ES2924706T3

ES2924706T3 - Chip microfluídico

Info

Publication number: ES2924706T3
Application number: ES18189586T
Authority: ES
Inventors: Piotr Garstecki; Pawel Debski; Jaroslaw Ziolkowski; Piotr Knap
Original assignee: Bacteromic Sp Z O O; Bacteromic Sp zoo
Current assignee: Bacteromic Sp Z O O; Bacteromic Sp zoo
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2022-10-10
Anticipated expiration: 2038-08-17
Also published as: US20210016274A1; PL3546067T3; EP3546067B1; CN111989157A; WO2019185927A1; PL425106A1; US11975324B2; CN116571292A; EP3546067A1; DK3546067T3; CN111989157B; EP4101538A1

Abstract

Un chip microfluídico para realizar ensayos microbiológicos comprende un sustrato en el que se disponen segmentos de incubación, un depósito de muestra y canales microfluídicos que conectan dicho depósito de muestra con dichos segmentos de incubación. Dicho chip microfluídico comprende además un depósito de fluido no acuoso para contener líquido no acuoso en el que dicho depósito se puede conectar a través de una válvula hermética liberable y hermética a líquidos con dichos canales microfluídicos que conectan dicho depósito de muestra con dichos segmentos de incubación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Chip microfluídico

Campo técnico

La invención se refiere a tarjetas de prueba para ensayos microbiológicos, especialmente identificación microbiana y prueba de susceptibilidad antimicrobiana (PSA). Una determinación fenotípica de la resistencia a los antibióticos requiere el cultivo de microbios aislados (tal como una muestra recolectada de un paciente) en presencia de un antibiótico (en esta descripción, 'antibiótico' puede significar también una combinación de dos o más antibióticos diferentes si la determinación se refiere a la susceptibilidad a la combinación) e inspeccionar si se produce crecimiento de microbios durante el cultivo. La determinación de una concentración inhibitoria mínima (MIC) requiere realizar el cultivo para diferentes concentraciones de antibióticos. La adición de reactivos auxiliares específicos puede permitir la determinación del mecanismo de resistencia.

Para realizar un ensayo automático de susceptibilidad al fármaco y determinación de la MIC (a menudo combinado con la identificación del microorganismo presente en una muestra), se usan tarjetas de prueba desechables en las que el cultivo de bacterias aisladas de una muestra se realiza simultáneamente en múltiples segmentos de incubación. En el contexto de la presente solicitud, siempre que se mencionen "bacterias", lo mismo aplica a otros microorganismos, tales como, por ejemplo, hongos unicelulares. Después de preparar un aislado para analizarlo y colocarlo en una tarjeta, se realizan automáticamente etapas adicionales en un dispositivo dedicado (el llamado "analizador"). Estas etapas suelen incluir la incubación de los microbios y mediciones ópticas cíclicas para detectar su crecimiento. Las tarjetas de prueba suelen ser chips microfluídicos hechos de material polímero. Se coloca una muestra en una cámara de muestra en el chip desde donde fluye a través de una red de canales microfluídicos a una pluralidad de segmentos de incubación independientes donde tiene lugar el cultivo. El flujo de muestra y el llenado de los segmentos de incubación pueden ser forzados por diferencia de presión, gravedad o fuerzas capilares.

Un tema importante es cómo permitir la determinación de la susceptibilidad a los medicamentos y la MIC para muchos antibióticos y sus combinaciones. Las tarjetas para este tipo de pruebas que se conocen en el estado de la técnica tienen apenas de 64 a 136 segmentos de incubación lo que limita la información obtenida en una sola prueba. Desde el punto de vista del usuario, es un problema fundamental ya que incluso la aplicación de la prueba destinada a una determinada especie de microbio no garantiza un resultado consistente con las directrices vigentes en un país determinado y las establecidas por EUCAST (Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos) o CLSI (Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio). A menudo, la información sobre la resistencia se obtiene como los llamados puntos de ruptura de concentración de antibióticos y no como los niveles reales de MIC que requieren realizar una mayor cantidad de cultivos. Esta invención tiene como objetivo resolver este y otros problemas técnicos relacionados con la funcionalidad y el correcto funcionamiento de una tarjeta de prueba para la identificación de microbios y pruebas de susceptibilidad a fármacos.

Estado de la técnica

La solicitud de patente EP 0785433 A2 describe una tarjeta para pruebas microbiológicas donde la muestra llena segmentos de incubación bajo la diferencia de presión. Antes de que se llene el chip, la muestra se encuentra en un recipiente separado conectado con el chip con el uso de una manguera. El chip tiene solo 45 segmentos de incubación, lo que limita considerablemente la cantidad de posibles ensayos que se pueden realizar en una sola prueba. El procedimiento de llenado requiere elementos de sistema adicionales (recipientes de muestra y mangueras).

Un chip similar se describe en la solicitud de patente EP 1696238 A2. Se rellena mediante una compensación de una presión alrededor del chip que se redujo previamente a 48-62 mbar. El proceso de llenado dura de 3-60 s y del 90-95 % de la muestra fluye hacia los segmentos de incubación. Además, los canales que conducen a los segmentos de incubación están inclinados para que la fuerza de la gravedad ayude a llenarlos. Se usan canales con una sección transversal circular que, de acuerdo con la especificación, aseguran una menor resistencia al flujo y una menor perturbación que en el caso de los canales rectangulares. Para permitir el flujo del volumen de muestra adecuado, los canales que conducen a diferentes números de ramificaciones (segmentos de incubación) tienen diferentes secciones transversales.

La solicitud de patente WO 2012/048096 A2 muestra un chip microfluídico para PSA que tiene cámaras para el exceso de muestra, de modo que su volumen aspirado en el chip puede ser mayor que la suma de los volúmenes de los segmentos de incubación y las redes de canales microfluídicos. Los canales de exceso de muestra son más pequeños (es decir, tienen una sección transversal más pequeña) que los canales que conducen la muestra a los segmentos de incubación, por lo que el proceso de llenado es lo suficientemente lento para garantizar un llenado adecuado de los segmentos de incubación. Además, se describe el posible uso de líquido no acuoso (líquido hidrófobo) para separar los segmentos de incubación después de llenarlos con la muestra. Para este propósito, puede usarse un amplio grupo de líquidos, incluyendo aceite mineral, olefinas, ésteres, amidas, aminas, siloxanos, organosiloxanos, éteres, acétales, carbonatos de dialquilo, hidrocarburos. Los segmentos de incubación de separación de líquido también se pueden colocar en el contenedor externo, en el que se almacena la suspensión de bacterias durante un proceso de llenado, ya que el líquido no acuoso no se mezcla con dicha suspensión (generalmente suspensión en un caldo). Los chips microfluídicos descritos anteriormente tienen más segmentos de incubación que la tarjeta de prueba divulgada en la solicitud EP 0785433 A2 la cual es su versión anterior. Sin embargo, su número (hasta 140) aún es demasiado pequeño para realizar un amplio panel de ensayos de identificación y susceptibilidad a fármacos. La separación de las cámaras en un chip microfluídico con el uso de un líquido no acuoso se analiza en la solicitud mencionada anteriormente con respecto a la tarjeta de prueba y en otras publicaciones, por ejemplo, el artículo de KA Heyries y otros. Megapixel digital PCR (Nature Methods Volumen 8 Número 8, agosto de 2011). En estas soluciones, se proporciona un líquido no acuoso al sistema desde el exterior. La solicitud de patente WO 2014/052671 A1 especifica el dispositivo (tubo de nido de abeja) usado para el análisis biológico (PCR múltiple), donde una cámara de aceite con un líquido no acuoso es parte del sistema y puede conectarse fluidamente con el área de las cámaras de reacción. Se usó una solución similar en el cartucho para preparar una muestra para la reacción de PCR descrita en la solicitud de patente US 2017/0029871. Esta última describe un dispositivo microfluídico que comprende una pluralidad de pozos conectados en serie a un canal fluídico común. Cada pozo tiene una abertura para funcionar como entrada y salida para el pozo. El canal fluídico está conectado a fuentes de líquido aguas arriba de los pozos ya una fuente de vacío aguas abajo del último pozo conectado en serie.

