ES2875521T3 - Segmento de incubación con una cavidad de gas sin ventilación en un chip de microfluidos - Google Patents

Segmento de incubación con una cavidad de gas sin ventilación en un chip de microfluidos Download PDF

Info

Publication number
ES2875521T3
ES2875521T3 ES18189593T ES18189593T ES2875521T3 ES 2875521 T3 ES2875521 T3 ES 2875521T3 ES 18189593 T ES18189593 T ES 18189593T ES 18189593 T ES18189593 T ES 18189593T ES 2875521 T3 ES2875521 T3 ES 2875521T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
incubation
equal
volume
less
well
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18189593T
Other languages
English (en)
Inventor
Piotr Garstecki
Jaroslaw Ziolkowski
Piotr Knap
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bacteromic Sp Z O O
Bacteromic Sp zoo
Original Assignee
Bacteromic Sp Z O O
Bacteromic Sp zoo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bacteromic Sp Z O O, Bacteromic Sp zoo filed Critical Bacteromic Sp Z O O
Application granted granted Critical
Publication of ES2875521T3 publication Critical patent/ES2875521T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/22—Transparent or translucent parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/18—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes
    • C12M41/24—Heat exchange systems, e.g. heat jackets or outer envelopes inside the vessel
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un segmento de incubación (S) en un chip de microfluidos para ensayos microbiológicos, en donde dicho segmento de incubación se forma en un sustrato (1) con una cara principal superior (3) y una cara principal inferior (5), dicho segmento incluye un pocillo de incubación (21), un canal de entrada (13) a través del cual se puede introducir una muestra en dicho pocillo de incubación, y una cavidad de gas (35) conectada a dicho pocillo de incubación por un canal de comunicación de microfluidos (31), caracterizado porque dicha cavidad de gas no está ventilada y que la base de la cavidad de gas está conectada a la base del pocillo de incubación por el canal de comunicación (31).

Description

DESCRIPCIÓN
Segmento de incubación con una cavidad de gas sin ventilación en un chip de microfluidos
Campo de la invención
El campo de la invención es la geometría de un solo segmento de incubación en un chip de microfluidos adecuado para pruebas microbiológicas. Tales pruebas incluyen la identificación de microbios y pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (AST). Cada segmento puede contener un antibiótico (o una combinación de antibióticos) con una(s) concentración(es) determinada(s). Un solo chip incluye múltiples segmentos de incubación que contienen, por ejemplo, diferentes antibióticos a diferentes concentraciones lo que permite detectar la resistencia a los antibióticos y determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) para cada uno de los antibióticos.
Estado de la técnica
La solicitud de patente EP1696238 A2 describe un chip para ensayos microbiológicos que incluye múltiples segmentos de incubación independientes en los que tiene lugar el cultivo bacteriano. Estos segmentos son orificios de salida en una placa de plástico fabricada mediante el uso de moldeo por inyección. Cada segmento está conectado a una pequeña trampa de aire. Con la orientación adecuada de la tarjeta de prueba (es decir, durante el cultivo de bacterias), la trampa se ubica sobre el pocillo donde se coloca un compartimiento de muestra. La trampa se usa para eliminar las burbujas de gas de la suspensión de bacterias que podrían perturbar la medición óptica. Sin embargo, no proporciona el acceso adecuado al aire necesario para el crecimiento bacteriano. El chip debe cerrarse con una lámina permeable para permitir el cultivo. La lámina se especifica en la solicitud de patente EP0745667 A1. Para garantizar la adecuada permeabilidad al oxígeno, la lámina se fabrica de polimetilpenteno permeable al oxígeno.
La patente europea EP 0903569 B1 describe un chip para ensayos microbiológicos que consta de tres secciones. Las dos secciones externas constituyen las paredes superior e inferior de cada segmento de incubación y el elemento central establece las paredes laterales. Este diseño significa que el chip debe fabricarse de material transparente (esto se aplica al menos a las capas externas) para que la prueba óptica de un cultivo sea posible en cada segmento. Tienen una sección circular que se ensancha de la parte inferior hacia arriba y están conectados entre sí por canales de ventilación con pequeñas secciones transversales. Al llenar los segmentos de incubación, la muestra expulsa el aire dentro del segmento de incubación a través del conducto de ventilación. El pequeño tamaño del conducto permite eliminar el gas al tiempo que evita la entrada de la muestra de agua. En el chip que se muestra en la solicitud US 2009/0155128 A1 el aire se elimina de los segmentos de incubación de manera similar.
