型の検出を使用してテンプレートの配列を決定する。複数の異なるテンプレートを、テンプレート毎の発生事象が識別可能な条件下においた表面上でＳＢＳ法に供することができる。例えば、テンプレートは、各テンプレートが空間的に識別可能となるアレイ表面上に存在させることができる。典型的には、テンプレートはフィーチャーにおいて発生し、各フィーチャーはそれぞれ同じテンプレートの複数のコピー（「クラスター」または「コロニー」とも呼ばれる）を有する。ただし、ＳＢＳは、各フィーチャーがシングルテンプレート分子を有し、シングルテンプレート分子が互いに分解可能なアレイ（「単分子アレイ」とも呼ばれる）上で実行してもよい。

フローセルは、核酸アレイの収容に利用可能な基板である。配列決定技法では典型的に試薬の送達が複数サイクルにわたって繰り返し実行されるため、フローセルは配列決定技法に好都合である。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するにあたり、一種または複数の標識ヌクレオチドやＤＮＡポリメラーゼなどを核酸テンプレートのアレイが収容されたフローセル内に流し込むこと、またはそのようなフローセルを通過させることができる。プライマー伸長により標識ヌクレオチドが取り込まれるフィーチャーの検出は、例えば本明細書に記載の方法または装置を使用して行うことができる。任意選択で、ヌクレオチドがプライマーに付加された後にプライマー伸長の進行を停止させる可逆的停止特性をヌクレオチドに備えさせることもできる。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログをプライマーに付加することにより、当該部分にブロック解除剤が送達されるまで伸長が進行しないようにしてもよい。したがって、可逆的停止を使用する実施形態では、（検出の実行前または実行後に）ブロック解除試薬をフローセルに送達するようにしてもよい。送達ステップ間に洗浄を実行してもよい。その後、このサイクルをｎ回繰り返してプライマーをヌクレオチドｎ個分伸長させ、それにより長さｎの配列を検出することができる。例示的な配列決定技法は、例えばBentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されている。該文献および出願の内容は参照により本明細書に援用される。

ＳＢＳサイクルのヌクレオチド送達ステップでは、一度に単一の型のヌクレオチドを送達することも、複数の異なるヌクレオチド型（例えばＡ、Ｃ、Ｔ、およびＧ）を送達することもできる。一度に単一の型のヌクレオチドしか存在しないヌクレオチド送達構成では、各ヌクレオチドを個別送達特有の時間的分離に基づいて識別することができるので、必ずしも各ヌクレオチドに固有の標識を付する必要はない。したがって、配列決定方法または装置は、単色検出法を使用することができる。例えば、ミクロ蛍光計または読み込みヘッドは、単一の波長または単一の波長範囲で励起を生じさせるものであればよい。したがって、ミクロ蛍光計または読み込みヘッドは単一の励起源さえあればよく、マルチバンド励起フィルターは必ずしも必要でない。一度に複数の異なるヌクレオチドがフローセル内に存在することになるヌクレオチド送達構成では、混合物中の各ヌクレオチド型に付される蛍光標識の差に基づいて、様々なヌクレオチド型が取り込まれるフィーチャーを識別することができる。例えば、それぞれ異なる蛍光体を有する４種類のヌクレオチドを使用してもよい。一実施形態において、これら４種類の蛍光体は、スペクトル中の４種類の領域における励起を使用して識別することができる。例えば、ミクロ蛍光計または読み込みヘッドが４種類の励起放射源を含むようにしてもよい。別法として、読み込みヘッドに含まれる励起放射源を４種類未満とする一方、単一ソースに由来する励起放射の光学フィルタリングを利用とし、フローセルにおいて様々なレンジの励起放射を発生させることができるようにしてもよい。

いくつかの実施形態では、試料（例えば核酸フィーチャーのアレイ）中に存在する４種類のヌクレオチドを４色未満の色を使用して検出することができる。第１の例として、１対のヌクレオチド型を同一波長で検出することができるが、１対のヌクレオチド型は、当該対の一方の要素と他方の要素の強度差に基づいて識別すること、または当該対の一方の要素に対する、当該対の他方の要素について検出されたシグナルと比較して見かけのシグナルを顕在化または消失させる変化（例えば化学的修飾、光化学的修飾、または物理的修飾による）に基づいて識別することが可能である。第２の例として、４種のヌクレオチド型のうち３種目までを特定の条件下で検出可能としながら、４種目のヌクレオチド型には当該条件下で検出可能な標識を付さないようにすることもできる。第２の例におけるＳＢＳの一実施形態では、３種目までのヌクレオチド型の核酸への取り込みを、それぞれのシグナルの存在に基づいて決定し、４種目のヌクレオチド型の核酸への取り込みを、シグナルの欠如に基づいて決定することができる。第３の例として、２種の画像または２種のチャネル内で１種のヌクレオチド型を検出することができ（例えばベースは同じであるが標識が異なる２つの種（species）の混合物を使用すること、２種の標識を有する単一の種を使用すること、または両チャネル内で検出される標識を有する単一の種を使用することができ）、他のヌクレオチド型は２種の画像またはチャネルのうちの一方のみで検出される。この第３の例において、２種の画像間または２種のチャネル間の比較は、異なるヌクレオチド型を識別する働きをする。