El documento US 2003/0152994 A1 describe dispositivos de ensayo con redes de distribución de muestras. Las cámaras de detección están conectadas en serie a un canal de suministro común, con una entrada al principio y un depósito de vacío (o puerto) al final. Cada cámara de detección forma una conexión frontal con el canal de entrega común.

El documento US 2013/0065280 A1 describe un aparato microfluídico que tiene una pluralidad de cámaras de reacción conectadas en serie a un canal de distribución, una cámara de muestra y una cámara de prevención de mezcla conectadas al canal de distribución aguas arriba de las cámaras de reacción, y un respiradero en el extremo aguas abajo del canal de distribución.

Las tarjetas usadas para las pruebas microbiológicas automáticas realizadas en muchos segmentos de incubación independientes también se encuentran en las solicitudes de patente EP 0903569 A1 y US 2009/0155128 A1. Estos chips se llenan por gravedad o fuerzas capilares, respectivamente.

El documento US 2012/0082599A1 describe el llenado de cámaras cerradas (frontales) aplicando a la muestra una presión superior a la presión generada en estas estructuras cerradas. En las modalidades discutidas en este documento, la presión en las estructuras cerradas se puede controlar adicionalmente cambiando sus volúmenes (por ejemplo, mediante el uso de una membrana flexible o un pistón móvil), pero no se menciona un procedimiento de llenado en el que se reduce la presión antes de comenzar el procedimiento de llenado y subsecuentemente se eleva a la presión atmosférica. Esto podría deberse al hecho de que una de las ventajas expresadas de la invención es la capacidad de controlar el flujo: al controlar la presión ejercida sobre la muestra, su flujo puede forzarse en ambas direcciones o puede dejarse estacionario para que los lugares donde tiene lugar la reacción, la detección o la mezcla se puedan separar en el chip.

Los sistemas para pruebas microbiológicas automáticas, incluida la determinación de la resistencia a los antibióticos con tarjetas de prueba dedicadas (tales como las tarjetas descritas en las solicitudes de patente a las que se hace referencia anteriormente) están disponibles comercialmente. Estos incluyen VITEK, ofrecido por bioMerieux y Phoenix (Becton Dickinson). MicroScan y Sensititre usan placas de 96 pocillos para AST.

En resumen, en el estado de la técnica se conocen tarjetas para ensayos automáticos de AST. Estas tarjetas permiten realizar cultivos en múltiples segmentos de incubación. Después de rellenar los segmentos con una muestra, las cámaras se pueden separar con un líquido no acuoso para evitar la contaminación cruzada. Una de sus principales limitaciones técnicas es la cantidad de ensayos de prueba diferentes que se pueden realizar simultáneamente en la misma muestra, lo que no permite evaluar los valores reales de MIC para todo el intervalo de antibióticos recomendados, por lo que no proporciona, después de un solo tiempo de ejecución, la información completa necesaria para el tratamiento oportuno y preciso del paciente infectado.

Breve descripción de la invención

Ninguna de las tarjetas del estado de la técnica enseña un dispositivo o procedimiento de acuerdo con la presente invención que permita realizar un amplio panel de ensayos microbiológicos, lo que requiere cultivar un cultivo microbiano en varios cientos de segmentos de incubación, mientras se asegura que no haya contaminación entre ellos mediante la separación física de subvolúmenes de la muestra en diferentes segmentos, donde un líquido no acuoso se coloca en un depósito separado en el chip para evitar la contaminación cruzada. Una ventaja de la presente invención es que para realizar el proceso de llenado y separación de los segmentos de incubación solo es necesario colocar el chip en el ambiente donde sea posible lograr las presiones adecuadas (y la temperatura adecuada si se usa una válvula de cera). No es necesario ningún depósito de líquido no acuoso externo ni ningún dispositivo para transferir un líquido no acuoso, por ejemplo, aceite mineral o similar, al chip.

La presente invención se refiere a un chip microfluídico, como se define en la reivindicación 1. El chip microfluídico incluye múltiples segmentos de incubación independientes donde se lleva a cabo la incubación y detección de cualquier crecimiento microbiano. En los ejemplos de modalidades se presentan hasta 640 segmentos de incubación independientes, pero la tecnología permite proporcionar incluso más, por ejemplo, hasta 2.000 segmentos de incubación independientes en un solo chip. El chip también tiene un depósito de la muestra y un depósito de líquido no acuoso (tales como aceite mineral u otro líquido que no se mezcle con agua) que pueden usarse para separar los segmentos de incubación entre sí para evitar la contaminación cruzada. El líquido no acuoso también puede evitar la evaporación de líquido de los segmentos de incubación. Para iniciar un análisis, se hace fluir una muestra, que se ha cargado en un depósito de la muestra, desde el depósito hasta la estructura microfluídica y llenar los pozos de incubación individuales. Luego, el líquido no acuoso se libera del depósito y fluye hacia los canales microfluídicos, separando de esta manera los segmentos de incubación entre sí, lo que evita la contaminación entre los segmentos. El flujo de líquido no acuoso se puede controlar, por ejemplo, mediante una válvula termosensible (por ejemplo, de cera u otra sustancia de bajo punto de fusión) u otra válvula convencional conocida por un experto en la técnica. Preferentemente, la válvula es operable remotamente. El flujo de muestra desde el depósito hasta los segmentos de incubación y el siguiente aislamiento de los segmentos de incubación entre sí por el líquido no acuoso se logran por medio de la diferencia de presión. Para generar esta diferencia, el chip, con una muestra en su depósito de la muestra, se coloca inicialmente en un ambiente (una cámara) donde la presión se reduce subsecuentemente a un cierto valor p0 inferior a la presión atmosférica circundante (es decir, una presión en los alrededores fuera de una cámara donde se coloca el chip). Esto conduce a la evacuación de aire desde el interior del chip (es decir, desde los segmentos de incubación y los canales microfluídicos) a través de la muestra en el depósito de la muestra y fuera del chip, lo que hace que la presión dentro del chip caiga a p0 también. Luego se aumenta la presión en la cámara, lo que hace que las presiones en el sistema se igualen. La presión creciente en la cámara comprime el aire en el sistema de microfluidos y fuerza el movimiento de la muestra desde el depósito de la muestra hasta los segmentos de incubación. Se pueden usar aumentos adicionales de presión, en una etapa siguiente, para impulsar el flujo de líquido no acuoso. El proceso de llenado se puede realizar en cualquier cámara o contenedor apropiado que puede ser un desecador, un instrumento dedicado para llenar uno o más chips al mismo tiempo, o cualquier otro instrumento capaz de generar presiones inferiores a la presión atmosférica.