El documento WO2013/045631 A1 enseña cámaras llenas de gas sin ventilación en las que el gas se usa para controlar el flujo de un líquido desde un canal de distribución hacia la cámara (reducir la temperatura del gas en una cámara provoca una caída en la presión del gas y arrastra el líquido hacia la cámara). La cámara llena de gas y el canal de distribución se colocan radialmente. Esta configuración geométrica no proporciona el intercambio de gases con el pocillo donde se cultivan las bacterias y tampoco permite una distribución densa de cámaras en el chip.
El documento WO 2018/030958 A1 describe un segmento de incubación en un chip de microfluidos que tiene una primera y una segunda superficie principal con un pocillo de incubación que puede incluir una cavidad superior usada para la perfusión de gases y un canal de entrada.
Por lo tanto, en el estado de la técnica no hay soluciones donde el pocillo de incubación en el chip para ensayos microbiológicos esté conectado con una cavidad de gas que satisfaga la necesidad del intercambio de gases de los microorganismos cultivados, particularmente de oxígeno, en particular de una forma que no limite su crecimiento. En los chips conocidos, el aire se elimina del segmento de incubación mientras se llena, ya sea fuera de su volumen o en la trampa de aire especial. Proporcionar el aire a las bacterias a través de la red de canales de microfluidos hace que sea imposible garantizar su separación física, la que de cualquier otra manera podría lograrse mediante el llenado de los canales de microfluidos con un aceite mineral para contrarrestar cualquier contaminación cruzada. Otra solución usada es una lámina especial permeable al aire. La invención descrita permite el cultivo bacteriano en los segmentos de incubación con el sellado del chip con una lámina impermeable.
Objeto de la invención
El objeto de la invención es proporcionar segmentos de incubación mejorados para ensayos microbiológicos y similares.
Esto se logra mediante un segmento de incubación que tiene las características de acuerdo con la reivindicación 1. Las características de las reivindicaciones dependientes proporcionan mejoras adicionales.
Descripción de las figuras
La Figura 1A muestra una modalidad de acuerdo con la presente invención de un segmento de incubación desde arriba oblicuamente cuando está en uso y la Figura 1B muestra una vista oblicua desde abajo del segmento de incubación cuando está en uso.
La Figura 2 muestra la sección transversal a través de la línea I-I' de la Figura 1A.
La Figura 3 muestra esquemáticamente una vista en planta de un lado principal de un chip que comprende una pluralidad de segmentos de incubación de acuerdo con la presente invención.
La Figura 4 muestra esquemáticamente una vista en planta del lado principal opuesto del chip de la Figura 3.
Descripción detallada de la invención
En los siguientes términos relacionados con la posición u orientación tales como "superior", "inferior", "horizontalmente", "verticalmente", "arriba" y "abajo" están en relación con el segmento de incubación cuando está en su posición normal de uso. En la modalidad mostrada en las figuras, esta posición normal de uso es donde la superficie del chip que contiene los segmentos de incubación se coloca con la salida del depósito de muestra colocada debajo de la entrada al depósito de muestra.
En el contexto de la presente solicitud, siempre que se mencionen "bacterias", lo mismo aplica a otros microorganismos, tales como, por ejemplo, hongos unicelulares.
Las Figuras 1A, 1B y 2 muestran esquemáticamente un ejemplo de un segmento de incubación S formado en un sustrato 1 de grosor preferentemente constante. El sustrato es preferentemente plano con una cara principal superior 3 y una cara inferior 5, preferentemente paralela. El sustrato puede fabricarse de cualquier material impermeable a los vapores y a los líquidos, por ejemplo, un polímero, metal o vidrio. Como se muestra en la Figura 2, la superficie superior está cubierta por una capa superior 7 de material transparente impermeable tal como una película de polímero y la superficie principal inferior está cubierta por una capa inferior 9 de material transparente impermeable tal como una película de polímero. La abertura de entrada 11 conduce a un canal de entrada 13 para transportar una muestra desde la abertura de entrada a un pocillo de incubación. Alternativamente, o adicionalmente, una abertura de entrada puede conducir a un canal de suministro de muestra (no mostrado) formado en el sustrato. El canal de entrada se forma preferentemente como una ranura 17 en la cara principal. El canal de entrada se extiende y desemboca en la pared lateral 19 del extremo superior 25 de un pocillo de incubación 21. El pocillo de incubación tiene preferentemente la forma de un agujero pasante vertical 23 que se extiende a través del sustrato, pero no a través de las capas superior e inferior de material impermeable. El pocillo de incubación está cubierto en su extremo superior 25 y extremo inferior 27 por las respectivas películas transparentes impermeables superior e inferior. En el extremo inferior del pocillo de incubación, una ranura 29, preferentemente horizontal, formada en la cara inferior del sustrato forma un canal de comunicación de microfluidos 31, que también puede denominarse un canal de intercambio de gases, que conduce hacia una abertura de la pared lateral 33 en la base 34 de una cavidad de gas sin ventilación 35. La profundidad del extremo de la ranura donde entra en la pared lateral de la cavidad de gas es una profundidad predeterminada. La profundidad del otro extremo de la ranura donde entra en el pocillo de incubación puede ser menor, igual o mayor que esa profundidad predeterminada. Por "cavidad de gas sin ventilación" se entiende que el aire u otros fluidos solo pueden entrar o salir de la cavidad de gas mediante el canal de comunicación durante el uso. La cavidad de gas tiene forma de un agujero ciego 37 de profundidad predeterminada. El volumen V¡ del pocillo de incubación es mayor que el volumen Vg de la cavidad de gas. El volumen Vc del canal de comunicación es preferentemente más pequeño que el de la cavidad de gas.
