BR112016000456B1 - Sistema e método de reutilização de reagentes - Google Patents

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Drew Verkade
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Abstract

sistema fluídico para distribuição de reagente a uma célula de fluxo. a presente invenção proporciona um sistema de fluidos que inclui um coletor de reagente que compreende uma pluralidade de canais configurados para a comunicação de fluido entre um cartucho de reagente e uma entrada de uma célula de fluxo; uma pluralidade de tubos aspiradores de reagentes que se estendem para baixo a partir de orifícios no coletor, cada um dos tubos aspiradores de reagente configurado para ser colocado dentro de um reservatório de reagente em um cartucho de reagente de modo a que o reagente líquido possa ser retirado do recipiente de reagente para a o tubo aspirador; pelo menos uma válvula configurada para mediar a comunicação de fluido entre os reservatórios e a entrada da célula de fluxo. o coletor de reagente também pode incluir reservatórios depósito para a reutilização de reagente.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 61 / 863.795, depositado em 8 de Agosto de 2013, atualmente pendente, que é aqui incorporado por referência.
ANTECEDENTES
[002] Formas de realização da presente descrição referem-se geralmente, a um aparelho e métodos para a manipulação de fluidos e de detecção óptica de amostras, por exemplo, em procedimentos de sequenciamento de ácido nucléico.
[003] Nosso genoma fornece um diagrama para prever muitas das nossas predisposições inerentes, tais como as nossas preferências, talentos, a susceptibilidade a doenças e a capacidade de resposta aos medicamentos terapêuticos. Um genoma humano individual contém uma sequência de mais de 3 bilhões de nucleotídeos. As diferenças em apenas uma fração desses nucleotídeos transmitem muitas das nossas características singulares. A comunidade de pesquisa está fazendo progressos impressionantes em desvendar as características que compõem o diagrama, e com isso uma compreensão mais completa de como a informação em cada diagrama diz respeito à saúde humana. No entanto, o nosso entendimento está longe de terminar e isso está impedindo o movimento das informações dos laboratórios de pesquisa para a clínica onde a esperança é que um dia cada um de nós terá uma cópia do nosso próprio genoma pessoal para que possamos discutir com o clínico a fim de determinar escolhas apropriadas para um estilo de vida saudável ou um curso de tratamento adequado.
[004] O empecilho atual é uma questão de rendimento e escala. Um componente fundamental para desvendar o esquema para qualquer indivíduo é determinar a sequência exata dos 3 bilhões de nucleotídeos em seu genoma. Técnicas estão disponíveis para isto, mas essas técnicas normalmente levam muitos dias e milhares e milhares de dólares para executar. Além disso, a relevância clínica de qualquer sequência genômica individual é uma questão de comparar as características originais da sua sequência genômica (isto é, o seu genótipo) para fazer referência a genomas que estão correlacionados com características conhecidas (isto é, fenótipos). A questão da escala e produção torna-se evidente quando se considera que os genomas de referência são criados com base na correlação do genótipo para o fenótipo que surgem a partir de estudos de investigação, que normalmente usam milhares de indivíduos, a fim de serem estatisticamente válidos. Assim, bilhões de nucleotídeos podem, eventualmente, ser sequenciados por milhares de indivíduos para identificar qualquer correlação clinicamente relevante de genótipo para fenótipo. Multiplicado ainda pelo número de doenças, respostas a fármacos e outras características clinicamente relevantes, a necessidade de tecnologias de sequenciamento muito baratas e rápidas se torna cada vez mais evidente.
[005] O que se faz necessário é uma redução no custo de sequenciamento que conduz grandes estudos de correlação genética realizados por cientistas de pesquisa e que torna o sequenciamento acessível no ambiente clínico para o tratamento de pacientes individuais que tomam decisões de mudança de vida. Formas de realização da invenção apresentadas aqui atendem esta necessidade e proporcionam outras vantagens também.
SUMÁRIO
[006] A presente invenção proporciona um sistema de fluidos que inclui um coletor de reagente que compreende uma pluralidade de canais configurados para a comunicação fluida entre um cartucho de reagente e uma entrada de uma célula de fluxo; uma pluralidade de tubos aspiradores de reagente que se estendem para baixo a partir de orifícios no coletor, cada um dos tubos aspiradores de reagente configurado para ser colocado dentro de um reservatório de reagente em um cartucho de reagente de modo a que o reagente líquido possa ser retirado do recipiente de reagente para a o tubo aspirador; pelo menos uma válvula configurada para mediar a comunicação fluida entre os reservatórios e a entrada da célula de fluxo.
