ES2939140T3 - Sistema de fluido para el suministro de reactivos a una celda de flujo - Google Patents

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Abstract

Un sistema de fluidos que incluye un colector de reactivos que comprende una pluralidad de canales configurados para la comunicación de fluidos entre un cartucho de reactivo y una entrada de una celda de flujo; una pluralidad de sippers de reactivos que se extienden hacia abajo desde puertos en el colector, cada uno de los sippers de reactivos está configurado para colocarse en un depósito de reactivos en un cartucho de reactivos para que el reactivo líquido pueda extraerse del depósito de reactivos al sipper; al menos una válvula configurada para mediar en la comunicación fluida entre los depósitos y la entrada de la celda de flujo. El colector de reactivos también puede incluir depósitos de caché para la reutilización de reactivos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema de fluido para el suministro de reactivos a una celda de flujo
Antecedentes
Las realizaciones de la presente descripción se refieren en general a aparatos y métodos para la manipulación de fluido y la detección óptica de muestras, por ejemplo, en procedimientos de secuenciación de ácidos nucleicos.
Nuestro genoma proporciona un modelo para predecir muchas de nuestras predisposiciones inherentes tales como nuestras preferencias, cualidades, susceptibilidad a la enfermedad y capacidad de respuesta a fármacos terapéuticos. Un genoma humano individual contiene una secuencia de más de 3 mil millones de nucleótidos. Las diferencias en sólo una fracción de esos nucleótidos imparten muchas de nuestras características únicas. La comunidad de investigación está haciendo un esfuerzo impresionante en desentrañar las características que conforman el modelo y con la comprensión más completa de cómo la información en cada modelo se refiere a la salud humana. Sin embargo, nuestra comprensión está lejos de ser completa y esto dificulta el movimiento de la información de los laboratorios de investigación a la clínica donde la esperanza es que un día cada una de ellas tenga una copia de nuestro propio genoma personal de modo que podamos sentarnos con nuestro médico para determinar las opciones apropiadas para un estilo de vida saludable o una evolución adecuada del tratamiento.
El cuello de botella actual es una cuestión de rendimiento y escala. Un componente fundamental del desentrañado del modelo para cualquier individuo dado es determinar la secuencia exacta de los 3 mil millones de nucleótidos en su genoma. Las técnicas están disponibles para hacer esto, pero esas técnicas normalmente cuestan miles y miles de dólares y tardan muchos días en realizarse. Además, la relevancia clínica de la secuencia genómica de cualquier individuo es una cuestión de comparar características únicas de su secuencia genómica (es decir, su genotipo) con genomas de referencia que están correlacionados con características conocidas (es decir, fenotipos). El problema de escala y rendimiento se vuelve evidente cuando se considera que los genomas de referencia se crean en base a las correlaciones de un genotipo con un fenotipo que surgen de estudios de investigación que normalmente usan miles de individuos para ser estadísticamente válidos. Por tanto, los miles de millones de nucleótidos pueden secuenciarse eventualmente para miles de individuos para identificar cualquier correlación de un genotipo con un fenotipo clínicamente relevante. También se hace más evidente la necesidad de tecnologías de secuenciación muy económicas y rápidas, multiplicadas además por el número de enfermedades, respuestas de fármacos y otras características clínicamente relevantes. Los documentos US 2010/009871, US 8.404.198, US 2011/008223, US 2008/056948, US 2011/287447, US 2012/178091 y US 2003/175163 describen sistemas de fluido para suministrar reactivos desde un cartucho de reactivos a una celda de flujo.
Lo que se necesita es una reducción en el coste de la secuenciación que impulse grandes estudios de correlación genética llevados a cabo por científicos de investigación y que hagan que la secuenciación sea accesible en el entorno clínico para el tratamiento de pacientes individuales que producen decisiones de cambio de vida. Las realizaciones de la invención expuestas en el presente documento satisfacen esta necesidad y también proporcionan otras ventajas.
Breve resumen
La presente invención se define mediante las reivindicaciones independientes 1 y 8. Las realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes.
La presente descripción proporciona un sistema tal como se define en la reivindicación 1.
Esta descripción además proporciona un método tal como se define en la reivindicación 8.
Los detalles de una o más realizaciones se exponen en los dibujos adjuntos y la siguiente descripción. Otras características, objetos y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A muestra un sistema de fluido con sorbedores de reactivos que interactúan con un cartucho de reactivos.
La figura 1B muestra una vista isométrica de un conjunto de colector y muestra un ejemplo de una disposición en planta de canales de fluido dentro del colector.
La figura 2 muestra una vista en perspectiva frontal de un conjunto de colector que tiene sorbedores de reactivos, válvulas y pasadores de alineación. También muestra sorbedores de diferentes longitudes.
La figura 3 muestra una vista superior de un conjunto de colector que muestra una posible disposición en planta de canales de fluido dentro del colector.
La figura 4 muestra una vista en sección transversal de canales dentro de un colector, que incluye vistas en sección transversal de una línea de almacenamiento temporal, y un canal de fluido de almacenamiento no temporal.
La figura 5 muestra una variedad de uniones para conectar un puerto de reactivos con dos válvulas.
La figura 6 muestra una vista en sección transversal de un cartucho de reactivos que tiene pocillos de profundidades variables.
La figura 7A muestra una vista superior simplificada de líneas de almacenamiento temporal en un conjunto de colector según una realización.
La figura 7B muestra diversas etapas de reutilización de reactivos en un método que utiliza flujo recíproco de reactivo desde una línea de almacenamiento temporal hasta una celda de flujo, seguido de rellenado parcial de la línea de almacenamiento temporal desde la celda de flujo.
La figura 8 muestra una vista superior de una interfaz de bandeja de reactivos que tiene pocillos de reactivos y ranuras de interfaz para pasadores de alineación.
La figura 9 muestra un mapa de fluido para un sistema de fluido.
La figura 10 muestra una vista detallada de los sorbedores de reactivos que incluyen sorbedores flexibles y un sorbedor de perforación.
Descripción detallada
Esta descripción proporciona métodos y sistemas de fluido para proporcionar reactivos a una cámara tal como una celda de flujo. Una aplicación particularmente útil es la detección de una muestra biológica inmovilizada. Por ejemplo, los métodos y sistemas expuestos en el presente documento pueden usarse en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. Puede usarse una variedad de técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos que utilizan muestras y/o reactivos detectables de manera óptica y no óptica. Estas técnicas son particularmente adecuadas para los métodos y aparatos de la presente descripción y, por tanto, destacan diversas ventajas para realizaciones particulares de la invención. Algunas de esas ventajas se exponen a continuación con fines ilustrativos y, aunque se ejemplifican aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos, las ventajas pueden extenderse también a otras aplicaciones.
Los sistemas de fluido expuestos en el presente documento son particularmente útiles con cualquiera de las configuraciones del aparato de detección y los métodos de secuenciación expuestos en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 13/766.413 presentada el 13 de febrero de 2013 y titulada “ INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING” .
En realizaciones particulares, puede proporcionarse una muestra que va a detectarse a una cámara de detección usando un sistema de fluido tal como se proporciona en el presente documento. Tomando el ejemplo más específico de una aplicación de secuenciación de ácidos nucleicos, el sistema de fluido puede incluir un conjunto de colector que puede colocarse en comunicación de fluido con uno o más depósitos para contener reactivos de secuenciación, depósitos para contener reactivos de preparación de muestras, depósitos para contener productos de desecho generados durante la secuenciación, y/o bombas, válvulas y otros componentes capaces de mover fluidos a través de una celda de flujo.
En realizaciones particulares, un sistema de fluido puede configurarse para permitir la reutilización de uno o más reactivos. Por ejemplo, el sistema de fluido puede configurarse para suministrar un reactivo a una celda de flujo, luego retirar el reactivo de la celda de flujo y luego volver a introducir el reactivo a la celda de flujo. Una ventaja de reutilizar reactivos es reducir el volumen de desechos y reducir el coste de los procedimientos que utilizan reactivos costosos y/o reactivos que se suministran a altas concentraciones (o en grandes cantidades). La reutilización de reactivos aprovecha la comprensión de que el agotamiento de reactivo se produce sólo o principalmente en la superficie de la celda de flujo y, por tanto, la mayoría del reactivo no se usa y puede someterse a reutilización.
La figura 1A muestra un sistema 100 de fluido a modo de ejemplo que tiene sorbedores 103 y 104 de reactivos y válvulas 102 que aprovechan las ventajas de los sistemas de fluido que se proporcionan por varias realizaciones expuestas en el presente documento. El sistema 100 de fluido incluye un conjunto 101 de colector que contiene diversos componentes fijos que incluyen, por ejemplo, sorbedores de reactivos, válvulas, canales, depósitos y similares. Está presente un cartucho 400 de reactivos que tiene depósitos 401 y 402 de reactivos configurados para acoplar simultáneamente un conjunto de sorbedores 103 y 104 de reactivos a lo largo de una dimensión z de tal manera que el reactivo líquido puede extraerse de los depósitos de reactivos en los sorbedores.