Preferentemente, se forma una pluralidad de segmentos de incubación S como una red en un chip 39 como se muestra en la Figura 3. El chip puede estar provisto con una red de canales de suministro de muestras 41. Estos canales están conectados a uno o más canales de entrada de muestra 43 que conducen a través de un agujero pasante 45 en el sustrato a un depósito de muestra. Preferentemente, la red de canales está dispuesta en una red fractal, lo que significa que la distancia que recorre la muestra hasta cada pocillo de incubación desde el depósito de muestra es la misma distancia para cada segmento de incubación. La forma del canal de entrada de cada segmento de incubación se puede adaptar, por ejemplo, haciéndolo más o menos curvado, para ayudar a lograrlo.
Los pocillos de incubación contienen preferentemente cantidades diferentes de sustancias a probar, por ejemplo, antibióticos, y cualquier otra sustancia auxiliar y/o indicadores de crecimiento microbiano y cualquier combinación de estos u otros reactivos necesarios para realizar ensayos microbiológicos. Estas sustancias (denominadas colectivamente "reactivos" en lo adelante) se pueden cargar en los pocillos de incubación después de la unión de una de las capas de material transparente impermeable y antes de la unión de la segunda de las dos capas de material transparente impermeable. Preferentemente, los reactivos se unen a las paredes del segmento de incubación de una manera que les permita liberarse cuando se exponen a una solución acuosa.
Las capas 7, 9 de material transparente impermeable (tal como una lámina de polímero hecha de, por ejemplo, preferentemente poliestireno, policarbonato, poli(metacrilato de metilo), polímero de olefina cíclica o copolímero de olefina cíclica) forman ventanas ópticas que permiten la iluminación del pocillo de incubación 21 y subsecuentemente la detección de luz dispersa o fluorescente. La cavidad de gas se construye preferentemente de manera que se abra solo desde un lado de la placa antes de la unión de la capa inferior de material transparente impermeable. Preferentemente, la cavidad de gas se ubica debajo del canal de entrada 13 que conduce la muestra al pocillo de incubación y separada del canal de entrada por un grosor predeterminado de material de sustrato. Tener el canal de entrada superpuesto a la cavidad de gas permite el uso eficiente de un espacio en el chip, de modo que con chips de tamaños fáciles de manipular (por ejemplo, 128 mm x 85 mm), una gran cantidad de segmentos de incubación poco espaciados (hasta 640 o más) se pueden ubicar en el chip, lo que mejora su funcionalidad al permitir que se realicen más cultivos bacterianos durante una sola prueba. Se debe señalar que el número de pocillos de reacción independientes es el factor principal que limita la funcionalidad de las tarjetas de prueba AST de la técnica anterior. La posibilidad de acomodar un número tan grande de segmentos de incubación en un solo chip permite la adquisición de información completa sobre la susceptibilidad a los medicamentos de las bacterias en la muestra (es decir, al permitir la prueba de más antibióticos o sus combinaciones para una posible resistencia, la determinación de una verdadera MIC que requiere la realización de un mayor número de cultivos que la determinación de los puntos de ruptura de la concentración de antibiótico, posible hallazgo de un mecanismo de resistencia). En este sentido, el segmento de incubación permite obtener propiedades únicas que superan significativamente las propiedades de las tarjetas de prueba AST conocidas en el estado de la técnica.
El gas necesario para el crecimiento bacteriano está contenido en la cavidad de gas desde donde se difunde a la suspensión en el pocillo de incubación. Con esta solución, puede usarse una lámina impermeable para sellar el chip, que es menos costosa que una lámina permeable y proporciona una mejor protección contra la evaporación de la muestra. La provisión de aire desde la cavidad interior del segmento de incubación significa que después de que se haya introducido una muestra en el segmento de incubación, es posible sellar la abertura de entrada y/o el canal de entrada. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la introducción de un líquido no acuoso, como un aceite mineral, en la abertura de entrada. Esto evita la contaminación entre los segmentos y también evita la evaporación de la solución de muestra.