[007] Esta invenção proporciona ainda um cartucho de reagente que inclui uma pluralidade de reservatórios de reagentes configurados para engatar simultaneamente, uma pluralidade de tubos aspiradores com reagentes de um sistema de fluidos ao longo de uma dimensão Z de tal modo que o reagente líquido pode ser retirado do recipiente de reagente nas tubos aspiradores, os reservatórios de reagente dispostos em dimensões X e Y na parte superior, linhas média e inferior, em reservatório de reagente ao longo de linhas superior e inferior do cartucho são mais profundas ao longo da dimensão z do que os reservatórios de reagente em uma ou mais linhas médias; e pelo menos duas ranhuras de interface configuradas para engatar com os pinos de alinhamento correspondentes do sistema de fluidos.
[008] Também é proporcionado um coletor de reagente ligado a difusão de múltiplas camadas, que compreende pelo menos 10, 15, ou pelo menos 20 orifícios, cada orifício configurado para puxar o reagente a partir de um reservatório de reagente separado através de um recipiente aspirador, em que os orifícios estão em comunicação fluida com um ou mais canais de uma célula de fluxo através de canais fluídicos no coletor.
[009] Esta invenção proporciona ainda um método de reutilização de reagentes que inclui a) extrair um reagente líquido de um reservatório de reagente para um reservatório cache, o reservatório cache estando em comunicação fluida com o reservatório de reagente e pelo menos um canal de uma célula de fluxo; b) transportar o reagente a partir do reservatório cache para o pelo menos um canal de fluxo da célula; c) transportar, pelo menos, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% do reagente sobre o canal de célula de fluxo para o reservatório cache de tal modo que, o reagente líquido da célula de fluxo não é dirigido de volta para o reservatório de reagente após o contacto da célula de fluxo; e d) repetir as etapas b) e c) para se conseguir a reutilização do reagente líquido na célula de fluxo.
[010] Esta invenção proporciona ainda um método de sequenciamento que inclui as etapas de (a) proporcionar um sistema de fluidos que compreende (i) uma célula de fluxo que compreende uma superfície opticamente transparente, (ii) uma amostra de ácido nucléico, (iii) uma pluralidade de reagentes para uma reação de sequenciamento, e (iv) um sistema de fluidos para distribuir os reagentes para a célula de fluxo; (b) proporcionar um aparelho de detecção que compreende (i) uma pluralidade de microfluorímetros, em que cada um dos microfluorímetros compreende um objetivo configurado para detecção de imagem em campo amplo num plano de imagem em dimensões, X e Y e (ii) uma fase de amostra; e (c) a realização de operações de fluidos de um procedimento de sequenciamento de ácidos nucléicos nas operações de cartuchos e de detecção do processo de sequenciamento de ácidos nucléicos no aparelho de detecção, em que (i) os reagentes são fornecidos à célula de fluxo pelo sistema de fluidos, (ii) as imagens de campo amplo das características de ácidos nucléicos são detectadas pela pluralidade de microfluorímetros, e (iii) pelo menos, alguns reagentes são removidos a partir da célula de fluxo para um reservatório cache.
[011] Os detalhes de uma ou mais formas de realização são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens serão evidentes a partir da descrição e desenhos, e a partir das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[012] A Figura 1A mostra um sistema de fluidos com tubos aspiradores de reagente que interagem com um cartucho de reagente.
[013] A Figura IB mostra uma vista isométrica de um conjunto de coletor e exibe um exemplo de um esquema de canais de fluidos dentro do coletor.
[014] A Figura 2 mostra uma vista em perspectiva frontal de um conjunto de coletor tendo tubos aspiradores de reagente, válvulas e pinos de alinhamento. Também mostra tubos de diferentes comprimentos.
[015] A Figura 3 mostra uma vista de topo de um conjunto de coletor exibindo um possível esquema dos canais de fluidos dentro do coletor.