上段に記載した３種の例示的な構成は、互いに排他的なものではなく様々な組合せで使用することができる。例示的な一実施形態は、蛍光標識を有する、可逆的にブロックされたヌクレオチド（ｒｂＮＴＰ）を使用するＳＢＳ法である。この形式では、４種の異なるヌクレオチド型を配列決定対象となる核酸フィーチャーのアレイに送達することができる。また、可逆的ブロック群の存在により各フィーチャーにつき１つの取り込み事象しか発生しない。本例においてアレイに送達されるヌクレオチドは、以下のヌクレオチド型を含むことができる。すなわち、第１のチャネルで検出される第１のヌクレオチド型（例えば、第１の励起波長で励起したときに第１のチャネルで検出される標識を有するｒｂＡＴＰ）、第２のチャネルで検出される第２のヌクレオチド型（例えば、第２の励起波長で励起したときに第２のチャネルで検出される標識を有するｒｂＣＴＰ）、第１のチャネルと第２のチャネルの両方で検出される第３のヌクレオチド型（例えば、第１および／または第２の励起波長で励起したときに両チャネルで検出される少なくとも１種の標識を有するｒｂＴＴＰ）、およびどちらのチャネルで検出される標識も有しない第４のヌクレオチド型（例えば、外因性標識のないｒｂＧＴＰ）である。

これら４種のヌクレオチド型が上例のアレイと接触したときに検出作業を実行して、例えばアレイの２種の画像をキャプチャすることができる。これらの画像は別々のチャネルにおいて同時に取得しても順次取得してもよい。第１の励起波長および第１のチャネル内の蛍光波長を使用して得られる第１の画像は、第１および／または第３のヌクレオチド型（例えばＡおよび／またはＴ）が取り込まれたフィーチャーを示す。第２の励起波長および第２のチャネル内の蛍光波長を使用して得られる第２の画像は、第２および／または第３のヌクレオチド型（例えばＣおよび／またはＴ）が取り込まれたフィーチャーを示す。各フィーチャーに取り込まれるヌクレオチド型の明確な同定は、これら２種の画像を比較して下記のフィーチャーを特定することによって決定することができる。すなわち、第１のヌクレオチド型（例えばＡ）が取り込まれた、第１のチャネルでのみ確認されるフィーチャー、第２のヌクレオチド型（例えばＣ）が取り込まれた、第２のチャネルでのみ確認されるフィーチャー、第３のヌクレオチド型（例えばＴ）が取り込まれた、両チャネルで確認されるフィーチャー、および第４のヌクレオチド型（例えばＧ）が取り込まれた、どちらのチャネルでも確認されないフィーチャーである。なお、本例においてＧが取り込まれたフィーチャーの位置は、（他の３種のヌクレオチド型のうちの少なくとも１種が取り込まれる）他のサイクルから決定することができる。４色未満の色の検出を使用して４種類のヌクレオチドを識別する例示的な装置および方法は、例えば米国仮出願第６１／５３８，２９４号に記載されている。該出願の内容は参照により本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、核酸を表面に付加し、配列決定前または配列決定中に増幅させることができる。増幅は、例えば表面上に核酸クラスターを形成するブリッジ増幅を使用して行うこともできる。有用なブリッジ増幅方法は、例えば米国特許第５，６４１，６５８号、米国特許出願公開第２００２／００５５１００号、米国特許第７，１１５，４００号、米国特許出願公開第２００４／００９６８５３号、米国特許出願公開第２００４／０００２０９０号、米国特許出願公開第２００７／０１２８６２４号、または米国特許出願公開第２００８／０００９４２０号に記載されている。該特許文献の内容は参照により本明細書に援用される。表面上の核酸を増幅させる別の有用な方法は、例えばLizardi etal., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)や米国特許出願公開第２００７／００９９２０８号に記載されているローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）である。該文献および出願の内容は参照により本明細書に援用される。ビーズを利用したエマルジョンＰＣＲも使用可能であり、例えばDressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003)、国際公開第０５／０１０１４５号、米国特許出願公開第２００５／０１３０１７３号、または米国特許出願公開第２００５／００６４４６０号に記載がある。該文献および出願の内容は参照により本明細書に援用される。