El chip 39 comprende una red de canales de microfluidos 41 que conducen a las aberturas de entrada de los segmentos de incubación. Cuando se va a usar el chip y se llenan los segmentos de incubación, puede aplicarse una muestra al extremo de entrada 43 de la red desde la salida 45 de un depósito de muestra 47 previamente cargado por un operador a través de un puerto de entrada 46 en el depósito de muestra. La muestra fluye mediante la red de canales de microfluidos 41 desde el depósito de muestras a los canales de suministro que se ramifican desde la red principal de los canales de microfluidos y cada uno de los cuales conduce a la respectiva abertura de entrada de un segmento de incubación. El llenado puede lograrse mediante la colocación del chip, con una muestra en su depósito de muestra, en un contenedor sellado tal como una cámara de llenado y reducción de la presión en la cámara de manera que el chip se someta a una atmósfera que está a una presión por debajo de la presión atmosférica ambiental -de esta manera se forma una subpresión en la red de canales y segmentos de incubación por medio de la evacuación de aire de los segmentos de incubación y los canales de microfluidos a través de la muestra en el depósito de muestra y fuera del chip. La presión en la atmósfera circundante (por ejemplo, en la cámara de llenado) puede aumentar subsecuentemente, lo que provoca de esta manera el movimiento de la muestra desde el depósito de muestra a los segmentos de incubación. El volumen del depósito de muestra debe ser suficiente para garantizar que cada uno de los pocillos de incubación reciba la dosis correcta de muestra. Preferentemente, la presión no aumenta a la presión atmosférica ambiental en este momento, para permitir el uso de un aumento de presión adicional para permitir que un líquido de sellado, por ejemplo un líquido no acuoso o un aceite, se aplique a la red de canales de microfluidos - ya sea desde la salida 48 de un depósito de líquido no acuoso 50 mediante el depósito de muestra u otra ruta - cuyo líquido de sellado, al elevar la presión externa a, por ejemplo, la presión atmosférica, es aspirado en los canales de entrada, lo que sella de esta manera los canales de entrada. Esto evita la evaporación de la muestra y la contaminación cruzada entre los segmentos de incubación.
En una modalidad adicional de la invención, las posiciones del canal de entrada, el canal de comunicación y la cavidad de gas están invertidas, es decir, la cavidad de gas se forma como un orificio ciego desde la superficie superior del sustrato, el canal de comunicación se forma como una ranura en la superficie superior del sustrato y el canal de entrada se forman como una ranura en la superficie inferior del sustrato.
Los volúmenes de las secciones individuales en un segmento de incubación en una modalidad de un segmento de incubación de acuerdo con la invención son los siguientes:
Preferentemente, el volumen de la cavidad del gas Vg es mayor o igual que el 5 % del volumen Vi del pocillo de incubación e igual o menor que el 100 % del volumen V ¡ del pocillo de incubación, preferentemente igual o menor que el 90 % del volumen Vi del pocillo de incubación, con la máxima preferencia igual o menor que el 80 % del volumen Vi del pocillo de incubación y con mayor preferencia es menor que el 70 % del volumen Vi del pocillo de incubación, o el volumen de la cavidad de gas Vg es mayor o igual que el 10 % del volumen V i del pocillo de incubación e igual o menor que el 90 % del volumen Vi del pocillo de incubación, preferentemente igual o menor que el 70 % del volumen Vi del pocillo de incubación, con mayor preferencia igual o menor que el 50 % del volumen Vi del pocillo de incubación y con la máxima preferencia es menor que el 30 % del volumen Vi del pocillo de incubación, o el volumen de la cavidad de gas Vg es mayor o igual que el 20 % del volumen Vi del pocillo de incubación e igual o menor que el 70 % del volumen Vi del pocillo de incubación, preferentemente igual o menor que el 50 % del volumen Vi del pocillo de incubación, con mayor preferencia igual o menor que el 40 % del volumen Vi del pocillo de incubación y con la máxima preferencia menor que el 30 % del volumen Vi del pocillo de incubación.