[016] A Figura 4 mostra uma vista em secção transversal dos canais dentro de um coletor, incluindo uma vista de secção transversal de uma linha de depósito, e um canal de fluidos que não de depósito.
[017] A Figura 5 mostra uma série de junções para ligar um orifício do reagente com duas válvulas.
[018] A Figura 6 mostra uma vista em corte transversal de um cartucho de reagente que possui poços de diferentes profundidades.
[019] A Figura 7A mostra uma vista de topo simplificada de linhas de depósito em um conjunto de coletor de acordo com uma forma de realização.
[020] A Figura 7B mostra diferentes fases de reutilização de reagente num método que utiliza o fluxo recíproco de reagente a partir de uma linha de depósito para uma célula de fluxo, seguido de novo enchimento parcial da linha de depósito da célula de fluxo.
[021] A Figura 8 mostra uma vista de topo de uma interface de bandeja de reagente que possui poços de reagente e ranhuras de interface para alinhamento dos pinos.
[022] A Figura 9 mostra um mapa de fluidos para um sistema de fluidos.
[023] A Figura 10 mostra uma visão detalhada de tubos aspiradores de reagente incluindo tubos aspiradores compatíveis e uma garrafa perfurada.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[024] Esta invenção proporciona sistemas e métodos para fornecimento de fluidos reagentes a uma câmara, tal como uma célula de fluxo. Uma aplicação particularmente útil é a detecção de uma amostra biológica imobilizada. Por exemplo, os métodos e sistemas aqui apresentados podem ser usados em aplicações de sequenciamento de ácidos nucléicos. Uma variedade de técnicas de sequenciamento de ácidos nucléicos que utiliza amostras opticamente e não-opticamente detectáveis e/ou reagentes pode ser utilizada. Estas técnicas são particularmente bem adequadas para os métodos e aparelhos da presente revelação e, por conseguinte, destacam várias vantagens para formas de realização particulares da invenção. Algumas destas vantagens são apresentadas abaixo para fins de ilustração e, embora as aplicações de sequenciamento de ácidos nucléicos sejam exemplificadas, as vantagens podem ser estendidas a outras aplicações também.
[025] Os sistemas fluídicos aqui descritos são particularmente úteis com qualquer uma das configurações de aparelhos de detecção e métodos de sequenciamento estabelecidos no Pedido de Patente US número de série 13/766.413 depositado em 13 de fevereiro de 2013 e intitulado "INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING" cujo conteúdo está ora incorporado por referência na sua totalidade.
[026] Em concretizações particulares, uma amostra que está a ser detectada pode ser fornecida a uma câmara de detecção utilizando um sistema de fluidos, tal como aqui fornecido. Tomando o exemplo mais específico de um pedido de sequenciamento de ácidos nucléicos, o sistema de fluidos pode incluir um conjunto de coletor que pode ser colocado em comunicação fluídica com um ou mais dos reservatórios para a manutenção dos reagentes de sequenciamento, reservatórios para manter reagentes de preparação da amostra, reservatórios para manter os produtos residuais gerados durante o sequenciamento, e/ou das bombas, válvulas e outros componentes capazes de deslocar fluidos através de uma célula de fluxo.
[027] Em formas de realização particulares de um sistema de fluidos pode ser configurado para permitir a reutilização de um ou mais reagentes. Por exemplo, o sistema de fluidos pode ser configurado para fornecer um reagente para uma célula de fluxo, em seguida, remover o reagente a partir da célula de fluxo, e, em seguida, reintroduzir o reagente para a célula de fluxo. Uma vantagem de reagentes de reutilização é a redução do volume de resíduos e redução do custo dos processos que utilizam reagentes e/ou reagentes dispendiosos que são liberados em concentrações elevadas (ou em quantidades elevadas). A reutilização de reagentes tem como vantagem o entendimento de que o esgotamento do reagente ocorre apenas ou principalmente na superfície da célula de fluxo, e, por conseguinte, uma maior parte do reagente não é usado podendo estar submetido a uma reutilização.