En la figura 1B se muestra un conjunto 101 de colector a modo de ejemplo que puede usarse para proporcionar reactivos líquidos desde los depósitos de reactivos a una celda de flujo. El colector incluye sorbedores 103 y 104 de reactivos que se extienden hacia abajo en una dimensión z desde los puertos en el colector. Los sorbedores 103 y 104 de reactivos pueden colocarse en uno o más depósitos de reactivos (no mostrados) en un cartucho de reactivos. El colector también incluye canales 107 que conectan en comunicación de fluido el sorbedor 103 de reactivos a una válvula 102 y una válvula 109. Los sorbedores 103 y 104 de reactivos, los canales 107 y la válvula 102 median la comunicación de fluido entre los depósitos de reactivos y una celda de flujo (no mostrada). Las válvulas 102 y 109 pueden seleccionar individualmente, o en conjunto, sorbedores 103 ó 104 y a través de canales tales como 107, median la comunicación de fluido entre los depósitos de reactivos y una celda de flujo (no mostrada).
Los aparatos mostrados en las figuras 1A y 1B son a modo de ejemplo. A continuación, se exponen con más detalle realizaciones a modo de ejemplo adicionales de los métodos y el aparato de la presente descripción que pueden usarse alternativa o adicionalmente al ejemplo de las figuras 1A y 1B.
La figura 2 muestra otro conjunto de colector a modo de ejemplo que tiene sorbedores de reactivos y válvulas. El colector tiene pasadores 105 de alineación que sobresalen hacia abajo desde el colector en un eje paralelo a los sorbedores de reactivos. Los pasadores 105 de alineación son más largos a lo largo de la dimensión z en comparación con los sorbedores de reactivos, aunque en realizaciones alternativas también pueden ser de igual longitud o más cortos. Los pasadores 105 de alineación están configurados para acoplarse con una o más ranuras de interfaz correspondientes en un cartucho de reactivos (no mostrado). Los sorbedores 103 y 104 de reactivos se acoplan al colector a través de puertos 106 que están alojados en el cuerpo de colector. Los sorbedores 104 de reactivos son más largos en comparación con los sorbedores 103 de reactivos, para extraer líquido de depósitos de reactivos de una profundidad variable que corresponde a la profundidad del sorbedor 103 ó 104 de reactivos. En realizaciones alternativas, los sorbedores 103 y 104 pueden ser de longitudes iguales, o pueden cambiar de longitudes dominantes.
También se muestran en la figura 2 canales 107A y 107B que residan en planos x-y independientes. Los canales 107A y 107B independientes pueden originarse a partir de un solo canal que luego se bifurca en una unión 109 en T que genera múltiples canales que residen en planos independientes. El colector dirige el reactivo líquido de un sorbedor a una o más válvulas haciendo que los canales que se conectan a una válvula 102 particular residan o bien, en su totalidad, en el mismo plano A , o bien una combinación del plano A y B, mientras que los canales que se conectan a cualquier otra válvula pueden compartir esta característica del origen coplanar o interplanar.
La figura 3 muestra una vista superior de un conjunto 101 de colector que muestra una posible disposición en planta de canales de fluido dentro del colector. Los canales 107A y 107B de fluido se originan a partir de un solo puerto 106 y conectan el puerto 106 a cualquier válvula 102A o 102b . Determinados canales incluyen un depósito 108 de almacenamiento temporal que tiene suficiente volumen para permitir que una cantidad de reactivo líquido fluya desde una celda de flujo (no mostrada) al depósito 108 de almacenamiento temporal de tal manera que el reactivo líquido de la celda de flujo no se dirige de vuelta al depósito de reactivos (no mostrado) después de ponerse en contacto con la celda de flujo. También se muestran en la figura 3 posiciones a modo de ejemplo de uno o más pasadores 105 de alineación. El conjunto de colector mostrado en la figura 3 también incluye puertos 111 de entrada para tampones compartidos. Cada una de las válvulas 102A y 102B están configuradas con puertos de entrada correspondientes a cada puerto 106 de reactivos y con unos puertos 112 y 110 de salida comunes que conectan en comunicación de fluido a una celda de flujo y un puerto 113 y 109 de desechos que se conecta en comunicación de fluido a un receptáculo de desechos.
Tal como se demuestra mediante las realizaciones a modo de ejemplo anteriores, un sistema de fluido para suministrar reactivos desde un cartucho de reactivos a una celda de flujo puede incluir un colector de reactivos que comprende una pluralidad de canales configurados para comunicación de fluido entre un cartucho de reactivos y una entrada de una celda de flujo. El uso de un colector en sistemas de fluido proporciona varias ventajas sobre el uso del tubo solo. Por ejemplo, un colector con canales fijos reduce la probabilidad de error durante el ensamblaje, tal como la mala colocación de los accesorios de tubo, así como el apriete excesivo o insuficiente de las conexiones. Además, un colector proporciona facilidad de mantenimiento, lo que permite, por ejemplo, una rápida sustitución de una unidad completa en lugar de pruebas que requieren mucho tiempo y la sustitución de líneas individuales.
El uno o más de los canales del colector pueden incluir una carril de fluido a través de un material sólido. El carril puede ser de cualquier diámetro para permitir el nivel deseado de transferencia de fluido a través del carril. El carril puede tener un diámetro interior de, por ejemplo, menos de 0,1 mm, 0,2 mm, 0,3 mm, 0,4 mm, 0,5 mm, 0,6 mm, 0,7 mm, 0,8 mm, 0,9 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm o menos de 10 mm de diámetro. La configuración de carril puede ser, por ejemplo, recta o curvada. Alternativa o adicionalmente, el carril puede tener una combinación de partes curvas y partes rectas. La sección transversal del carril puede ser, por ejemplo, cuadrada, redonda, en forma de D, o cualquier otra forma que permita un nivel deseado de transferencia de fluido a través del carril. La figura 4 ejemplifica un carril de fluido a través de un cuerpo de colector y muestra una vista en sección transversal de un carril 302. El canal 302 a modo de ejemplo mostrado en la figura 4 tiene una sección transversal en forma de “ D” formada por un semicírculo de 0,65 mm de diámetro fusionado con un rectángulo de 0,65 mm x 0,325 mm adicional.
El canal entre el sorbedor y la válvula puede alojarse completamente dentro del cuerpo de colector. Alternativa o adicionalmente, el canal puede incluir una o más partes que son externas al colector. Por ejemplo, los tubos tales como, por ejemplo, tubos flexibles pueden conectar una parte del carril de fluidos a otra parte del carril en el colector. Alternativa o adicionalmente, los tubos flexibles pueden conectar una celda de flujo a componentes de fluido fijos del sistema, incluyendo, por ejemplo, bombas, válvulas, sensores y medidores. Como ejemplo, pueden usarse tubos flexibles para conectar una celda de flujo o un canal del presente sistema a una bomba tal como una bomba de jeringa o una bomba peristáltica.
El cuerpo de colector puede estar hecho, por ejemplo, de cualquier material sólido adecuado que sea capaz de soportar uno o más canales en el mismo. Por tanto, el cuerpo de colector puede ser una resina tal como policarbonato, poli(cloruro de vinilo), DELRIN®(polioximetileno); HALAR®; pCt FE (policlorotrifluoroetileno); PEEK™ (polieteretercetona); PK (policetona); PERLAST®; polietileno; PPS (poli(sulfuro de fenileno)); polipropileno; polisulfona; Fe P; PFA; PFA de alta pureza; RADEL® R; acero inoxidable 316; TEFZEL® ETFE (etileno-tetrafluoroetileno); TPX® (polimetilpenteno); titanio; UHMWPE (polietileno de peso molecular ultra alto); ULTEm ® (polieterimida); VESPEL® o cualquier otro material sólido adecuado que sea compatible con los disolventes y fluidos transportados a través de los canales del colector en las realizaciones presentadas en el presente documento. El cuerpo de colector puede formarse a partir de una sola pieza de material. Alternativa o adicionalmente, el cuerpo de colector puede formarse a partir de múltiples capas que se unen entre sí. Los métodos de unión incluyen, por ejemplo, el uso de adhesivos, juntas y unión por difusión. Los canales pueden formarse en el material sólido mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, los canales pueden perforarse, abrirse o fresarse en el material sólido. Los canales pueden formarse en el material sólido antes de unir múltiples capas entre sí. Alternativa o adicionalmente, pueden formarse canales después de unir capas entre sí.