El volumen del pocilio de incubación V i es preferentemente mayor o igual a 0,5 pl y menor o igual a 5 pl, el volumen de la cavidad de gas Vg es preferentemente mayor o igual a 0,5 pl y menor o igual a 1,5 pl, con mayor preferencia el volumen del pocillo de incubación V i es mayor o igual a 1 pl y menor o igual a 2,5 pl, el volumen de la cavidad de gas Vg es preferentemente mayor o igual a 0,7 pl y menor o igual a 1,3 pl; y, con la máxima preferencia, el volumen del pocillo de incubación V i es mayor o igual a 2,2 pl y menor o igual a 2,4 pl, el volumen de la cavidad del gas Vg es mayor o igual a 0,9 pl y menor o igual a 1,2 pl.
El volumen del canal de comunicación Vc es preferentemente mayor o igual que el 2 % y menor o igual al 10 % del volumen Vi del pocillo de incubación.
Preferentemente en todas las modalidades de la presente invención, la dimensión lineal más pequeña del pocillo de incubación, por ejemplo, su diámetro o ancho o distancia lineal desde el canal de comunicación al canal de entrada es igual o menor que 2 mm, preferentemente igual o menor que 1,5 mm, con mayor preferencia igual o menor que 1,0 mm, con la máxima preferencia igual o menor que 0,5 mm.
El tiempo necesario para difundir el oxígeno a través de una capa de medio de cultivo con una altura determinada se calculó y comparó con el tiempo en el que las bacterias consumirán todo el oxígeno en el medio de cultivo. Estos cálculos se basan en un ejemplo con un pocillo de incubación de 2,5 pl de volumen y los siguientes supuestos:
• Se considera la variante de difusión más simple donde las partículas difunden la distancia media de x, que se puede aproximar con la ecuación , donde D es la constante del medio donde tiene lugar la difusión; i~ —
2D ,
• La cantidad de oxígeno disuelto en el medio de cultivo en estado estacionario se calcula según la ley de Henry, de acuerdo con la cual la concentración de oxígeno en el medio de cultivo es directamente proporcional a su presión parcial (para el aire presente en el pocillo, si no está comprimido, es 0,22 x 101,3 kPa (1 atmósfera) = 22,3 kPa (0,22 atmósferas));
• las bacterias tendrán acceso a suficiente oxígeno para permitir su crecimiento cuando el tiempo necesario para difundir el oxígeno desde la cavidad de gas al medio de cultivo sea mucho más corto que el tiempo en el que las bacterias consumirán todo el oxígeno disuelto en el medio.
También se calculó el tiempo en el que las bacterias usarán todo el oxígeno recogido en la cavidad de gas en un caso simplificado donde la difusión es inmediata.
En la variante más simple, el cálculo determina cuánto tardará un número dado de bacterias (expresado por DO o UFC/ml y el volumen del medio de cultivo) para consumir el oxígeno recogido en la cavidad del gas (que tiene un volumen determinado), por comparación del número de moles de oxígeno recogidos en la cavidad y la velocidad de consumo de oxígeno expresada en moles por minuto, que se establece en base a la literatura científica. En el ejemplo analizado, se usaron los datos para E. coli, sin embargo, la literatura científica permite suponer que es altamente probable que sea el valor representativo de la mayoría de las bacterias, lo que también se justifica por la Ley de Kleiber. Adicionalmente, para mejorar la confiabilidad de la estimación, una velocidad de consumo un orden de magnitud mayor que el valor determinado experimentalmente para E. coli se asumió como parte de los cálculos.
En un caso más complejo, se calculó el consumo total de oxígeno durante el crecimiento bacteriano, a partir de la DO o UFC/ml dadas hasta un número determinado de veces. Se supuso que el consumo actual de oxígeno M en un momento dado de tiempo t se puede calcular a partir de la fórmula donde No es el número inicial M = k02N02s,
de bacterias, ko2 es la constante correspondiente al consumo de oxígeno en moles por minuto, y g es la constante correspondiente al tiempo en el que se duplica el número de bacterias. El consumo total de oxígeno se puede calcular luego por integración y para el tiempo final T, expresado en minutos, será:
Figure imgf000005_0001
La siguiente tabla muestra el consumo total de oxígeno asumiendo que el cultivo comienza con una DO = 0,001 en un pocillo de incubación con un volumen de 2,5 pl y un consumo de oxígeno de
Figure imgf000005_0002
mot Se asumió un tiempo de VFCs ■
duplicación de 30 minutos para una bacteria y se asumió que la inhibición del crecimiento bacteriano ocurrió después de exceder 3,3 x 109 UFC/ml. Debido a la estimación del consumo máximo, se asumió también que el consumo de oxígeno no baja cuando se alcanza el número máximo de bacterias.