[028] A Fig. 1A mostra um sistema exemplar 100 fluídico com tubos aspiradores de reagente 103 e 104 e as válvulas 102, que exploram vantagens dos sistemas de fluidos que são fornecidos por várias formas de realização aqui apresentadas. O sistema de fluidos 100 inclui um conjunto de coletor 101, que contém vários componentes fixos, incluindo, por exemplo, reagentes, tubos aspiradores, válvulas, canais, reservatórios e semelhantes. Um cartucho de reagente 400 está presente com reservatório de reagentes 401 e 402 configurado para engatar simultaneamente um conjunto de tubos aspiradores de reagente 103 e 104 ao longo de uma dimensão z, de modo que o reagente líquido pode ser extraído dos reservatórios de reagente para os tubos aspiradores.
[029] Na FIG. 1B está ilustrado um conjunto de coletor exemplar 101, que pode ser usado para fornecer reagentes líquidos a partir de reservatórios de reagentes para uma célula de fluxo. O distribuidor inclui recipientes gotejantes de reagentes 103 e 104 que se estendem para baixo em uma dimensão z a partir de orifícios no coletor. Os recipientes gotejantes 103 e 104 podem ser colocados em um ou mais reservatórios de reagentes (não mostrado) em um cartucho de reagente. O distribuidor também inclui canais 107 que ligam no modo fluídico o recipiente gotejante 103 a uma válvula 102 e a uma válvula 109. Os recipientes gotejantes 103 e 104, os canais 107 e a válvula 102 mediam a comunicação fluida entre os reservatórios de reagentes e uma célula de fluxo (não mostrada). As válvulas 102 e 109 podem, individualmente ou em conjunto, selecionar tubos aspiradores de recipientes 103 ou 104, e através de canais tais como 107, mediar a comunicação fluida entre os reservatórios de reagentes e uma célula de fluxo (não mostrado).
[030] Os aparelhos mostrados nas Figs. 1A e 1B são exemplares. Outras formas de realização exemplificativas do aparelho e os métodos da presente revelação que podem ser utilizadas alternativamente, ou adicionalmente ao exemplo das Figs. 1A e 1B são apresentados em maior detalhe abaixo.
[031] A Fig. 2 mostra um outro conjunto de distribuidor exemplar tendo recipientes gotejantes com reagentes e válvulas. O coletor tem pinos de alinhamento 105 que sobressaem para baixo a partir do coletor de um eixo paralelo aos recipientes de reagente. Os pinos de alinhamento 105 são maiores ao longo da dimensão Z em comparação com os recipientes de reagente, embora em formas de realização alternativas podem também ser de comprimento igual ou mais curtos. O alinhamento dos pinos 105 são configurados para encaixe com uma ou mais ranhuras de interface correspondentes em um cartucho de reagente (não mostrado). Os recipientes de reagente 103 e 104 são acoplados ao tubo de distribuição via orifícios 106 que estão alojados no corpo do distribuidor. Os recipientes de reagente 104 são mais longos, em comparação com os recipientes de reagente 103, a fim de aspirar o líquido a partir de reservatórios de reagentes de profundidade variável que corresponde à profundidade dos recipientes de reagente 103 ou 104. Em formas de realização alternativas, os recipientes 103 e 104 podem ser de comprimento igual, ou pode alternar comprimentos dominantes.
[032] Ainda na Fig. 2 estão canais 107A e 107B, que residem em planos separados x-y. Canais separados 107A e 107B podem se originar de um único canal que então se bifurca em um entroncamento T 109 gerando múltiplos canais que residem em planos separados. O coletor dirige reagente líquido de um recipiente para uma ou mais válvulas, tendo os canais que ligam a uma válvula especial 102 residir, ou totalmente no mesmo plano A, ou uma combinação de plano A e B, enquanto os canais que ligam a qualquer outra válvula podem compartilhar essa característica de origem coplanar ou interplanar.
[033] A Fig. 3 mostra uma vista de topo de um conjunto de coletor 101 exibindo uma disposição possível dos canais de fluidos dentro do coletor. Canais fluídicos 107A e 107B são originários de um único orifício 106 e conectam o orifício 106 para qualquer válvula 102A ou 102B. Alguns canais incluem um reservatório cache 108, que tem um volume suficiente para permitir que uma quantidade de reagente líquido flua a partir de uma célula de fluxo (não mostrado) para o reservatório cache 108 de tal modo que o reagente líquido da célula de fluxo não é dirigido de volta para o recipiente de reagente (não mostrada), após o contacto da célula de fluxo. Também mostrado na Fig. 3 estão posições exemplares de um ou mais pinos de alinhamento 105. O conjunto de coletor mostrado na fig. 3 também inclui orifícios de entrada 111 para amortecedores compartilhados. Cada uma das válvulas 102A e 102B são configuradas com orifícios de entrada correspondentes a cada orifício de reagente 106, e com orifícios externos comuns 112 e 110, que fluidamente ligam-se a uma célula de fluxo e um orifício de escoamento 113 e 109, que fluidamente ligam-se a um recipiente de resíduos.