La presente invención también se refiere al procedimiento de llenado de los pozos de incubación definido en la reivindicación 13. El análisis termodinámico de un proceso de llenado de los pozos de incubación y el flujo de un líquido no acuoso que separa los segmentos de incubación muestra que, para los volúmenes dados de las partes de un segmento individual, se puede seleccionar un conjunto de presiones para asegurar el desarrollo óptimo de estos procesos. Estas son las presiones del aire dentro de la estructura microfluídica del chip, por lo que también son las presiones que deberían generarse en un contenedor en el que se coloca el chip durante el llenado. Se necesitan las siguientes presiones:

• p0, al que se reduce la presión en la cámara de vacío;

• p1 > p0, en el que la muestra fluye hacia los segmentos de incubación;

• p2 > p-i, en el que el líquido no acuoso fluye hacia los canales microfluídicos.

Estas presiones puede usarse para garantizar un proceso de llenado correcto, después del cual la sección del segmento de incubación destinada a recibir una porción de la muestra (llamada "pozo de incubación") preferentemente no contiene sustancialmente líquido no acuoso o aire, no hay contaminación entre los segmentos de incubación y se reduce la desviación en el volumen de los subvolúmenes de muestra contenidos en los segmentos de incubación en el chip que están más distantes del depósito de la muestra.

Los aspectos preferidos de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes.

Descripción detallada de la invención

Estructura del chip

La Figura 1 muestra una vista en planta esquemática de una primera superficie principal de un chip de acuerdo con la presente invención.

La Figura 2 muestra una vista en planta esquemática de la segunda superficie principal del chip de la Figura 1. La Figura 3 muestra una vista esquemática de la estructura detallada de los canales en la segunda superficie principal del chip de la Figura 1.

La Figura 4 muestra una vista esquemática ampliada de la sección de la primera superficie principal del chip que incluye 8 segmentos de incubación.

La Figura 5 muestra una representación esquemática de un chip con conexión en serie de segmentos de incubación.

La Figura 6 muestra esquemáticamente una vista en planta de una sección de un chip con geometría fractal que incluye 16 segmentos de incubación.

La Figura 7 muestra esquemáticamente una vista en planta de una sección de un chip con geometría fractal que incluye 32 segmentos de incubación.

La Figura 8 muestra esquemáticamente una vista en planta de una sección de un chip con geometría fractal que incluye 128 segmentos de incubación.

La Figura 9 muestra esquemáticamente una vista en planta de un chip con geometría fractal asimétrica con 640 segmentos de incubación.

La Figura 10 muestra esquemáticamente una vista en planta de una sección del chip de la Figura 9, en la que se destacan los canales de alimentación que conducen a dos áreas con diferente número de segmentos de incubación.

La Figura 11 muestra esquemáticamente las etapas de un procedimiento de acuerdo con la presente invención para mediante el uso de un chip de acuerdo con la presente invención.

La Figura 12 muestra una vista en planta de una modalidad de un depósito de la muestra y un depósito de líquido no acuoso de acuerdo con la presente invención.

Las Figuras 1 y 2 muestran esquemáticamente una primera modalidad de un chip microfluídico 1 de acuerdo con la presente invención. El chip está formado por un sustrato 2. El sustrato es preferentemente plano con una primera cara principal 3 y una segunda cara principal 5, preferentemente paralela. El sustrato puede fabricarse de cualquier material impermeable a los vapores y a los líquidos, por ejemplo, un polímero, metal o vidrio. El sustrato puede fabricarse como una sola pieza (por ejemplo, moldeando por inyección o moliendo un polímero) o puede estar compuesto de dos partes, es decir, una placa base (con los segmentos de incubación y los canales microfluídicos) y los depósitos que se unen entre sí por medio de procedimientos de unión conocidos en el estado de la técnica. La superficie de la primera cara principal está cubierta por una primera capa 7 de material impermeable sustancialmente transparente y la superficie de la segunda superficie principal está cubierta por una segunda capa 9 de material impermeable sustancialmente transparente. Estas capas evitan la entrada o liberación de gases y líquidos no deseados de las estructuras (descritas más adelante) formadas en el sustrato mientras permiten que la luz pase a través de los pozos de incubación, lo que permite el examen óptico de las muestras en los pozos de incubación. El chip microfluídico 1 incluye un depósito de la muestra 11 para recibir y almacenar una muestra para análisis (por ejemplo, un inóculo de bacterias), un depósito de líquido no acuoso 13 para recibir y almacenar un líquido no acuoso y un área de segmento de incubación 15 que comprende una pluralidad de segmentos de incubación 17 en cada uno de los cuales se puede cultivar una porción de la muestra.

El depósito de líquido no acuoso 13 se puede suministrar con un líquido no acuoso a través de un paso de entrada de líquido no acuoso 19 que conduce a través del sustrato al depósito de líquido no acuoso desde una abertura de entrada de líquido no acuoso 21 en la primera cara principal.

El depósito de la muestra 11 se puede suministrar con una muestra, por ejemplo, un inóculo de bacterias para análisis, a través de un paso de entrada de muestra 23 que conduce a través del sustrato al depósito de la muestra desde una abertura de entrada de la muestra 25 en la primera cara principal.

El depósito de la muestra tiene una abertura de salida 27 que conduce a un canal 22 formado en el sustrato en la segunda cara principal del chip. El canal 22 conduce a un pasaje 31 formado en el sustrato en el área del segmento de incubación 15. Este pasaje atraviesa el sustrato y conecta el canal 22 con un canal 33 formado en la primera cara principal del sustrato. El canal 33 está conectado a través de otro pasaje 34 a una red de canales microfluídicos 35 que conducen a los segmentos de incubación 17 formados en el sustrato.

El depósito de líquido no acuoso tiene una abertura de salida 39 que conduce al canal 29 y, además, a través de este canal, a una abertura de salida 39' a través de la cual el líquido no acuoso entra en el depósito de la muestra. El canal 29 puede bloquearse temporalmente mediante una válvula de cera 24 u otra válvula, preferentemente activada a distancia, ubicada en el canal 29 que, cuando está cerrada, evita que el líquido no acuoso fluya a través del canal 29. Cuando la válvula 24 está abierta, por ejemplo, mediante calentamiento en el caso de una válvula de cera, el líquido no acuoso puede fluir a través del canal 29 y hacia el depósito de la muestra.

El chip tiene preferentemente muescas 26, 26' formadas en dos o más bordes 28, 28' para permitir que el chip se enganche en los bordes de una cesta (no mostrada) usada para transportar los chips y/o un contenedor en un dispositivo analizador (no mostrado) de manera que la abertura de entrada de muestra 25 esté por encima de la abertura de salida del depósito de la muestra 27 durante el llenado.

El área de segmentos de incubación incluye una pluralidad de segmentos de incubación 17 y canales microfluídicos 35 que pueden conducir la muestra a estos segmentos de incubación. La muestra es transportada a los segmentos de incubación individuales por la red de canales de interconexión (22, 33, 35), también denominada "red microfluídica principal", formada en las dos caras principales del sustrato del chip que mejora el uso efectivo de espacio en el chip y, por lo tanto, permite acomodar más segmentos en un solo chip. El chip que se muestra en la Figura tiene 640 segmentos de incubación independientes en los que puede tener lugar el cultivo de bacterias (u otros microorganismos).