La figura 5 muestra una variedad de uniones 300 para conectar un puerto 301 de reactivos con dos válvulas. En cada ejemplo mostrado en la figura 5 un puerto 301 está conectado en comunicación de fluido a un canal 302 que se bifurca en dos canales 302A y 302B suministrando cada canal a una válvula diferente. En la primera configuración, la unión divide el flujo de fluido desde el puerto 301 a canales 302A y 302B en capas independientes del colector. En la segunda y tercera configuraciones mostradas en la figura 5 , la unión 300 incluye un cuadrado 303 redondeado dividido dentro de una capa o una división 304 redonda completa dentro de una capa del colector.
Los conjuntos de colector presentados en este caso están configurados para el suministro de reactivos líquidos desde un cartucho de reactivos a una celda de flujo. Por tanto, el colector puede tener cualquier número de puertos acoplados a sorbedores de reactivos. Más específicamente, el número de puertos puede corresponder al número y configuración de depósitos de reactivos en un cartucho de reactivos. En algunas realizaciones, el colector comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o al menos 30 puertos, cada puerto configurado para acoplar un sorbedor de reactivos a un canal en comunicación de fluido con la al menos una válvula.
Los sistemas de fluido presentados en el presente documento también pueden incluir una matriz de tubos sorbedores que se extienden hacia abajo a lo largo de la dimensión z desde los puertos en el colector, cada uno de los sorbedores de reactivos configurados para insertarse en un depósito de reactivos en un cartucho de reactivos de modo que el reactivo líquido pueda extraerse del depósito de reactivos al sorbedor. Los sorbedores de reactivos pueden comprender, por ejemplo, un cuerpo tubular con un extremo proximal y un extremo distal. El extremo distal puede estrecharse hasta una punta afilada que está configurada para perforar una capa de lámina o película usada como un sello sobre un depósito de reactivos en un cartucho de reactivos. En la figura 10 se muestran diversas puntas de sorbedor a modo de ejemplo. Los sorbedores de reactivos pueden proporcionarse con, por ejemplo, una sola luz que atraviesa el cuerpo tubular desde el extremo distal al proximal. La luz puede configurarse para proporcionar comunicación de fluido entre el cartucho de reactivos en un extremo del sorbedor y el colector de reactivos en el otro extremo del sorbedor. Tal como se muestra en la figura 2 a modo de ejemplo, los sorbedores 103 y 104 de reactivos se acoplan al colector a través de puertos 106 que están alojados en el cuerpo de colector.
En algunas realizaciones, tal como se ejemplifica en la figura 2 , un subconjunto de los sorbedores de reactivos es de una longitud que es más corta que otros sorbedores de reactivos. Por ejemplo, la longitud del subconjunto puede ser de al menos 1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o al menos 2,0 mm más corta que los otros sorbedores de reactivos. El colector y los sorbedores de reactivos pueden usarse en un dispositivo que tiene un mecanismo de elevador configurado para mover un cartucho de reactivos de manera bidireccional a lo largo de la dimensión z de modo que los sorbedores de reactivos se inserten en los pocillos o depósitos correspondientes en el cartucho de reactivos. En determinadas realizaciones, los pocillos de reactivos pueden cubrirse con láminas protectoras. Por tanto, una ventaja de proporcionar sorbedores de longitud variable es una reducción en la fuerza requerida por el mecanismo de elevador para acomodar una fuerza de perforación de lámina cuando un cartucho de reactivos se pone en contacto con los sorbedores de perforación. La diferencia en la longitud de sorbedor puede corresponder ventajosamente a la profundidad de los pocillos de reactivos en un cartucho de reactivos, de modo que cada sorbedor alcanza una profundidad deseada en su pocillo de reactivos correspondiente cuando los sorbedores y el cartucho están en una posición totalmente acoplada.
Los sorbedores pueden formarse de cualquier material adecuado que permita la transferencia de fluido a través de una luz y que sea compatible con los disolventes y fluidos transportados a través de los canales del colector en las realizaciones presentadas en el presente documento. Los sorbedores pueden formarse a partir de un único tubo.
Alternativa o adicionalmente, uno o más sorbedores pueden estar hechos de múltiples segmentos que juntos forman un sorbedor de una longitud y diámetro deseados.
En algunas realizaciones, al menos uno de los sorbedores de reactivos incluye una punta flexible configurada para flexionarse cuando la punta incide sobre la parte inferior de un pocillo de reactivos en un cartucho de reactivos. Al flexionarse o deformarse, una punta flexible permite que la luz del sorbedor se acerque más completamente o incluso se ponga en contacto con la parte inferior del pocillo de reactivos, reduciendo o incluso eliminando de ese modo el volumen de evacuación en el pocillo de reactivos. Una punta flexible puede ser especialmente ventajosa para la captación de muestras o reactivos donde se usan pequeños volúmenes, o en situaciones donde es deseable para la captación de la mayoría o la totalidad del líquido en un depósito de reactivos. El cuerpo del sorbedor que tiene una punta flexible puede estar hecho completamente del mismo material flexible que la punta. Alternativa o adicionalmente, el cuerpo del sorbedor puede estar hecho de un material distinto a la punta. La punta flexible puede estar hecha de cualquier material adecuado de modo que la punta flexible pueda deformarse o ceder al entrar en contacto con la parte inferior de un depósito de reactivos. Algunos materiales adecuados incluyen espumas poliméricas y/o sintéticas, caucho, silicona y/o elastómeros, incluyendo polímeros termoplásticos tales como poliuretano.
Los sistemas de fluido presentados en el presente documento también pueden incluir, por ejemplo, bombas y válvulas que pueden hacerse funcionar selectivamente para controlar la comunicación de fluido entre los depósitos y la entrada de la celda de flujo. Tal como se ejemplifica por el conjunto de colector mostrado en las figuras 2 y 3 , las salidas de canal en el colector pueden configurarse para conectarse con los puertos de entrada correspondientes en la una o más válvulas de modo que cada canal de reactivos esté en comunicación de fluido con un puerto de entrada en la válvula. Por tanto, a través de los canales de reactivos del colector, uno o más o cada uno de los puertos de entrada puede estar en comunicación de fluido con un sorbedor de reactivos. Cada una de las una o más válvulas puede configurarse con un puerto (110, 112) de salida común que se conecta en comunicación de fluido a una entrada de una o más pistas en una celda de flujo. Alternativa o adicionalmente, cada una de las una o más válvulas puede configurarse con un puerto (109, 113) de desechos conectado en comunicación de fluido a uno o más receptáculos de desechos.
En realizaciones donde el sistema de fluido comprende al menos una primera válvula y una segunda válvula, cada válvula puede configurarse para suministrar simultáneamente reactivos independientes a través de un primer canal y un segundo canal de una celda de flujo, respectivamente. Por tanto, una válvula puede suministrar un reactivo a un primer canal de celda de flujo mientras la segunda válvula puede suministrar simultáneamente un reactivo diferente a un segundo canal de celda de flujo. Tal como se muestra en realizaciones a modo de ejemplo de la figura 9, la válvula A (VA) está conectada en comunicación de fluido con la entrada V1 de la celda de flujo, que es un colector para suministrar reactivos a la pista 1 y la pista 3. Del mismo modo, la válvula B (VB) está conectada en comunicación de fluido a la entrada V2 situada en el extremo opuesto de la celda de flujo, y que suministra reactivos a la pista 2 y la pista 4. Las entradas V1 y V2 están situadas en extremos opuestos de la celda de flujo y el sentido del flujo de reactivos se produce en sentidos opuestos para las pistas 1 y 3 en comparación con las pistas 2 y 4.
Los sistemas de fluido descritos en el presente documento pueden usarse ventajosamente para la manipulación de fluido de canales de celdas de flujo durante la secuenciación de ácidos nucleicos. Más específicamente, un sistema de fluido descrito en el presente documento puede asociarse operativamente con un aparato de detección en una configuración para la detección de características de ácido nucleico en la celda de flujo mediante el aparato de detección. En algunas realizaciones, el aparato de detección puede comprender una pluralidad de microfluorómetros, en donde cada uno de los microfluorómetros comprende un objetivo configurado para la detección de imagen de campo ancho en un plano de imagen en la dimensión x e y. Los sistemas de fluido expuestos en el presente documento son particularmente útiles con cualquiera de las configuraciones del aparato de detección expuestas en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 13/766.413 presentada el 13 de febrero de 2013 y titulada “ INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING” .