[034] Como demonstrado pelos exemplos de formas de realização acima, um sistema de fluidos para a distribuição de reagentes a partir de um cartucho de reagente para uma célula de fluxo pode incluir um coletor de reagente que compreende uma pluralidade de canais configurados para a comunicação fluida entre um cartucho de reagente e uma entrada de uma célula de fluxo. O uso de um coletor em um sistema de fluidos fornece várias vantagens sobre a utilização de tubagem apenas. Por exemplo, um tubo de distribuição com canais fixos reduz a probabilidade de erro durante a montagem, tais como má colocação de acessórios da tubagem, bem como o aperto demasiado ou insuficiente das conexões. Além disso, um coletor fornece facilidade de manutenção, permitindo, por exemplo, a substituição rápida de uma unidade integral em vez de testes demorados e substituição de linhas individuais.
[035] O um ou mais dos canais do coletor pode incluir uma faixa fluídica através de um material sólido. A faixa pode ser de qualquer diâmetro para permitir o nível desejado de transferência de fluido através da faixa. A faixa pode ter um diâmetro interno de, por exemplo, menos do que 0,1 mm, 0,2 mm, 0,3 mm 0,4 mm, 0,5 mm, 0,6 mm, 0,7 mm, 0,8 mm, 0,9 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm ou menos de 10 mm de diâmetro. A configuração da faixa pode ser, por exemplo, linear ou curva. Alternativamente ou adicionalmente, a faixa pode ter uma combinação de partes curvas e partes retilíneas. A secção transversal da faixa pode ser, por exemplo, quadrada, redonda, em forma de "D", ou qualquer outra forma que permite um nível desejado de transferência de fluido através da faixa. A Fig. 4 exemplifica uma faixa fluídica através de um corpo coletor e mostra uma vista em corte de uma faixa 302. O canal exemplar 302 mostrado na Fig. 4 tem uma seção transversal em forma de "D" formada por um meio círculo de 0,65 mm em diâmetro fundido com um retângulo adicional de 0,65 mm x 0,325 mm.
[036] O canal entre o recipiente gotejante e a válvula pode ser inteiramente encerrado dentro do corpo do distribuidor. Alternativamente ou adicionalmente, o canal pode incluir uma ou mais partes que são externas ao coletor. Por exemplo, a tubagem, tal como, por exemplo, tubos flexíveis podem ligar-se uma porção da faixa fluídica a uma outra parte da faixa no coletor. Alternativamente ou adicionalmente, tubos flexíveis podem ligar-se a uma célula de fluxo a componentes fluídicos fixos do sistema, incluindo, por exemplo, bombas, válvulas, sensores e bitolas. Como um exemplo, a tubagem flexível pode ser processada para ligar uma célula de fluxo ou um canal do presente sistema a uma bomba tal como uma bomba de seringa ou uma bomba peristáltica.