Durante el proceso de llenado, la muestra ubicada al principio en el depósito de la muestra fluye hacia el canal 22. El canal termina con un paso 31 por el que la muestra entra en el canal 33 de la primera cara mayor del chip. Este canal conduce la muestra a la red de canales microfluídicos 35. En esta modalidad de la invención, la red de canales microfluídicos está dispuesta como una estructura fractal de canales que conducen a los segmentos de incubación en los que la muestra se divide en porciones iguales que entran en estructuras de microcanales más pequeñas a través de canales ramificados. Más específicamente, el chip de las figuras 1-2 consta de dos partes asimétricas con 128 y 512 segmentos de incubación. Preferentemente, la resistencia al flujo para cada trayectoria desde el depósito de la muestra hasta un segmento de incubación individual es sustancialmente la misma para cada trayectoria de modo que la cantidad de muestra que llega a cada segmento de incubación será sustancialmente la misma. La Figura 3 muestra un ejemplo de una trayectoria a través de estos microcanales conectados: una porción de la muestra fluye por el canal 36 hasta que llega a una unión en T 37 con un canal secundario 38. Aquí, sustancialmente la mitad de la muestra fluye en una dirección (por ejemplo, hacia la izquierda) en la primera rama 38' del canal secundario y la otra mitad de la muestra fluye en la dirección opuesta (por ejemplo, hacia la derecha) en la segunda rama 38". Cada una de estas ramificaciones conduce a su vez a una unión en T 40 con un canal terciario 41.

En la unión en T 40, sustancialmente la mitad de la muestra fluye en una dirección (por ejemplo, hacia la izquierda) en la primera ramificación 41' del canal terciario y la otra mitad de la muestra fluye en la dirección opuesta (por ejemplo, hacia la derecha) en la segunda ramificación 41". Cada una de estas ramificaciones conduce a su vez a una unión en T 42 con un canal cuaternario 43.

En la unión en T, sustancialmente la mitad de la muestra fluye en una dirección (por ejemplo, hacia la izquierda) en la primera ramificación 43' del canal cuaternario y la otra mitad de la muestra fluye en la dirección opuesta (por ejemplo, hacia la derecha) en la segunda ramificación 43". Cada una de estas ramificaciones conduce a su vez a una unión en T 44 con un canal quinario 45.

En la unión en T, sustancialmente la mitad de la muestra fluye en una dirección (por ejemplo, hacia la izquierda) en la primera rama 45' del canal quinario y la otra mitad de la muestra fluye en la dirección opuesta (por ejemplo, hacia la derecha) en la segunda ramificación 45". Cada una de estas ramificaciones conduce a su vez a una unión en T 46 con un canal senario 47.

Aquí, sustancialmente la mitad de la muestra fluye en una dirección (por ejemplo, hacia la izquierda) en la primera ramificación 47" del canal senario y la otra mitad de la muestra fluye en la dirección opuesta (por ejemplo, hacia la derecha) en la segunda ramificación 47'. Cada una de estas ramificaciones conduce a su vez a un pasaje de transporte 49 que penetra en el sustrato (pero no en las capas de material impermeable) y conduce la muestra a un canal septenario 51 que tiene dos ramificaciones 51', 51" cada uno de los cuales se extienden, como se muestra en la Figura 4, en la superficie de la primera cara mayor del sustrato, en dos direcciones opuestas desde el pasaje de transporte hasta una unión en T 52 con un canal de entrega 53.

En la unión en T 52, sustancialmente la mitad de la muestra fluye en una dirección (por ejemplo, hacia la izquierda) en la primera ramificación 53' del canal de entrega y la otra mitad de la muestra fluye en la dirección opuesta (por ejemplo, hacia la derecha) en la segunda ramificación 53". Cada una de estas ramificaciones conduce a su vez a una unión en T 54 con un canal divisor 57.

En la unión en T 54, sustancialmente la mitad de la muestra fluye en una dirección (por ejemplo, hacia la derecha) hacia un canal de entrada 57' de un primer segmento de incubación asociado 17' y la otra mitad de la muestra fluye en la dirección opuesta (por ejemplo, hacia la izquierda) en un canal de entrada 57" de un segundo segmento de incubación asociado 17".

Cada segmento de incubación 17 incluye un pozo de incubación 113, una cámara donde se ubica un subvolumen de la muestra durante la incubación, conectado por un canal de intercambio gaseoso 115 a su cavidad de gas sin ventilación 111 asociada, que comprende una cámara rellena de aire o cualquier otro gas o mezcla de gases, necesaria para el crecimiento microbiano.

Una vez que la muestra ha ingresado al pozo de incubación, se opera la válvula para liberar el líquido no acuoso, por ejemplo, la válvula de cera se calienta y la cera se derrite, lo que libera el líquido no acuoso del depósito 13. Este líquido no acuoso fluye a través de los mismos caminos que la muestra que permanece en los canales microfluídicos hasta que llega al canal divisor 57', 57" que llena al menos parcialmente, proporcionando de esta manera una barrera que evita que el gas o los fluidos acuosos se muevan de un segmento de incubación a otro. Preferentemente la viscosidad -a la temperatura usada para la carga del chip- del líquido no acuoso es superior o igual a 20 cP, con mayor preferencia superior o igual a 50 cP medida de acuerdo con el procedimiento ASTM ASTM D7279.

La modalidad de un chip presentado en las Figuras 1-4 tiene unas dimensiones generales de 128 x 85 mm y el grosor de su sustrato es igual a 2,2 mm. Pero cualquier tamaño es posible siempre y cuando permita acomodar el número deseado de segmentos de incubación y cumplir otros criterios descritos en esta descripción. Por ejemplo, se diseñó un chip con 128 segmentos de incubación con unas dimensiones totales de 85,5 x 49,7 mm. También se puede fabricar un chip de mayor tamaño siempre que sea práctico para el usuario, lo cual es una propiedad deseada de un chip de diagnóstico.

Explicación de una operación de chip

En la siguiente descripción el símbolo p^atmse refiere a la presión atmosférica ambiental en los alrededores fuera de un dispositivo en el que los segmentos de incubación se rellenan de acuerdo con el procedimiento que se describe más abajo.

Chip con conexión en serie de los segmentos de incubación

A continuación, se presenta un chip con una conexión en serie entre los segmentos de incubación. Un chip 109 con una conexión en serie de segmentos de incubación al depósito de la muestra se representa esquemáticamente en la Figura 5. En aras de la simplicidad, la Figura 5 muestra solo un segmento de incubación que se ramifica desde el canal microfluídico principal, aunque preferentemente muchos segmentos de incubación se ramifican desde él. Se pueden ubicar a ambos lados del canal principal. Además, el chip puede incluir muchos de estos canales principales. Un depósito 118 incluye una porción 119 que contiene una muestra y un depósito 120 para líquido no acuoso 121 que puede aislarse de la porción 119 mediante una válvula (no mostrada). Cada segmento de incubación 110 comprende 4 elementos, es decir, una cavidad de gas 111 de volumen V^d, un pozo de incubación 113 de volumen V^b, un canal microfluídico 115 de volumen V^cconectando estas dos partes, también denominadas canal de intercambio gaseoso, y un canal microfluídico 117 de volumen V^a, también denominado canal de entrada del segmento de incubación, que conduce al pozo de incubación desde un canal principal 123. Así, el volumen total del segmento de incubación V^{a b c d}es igual a V^a+V^b+V^c+V^d. El canal principal 123 del volumen V^{k g}está conectado al depósito 118 por un canal de entrada 125 de volumen V^enty conectado a una cámara de vacío 129 de volumen V^vaca través de un canal 127 del volumen V^sal. Por lo tanto, el volumen total del canal principal V^okges la suma de los volúmenes respectivos, es decir, V^okg= V^ent+V^{k g}+V^sal. En el caso de un chip con conexión en serie de segmentos de incubación, el volumen V^entdel canal de entrada de la red microfluídica principal se define como un volumen de la parte de la red microfluídica principal entre la salida del depósito de la muestra y un punto en el que un primer canal de entrada (proximal) 117 de un segmento de incubación se ramifica desde la red microfluídica principal la red. Chip con geometría fractal

Las Figuras 6, 7 y 8 muestran esquemáticamente las partes de un chip con geometría fractal que incluye 16, 32 y 128 segmentos de incubación respectivamente. En la Figura 6 están marcados los elementos de cada segmento de incubación. Estos son: pozo de incubación (62) de volumen V^b, cavidad de gas (64) de volumen V^d, y los canales microfluídicos 61 (canal de entrada del segmento de incubación del volumen V^a) y 63 (canal de intercambio gaseoso de volumen V^c). Los canales 65, 66, 67 y 68 conducen una muestra a 2, 4, 8 y 16 segmentos de incubación, respectivamente. De manera similar, los canales 70, 81 y 82 conducen una muestra a 32, 64 y 128 segmentos de incubación respectivamente.