Como ejemplo, en realizaciones de secuenciación de ácidos nucleicos particulares, una celda de flujo que contiene una pluralidad de canales puede manipularse y detectarse en comunicación de fluido de manera escalonada. Más específicamente, las manipulaciones de fluido pueden llevarse a cabo en un primer subconjunto de los canales en la celda de flujo mientras se produce la detección óptica para un segundo subconjunto de los canales. Por ejemplo, en una configuración, al menos cuatro canales lineales pueden disponerse paralelos entre sí en la celda de flujo (por ejemplo, los canales 1 a 4 pueden ordenarse en filas secuenciales). Las manipulaciones de fluido pueden llevarse a cabo en cualquier otro canal (por ejemplo, los canales 1 y 3) mientras se produce la detección para los otros canales (por ejemplo, canales 2 y 4). Esta configuración particular puede acomodarse usando un cabezal de lectura que tiene detectores ubicados en una configuración separada de modo que los objetivos se dirijan a cualquier otro canal de la celda de flujo. En este caso, las válvulas pueden accionarse para dirigir el flujo de reactivos para un ciclo de secuenciación para alternar canales mientras que los canales que se detectan se mantienen en un estado de detección. En este ejemplo, un primer conjunto de canales alternos puede experimentar etapas de fluido de un primer ciclo de secuenciación y un segundo conjunto de canales alternos experimentan etapas de detección de un segundo ciclo de secuenciación. Una vez que se completan las etapas de fluido del primer ciclo y se completan las etapas de detección del segundo ciclo, el cabezal de lectura puede estar escalonado sobre (por ejemplo, a lo largo de la dimensión x) el primer conjunto de canales y válvulas alternos puede accionarse para suministrar reactivos de secuenciación al segundo conjunto de canales. Luego pueden completarse las etapas de detección para el primer ciclo (en el primer conjunto de canales) y pueden producirse etapas de fluido para un tercer ciclo (en el segundo conjunto de canales). Las etapas pueden repetirse de esta manera varias veces hasta que se haya realizado un número deseado de ciclos o hasta que se complete el procedimiento de secuenciación.
Una ventaja de las etapas de fluido y detección escalonadas expuestas anteriormente es proporcionar una ejecución de secuenciación global más rápida. En el ejemplo anterior, una ejecución de secuenciación más rápida dará como resultado la configuración escalonada (en comparación con la manipulación en comunicación de fluido de todos los canales en paralelo seguido de la detección de todos los canales en paralelo) si el tiempo requerido para la manipulación de fluido es aproximadamente el mismo que el tiempo requerido para la detección. Por supuesto, en realizaciones donde la programación para las etapas de detección no es la misma que la programación para las etapas de fluido, la configuración escalonada puede cambiarse de cualquier otro canal a un patrón más apropiado para acomodar el barrido paralelo de un subconjunto de canales mientras otro subconjunto de canales experimenta las etapas de fluido.
Una ventaja adicional de tener flujo de fluido en sentidos opuestos es proporcionar un medio de comparación del rendimiento de microfluorómetro individual. Por ejemplo, cuando se usan múltiples microfluorómetros por pista de celda de flujo, puede ser difícil distinguir si la disminución del rendimiento de microfluorómetro es provocada por el detector o a partir de la disminución de la eficiencia química desde un extremo de la pista hasta el otro. Al tener sentidos opuestos de flujo de líquido, puede compararse el rendimiento de microfluorómetro en las pistas, distinguiendo eficazmente si la disminución de rendimiento se debe al microfluorómetro o no.
En la figura 9 se muestra un mapa de fluido para un sistema de fluido a modo de ejemplo. La celda 2020 de flujo tiene cuatro pistas conectadas en comunicación de fluido a una de dos líneas FV y RV de fluido individuales que se accionan individualmente por válvulas VA y VB de entrada. La válvula VA de entrada y la válvula VB de entrada controlan el flujo de fluido desde depósitos de muestras, depósitos de reactivos SBS y depósitos de reactivos de amplificación en un cartucho o bandeja 2035 de reactivos conectados en comunicación de fluido a diversos puertos dentro del colector 2030 de reactivos.
El flujo de fluidos a través del sistema de la figura 9 se acciona por dos bombas 2041 y 2042 de jeringa independientes. Las bombas de jeringa se colocan para extraer fluidos a través del sistema de fluido y cada bomba puede accionarse individualmente por válvulas 2051 y 2052. Por tanto, el flujo a través de cada canal de la celda de flujo puede controlarse individualmente mediante una fuente de presión dedicada. Las válvulas 2051 y 2052 también se configuran para controlar el flujo de fluidos al depósito 2060 de desechos.
La figura 9 ejemplifica un sistema de fluido en donde se extraen los fluidos mediante la acción de las bombas de jeringa aguas abajo. Se entenderá que un sistema de fluido útil puede usar otros tipos de dispositivos en lugar de bombas de jeringa para impulsar fluidos incluyendo, por ejemplo, presión positiva o negativa, bomba peristáltica, bomba de diafragma, bomba de pistón, bomba de engranajes o tornillo hidráulico. Además, estos y otros dispositivos pueden configurarse para extraer fluidos de una posición aguas abajo con respecto a una celda de flujo o para impulsar fluidos desde una posición aguas arriba.
La figura 9 también ejemplifica el uso de dos bombas de jeringa para cuatro canales de una celda de flujo. Por tanto, el sistema de fluido incluye un número de bombas que es menor que el número de canales en uso. Se entenderá que un sistema de fluido que es útil en un cartucho de fluido de la presente descripción puede tener cualquier número de bombas, por ejemplo, un número equivalente o menor de bombas (u otras fuentes de presión) que el número de canales en uso. Por ejemplo, varios canales pueden conectarse en comunicación de fluido a una bomba compartida y puede usarse una válvula para accionar el flujo de fluido a través de un canal individual.
El sistema de fluido ejemplificado en la figura 9 también incluye un sensor BUB-4 para detectar burbujas de aire, ubicadas a lo largo de la trayectoria RV de fluido entre la válvula VA y la entrada V1 de celda de flujo. Un sensor BUB-3 de burbujas de aire adicional se coloca a lo largo de la trayectoria FV de fluido entre la válvula VB y la entrada V2 de celda de flujo. Se entenderá que una línea de fluido que es útil en un sistema de fluido de la presente descripción puede incluir cualquier número de sensores de burbujas de aire, manómetros y similares. Los sensores y/o manómetros pueden ubicarse en cualquier posición a lo largo de cualquier parte de la trayectoria de fluido en el sistema de fluido. Por ejemplo, un sensor o manómetro puede colocarse a lo largo de una línea de fluido entre una de las válvulas y la celda de flujo. Alternativa o adicionalmente, un sensor o manómetro puede colocarse a lo largo de una línea de fluido entre un depósito de reactivos y una de las válvulas, entre una válvula y una bomba, o entre una bomba y una salida o depósito tal como un depósito de desechos.
En la figura 6 se muestra una sección transversal de un cartucho de reactivos a modo de ejemplo. El cartucho 400 de reactivos mostrado en la figura 6 incluye pocillos 401 de profundidades variables a lo largo de la dimensión z en comparación con las de los pocillos 402. Más específicamente, el cartucho de reactivos ejemplificado en la figura 6 tiene pocillos diseñados para acomodar la longitud de un sorbedor de reactivos correspondiente (no mostrado) de modo que cada sorbedor alcanza una profundidad deseada en su pocillo de reactivos correspondiente cuando los sorbedores y el cartucho están en una posición totalmente acoplada. En el cartucho de reactivos ejemplificado en la figura 6 , los pocilios están dispuestos en una fila o columna a lo largo de la dimensión y, donde esos pocilios 401 en el exterior de la fila o columna se extienden más hacia abajo a lo largo de la dimensión z que esos pocillos 402 en el interior de la fila o columna. Algunos o todos los pocillos pueden ser de profundidades variables. Alternativa o adicionalmente, algunos o todos los pocillos pueden ser de la misma profundidad. Cuando los sorbedores y el cartucho están en una posición totalmente acoplada, la profundidad de penetración de cualquier punta de sorbedor (es decir, la distancia desde la superficie inferior del pocillo al extremo de la punta del sorbedor) puede ser equivalente a la profundidad de penetración de cualquier otra punta de sorbedor en cualquier otro pocillo dado en el cartucho de reactivos. La profundidad de penetración de cualquier punta de sorbedor no necesita ser la misma que la profundidad de penetración de cualquier otro pocillo dado en el cartucho de reactivos. Cuando al menos algunos pocillos de reactivos tienen una profundidad de pocillo diferente, la profundidad de pocillo puede ser, por ejemplo, al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, o al menos 2,0 mm más corta que los otros sorbedores de reactivos. De manera similar, cuando los sorbedores y el cartucho están en una posición totalmente acoplada, la profundidad de penetración de cualquier punta de sorbedor puede ser de al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, o al menos 2,0 mm diferente de la profundidad de penetración de cualquier otra punta de sorbedor en el cartucho de reactivos.