Figure imgf000006_0001
Los datos anteriores indican que, con un ciclo de prueba de 24 horas, el volumen requerido de la cavidad del gas es bajo y no restringe considerablemente el crecimiento bacteriano. Además, se necesita un volumen incluso menor para alcanzar una concentración máxima posible de bacterias, que es el último momento que proporciona información relevante sobre el crecimiento bacteriano, es decir, los procesos posteriores en el pocillo de incubación no son importantes para la identificación de microbios o ensayos de AST con el uso del segmento de incubación de acuerdo con la presente invención.
Para el pocillo con un volumen de 2,5 pl a presión atmosférica, el factor limitante del crecimiento bacteriano puede ser el tiempo de difusión, que puede llegar a ser significativo a partir de aproximadamente 1,4x105 UFC (que corresponde a una DO de 0,07 y 5,6x107 UFC/ml), si se supone que este tiempo debe ser más corto en un orden de magnitud que el tiempo de consumo de oxígeno. Este puede ser el caso a pesar de la alta reserva de oxígeno en el aire de la cavidad del gas. Dado que el tiempo de difusión es proporcional al cuadrado de la distancia, la capa de medio de cultivo debe hacerse tan delgada como sea posible.
Para evitar limitar la difusión de gas en todas las modalidades de la presente invención, preferentemente la longitud del canal de comunicación desde la cavidad del gas hasta el pocillo de incubación es menos de 0,5 mm, con mayor preferencia, menos de 0,4 mm, aún con mayor preferencia igual o menor de 0,3 mm y con la máxima preferencia igual o menor de 0,2 mm.
El aumento de la presión del aire en el chip permitirá que se difunda más oxígeno en el medio de cultivo, lo que también mejorará la eficiencia de la alimentación de las bacterias. Por ejemplo, a una presión de 10 bar, se enviaría al medio en cualquier momento 10 veces más oxígeno en comparación con la presión atmosférica.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un aislado de bacterias que se introduce en suspensión en un depósito de muestra en el chip. La suspensión de bacterias es forzada a fluir hacia los segmentos de incubación, habiéndose suministrado previamente a cada uno de ellos antibiótico en forma seca (por ejemplo, con diferentes tipos de antibióticos en varias cantidades) y posibles sustancias auxiliares y/o indicadores de crecimiento bacteriano y cualquier combinación de estos u otros reactivos necesarios para realizar ensayos microbiológicos. Después de llenar los pocillos de incubación con una muestra, estos antibióticos y sustancias se disuelven en la muestra.
Las propiedades del segmento de incubación permiten una funcionalidad adecuada durante las pruebas de susceptibilidad a fármacos u otros ensayos microbiológicos similares, es decir, el segmento de incubación permite el cultivo de bacterias y mediciones ópticas repetidas para detectar su crecimiento potencial. En particular, el segmento de incubación: (1) permite el intercambio de gases para que no sea un factor que limite la velocidad de crecimiento de la población bacteriana y (2) proporciona una trayectoria óptica adecuadamente larga y sin perturbaciones para la investigación óptica.
El chip que contiene los segmentos de incubación debe ser lo suficientemente hermético para proteger la muestra de fugas o derrames y evaporación durante una prueba.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un segmento de incubación (S) en un chip de microfluidos para ensayos microbiológicos, en donde dicho segmento de incubación se forma en un sustrato (1) con una cara principal superior (3) y una cara principal inferior (5), dicho segmento incluye un pocillo de incubación (21), un canal de entrada (13) a través del cual se puede introducir una muestra en dicho pocillo de incubación, y una cavidad de gas (35) conectada a dicho pocillo de incubación por un canal de comunicación de microfluidos (31), caracterizado porque dicha cavidad de gas no está ventilada y que la base de la cavidad de gas está conectada a la base del pocillo de incubación por el canal de comunicación (31).
2. Un segmento de incubación de acuerdo con la reivindicación 1 está caracterizado porque:
el volumen del pocillo de incubación V ¡ es preferentemente mayor o igual a 0,5 pl y menor o igual a 5 pl, el volumen de la cavidad de gas Vg es preferentemente mayor o igual a 0,5 pl y menor o igual a 1,5 pl, con mayor preferencia el volumen del pocillo de incubación V i es mayor o igual a 1 pl y menor o igual a 2,5 pl, el volumen de la cavidad de gas Vg es preferentemente mayor o igual a 0,7 pl y menor o igual a 1,3 pl; y, con la máxima preferencia, el volumen del pocillo de incubación V i es mayor o igual a 2,2 pl y menor o igual a 2,4 pl, el volumen de la cavidad de gas Vg es mayor o igual a 0,9 pl y menor o igual a 1,2 pl.