Cálculos

1. Modelo matemático y condiciones para el correcto funcionamiento de un chip:

1.1. Supuestos con respecto a la geometría:

1.1.1. El rango de un fractal es igual a i significa N = 2ⁱde los segmentos de incubación V^{a b c d}.

1.1.2. La forma de un canal de entrada de un segmento de incubación se cambia en comparación con un chip con una conexión en serie.

1.1.3. Una célula base consta de dos segmentos de incubación de volumen V^{a b c d}. Un canal V^kconduce al número k de segmentos de incubación.

1.1.4. No hay cámara de vacío.

1.2. Etapas durante el llenado de los segmentos de incubación:

1.2.1. Descenso de una presión al valor p⁰.

1.2.2. Provocar un flujo de muestra desde el depósito de la muestra al sistema de microfluidos cambiando la presión a la presión preferida ilustrativa p1. Como resultado, habrá el siguiente volumen de una muestra en el sistema de microfluidos:

^ ( ¿ V ^a+ V^b + 4 v c )

2i(vA+vB+vc+vD)+vent+Yli=12i-W j

V , = 2)n ------- i -------- i ------------------------------ ----------------- —

2 i q V A l v c V D ) V m í+ r j = 1 2 l ~ J V 2j

1.2.3. Forzar a un líquido no acuoso a fluir hacia los canales microfluídicos que conectan el depósito de la muestra y dicho depósito de líquido no acuoso con los segmentos de incubación a la presión preferida ilustrativa p2. Luego, los canales de la red microfluídica principal se alimentan con un volumen

Z U 2 í ~j v 2j

del líquido no acuoso y los segmentos de incubación se separan.

² 1 ^(\v A \vc ^{+ V D} ⁾ ^Vgnt ^{+£}= 12} ^{l~JV j}

p 2 = P i — ^ ------- 1 -------------------------------—

2 l ( l v A ± V c V D ) V eM

1.2.4. Provocando un mayor flujo en el sistema de microfluidos del líquido no acuoso a la presión p3 = patm. Esto permite comprimir aire en las cavidades de gas V^dy llenar todos los pozos de incubación con una muestra.

2 Í { l V A ^ C V D )+ V e *

P 3 = P2 2 i i y D ^ - v c )

.3. Sumario:

1.3.1. Fórmulas ilustrativas de volumen preferidos para el gas V^air, muestra V^wy líquido no acuoso V^ocontenido en la estructura microfluídica del chip después de llenarlo a la temperatura T¹= 20 °C:

Va„ = 2 % ,

1.3.2. Las fórmulas de volumen a la temperatura. T 2 = 37 °C:

1.3.3. Valores óptimos de presión:

_ ________ 2l(vD+íyc) _________

Pl ~ P32Í{\vA+\vc VD) Vm >r'Z)^ 2<-ivJ

P z P3

donde:

yi 9 i - jv ■

21 es una suma de los volúmenes de todos los canales que van desde el depósito de la muestra hasta los segmentos de incubación (con la excepción del canal de entrada V^ent);

V^entes un volumen de un canal de entrada de la red microfluídica principal, es decir, el canal que va desde el depósito de la muestra (y el depósito de líquido no acuoso) a una estructura microfluídica fractal del chip, es decir, al primer punto de ramificación;

Por lo tanto

VM + £ y = i 2 l~JV2j

Es la suma de los volúmenes de todos los canales que van desde el depósito de la muestra hasta los segmentos de incubación;

p3 es la presión atmosférica.

.4. Datos de entrada:

P3 Patm>

VA = 0,197M¿,

VB = 2,45 iiL,

Vc =0,174 \iL,

VD = 1,17 fiL,

i = 7 ,

V2 = 1 ^-0,5 ^-0,5 nL ⁼0,25 uL,

V8 = 4 ■ 0 ,5 ■ 0 ,5 fiL = 1 ¡jlL,

V ⁱ¿ — 4 ■ 0 ,5 10 ,5 ¡ i L — 1 f i l ,

V 32 = 8 - 0,5 ■ 0,5 fiL = 2 fiL,

V 64 = 8 - 0,5 ■ 0,5 fiL = 2 fíL,

Vi28 = 16 ■ 0,510,5 iiL = A \xl,

V.M = 4 ¡J.L.

1.4.1. Resultados - los valores óptimos de presión que permiten el correcto funcionamiento del chip con los volúmenes anteriores y relaciones entre los volúmenes de las diferentes secciones:

P 3 = Patm = 1013,25 mbar,

po = 0 ,274 p 3 = 278 m bar,

653 mbar,

p 2 = 0,906 p 3 = 918 m b a r

Chip con geometría fractal y ramificaciones asimétricas

1.1. Geometría del chip

En la Figura 9 se muestra un ejemplo de un chip fractal asimétrico. El chip incluye 640 segmentos de incubación los cuales consisten de las siguientes estructuras

i) 4 partes con 128 segmentos de incubación (descritos anteriormente) - mostrado por 91 en la Figura 9, ii) 2 partes con 64 segmentos de incubación - mostrado por 92 en la Figura 9.

1.2. Supuestos matemáticos y de diseño:

1.2.1. Todos los segmentos de incubación son idénticos e indistinguibles (desde el punto de vista del modelo).

1.2.2. Un volumen parcial de todos los canales de suministro por un solo segmento de incubación (cociente de la suma de los volúmenes de todos los canales que conducen a un segmento de incubación, incluido el canal V^ent, y un número de los segmentos de incubación que comparten estos canales) es constante. Esto se calcula para cada segmento de incubación sumando, para cada sección del canal microfluídico que va desde el depósito de la muestra al segmento de incubación en cuestión, un cociente del volumen de la sección del canal microfluídico y una cantidad de segmentos de incubación a los que conduce.

1.2.3. Todos los segmentos de incubación están conectados en paralelo. Esto significa que solo puede haber horquillas de los canales (o, de manera más generalmente, cada canal solo puede dividirse en dos ramificaciones en los cruces) sin conexiones en serie.

Las condiciones antes mencionadas conducen a una partición uniforme de una muestra y un líquido no acuoso. 1.3. Modelo matemático.