En la figura 8 se muestra una vista superior de una interfaz de bandeja de reactivos a modo de ejemplo que tiene pocillos de reactivos y ranuras de interfaz para los pasadores de alineación. Tal como se muestra en el cartucho 400 de reactivos a modo de ejemplo en la figura 8 , el cartucho incluye una pluralidad de depósitos 401A, 401B, 402A y 402B de reactivos. Los depósitos de reactivos en la figura 8 se disponen en las dimensiones x e y en filas. También se muestra en la figura 8 , el cartucho incluye ranuras 403 y 404 de interfaz configuradas para acoplarse con los pasadores de alineación correspondientes de un conjunto de colector (no mostrado). El cartucho también puede incluir una lámina protectora que cubre cualquier número de pocillos o depósitos de reactivos, que pueden perforarse mediante sorbedores de perforación cuando el cartucho se pone en contacto con los sorbedores de perforación.
Los cartuchos de reactivos presentados en el presente documento pueden incluir cualquier número de depósitos o pocillos de reactivos. Los depósitos o pocillos de reactivos pueden disponerse en cualquier formato a lo largo de las dimensiones x e y para facilitar el transporte y el almacenamiento de reactivos en el cartucho. Alternativa o adicionalmente, los depósitos o pocillos de reactivos pueden disponerse en cualquier formato a lo largo de las dimensiones x e y adecuado para la interacción con una matriz de tubos de sorbedor que se extienden hacia abajo a lo largo de la dimensión z desde los puertos en el colector. Más específicamente, los depósitos o pocillos de reactivos pueden disponerse en cualquier formato adecuado para acoplar simultáneamente una matriz de sorbedores de reactivos de manera que el reactivo líquido pueda extraerse del depósito de reactivos a los sorbedores.
No todos los pocillos de reactivos necesitan interactuar simultáneamente con todos los tubos de sorbedor de un conjunto de colector. Por ejemplo, el cartucho de reactivos puede incluir un subconjunto de uno o más depósitos o pocillos de reactivos que se configuran para permanecer en un estado sin interacción mientras que otros depósitos o pocillos se acoplan mediante una matriz de tubos de sorbedor. Como un ejemplo, un cartucho presentado en el presente documento puede comprender una pluralidad de depósitos de lavado dispuestos en una configuración correspondiente a la pluralidad de depósitos de reactivos, mediante lo cual los depósitos de lavado se configuran para acoplarse simultáneamente con los sorbedores de reactivos cuando los sorbedores de reactivos no están acoplados con los depósitos de reactivos de modo que el tampón de lavado pueda extraerse de los depósitos de lavado a los sorbedores. Se presenta una realización a modo de ejemplo en la figura 8 , que muestra una fila de pocillos 401A de reactivos. El cartucho también incluye una fila de pocillos 401B correspondientes que conservan la misma orientación en la dimensión x entre sí, pero que están desplazados en la dimensión y de los pocillos 401A. Los pocillos 401B desplazados pueden incluir un tampón de lavado, por ejemplo, proporcionado para aclarar tubos de sorbedor y líneas de fluido después de usar un cartucho y antes de usar otro cartucho.
Alternativa o adicionalmente, pueden estar presentes otros depósitos que están vacíos, o que mantienen tampón, muestra u otros reactivos en el cartucho. Los depósitos adicionales pueden, pero no necesariamente, interactuar con un tubo de sorbedor. Por ejemplo, un depósito puede configurarse para llenarse con un reactivo o tampón de desechos o de rebosamiento durante el transcurso del uso del cartucho. Puede accederse a dicho depósito, por ejemplo, a través de un puerto que no interactúe con un tubo de sorbedor.
Para facilitar la correcta alineación de depósitos de cartucho con los tubos de sorbedor correspondientes, pueden colocarse ranuras de alineación en el cartucho. Por ejemplo, en realizaciones particulares en donde una matriz de tubos de sorbedor se retira de un conjunto de depósitos y se transporta a otro conjunto de depósitos de reactivos o de lavado, pueden colocarse ranuras de alineación en el cartucho para asegurar la correcta alineación de la matriz de sorbedores de reactivo con uno o ambos conjuntos de depósitos. Tal como se muestra en la figura 8 , el cartucho a modo de ejemplo incluye ranuras 404 de alineación que retienen la misma orientación en la dimensión x, pero que están desplazadas en la dimensión y con respecto a la ranura 403 de alineación correspondiente. Un cartucho de las realizaciones presentadas en la presente descripción puede tener cualquier número de ranuras de alineación que proporcionen una alineación adecuada con las características de un conjunto de fluido. Por ejemplo, un cartucho puede incluir 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ranuras de alineación configuradas para acoplarse con los correspondientes pasadores de alineación del sistema de fluido de modo que los sorbedores de reactivos del sistema de fluido se coloquen en alineación con los depósitos de reactivos y/o lavado.
En realizaciones particulares, un sistema de fluido puede configurarse para permitir la reutilización de uno o más reactivos. Por ejemplo, el sistema de fluido puede configurarse para suministrar un reactivo a una celda de flujo, luego retirar el reactivo de la celda de flujo y luego volver a introducir el reactivo a la celda de flujo. Se ejemplifica una configuración en la figura 7A , que muestra una vista superior de líneas de almacenamiento temporal en un conjunto de colector. Tal como se muestra en el esquema en la parte superior de la figura 7A , puede usarse un almacenamiento temporal de reactivos para mantener un gradiente de concentración del reactivo más usado al menos usado (recién preparado). En algunas realizaciones, el depósito de almacenamiento temporal puede configurarse para reducir el mezclado de fluido dentro del depósito de almacenamiento temporal, manteniendo de ese modo un gradiente de reactivo líquido a lo largo de la longitud del depósito desde el extremo proximal con respecto a la celda de flujo hasta el extremo distal con respecto a la celda de flujo. Como el reactivo se suministra de vuelta a la celda de flujo desde el depósito de almacenamiento temporal, el gradiente se mantiene de modo que el reactivo que fluyó a través de la celda de flujo forma un gradiente del reactivo más usado al menos usado (recién preparado).
Tal como ejemplifica el diagrama en la parte inferior de la figura 7A , pueden configurarse fluidos de colector de modo que un depósito de reactivos esté en comunicación de fluido con el puerto de entrada de una celda de flujo (no mostrada) a través de la entrada 1804 de válvula. La válvula 1804 controla el flujo de fluidos entre la celda de flujo (no mostrada) y cada uno del depósito CLM, el depósito SRE, el depósito IMF y los depósitos LAM1 y LPM1. El canal 1802 conecta en comunicación de fluido el depósito CLM a través del puerto 1801 con la entrada 1804 de válvula. Una parte del canal 1802 incluye un almacenamiento temporal 1803 de reactivos configurado para contener un volumen de reactivo equivalente al volumen de una o más pistas de la celda de flujo (no mostradas). El volumen aumentado de almacenamiento temporal 1803 de reactivos en comparación con otras partes del canal 1802 permite que el reactivo usado se almacene para su reutilización mientras mantiene una reserva de reactivo no usado en el depósito de reactivos, evitando de ese modo contaminar la reserva de reactivo no usada en el depósito de reactivos con reactivo usado.
La configuración mostrada en la figura 7A es a modo de ejemplo. Son posibles otras configuraciones también para lograr la reutilización. Por ejemplo, uno o más de los depósitos de almacenamiento temporal pueden tener un volumen que es del 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, el 150 %, el 200 %, el 250 %, el 300 %, el 350 %, el 400 %, el 450 %, el 500 %, el 550 %, el 600 %, el 650 %, el 700 %, el 750 %, el 800 %, el 850 %, el 900 %, el 950 %, el 1000 %, el 1500 %, el 2000 %, el 2500 %, el 3000 % o más del volumen de un canal de celda de flujo en comunicación de fluido con el depósito de almacenamiento temporal. Alternativa o adicionalmente, el depósito de almacenamiento temporal puede comprender suficiente volumen para permitir que una cantidad de reactivo líquido en uno o más canales de celda de flujo fluya al depósito de almacenamiento temporal de modo que el reactivo líquido de la celda de flujo no se dirija de vuelta al depósito de reactivos después de ponerse en contacto con la celda de flujo. Por ejemplo, la cantidad de reactivo líquido puede comprender el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, el 150 %, el 200 %, el 250 %, el 300 %, el 350 %, el 400 %, el 450 %, el 500 %, el 550 %, el 600 %, el 650 %, el 700 %, el 750 %, el 800 %, el 850 %, el 900 %, el 950 %, el 1000 %, el 1500 %, el 2000 %, el 2500 %, el 3000 % o más del reactivo líquido en uno o más canales de celda de flujo.