[037] O corpo do distribuidor pode ser, por exemplo, feito de qualquer material sólido adequado que seja capaz de suportar um ou mais canais no mesmo. Assim, o corpo do distribuidor pode ser uma resina, tal como policarbonato, cloreto de polivinila, DELRIN® (Polioximetileno); HALAR®; PCTFE (PoliCloroTriFluorEtileno); PEEK™ (Polieter-etercetona); PK (Policetona); PERLAST®; Polietileno; PPS (sulfureto de Polifenileno); Polipropileno; Polisulfona; FEP; PFA; PFA de elevada pureza; RADEL® R; Aço inoxidável 316; TEFZEL® ETFE (Etileno Tetrafluoretileno); TPX® (Polimetilpenteno); Titânio; UHMWPE (Polietileno De Peso Molecular Ultra Elevado); ULTEM® (polieterimida); VESPEL® ou qualquer outro material sólido adequado que seja compatível com os solventes e líquidos transportados através dos canais do coletor nas formas de realização aqui apresentadas. O corpo do distribuidor pode ser formado a partir de uma única peça de material. Alternativamente ou adicionalmente, o corpo do distribuidor pode ser formado a partir de múltiplas camadas que são ligadas em conjunto. Os métodos de ligação incluem, por exemplo, o uso de adesivos, vedantes, e a ligação por difusão. Os canais podem ser formados no material sólido por qualquer método adequado. Por exemplo, os canais podem ser perfurados, gravados a ácido ou branqueados num material sólido. Os canais podem ser formados no material sólido antes da ligação das múltiplas camadas em conjunto. Alternativamente ou adicionalmente, os canais podem ser formados depois das camadas de ligação em conjunto.
[038] A Fig. 5 mostra uma série de junções 300 para ligação de um orifício de reagente 301 com duas válvulas. Em cada exemplo mostrado na Fig. 5, um orifício 301 está fluidamente conectado a um canal 302 que se bifurca em dois canais 302A e 302B em cada canal de fornecimento de uma válvula diferente. Na primeira configuração, a junção divide o fluxo de fluido a partir do orifício 301 para os canais 302A e 302B em camadas separadas do coletor. Nas segunda e terceira configurações mostradas na Fig. 5 a junção 300 inclui um quadrado arredondado 303 dividido dentro de uma camada ou uma divisão redonda completa 304 dentro de uma camada do coletor.
[039] Os conjuntos de coletores aqui apresentados são configurados para o fornecimento de reagentes líquidos a partir de um cartucho de reagente para uma célula de fluxo. Assim, o distribuidor (ou coletor) pode ter qualquer número de orifícios acoplados aos tubos aspiradores de reagente. Mais especificamente, o número de orifícios pode corresponder ao número e configuração dos reservatórios de reagentes em um cartucho de reagente. Em algumas formas de realização, o distribuidor compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou pelo menos 30 orifícios, cada orifício configurado para acoplar um recipiente aspirador de reagente para um canal em comunicação fluida com a pelo menos uma válvula.
[040] Os sistemas fluídicos aqui apresentados também podem incluir uma disposição de tubos aspiradores que se estendem para baixo ao longo da dimensão Z a partir de orifícios no tubo de distribuição, cada um dos tubos aspiradores de reagente configurados para serem inserido dentro de um reservatório de reagente em um cartucho de reagente de modo a que o reagente líquido possa ser extraído a partir do reservatório de reagente para o recipiente aspirador. Os tubos aspiradores de reagente podem compreender, por exemplo, um corpo tubular com uma extremidade proximal e uma extremidade distal. A extremidade distal pode afunilar para uma ponta afiada que é configurada para perfurar uma folha ou camada de película utilizada como um vedante por cima de um reservatório de reagente num cartucho de reagente. Várias pontas exemplares de tubos aspiradores são mostradas na Fig. 10. Os recipientes sorvedores de reagente podem ser fornecidos com, por exemplo, um único lúmen que atravessa o corpo tubular da distal para a extremidade proximal. O lúmen pode ser configurado para proporcionar comunicação de fluidos entre o cartucho de reagente sobre uma extremidade do reação recipiente aspirador e o coletor de reagente na outra extremidade do recipiente aspirador. Como mostrado na Fig. 2 recipientes sorvedores exemplares 103 e 104 são acoplados ao tubo de distribuição através de orifícios 106 que estão alojados no corpo do distribuidor.