上述のとおり、配列決定の実施形態は繰り返し処理の一例である。本開示の方法は、繰り返し処理との相性が良い。以下および本明細書の他の箇所に記載する実施形態を参照されたい。

このように、本明細書に記載の配列決定方法は、（ｉ）光透過性表面を具備するフローセル、（ｉｉ）核酸試料、（ｉｉｉ）配列決定反応のための複数の試薬、および（ｉｖ）前記試薬を前記フローセルに送達する流体システムを備えた流体システムを提供するステップ（ａ）と、（ｉ）ｘおよびｙ次元の画像平面において広視野画像を検出するように構成した対物レンズをそれぞれ具備する複数のミクロ蛍光計、および（ｉｉ）試料ステージを備える検出装置を提供するステップ（ｂ）と、塩基配列決定作業における流体操作をカートリッジ内で実行し、該塩基配列決定作業における検出操作を前記検出装置において実行するステップ（ｃ）とを含み、（ｉ）前記流体システムによって前記試薬が前記フローセルに送達され、（ｉｉ）前記複数のミクロ蛍光計によって前記核酸のフィーチャーの広視野画像が検出され、（ｉｉｉ）少なくとも一部の試薬が前記フローセルからキャッシュリザーバに取り出されることを特徴とする。

本出願全体にわたって、種々の出版物および／または特許出願を参照した。これら出版物等の開示内容は、参照により本出願に完全に援用される。

本明細書における「備える（comprising）」という用語は、オープンエンド形式を意図し、記載した要素だけでなく、いかなる追加的要素もさらに含むことを意図する。

いくつかの実施形態を記載したが、種々の変形が行われるうることは理解されたい。よって、ほかの実施形態も添付の実用新案登録請求の範囲に含まれる。

Claims (24)