Un depósito de almacenamiento temporal tal como se presenta en el presente documento puede configurarse para reducir el mezclado de fluido dentro del depósito de almacenamiento temporal. En algunas de tales realizaciones, el mezclado reducido puede mantener, de ese modo, un gradiente de reactivo líquido a lo largo de la longitud del depósito desde el extremo proximal con respecto a la celda de flujo hasta el extremo distal con respecto a la celda de flujo. Alternativa o adicionalmente, un depósito de almacenamiento temporal tal como se presenta en el presente documento puede comprender uno o más elementos de mezclado configurados para promover el mezclado de fluido dentro del depósito de almacenamiento temporal. Cualquier elemento de mezclado activo o pasivo adecuado puede usarse en tales realizaciones. Por ejemplo, el elemento de mezclado podría comprender elementos deflectores, estructuras curvadas o cualquier otra característica estructural pasiva o activa o de fluido, configurada para promover el mezclado a medida que el fluido se transporta a través de un depósito de almacenamiento temporal. Alternativa o adicionalmente, cualquier bomba, rotor, cuchilla, entrada y similares adecuados pueden usarse para el mezclado activa dentro de un depósito de almacenamiento temporal.
Un depósito de almacenamiento temporal tal como se presenta en el presente documento puede tener cualquier forma, volumen y longitud que sea adecuada para los propósitos de un depósito de almacenamiento temporal. En realizaciones específicas, pueden usarse depósitos de almacenamiento temporal de cualquier forma, volumen y/o longitud en los sistemas de fluido presentados en la presente descripción que permiten que una cantidad de reactivo líquido en uno o más canales de celda de flujo fluya al depósito de almacenamiento temporal de modo que el reactivo líquido de la celda de flujo no se dirija de vuelta al depósito de reactivos después de ponerse en contacto con la celda de flujo. Por ejemplo, un depósito de almacenamiento temporal puede comprender un canal de en serpentín. A modo de otro ejemplo, un depósito de almacenamiento temporal puede comprender un canal de forma cilíndrica o no cilíndrica. Además, cualquier número de canales de fluido en el sistema de fluido presentado en el presente documento puede incluir uno o más depósitos de almacenamiento temporal individuales.
Un depósito de almacenamiento temporal tal como se presenta en el presente documento puede estar en comunicación de fluido con una bomba configurada para mover el reactivo líquido desde el depósito de almacenamiento temporal hasta la celda de flujo y desde la celda de flujo de vuelta al depósito de almacenamiento temporal, en donde la entrada de reactivo a la celda de flujo y la salida de reactivo desde la celda de flujo se produce a través del mismo puerto de la celda de flujo. Alternativa o adicionalmente, la entrada de reactivo a la celda de flujo y la salida de reactivo desde la celda de flujo puede producirse a través de distintos puertos de la celda de flujo y aún lograr la reutilización de reactivos. Por ejemplo, los sistemas de fluido presentados en el presente documento pueden hacer uso de cualquiera de los depósitos y configuraciones de reutilización descritos en relación con las configuraciones del aparato expuestas en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 13/766.413 presentada el 13 de febrero de 2013 y titulada “ INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING” .
El esquema de la figura 7B establece una ilustración a modo de ejemplo de un método de reutilización presentado en el presente documento que utiliza flujo recíproco de reactivo desde una línea de almacenamiento temporal hasta una celda de flujo, seguido de rellenado parcial de la línea de almacenamiento temporal desde la celda de flujo. En el estado mostrado en el panel superior de la figura 7B , el depósito 1903 de almacenamiento temporal que contiene 100 pl de reactivo 1906 está en comunicación de fluido con carriles de pistas 1905 de flujo a través del divisor 1904 y la válvula 1911. La válvula 1904 se acciona para permitir que el reactivo 1906 fluya a pistas 1905 de celda de flujo. Al mismo tiempo, se extrae reactivo 1097 recién preparado del depósito de reactivos para llenar el vacío dejado en el depósito 1903 de almacenamiento temporal. Después del uso del reactivo en la celda de flujo, la válvula 1911 dirige una parte (75 pl) de reactivo 1906 usado de vuelta al depósito 1903 de almacenamiento temporal. Otra parte (25 pl) de reactivo 1906 usado se desvía mediante la válvula 1911 a un receptáculo de desechos. Al final del ciclo 1, el depósito 1903 de almacenamiento temporal tiene un gradiente con 25 pl de reactivo 1907 recién preparado y 75 pl de reactivo 1906 usado a través de la longitud del depósito de almacenamiento temporal. El ciclo de flujo recíproco de reactivo desde el depósito de almacenamiento temporal hasta la celda de flujo y de vuelta al depósito de almacenamiento temporal se repite, con una parte (25 pl) de reactivo 1906 usado desviadas en cada ciclo mediante la válvula 1911 a un receptáculo de desechos y el resto del reactivo 1906 usado se hace fluir de vuelta al depósito 1903 de almacenamiento temporal. Al final de cuatro ciclos repetidos, el depósito 1903 de almacenamiento temporal contiene 25 pl de reactivo 1910 recién preparado, 25 pl de reactivo 1909 que se ha usado una vez, 25 pl de reactivo 1908 que se ha usado dos veces y 25 pl de reactivo 1907 que se ha usado tres veces.
Las configuraciones mostradas en la figura 7A y la figura 7B son ejemplos. Son posibles otras configuraciones también para lograr la reutilización de uno o más de los reactivos usados en un procedimiento particular. Se entenderá que en algunas configuraciones de reutilización de reactivos, las configuraciones de fluido para la reutilización de reactivos sólo se usarán para un subconjunto de los reactivos usados en un procedimiento particular. Por ejemplo, un primer subconjunto de los reactivos puede ser lo suficientemente robusto como para reutilizarse, mientras que un segundo subconjunto puede ser propenso a contaminación, degradación u otros efectos no deseados después de un solo uso. Por consiguiente, el sistema de fluido puede configurarse para reutilizar el primer subconjunto de reactivos, mientras que los fluidos para el segundo conjunto de reactivos se configurarán para un solo uso.
Un reactivo particular puede reutilizarse cualquier número de veces deseado para adaptarse a un procedimiento particular. Por ejemplo, uno o más de los reactivos ejemplificados en el presente documento, descrito en una referencia citada en el presente documento, o conocido de otro modo para su uso en un procedimiento expuesto en el presente documento, puede reutilizarse al menos 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50 o más veces. De hecho, cualquiera de una variedad de reactivos deseados puede reutilizarse durante al menos muchas veces. Cualquier parte de un reactivo particular puede desviarse de vuelta a un depósito de almacenamiento temporal para su reutilización. Por ejemplo, uno o más de los reactivos ejemplificados en el presente documento, descrito en una referencia citada en el presente documento, o conocido de otro modo para su uso en un procedimiento expuesto en el presente documento puede tener el 1 %, el 2 %, el 3 %, el 4 %, el 5 %, el 6 %, el 7 %, el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % del volumen de reactivo en una o más pistas de celda de flujo dirigidas de vuelta a un depósito de almacenamiento temporal para su posterior reutilización. Alternativa o adicionalmente, el 1 %, el 2 %, el 3 %, el 4 %, el 5 %, el 6 %, el 7 %, el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % del volumen de reactivo en una o más pistas de celda de flujo pueden desviarse a un receptáculo de desechos o retirarse de otro modo del uso posterior en una celda de flujo.
Las configuraciones de fluido y los métodos para reutilización de reactivos, aunque se ejemplifican para un procedimiento de secuenciación de ácidos nucleicos, pueden aplicarse a otros procedimientos, en particular procedimientos que implican ciclos repetidos de suministro de reactivos. Los procesos a modo de ejemplo incluyen la secuenciación de polímeros tales como polipéptidos, polisacáridos o polímeros sintéticos y también incluyen síntesis de tales polímeros.
Tal como se demuestra por las realizaciones a modo de ejemplo anteriores, un método de reutilización de reactivos puede incluir las etapas de: a) extraer un reactivo líquido de un depósito de reactivos a un depósito de almacenamiento temporal, el depósito de almacenamiento temporal en comunicación de fluido con el depósito de reactivos y al menos un canal de una celda de flujo; b) transportar el reactivo desde el depósito de almacenamiento temporal en el al menos un canal de la celda de flujo; d) transportar al menos el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 % del reactivo en el canal de celda de flujo al depósito de almacenamiento temporal de modo que el reactivo líquido de la celda de flujo no se dirige de vuelta al depósito de reactivos después de ponerse en contacto con la celda de flujo; d) repetir las etapas b) y c) para lograr la reutilización del reactivo líquido en la celda de flujo. El uno o más depósitos de almacenamiento temporal puede estar en comunicación de fluido con una bomba configurada para mover el reactivo líquido desde el depósito de almacenamiento temporal hasta la celda de flujo y desde la celda de flujo de vuelta al depósito de almacenamiento temporal, de modo que la entrada de reactivo a la celda de flujo y la salida de reactivo desde la celda de flujo se produce a través del mismo puerto de la celda de flujo. Alternativamente o adicionalmente, la entrada de reactivo a la celda de flujo y la salida de reactivo desde la celda de flujo puede producirse a través de distintos puertos de la celda de flujo y aún lograr la reutilización de reactivos. En algunas realizaciones, puede desviarse el reactivo de la celda de flujo que no se transporta al depósito de almacenamiento temporal en la etapa c). Como ejemplo, el reactivo de la celda de flujo que no se transporta al depósito de almacenamiento temporal puede transportarse a un depósito de desechos. El transporte de reactivo en una o ambas de las etapas b) y c) puede realizarse a través de una válvula que conecta en comunicación de fluido el depósito de almacenamiento temporal y la celda de flujo. El transporte de reactivo en una o ambas de las etapas b) y c) puede realizarse, por ejemplo, con flujo de fluido en un único sentido, o puede realizarse con flujo recíproco.