Las suposiciones del punto 1.2 no modifican los valores de presión derivados en el inciso anterior porque dependen únicamente de los volúmenes ocupados por una muestra y aire en los segmentos de incubación que son los mismos. Por lo tanto, obtenemos los siguientes valores de una presión:

i) Presión inicial óptima:

_ _________ ^{n c v q}+ ± v c ) _________

Po — P 3 NQVA.+VB Vc VD -) VM . Vtocal'

Donde Vtotal significa una suma de los volúmenes de todos los canales que van desde el depósito de muestra hasta los segmentos de incubación sin el canal de entrada V^enty N significa el número total de segmentos de incubación.

ii) La presión óptima requerida para provocar el flujo de muestra hacia los segmentos de incubación:

ⁿ(^{v d}r\vc)

^{P l =} ^{P 3 —} _N( ⁷ _± ^3- _V ^--- _A ^--- ₊ ^{- i} _± ^-- _V ^-- _c ^--- ₊ ^--- _V ^-- _L - _> ^-\ ₎ ^- ₊ ^--- _V ^-- _. ^-- _„ ^-- _, ^-- ₊ ^-- _V ^-- _t ^-- _o ^-- _t - _a ^-- _. - _i

iii) La presión óptima requerida para separar los segmentos de incubación con un líquido no acuoso:

1.4. Conclusiones - Es necesaria una optimización de una geometría del chip fractal asimétrico para asegurar su correcto funcionamiento:

1.4.1. En la primera horquilla 100 (en la Figura 10), el volumen de una muestra que fluye hacia los segmentos de incubación del lado derecho debe ser correspondientemente mayor que el volumen de una muestra que fluye hacia los segmentos de incubación del lado izquierdo. Una relación de estos volúmenes es igual a la relación de los números de los segmentos de incubación en el lado derecho y en el lado izquierdo.

v m uestra derecha _ N derecha

m uestra '^ q u ie rd a ^ izquierda

1.4.2. La suposición anterior impone una relación análoga de un volumen de aire y por lo tanto de un volumen de los canales en el lado derecho y en el lado izquierdo.

V canales ^ N *r~ha

V canales aqulerda N izquierda

Existen las siguientes simetrías en este caso:

i) Los canales 101-104 y los canales 105-107 en la Figura 10 deben tener un volumen proporcional a Nderecho y Nizquierda respectivamente, que se puede escribir como la siguiente ecuación:

V canales l o 1 _ i o ¿ _ N derecha

canales i o s —107 ^ izquierda

ii) Los otros canales son compartidos por el mismo número de segmentos de incubación. Por lo tanto, todos los canales a ambos lados de la bifurcación A son idénticos y su número aumenta con la Nderecho y Nizquierdo. Conclusiones

1.1. El chip con geometría fractal no necesita la cámara de vacío. Por lo tanto, un volumen de muestra requerido es igual a la suma de los volúmenes de los pozos de incubación con posiblemente una pequeña reserva.

1.2. El llenado uniforme de los segmentos de incubación no requiere ningún control específico del flujo de líquido. Se logra mediante un equilibrio térmico y un equilibrio de presión.

1.3. Los valores requeridos de presiones se pueden aplicar fácilmente con el uso de una bomba de vacío. Una desviación de llenado igual o inferior al 5% no afecta al correcto funcionamiento de un chip.

1.4. La derivación anterior muestra los valores óptimos de las presiones. Sin embargo, se puede aplicar una presión con cierta tolerancia resultante de la diferente ocupación de los elementos del segmento de incubación (V^a-V^d) por un aire, una muestra y un líquido no acuoso. Estas diferentes configuraciones deberían garantizar que una muestra no entre en una cavidad de gas y que un gas y un líquido no acuoso no entren en un pozo de incubación. Pero tales condiciones dejan ciertos márgenes para el p0, p1 y P2 valores de acuerdo con las siguientes fórmulas y especificaciones:

(el gas solo llena las cavidades de gas);

_ __________ Aí(lr D - V c )____________

• í?0Opt ~~ N(VA^VB+Vc+VD)+Vi:„,+Vtotai Patm

(el gas llena las cavidades de gas y la mitad de cada canal de intercambio gaseoso);

jV(^ D+ VC)

• Po máx NiVA+VB+Vc+VDi+Vrt+Vtoua Patín

(el gas llena las cavidades de gas y los canales de intercambio gaseoso);

NVD

. Plmm = N(VA+Vc+VD)+Vem+Vtotal 'P‘ a tm

(el gas llena solo las cavidades de gas, la muestra llena solo los pozos de incubación);

(el gas llena las cavidades de gas y la mitad de cada canal de intercambio gaseoso, la muestra llena los pozos de incubación y la mitad de todos los canales de entrada y de intercambio gaseoso);

(el gas llena las cavidades de gas, la muestra llena los pozos de incubación y los canales de entrada y de intercambio gaseoso);

(el gas llena las cavidades de gas, la muestra llena los pozos de incubación y los canales de intercambio gaseoso, el líquido no acuoso llena los canales de entrada (o sus partes, en dependencia de p-i) y los canales que conducen a los segmentos de incubación);

(el gas llena las cavidades de gas y las mitades de los canales de intercambio gaseoso, la muestra llena los pozos de incubación, las mitades de los canales de intercambio gaseoso y parte de cada canal de entrada (en dependencia de pi), líquido no acuoso llena parte de cada canal de entrada (en dependencia de pi) y los canales que conducen a los segmentos de incubación);

• p 2máx = patm (el gas llena las cavidades de gas y los canales de intercambio gaseoso, la muestra llena los pozos de incubación y parte de cada canal de entrada (en dependencia de pⁱ), líquido no acuoso llena parte de cada canal de entrada (en dependencia de pⁱ) y los canales que conducen a los segmentos de incubación).

La tabla de más abajo presenta los valores ilustrativos de una presión definida como anteriormente que se calcularon para un chip con ramificaciones asimétricas y 640 segmentos de incubación acomodados. Los siguientes volúmenes se usan V^a= 0,36 pl, V^b= 2,26 pl, Vc= 0,26, V^d= 1,06 pl, V^ent= 0, y V^total= 668,2 pl. Ade supone que es igual a 1.013,25 mbar.

Las Figuras 11A a 11G muestran vistas laterales esquemáticas de las etapas de llenado de un pozo de incubación de un chip.

La Figura 11A muestra esquemáticamente una porción de un chip. El chip comprende un depósito de la muestra para recibir y almacenar una muestra para análisis 11, un depósito de líquido no acuoso 13 para recibir y almacenar un líquido no acuoso, una abertura de entrada de líquido no acuoso 21 que conduce al depósito de líquido no acuoso, una abertura de entrada de muestra 25 que conduce al depósito de la muestra, una abertura de salida del depósito de la muestra 27 que conduce a un conducto 22, una abertura de salida del depósito de líquido no acuoso

39 que conduce al conducto 22, una válvula de cera 24 que puede evitar que el líquido no acuoso salga del depósito de líquido no acuoso y entre en el depósito de la muestra, una red de canales que van desde el depósito de la muestra hasta el canal de entrada 57' de un segmento de incubación 17', un pozo de incubación 113 conectado por un canal de intercambio de gases 115 a su cavidad de gas sin ventilación 111 asociada. La presión ambiental alrededor y dentro de las cámaras y canales del chip es la presión atmosférica p^atm.

En la Figura 11B, el depósito de líquido no acuoso se ha rellenado parcialmente con un líquido no acuoso NAL y la abertura de entrada 21 se ha sellado a presión atmosférica.

En la Figura 11 C, el depósito de la muestra se ha llenado parcialmente con una muestra SAM. La abertura de entrada de la muestra permanece abierta a la presión ambiental. Las fuerzas capilares impiden que la muestra entre en la red de canales. El chip se coloca en una cámara en la que la presión se reduce a una presión p^oque está más abajo de la presión atmosférica. Esto hace que parte del gas del chip fluya fuera de la cavidad de gas, el canal de intercambio de gases, el pozo de incubación, el canal de entrada y la red de canales (la red microfluídica principal) y pase a través del depósito de la muestra hacia el exterior del chip hasta que la presión dentro del sistema microfluídico sea igual a p^o.