3. Un segmento de incubación de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde el volumen de la cavidad de gas Vg es mayor o igual que el 5 % del volumen V i del pocillo de incubación e igual o menor que el 100 % del volumen V i del pocillo de incubación, preferentemente igual o menor que el 90 % del volumen V i del pocillo de incubación, con mayor preferencia igual o menor que el 80 % del volumen V i del pocillo de incubación y con la máxima preferencia menor que el 70 % del volumen V i del pocillo de incubación.
4. Un segmento de incubación de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde el volumen de la cavidad de gas Vg es mayor o igual que el 10 % del volumen Vi del pocillo de incubación e igual o menor que el 90 % del volumen Vi del pocillo de incubación, preferentemente igual o menor que el 70 % del volumen Vi del pocillo de incubación, con mayor preferencia igual o menor que el 50 % del volumen V i del pocillo de incubación y con la máxima preferencia menor que el 30 % del volumen Vi del pocillo de incubación.
5. Un segmento de incubación de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde el volumen de la cavidad de gas Vg es mayor o igual que el 20 % del volumen Vi del pocillo de incubación e igual o menor que el 70 % del volumen Vi del pocillo de incubación, preferentemente igual o menor que el 50 % del volumen Vi del pocillo de incubación, con mayor preferencia igual o menor que el 40 % del volumen V i del pocillo de incubación y con la máxima preferencia menor que el 30 % del volumen Vi del pocillo de incubación.
6. Un segmento de incubación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la dimensión lineal más pequeña del pocillo de incubación es igual o menor que 2 mm, preferentemente igual o menor que 1,5 mm, con mayor preferencia igual o menor que 1,0 mm, con la máxima preferencia igual o menor que 0,5 mm.
7. Un segmento de incubación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la longitud del canal de comunicación es preferentemente menor que 0,5 mm, con mayor preferencia menor que 0,4 mm, aun con mayor preferencia igual o menor que 0,3 mm y con la máxima preferencia igual o menor que 0,2 mm.
8. Un segmento de incubación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el pocillo de incubación está formado como un agujero pasante (23) desde dicha cara principal superior hasta dicha cara principal inferior de dicho sustrato.
9. Un segmento de incubación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cavidad de gas está formada como un agujero ciego (37) en dicha cara principal inferior de dicho sustrato.
10. Un segmento de incubación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el volumen del canal de comunicación Vc es mayor o igual que el 2 % del volumen del pocillo de incubación Vi e igual o menor que el 10 % del volumen V i del pocillo de incubación.
11. Un chip de microfluidos que incluye una pluralidad de segmentos de incubación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sustrato de dicho chip tiene una superficie superior que está cubierta por una capa superior (7) de material transparente impermeable y una superficie principal inferior cubierta por una capa inferior (9) de material transparente e impermeable.
12. Un chip de microfluidos de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque el sustrato está constituido por un polímero, preferentemente poliestireno, policarbonato, poli(metacrilato de metilo), polímero olefínico cíclico o copolímero olefínico cíclico.
ES18189593T 2018-03-30 2018-08-17 Segmento de incubación con una cavidad de gas sin ventilación en un chip de microfluidos Active ES2875521T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL425107A PL425107A1 (pl) 2018-03-30 2018-03-30 Segment inkubacyjny

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2875521T3 true ES2875521T3 (es) 2021-11-10

Family

ID=63311839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18189593T Active ES2875521T3 (es) 2018-03-30 2018-08-17 Segmento de incubación con una cavidad de gas sin ventilación en un chip de microfluidos

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210023553A1 (es)
EP (1) EP3546565B1 (es)
CN (1) CN111936614A (es)
DK (1) DK3546565T3 (es)
ES (1) ES2875521T3 (es)
PL (2) PL425107A1 (es)
WO (1) WO2019185885A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2862190T3 (es) 2018-07-16 2021-10-07 Bacteromic Sp Z O O Método y sistema para robar rápidamente la susceptibilidad antimicrobiana
KR102416335B1 (ko) 2021-06-29 2022-07-05 에스디바이오센서 주식회사 기체 이동 통로와 추출액 이동 통로를 갖는 증폭 모듈