Las realizaciones de los presentes sistemas y métodos de fluido encuentran uso particular para técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, los protocolos de secuenciación por síntesis (SBS) son particularmente aplicables. En la SBS, se controla la extensión de un iniciador de ácido nucleico a lo largo de una plantilla de ácido nucleico para determinar la secuencia de nucleótidos en la plantilla. El procedimiento químico subyacente puede ser polimerización (por ejemplo, catalizada por una enzima polimerasa) o ligamiento (por ejemplo, catalizada por una enzima ligasa). En una realización particular de SBS basada en polimerasa, se añaden nucleótidos marcados por fluorescencia a un cebador (extendiéndose de ese modo el cebador) de forma dependiente del molde, de modo que puedan usarse la detección del orden y el tipo de nucleótidos añadidos al cebador para determinar la secuencia del molde. Puede someterse una pluralidad de moldes diferentes a una técnica de SBS en una superficie en condiciones en donde pueden distinguirse eventos que se producen para diferentes moldes. Por ejemplo, los moldes pueden estar presentes en la superficie de una matriz de modo que los diferentes moldes sean distinguibles espacialmente entre sí. Normalmente, los moldes se producen en las características que tienen múltiples copias del mismo molde (a veces denominadas “ agrupamientos” o “colonias” ). Sin embargo, también es posible realizar SBS en matrices donde cada característica tiene una molécula de molde individual presente, de modo que las moléculas de molde individuales pueden descomponerse la una de la otra (a veces denominadas “ matrices de moléculas individuales” ).
Las celdas de flujo proporcionan un sustrato conveniente para alojar una matriz de ácidos nucleicos. Las celdas de flujo son convenientes para técnicas de secuenciación porque las técnicas implican normalmente la administración repetida de reactivos en ciclos. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados, a Dn polimerasa, etc., pueden fluir hacia/a través de una celda de flujo que aloja una matriz de moldes de ácidos nucleicos. Esas características donde la extensión del cebador provoca que se incorpore un nucleótido marcado, por ejemplo, usando métodos o aparatos expuestos en el presente documento. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que finalice la extensión adicional del cebador una vez que se haya añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, puede añadirse a un iniciador un análogo de nucleótido que tenga una fracción de terminador reversible, de modo que no se produzca una extensión posterior hasta que se suministre un agente desbloqueante para eliminar la fracción. Por tanto, para realizaciones que usan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la celda de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Los lavados pueden llevarse a cabo entre las diversas etapas de suministro. A continuación, el ciclo puede repetirse n veces para extender el cebador por n nucleótidos, detectando de ese modo una secuencia de longitud n. Se describen técnicas de secuenciación a modo de ejemplo, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008), los documentos WO 04/018497; US-7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US-7.329.492; US-7.211.414; US-7.315.019; US-7.405.281, y US 2008/0108082.
Para la etapa de suministro de nucleótidos de un ciclo de SBS, puede suministrarse un solo tipo de nucleótido cada vez o pueden suministrarse múltiples tipos de nucleótidos diferentes (por ejemplo, A, C, T y G juntos). Para una configuración de administración de nucleótidos en la que solo esté presente un solo tipo de nucleótido cada vez, no es necesario que los diferentes nucleótidos tengan etiquetas distintas, ya que se pueden distinguir en función de la separación temporal inherente a la administración individualizada. En consecuencia, un método o aparato de secuenciación puede usar detección de un solo color. Por ejemplo, un microfluorómetro o un cabezal de lectura sólo necesita proporcionar excitación en una única longitud de onda o en un único intervalo de longitudes de onda. Por tanto, un microfluorómetro o cabezal de lectura sólo necesita tener una única fuente de excitación y la filtración multibanda de excitación no tiene por qué ser necesaria. Para una configuración de suministro de nucleótidos en donde el suministro da como resultado que estén presentes múltiples nucleótidos diferentes en la celda de flujo al mismo tiempo, pueden distinguirse características que incorporan diferentes tipos de nucleótidos en función de los diferentes marcadores fluorescentes que se fijan a los respectivos tipos de nucleótidos en la mezcla. Por ejemplo, pueden usarse cuatro nucleótidos diferentes, cada uno con uno de cuatro fluoróforos diferentes. En un ejemplo, los cuatro fluoróforos diferentes pueden distinguirse usando excitación en cuatro regiones diferentes del espectro. Por ejemplo, un microfluorómetro o cabezal de lectura puede incluir cuatro fuentes de radiación de excitación diferentes.
Alternativamente, un cabezal de lectura puede incluir menos de cuatro fuentes de radiación de excitación diferentes, pero puede utilizarse filtración óptica de la radiación de excitación desde una única fuente para producir diferentes intervalos de radiación de excitación en la celda de flujo.
En algunos ejemplos, pueden detectarse cuatro nucleótidos diferentes en una muestra (por ejemplo, matriz de características de ácidos nucleicos) usando menos de cuatro colores diferentes. Como primer ejemplo, puede detectarse un par de tipos de nucleótidos en la misma longitud de onda, pero distinguirse en función de la diferencia de intensidad de un miembro del par en comparación con el otro, o en función de un cambio en un miembro del par (por ejemplo, mediante modificación química, modificación fotoquímica o modificación física) que hace que aparente aparezca o desaparezca una señal aparente en comparación con la señal detectada para el otro miembro del par. A modo de segundo ejemplo, pueden detectarse tres de los cuatro tipos de nucleótidos diferentes en condiciones particulares mientras que un cuarto tipo de nucleótido carecerá de una etiqueta detectable en esas condiciones. En un ejemplo de SBS, puede determinarse la incorporación de los primeros tres tipos de nucleótidos en un ácido nucleico basándose en la presencia de sus respectivas señales, y puede determinarse la incorporación del cuarto tipo de nucleótido en el ácido nucleico basándose en la ausencia de cualquier señal. Como tercer ejemplo, puede detectarse un tipo de nucleótido en dos imágenes diferentes o en dos canales diferentes (por ejemplo, puede usarse una mezcla de dos especies que tengan la misma base, pero pueden usarse marcadores diferentes, o puede usarse una única especie que tenga dos marcadores, o puede usarse una única especie que tenga un marcador que se detecte en ambos canales), mientras que otros tipos de nucleótidos se detectan en no más de una de las imágenes o canales. En este tercer ejemplo, la comparación de las dos imágenes o dos canales sirve para distinguir los diferentes tipos de nucleótidos.
Las tres configuraciones a modo de ejemplo en el párrafo anterior no son mutuamente excluyentes y pueden usarse en diversas combinaciones. Un ejemplo es un método SBS que usa nucleótidos bloqueados de manera reversible (rbNTP) que tienen marcadores fluorescentes. En este formato, pueden suministrarse cuatro tipos de nucleótidos diferentes a una matriz de características de ácidos nucleicos que van a secuenciarse y debido a los grupos de bloqueo reversibles se producirá uno y sólo un evento de incorporación en cada característica. Los nucleótidos suministrados a la matriz en este ejemplo pueden incluir un primer tipo de nucleótido que se detecta en un primer canal (por ejemplo, rbATP que tiene un marcador que se detecta en el primer canal cuando se excita con una primera longitud de onda de excitación), un segundo tipo de nucleótido que se detecta en un segundo canal (por ejemplo, rbCTP que tiene un marcador que se detecta en el segundo canal cuando se excita con una segunda longitud de onda de excitación), un tercer tipo de nucleótido que se detecta tanto en el primer como en el segundo canal (por ejemplo, rbTTP que tiene al menos un marcador que se detecta en ambos canales cuando se excita con la primera y/o segunda longitud de onda de excitación) y un cuarto tipo de nucleótido que carece de un marcador que se detecta en cualquiera de los canales (por ejemplo, rbGTP que no tiene marcador extrínseco).