1. ａ）再利用可能な液体試薬を試薬リザーバからキャッシュリザーバへ吸い上げるステップであって、該キャッシュリザーバは、前記試薬リザーバおよびフローセルの少なくとも１つのチャネルと流体連通している、吸い上げるステップと、
   ｂ）前記試薬を前記キャッシュリザーバから前記フローセルの少なくとも１つのチャネル上へ輸送するステップと、
   ｃ）前記フローセルのチャネル上の前記試薬の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を前記キャッシュリザーバへ輸送するステップであって、前記フローセルからの前記液体試薬は、前記フローセルと接触後、前記試薬リザーバへ戻らない、輸送するステップと、
   ｄ）ステップｂ）とステップｃ）とを繰り返して前記フローセル上の前記液体試薬の再利用を達成するステップと、を含む試薬を再利用する方法。
2. １つ以上の前記キャッシュリザーバは、ポンプと流体連通しており、該ポンプは、前記キャッシュリザーバからフローセルへ液体試薬を移動させ、かつ該フローセルから該キャッシュリザーバへ液体試薬を戻すよう構成され、前記フローセルへの試薬の進入および前記フローセルからの試薬の退出は、前記フローセルの同じポートを通して行われる、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ｃ）において前記キャッシュリザーバへ輸送されなかった、前記フローセルからの試薬は、廃棄物リザーバへ輸送される、請求項２に記載の方法。
4. ステップｂ）およびステップｃ）のうちの一方または両方の輸送するステップは、前記キャッシュリザーバと前記フローセルとを流体接続するバルブを介して行われる、請求項１に記載の方法。
5. ステップｂ）およびステップｃ）のうちの一方または両方の輸送するステップは、単一方向への流体の流動により行われる、請求項１に記載の方法。
6. ステップｂ）およびステップｃ）のうちの一方または両方の輸送するステップは、相互流動により行われる、請求項１に記載の方法。
7. 前記液体試薬は、塩基配列決定を行うための試薬を含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記試薬は、ポリメラーゼを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記試薬は、ヌクレオチドまたは種々のヌクレオチドの混合物を含む、請求項７に記載の方法。
10. 一種または複数種の試薬を前記フローセル上に流した後でステップｄ）を行う、請求項１に記載の方法。
11. ステップｃ）において前記キャッシュリザーバに戻った試薬は、該キャッシュリザーバ内の類似の試薬と混ざり、それにより、ステップｂ）とステップｃ）とを複数回繰り返すことから類似の試薬を含む混合試薬が形成される、請求項１に記載の方法。
12. 前記キャッシュリザーバに戻った試薬と新しい試薬との混合は、前記キャッシュリザーバ内では最小限に抑えられる、請求項１に記載の方法。
13. 試薬カートリッジからフローセルへ試薬を送達するための流体システムであって、
    試薬カートリッジとフローセルの注入口との間で流体連通が達成されるよう構成した複数のチャネルを備える試薬マニホールドと、
    前記マニホールドの複数のポートから下方へ伸びる複数の試薬シッパーであって、前記各試薬シッパーは、試薬カートリッジの試薬リザーバへ挿入され、前記試薬リザーバから前記シッパーへ液体試薬が吸い上げられるよう構成した、前記複数の試薬シッパーと、
    前記リザーバと前記フローセルの注入口との間の流体連通を媒介するよう構成した少なくとも１つのバルブと、を備えた流体システムを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
14. 拡散接合された多層試薬マニホールドであって、該マニホールドは少なくとも１０個、１５個、または２０個のポートを備え、該各ポートはシッパーを介して別の試薬リザーバから試薬を吸い上げ、前記マニホールド内の流体チャネルを介してフローセルの１つ以上のチャネルと流体連通するよう構成された、試薬マニホールドを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
15. （ｉ）光透過性表面を具備するフローセル、
    （ｉｉ）核酸試料、
    （ｉｉｉ）配列決定反応のための試薬を保存する試薬リザーバ、および
    （ｉｖ）前記試薬リザーバをキャッシュリザーバを介して前記フローセルと流体連通させるとともに、前記試薬を前記フローセルに送達する流体ラインシステム
    を備えた流体システムを提供するステップ（ａ）と、
    （ｉ）ｘおよびｙ次元の画像平面において広視野画像を検出するように構成した対物レンズを具備するミクロ蛍光計、および
    （ｉｉ）試料ステージ
    を備える検出装置を提供するステップ（ｂ）と、
    塩基配列決定作業における流体操作を前記流体システム内で実行し、該塩基配列決定作業における検出操作を前記検出装置において実行するステップ（ｃ）であって、
    （ｉ）前記流体ラインシステムによって前記試薬が前記フローセルに送達され、
    （ｉｉ）前記ミクロ蛍光計によって前記核酸のフィーチャーの広視野画像が検出され、
    （ｉｉｉ）前記試薬の再利用のために、少なくとも一部の試薬が前記フローセルから前記キャッシュリザーバに取り出される、ステップ（ｃ）と、を含む塩基配列を決定する方法。
16. 前記流体システムは、廃棄物リザーバをさらに備え、前記塩基配列決定作業における流体操作は、前記少なくとも一部の試薬を前記フローセルから前記廃棄物リザーバに取り出すことをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記キャッシュリザーバは、ポンプと流体連通しており、該ポンプは、前記キャッシュリザーバから前記フローセルへ試薬を移動させ、かつ該フローセルから該キャッシュリザーバへ試薬を戻すよう構成され、前記フローセルへの試薬の進入および前記フローセルからの試薬の退出は、前記フローセルの同じポートを通して行われる、請求項１５に記載の方法。
18. ステップ（ｃ）（ｉｉｉ）において前記キャッシュリザーバへ輸送されなかった、前記フローセルからの試薬は、廃棄物リザーバへ輸送される、請求項１５に記載の方法。
19. ステップ（ｃ）（ｉ）またはステップ（ｃ）（ｉｉｉ）における試薬送達は、前記キャッシュリザーバと前記フローセルとを流体接続するバルブを介して行われる、請求項１５に記載の方法。
20. ステップ（ｃ）（ｉ）またはステップ（ｃ）（ｉｉｉ）における試薬送達は、単一方向への流体の流動により行われる、請求項１５に記載の方法。
21. ステップ（ｃ）（ｉ）またはステップ（ｃ）（ｉｉｉ）における試薬送達は、相互流動により行われる、請求項１５に記載の方法。
22. 前記試薬は、塩基配列決定を行うための試薬である、請求項１５に記載の方法。
23. 前記試薬は、ポリメラーゼである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記試薬は、ヌクレオチドまたは種々のヌクレオチドの混合物である、請求項２２に記載の方法。

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