EP4125064A1 (en) 2021-07-30 2023-02-01 Bacteromic sp. z.o.o. Method and system for prediction of microorganism growth using artificial intelligence

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744366A (en) * 1992-05-01 1998-04-28 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale devices and methods for analysis of motile cells
US5609828A (en) 1995-05-31 1997-03-11 bio M erieux Vitek, Inc. Sample card
US5800778A (en) 1995-05-31 1998-09-01 Biomerieux Vitek, Inc. Sealant for sample holder
US5922593A (en) 1997-05-23 1999-07-13 Becton, Dickinson And Company Microbiological test panel and method therefor
CA2323424C (en) 1998-03-11 2005-03-08 Microparts Gesellschaft Fur Mikrostrukturtechnik Mbh Sample support
US6555389B1 (en) * 1999-05-11 2003-04-29 Aclara Biosciences, Inc. Sample evaporative control
US6720187B2 (en) * 2000-06-28 2004-04-13 3M Innovative Properties Company Multi-format sample processing devices
WO2004040001A2 (en) * 2002-10-02 2004-05-13 California Institute Of Technology Microfluidic nucleic acid analysis
US7238269B2 (en) * 2003-07-01 2007-07-03 3M Innovative Properties Company Sample processing device with unvented channel
DE102008003979B3 (de) * 2008-01-11 2009-06-10 Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. Fluidikvorrichtung, Fluidikmodul und Verfahren zum Handhaben einer Flüssigkeit
CN101545901A (zh) * 2008-03-24 2009-09-30 江苏省肿瘤医院 微气泡加快免疫反应的化学发光免疫检测系统
KR102481683B1 (ko) * 2008-07-16 2022-12-28 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 마이크로채널을 갖는 기관 모방 장치 및 그 사용 및 제조 방법
DE102011083920B4 (de) 2011-09-30 2018-07-19 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren und vorrichtung zum erzeugen von fluidisch voneinander separierten teilvolumina einer flüssigkeit
WO2015078884A1 (en) * 2013-11-26 2015-06-04 Alleati Ag Method and microfluidic assembly for antibiotic susceptibility testing
US11142790B2 (en) * 2014-04-09 2021-10-12 Agency For Science, Technology And Research Microfluidic device
US9956557B2 (en) * 2015-07-24 2018-05-01 HJ Science & Technology, Inc. Reconfigurable microfluidic systems: microwell plate interface
CN106676004B (zh) * 2015-11-09 2019-05-07 中国科学院微生物研究所 微流控培养装置及应用其培养细胞或微生物的方法
EP3468716B1 (en) * 2016-06-09 2021-01-06 Biosurfit, S.A. Liquid handling device for rotationally driving liquid flow
SG10201606627QA (en) * 2016-08-10 2018-03-28 Agency Science Tech & Res Microfluidic chip

Also Published As

Publication number Publication date
US20210023553A1 (en) 2021-01-28
PL425107A1 (pl) 2019-10-07
WO2019185885A1 (en) 2019-10-03
CN111936614A (zh) 2020-11-13
PL3546565T3 (pl) 2021-11-22
EP3546565B1 (en) 2021-05-12
EP3546565A1 (en) 2019-10-02
DK3546565T3 (da) 2021-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2875521T3 (es) Segmento de incubación con una cavidad de gas sin ventilación en un chip de microfluidos
ES2659165T3 (es) Casete para ensayos de esterilidad
ES2924706T3 (es) Chip microfluídico
ES2745752T3 (es) Equipo de prueba para cultivos celulares basado en pocillos múltiples para microfluidos
ES2615512B1 (es) Dispositivo y sistema microfluídico para el estudio de cultivos celulares
ES2409655T3 (es) Orificios de acceso para alimentar una placa de filtración de múltiples pocillos
ES2716568T3 (es) Cartucho de detección bacteriana
US11442015B2 (en) Sample test cards
ES2897966T3 (es) Receptáculo de portaobjetos autónomo para especímenes de paciente
TWI760783B (zh) 生物檢測卡匣及其操作方法
JP2002523083A (ja) 微生物をカウントおよび特徴決定するためのカード
US8043580B2 (en) Testing device
Kuo et al. A spatiotemporally defined in vitro microenvironment for controllable signal delivery and drug screening
ES2907101T3 (es) Celda para ensayo de permeación
ES2273929T3 (es) Control del flujo de liquido en una matriz de ensayo biologico.
ES2856259T3 (es) Dispositivo de ensayo de flujo vertical para detectar concentración de glucosa en una muestra de fluido
ES2913092T3 (es) Un método para detectar material genético en una muestra biológica y un dispositivo para su implementación
WO2022213518A1 (zh) 阵列式微流体芯片及抗生素感受性测试的操作方法
KR102132630B1 (ko) 섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치
WO2018106132A1 (en) Microfluidic device for cell culture in gradient of bioactive substance
TWI778569B (zh) 陣列式微流體晶片及抗生素感受性測試的操作方法
ES2938789T3 (es) Dispositivo de determinación de una contaminación bacteriológica en un fluido
US20230330663A1 (en) Conditioning chamber for dual-interface fluidic system
TWI715176B (zh) 生物檢測卡匣及方法
Novak Mechanotransduction in Breast and Ovarian Cancers: Using Bioreactors to Study the Cellular Response to Physiological Mechanical Stimuli