Una vez que los cuatro tipos de nucleótidos se han puesto en contacto con la matriz en el ejemplo anterior, puede llevarse a cabo un procedimiento de detección, por ejemplo, para capturar dos imágenes de la matriz. Las imágenes pueden obtenerse en canales independientes y pueden obtenerse de manera simultánea o secuencial. Una primera imagen obtenida usando la primera longitud de onda de excitación y emisión en el primer canal mostrará características que incorporan el primer y/o tercer tipo de nucleótido (por ejemplo, A y/o T). Una segunda imagen obtenida usando la segunda longitud de onda de excitación y emisión en el segundo canal mostrará características que incorporan el segundo y/o tercer tipo de nucleótido (por ejemplo, C y/o T). La identificación inequívoca del tipo de nucleótido incorporado en cada característica puede determinarse comparando las dos imágenes para llegar a lo siguiente: características que muestran sólo en el primer canal incorporado el primer tipo de nucleótido (por ejemplo, A), características que muestran sólo en el segundo canal incorporado el segundo tipo de nucleótido (por ejemplo, C), características que se muestran en ambos canales incorporados el tercer tipo de nucleótido (por ejemplo, T) y características que no muestran en ningún canal incorporado el cuarto tipo de nucleótido (por ejemplo, G). Obsérvese que la ubicación de las características que incorporan G en este ejemplo puede determinarse a partir de otros ciclos (donde se incorpora al menos uno de los otros tres tipos de nucleótidos). El aparato y los métodos a modo de ejemplo para distinguir cuatro nucleótidos diferentes usando la detección de menos de cuatro colores se describen, por ejemplo, en la patente solicitud de patente estadounidense con número de serie 61/538.294.
En algunos ejemplos, que no son parte de la presente invención, los ácidos nucleicos pueden unirse a una superficie y amplificarse antes o durante la secuenciación. Por ejemplo, la amplificación puede llevarse a cabo usando amplificación puente para formar agrupamientos de ácidos nucleicos en una superficie. Los métodos de amplificación puente útiles se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.641.658; Us 2002/0055100; US 7.115.400; US 2004/0096853; US 2004/0002090; u S 2007/0128624; o US 2008/0009420. Otro método útil para amplificar ácidos nucleicos en una superficie es la amplificación por círculo rodante (ACR), por ejemplo, tal como se describe en Lizardi y col., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) y el documento US 2007/0099208 A1. La Pc R en emulsión sobre perlas también puede usarse, por ejemplo, tal como se describe en Dressman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), documentos WO 05/010145, US 2005/0130173 o US 2005/0064460.
El término que comprende se entiende en el presente documento como abierto, incluyendo no sólo los elementos citados, sino abarcando además cualquier elemento adicional.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema que comprende:
un sistema (100) de fluido para suministrar reactivos desde un cartucho (400) de reactivos a una celda de flujo que comprende:
un conjunto (101) de colector de reactivos que comprende un cuerpo de colector que tiene un material sólido y una pluralidad de canales (107) configurados para conectar en comunicación de fluido un cartucho (400) de reactivos a una entrada de una celda de flujo, en donde la pluralidad de canales (107) del conjunto (101) de colector de reactivos incluye cada uno un carril (302) de fluido a través del material sólido del cuerpo del cuerpo de colector;
una pluralidad de sorbedores (103, 104) de reactivos acoplados al conjunto (101) de colector de reactivos y que se extienden hacia abajo desde los puertos que están alojados en el conjunto (101) de colector de reactivos, cada uno de la pluralidad de sorbedores (103, 104) de reactivos configurados para colocarse en un depósito (401,402) de reactivos en el cartucho (400) de reactivos de modo que los reactivos líquidos puedan extraerse de los depósitos (401,402) de reactivos en los sorbedores (103, 104);
al menos una válvula (102, 109) configurada para mediar la comunicación de fluido entre los depósitos (401,402) de reactivos y la entrada de la celda de flujo; caracterizado por al menos uno de la pluralidad de canales (107) en el colector (101) que comprende un depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal en el conjunto (101) de colector de reactivos y en comunicación de fluido con un depósito (401,402) de reactivos y al menos un canal de la celda de flujo, en donde el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal tiene un volumen que es al menos el 30 % del volumen de un canal de celda de flujo, en donde el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal tiene suficiente volumen para permitir que una cantidad de reactivo líquido fluya desde la celda de flujo al depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal de modo que el reactivo líquido desde la celda de flujo no se dirija de vuelta al depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal después de ponerse en contacto con la celda de flujo y en donde uno o más de los depósitos (108, 1903) de almacenamiento temporal se encuentran en comunicación de fluido con una bomba configurada para mover el reactivo líquido desde el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal a la celda de flujo y desde la celda de flujo de vuelta al depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal, en donde la entrada de reactivo a la celda de flujo y la salida de reactivo desde la celda de flujo se produce a través del mismo puerto de la celda de flujo; y
un aparato de detección operativamente asociado con el sistema (100) de fluido y configurado para detectar características de ácido nucleico en la celda de flujo.
2. El sistema según la reivindicación 1, en donde al menos una válvula está configurada para dirigir el reactivo líquido diferencialmente desde la celda de flujo de vuelta al depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal o al depósito (109) de desechos.
3. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicho depósito (108) de almacenamiento temporal está configurado para reducir el mezclado de fluido dentro del depósito de almacenamiento temporal, manteniendo de ese modo un gradiente de reactivo líquido a lo largo de la longitud del depósito desde el extremo proximal con respecto a la celda de flujo hasta el extremo distal con respecto a la celda de flujo.
4. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicho depósito de almacenamiento temporal comprende una pluralidad de elementos de mezclado configurados para promover el mezclado de fluido dentro del depósito de almacenamiento temporal, y opcionalmente en donde los elementos de mezclado comprenden características estáticas en el depósito de almacenamiento temporal o en una superficie interior del depósito de almacenamiento temporal, o en donde los elementos de mezclado comprenden elementos deflectores.
5. El sistema según la reivindicación 1, en donde dicho depósito de almacenamiento temporal comprende un canal de forma no cilíndrica.
6. El sistema según la reivindicación 1, en donde el colector está configurado para suministrar reactivo desde un primer depósito de reactivos a una primera válvula a través de un primer canal y desde el primer depósito de reactivos hasta una segunda válvula a través de un segundo canal.
7. El sistema según la reivindicación 1, en donde el aparato de detección comprende una pluralidad de microfluorómetros, en donde cada uno de los microfluorómetros comprende un objetivo configurado para la detección de imagen de campo ancho en un plano de imagen en la dimensión x e y.
Un método de reutilización de reactivos que comprende:
a) proporcionar un conjunto (101) de colector de reactivos que comprende un cuerpo de colector que tiene un material sólido y una pluralidad de canales (107) configurados para proporcionar reactivos líquidos desde los depósitos (401, 402) de reactivos de un cartucho (400) de reactivos a una entrada de una celda de flujo; caracterizado por:
b) extraer un reactivo líquido de un depósito (108, 402) de reactivos en un depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal, el depósito de almacenamiento temporal en comunicación de fluido con el depósito de reactivos y al menos un canal de la celda de flujo, teniendo el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal un volumen que es al menos el 30 % del volumen del al menos un canal, en donde el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal tiene un volumen suficiente para permitir que una cantidad de reactivo líquido fluya desde la celda de flujo al depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal de modo que el reactivo líquido de la celda de flujo no se dirija de vuelta al depósito (401,402) de reactivos después de ponerse en contacto con la celda de flujo y en donde uno o más de los depósitos (108, 1903) de almacenamiento temporal se encuentran en comunicación de fluido con una bomba configurada para mover el reactivo líquido desde el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal a la celda de flujo y desde la celda de flujo hacia el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal, en donde la entrada de reactivo a la celda de flujo y la salida de reactivo desde la celda de flujo se produce desde el mismo puerto de la celda de flujo; c) transportar el reactivo (1906) desde el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal en el al menos un canal de la celda de flujo;
d) transportar al menos el 30 %, del reactivo en el canal de celda de flujo al depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal de modo que el reactivo líquido de la celda de flujo no se dirige de vuelta al depósito de reactivos después de ponerse en contacto con la celda de flujo; y
e) repetir las etapas c) y d) para lograr la reutilización del reactivo líquido en la celda de flujo.
El método según la reivindicación 8, en donde el reactivo de la celda de flujo que no se transporta al depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal en la etapa c) se transporta a un depósito de desechos.
El método según la reivindicación 8, en donde el transporte en una o ambas etapas c) y d) se realiza a través de una válvula (1911) que conecta en comunicación de fluido el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal y la celda de flujo.
El método según la reivindicación 8, en donde el reactivo líquido comprende un reactivo para realizar la secuenciación de ácidos nucleicos, una polimerasa, un nucleótido o una mezcla de diferentes nucleótidos.
El método según la reivindicación 8, en donde el reactivo (1906) que fluyó de vuelta al depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal en la etapa d) se mezcla con un reactivo (1907) similar en el depósito (108, 1903) de almacenamiento temporal, formando de ese modo un reactivo mixto que comprende reactivos similares a partir de una pluralidad de repeticiones de las etapas c) y d).
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