En la Figura 11 D la presión se ha elevado a pⁱ. Esto hace que la muestra sea empujada fuera del depósito de muestras hacia la red de canales y hacia el pozo de incubación hasta que la presión dentro de la cavidad de gas, el canal de intercambio gaseoso, el pozo de incubación, el canal de entrada y la red de canales sea igual a p¹.

En la Figura 11 E se ha abierto la válvula entre el depósito de fluido no acuoso y el depósito de la muestra. Como la presión en el depósito de líquido no acuoso es inicialmente mayor que p¹, el líquido no acuoso en el depósito de líquido no acuoso fluirá desde el depósito de líquido no acuoso hacia el depósito de la muestra hasta que la presión en el depósito de líquido no acuoso caiga a p¹. Preferentemente, la densidad del líquido no acuoso es mayor que la de la muestra, de modo que el exceso de muestra flote sobre el líquido no acuoso.

En la Figura 11 F la presión ambiental se eleva a p²que puede ser menor que la presión atmosférica o igual a la presión atmosférica. El líquido no acuoso se succiona a la red de canales y llega al canal de entrada 57' de un segmento de incubación 17', evitando de esta manera un intercambio de muestra entre el segmento de incubación 17' y cualquier segmento de incubación vecino.

La Figura 11 G muestra la penetración continua de líquido no acuoso en el segmento de incubación si la presión p²era menor que la atmosférica y que ocurriría cuando el chip se sometiera a una presión ambiental igual a la presión atmosférica p^atm.

La Figura 12 muestra una vista en planta de una modalidad de un depósito de la muestra 141 de acuerdo con una modalidad de la presente invención. Los párrafos siguientes, junto con la Figura 12, describen las condiciones preferidas para la correcta operación de los depósitos de la muestra y de líquido no acuoso de acuerdo con la presente invención. Cuando la presión ambiental inicialmente está disminuyendo, el gas de la estructura microfluídica es evacuado del interior del chip por una trayectoria que fluye a través de la muestra en el depósito. Como la abertura de entrada de la muestra 25 no tiene por qué estar necesariamente cubierta por un material impermeable al líquido durante el llenado de los segmentos de incubación (de hecho, incluso puede estar abierta), es importante que la muestra no se pierda por esta abertura. Esto se puede lograr haciendo que la altura vertical h^sdel depósito de la muestra lo suficientemente grande como para dar suficiente distancia entre la superficie de una muestra en el depósito y la abertura de entrada para evitar fugas en uso normal. La altura h^ses preferiblemente superior o igual a 30 mm, con mayor preferencia superior o igual a 40 mm, aún con mayor preferencia superior o igual a 50 mm. Además, la prevención de fugas de muestras al ser arrastradas por burbujas de gas durante la salida del gas a través del depósito de la muestra puede mejorarse proporcionando al depósito de la muestra uno o más salientes internos 131 y 132.

Estas proyecciones sobresalen de las paredes laterales del depósito y evitan que las burbujas de gas que fluyen hacia arriba empujen hacia arriba una muestra. Deben ser lo suficientemente grandes para modificar la sección transversal de un canal a través del cual puede fluir el gas y para cambiar la forma de las burbujas.

Sin embargo, la distancia entre los extremos distales de las proyecciones y la pared lateral opuesta también debe ser mayor que la distancia a través de la cual las fuerzas capilares provocan el flujo de líquido, para evitar que las fuerzas capilares afecten allí a la muestra. Por lo tanto, el ancho w^sdel depósito de la muestra es preferentemente superior o igual a 6 mm, con mayor preferencia superior o igual a 7 mm, aún con mayor preferencia superior o igual a 9 mm. El ancho de la proyección w^pes preferentemente superior o igual a 1 mm, con mayor preferencia superior o igual a 2 mm, aún con mayor preferencia superior o igual a 3 mm. El ancho del espacio entre la punta distal de la proyección y la pared lateral opuesta w^gramoes preferentemente superior o igual a 3 mm, con mayor preferencia superior o igual a 4 mm. El depósito de muestra puede ser más amplio en su extremo inferior (es decir, opuesto a la abertura de entrada de muestra). Esto facilita la evacuación de un gas y, para un volumen dado de muestra, aumenta la distancia desde la superficie expuesta de la muestra hasta la abertura de entrada de muestra en comparación con el extremo inferior estrecho de un depósito de la muestra, lo que es útil para evitar fugas. Todas las dimensiones de ancho (es decir, perpendiculares a un eje longitudinal del depósito de la muestra) son relevantes para estos efectos. Preferentemente el ancho, perpendicularmente al plano del sustrato, del depósito de la muestra en la proximidad del extremo inferior es superior o igual a 5 mm, con mayor preferencia superior o igual a 7 mm. Preferentemente, el ancho en el plano del sustrato de la porción inferior del depósito de la muestra es superior o igual a 10 mm. Esas condiciones afectan significativamente un volumen del depósito de la muestra. Su valor mínimo es igual al producto del volumen de un solo pozo de incubación y el número de segmentos de incubación en el chip. El volumen mínimo es igual o superior a 1,5 ml para un chip de 640 segmentos, pero es menor para un número menor de segmentos (por ejemplo, unos 0,29 ml para un chip de 128 segmentos). Sin embargo, como puede verse a partir de las consideraciones anteriores, el volumen del depósito de la muestra debe ser mayor. Preferentemente es igual o superior al doble del volumen total de los pozos de incubación de todos los segmentos de incubación del chip al que está conectado y con mayor preferencia es igual o superior al triple del volumen total de dichos segmentos de incubación.

El depósito de líquido no acuoso (NAL) 143 también debería tener un volumen que sea mayor que un volumen mínimo de NAL que sea igual al volumen total de los canales microfluídicos que van desde el depósito de la muestra a todos los segmentos de incubación. Cuando un NAL fluye al depósito de muestra después de la activación de una válvula, el gas sobre el líquido debe cambiar su presión de p^atma p¹donde p¹es la presión en el chip microfluídico cuando la muestra fluye hacia los segmentos de incubación. Para expulsar sustancialmente todo el volumen de NAL del depósito, su volumen no debe ser menor que

donde V^{n a l}es el volumen mínimo de NAL mencionado anteriormente. Desde p¹puede ser alrededor de 0,67 p^atmo menos (generalmente disminuye con un número creciente de segmentos de incubación), el depósito NAL preferentemente tiene un volumen igual o mayor que dos veces el volumen total de los canales que van desde el depósito de la muestra a todos los segmentos de incubación, con mayor preferencia es igual o superior a tres veces dicho volumen total. Este depósito también debe ser lo suficientemente ancho para que las fuerzas capilares no impidan el flujo de NAL al depósito de la muestra. El ancho del depósito wⁿes preferentemente superior o igual a 4 mm, con mayor preferencia superior o igual a 5 mm, aún con mayor preferencia superior o igual a 6 mm. Como un NAL entra en el depósito de la muestra a través de la abertura de salida de NAL 39' y sale a través de la abertura de salida del depósito de la muestra 27, su posicionamiento adecuado es importante para minimizar el volumen muerto de NAL. Es posible que el volumen de la parte del depósito de la muestra encerrado entre estas aberturas, V^act, es mayor que el volumen mínimo de NAL como se define anteriormente. La abertura 27 también debe ubicarse preferiblemente cerca del punto más bajo del depósito de muestra, preferiblemente a una distancia d¹que es menor o igual a 3 mm. También es ventajoso cuando un NAL que ingresa al depósito de la muestra fluye hacia abajo por el costado del depósito de la muestra. Para este propósito, se prefiere una distancia d², que es menor o igual a 3 mm.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Chip microfluídico (1) para realizar ensayos microbiológicos, que comprende un sustrato (2) en el que una pluralidad de segmentos de incubación (17) cada uno con un canal de entrada (57', 57"), un depósito de la muestra (11) con una abertura de entrada de muestra (25) y una abertura de salida (27), y se disponen canales microfluídicos (22, 33, 35) que conectan la abertura de salida de dicho depósito de la muestra con cada canal de entrada a dichos segmentos de incubación, en donde:

dicho chip microfluídico comprende además un depósito de fluido no acuoso (13) para contener líquido no acuoso, en donde dicho depósito de fluido no acuoso tiene una abertura de salida (39) que se puede conectar a través de una válvula liberable hermética a gases y líquidos (24) con dichos canales microfluídicos caracterizados porque cada segmento de incubación comprende un pozo de incubación (113) conectado por un canal de intercambio gaseoso (115) a una cavidad de gas sin ventilación (111) y los segmentos de incubación están dispuestos de manera fractal en el que los respectivos microcanales que conectan cada uno de los segmentos de incubación al depósito de la muestra es sustancialmente igual de largo y/o tiene la misma resistencia al flujo.

2. Chip de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el número de segmentos de incubación es igual o superior a 100 segmentos de incubación, preferentemente igual o superior a 128 segmentos de incubación, con mayor preferencia igual o superior a 320 segmentos de incubación, aún con mayor preferencia igual a o superior a 640 segmentos de incubación, y con la máxima preferencia igual a o superior a 1.280 segmentos de incubación.

3. Chip de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque dicho chip está hecho de poliestireno, policarbonato, poli(metacrilato de metilo), polímero de olefina cíclica o copolímero de olefina cíclica.

4. Chip de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha válvula es una válvula termosensible.

5. Chip de acuerdo con la reivindicación 4 caracterizado porque dicha válvula termosensible es una válvula de cera que contiene cera que se funde a una temperatura superior o igual a 37 °C.

6. Chip de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, la distancia más corta entre dos segmentos de incubación adyacentes, medida a lo largo de los canales microfluídicos que conectan estos segmentos es menor o igual a 10 mm, preferentemente menor o igual a 8 mm, con mayor preferencia menor o igual a 7 mm.

7. Chip de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el volumen del depósito de la muestra es al menos tres veces mayor que el volumen total de los pozos de incubación, y/o porque el volumen del depósito de líquido no acuoso es al menos dos veces mayor, y preferentemente al menos tres veces mayor, que el volumen total de los canales microfluídicos que van desde el depósito de la muestra hasta los segmentos de incubación.

8. Chip de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el depósito de la muestra es de forma alargada y su dimensión longitudinal máxima es superior o igual a 30 mm, preferentemente superior o igual a 40 mm, con mayor preferencia superior o igual a 50 mm.

9. Chip de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el depósito de la muestra tiene un extremo de entrada y un extremo de salida en donde el extremo de salida es más ancho que el extremo de entrada y/o el ancho del extremo de salida del depósito de la muestra perpendicular al eje longitudinal del depósito de la muestra es superior o igual a 5 mm, preferentemente superior o igual a 7 mm, con mayor preferencia superior o igual a 10 mm, y/o porque el depósito de la muestra tiene al menos una primera pared lateral y una segunda pared lateral opuesta en la que al menos un proyección (131, 132) sobresale de dicha primera pared lateral en la que el ancho de la proyección medido en una dirección perpendicular a dicha pared lateral es superior o igual a 1 mm, preferentemente superior o igual a 2 mm, con mayor preferencia superior o igual a 3 mm, y/o en la que la distancia más corta entre el extremo distal del saliente y la pared lateral opuesta es preferentemente superior o igual a 3 mm, con mayor preferencia superior o igual a 4 mm.

10. Chip de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el depósito de líquido no acuoso tiene un extremo de entrada y un extremo de salida y porque el ancho del extremo de salida es más estrecho que el ancho del extremo de entrada, y/o porque el ancho del depósito de líquido no acuoso en su punto más ancho es superior o igual a 4 mm, preferentemente superior o igual a 5 mm, con mayor preferencia superior o igual a 6 mm.

11. Chip de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la distancia entre la abertura de salida del depósito de la muestra y el punto más bajo del depósito de la muestra, y la distancia entre la abertura por la que entra el líquido no acuoso en el depósito de la muestra y la pared lateral más cercana del depósito de la muestra son cada uno igual o inferior a 3 mm y con mayor preferencia igual o inferior a 2 mm.

12. Chip de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde dicho depósito de líquido no acuoso comprende un líquido no acuoso con una viscosidad superior o igual a 20 cP, preferentemente superior o igual a 50 cP de acuerdo con ASTM D7279.

13. Un procedimiento de llenado de los segmentos de incubación en un chip microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende en orden las siguientes etapas:

a. introducir líquido no acuoso, preferentemente con una viscosidad superior o igual a 20 cP, con mayor preferencia superior o igual a 50 cP de acuerdo con ASTM D7279, en el depósito de líquido no acuoso, b. introducir una muestra en el depósito de la muestra,

c. colocar un chip en un contenedor herméticamente cerrado separado de su entorno,

d. reducir la presión en dicho contenedor a un valor p0,

e. aumentar la presión en dicho contenedor herméticamente cerrado a un valor p-i, en el que la muestra fluye desde un depósito de la muestra a los canales microfluídicos que conectan dicho depósito de la muestra con los segmentos de incubación y más hacia dichos segmentos de incubación,

f. activar la válvula para abrir una trayectoria de flujo desde dicho depósito de líquido no acuoso a dichos canales microfluídicos que conectan dicho depósito de la muestra con dichos segmentos de incubación, y g. aumentar aún más la presión en dicho contenedor herméticamente sellado a un valor p2, para obligar a dicho líquido no acuoso a fluir hacia los canales microfluídicos que conectan el depósito de la muestra y dicho depósito de líquido no acuoso con los segmentos de incubación;

h. subsecuentemente de manera opcional, aumentar aún más la presión en dicho contenedor herméticamente cerrado hasta la presión atmosférica ambiente patm,

en donde p0 varía entre

____________ ⁿV^d ____________

N O V V B + V c + V _d) V 'M V total ^Patm

y

, pi varía entre

__________ N V ^d __________

N (VA Vc V D) V em Vt0ta i P a ím

y

______ n v d ______

N V 0 Venl ~¡~V to lu l ^{P a tm}

y p2 varía entre

y Patm,

donde p^atmdenota la presión atmosférica ambiente fuera de dicho contenedor herméticamente sellado, N -número de segmentos de incubación en dicho chip, V^a- el volumen del canal de entrada del segmento de incubación, es decir el canal que conecta la red microfluídica principal con el pozo de incubación, VB - el volumen del pozo de incubación, V^c- volumen de un canal de intercambio gaseoso, que conecta el pozo de incubación y una cavidad de gas, V^d- volumen de una cavidad de gas, V^ent- volumen de un canal de entrada de la red microfluídica principal, es decir, el canal que va desde el depósito de la muestra hasta la primera rama de la red microfluídica principal, V^total- un volumen total de la red de canales microfluídicos que van desde el depósito de la muestra hasta los segmentos de incubación excluyendo dicho canal de entrada.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque después de la etapa f) o de la etapa g), el chip microfluídico se sella de manera permanente y el interior del chip se separa de su entorno.