[041] Em algumas formas de realização, tal como exemplificado na Fig. 2, um subconjunto dos recipientes sorvedores é de um comprimento que é mais curto do que os outros recipientes sorvedores. Por exemplo, o comprimento do subconjunto pode ser de pelo menos 1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, ou pelo menos 2,0 mm mais curto do que os outros recipientes sorvedores. O tubo coletor e os recipientes sorvedores de reagentes podem ser utilizados num dispositivo que tem um mecanismo de elevador configurado para mover um cartucho de reagente bidirecionalmente ao longo da dimensão Z, de tal forma que, os coletores de reagentes sejam inseridos em poços ou reservatórios correspondente no cartucho de reagente. Em certas formas de realização, os poços de reagentes podem ser cobertos com folhas de proteção. Assim, uma vantagem de proporcionar recipientes coletores de comprimento variável é uma redução na força requerida pelo mecanismo de elevador para acomodar uma força de perfuração da folha quando um cartucho de reagente é posto em contacto com os recipientes sorvedores perfurantes. A diferença em comprimento de recipiente aspirador pode vantajosamente, corresponder à profundidade de poços de reagentes em um cartucho de reagente, de modo que cada recipiente aspirador atinja uma profundidade desejada no seu correspondente poço de reagente, quando os tubos aspiradores e o cartucho estão em uma posição totalmente encaixada.
[042] Os tubos aspiradores podem ser formados de qualquer material adequado que permita a transferência de fluido através de um lúmen e que seja compatível com os solventes e líquidos transportados através dos canais do coletor nas formas de realização aqui apresentadas. Os tubos aspiradores podem ser formados a partir de um único tubo. Alternativamente ou adicionalmente, um ou mais tubos aspiradores podem ser feitos de vários segmentos que, juntos formam um tubo de sucção de um comprimento e diâmetro desejado.
[043] Em algumas formas de realização, pelo menos um dos tubos de reagente inclui uma ponta compatível configurada para fletir quando a ponta colide com o fundo de um poço de reagente bem em um cartucho de reagente. Por flexão ou deformação, uma ponta compatível permite ao lúmen do tubo de sucção para se aproximar mais completamente, ou mesmo fazer contacto com o fundo do poço reagente, reduzindo ou mesmo eliminando o volume de evacuação no poço do reagente. Uma ponta compatível pode ser especialmente vantajosa para a absorção da amostra ou reagentes onde são utilizados pequenos volumes, ou em situações em que é desejável que a absorção da maior parte ou de todo o líquido em um reservatório de reagente. O corpo do tubo de sucção tendo uma ponta compatível pode ser inteiramente feito do mesmo material flexível da ponta. Alternativamente ou adicionalmente, o corpo do tubo de sucção pode ser feito de um material distinto daquele da ponta. A ponta compatível pode ser feita de qualquer material adequado, tal que a ponta compatível pode deformar-se ou o ceder, quando impelida para o contacto com o fundo de um reservatório de reagente. Alguns materiais adequados incluem espumas poliméricas e/ou sintéticas, borrachas, silicone, e/ou elastômeros incluindo polímeros termoplásticos tais como poliuretano.
[044] Os sistemas fluídicos aqui apresentados podem também incluir, por exemplo, bombas e válvulas que são seletivamente operáveis para controlar a comunicação fluida entre os reservatórios e a entrada da célula de fluxo. Como exemplificado pelo conjunto do coletor mostrado nas Figs. 2 e 3, as saídas de canal no coletor podem ser configuradas para ligar-se com os correspondentes orifícios de entrada em uma ou mais válvulas de modo a que cada canal de reagente está em comunicação fluida com um orifício de entrada da válvula. Assim, através dos canais do coletor de reagente, uma ou mais, ou cada um dos orifícios de entrada podem estar em comunicação fluida com um tubo de reagente. Cada uma de uma ou mais válvulas podem ser configuradas com um orifício de saída comum (110, 112), que liga de modo fluido a uma entrada de uma ou mais faixas em uma célula de fluxo. Alternativamente ou adicionalmente, cada uma das uma ou mais válvulas podem ser configurados com um orifício de descarga (109, 113) ligada de modo fluido a um ou mais recipientes para descarte.
[045] Em formas de realização em que o sistema de fluidos compreende, pelo menos, uma primeira válvula e uma segunda válvula, cada válvula pode ser configurado para fornecer em simultâneo, reagentes para fornecimento separados através de um primeiro canal e um segundo canal de uma célula de fluxo, respectivamente. Assim, uma válvula pode fornecer um reagente para um primeiro canal de fluxo da célula, enquanto a segunda válvula pode oferecer simultaneamente, um reagente diferente a um segundo canal de célula de fluxo. Como se mostra nas formas de realização exemplificativa da FIG. 9, uma válvula (VA) está ligada hidraulicamente à entrada V1 da célula de fluxo, que é um coletor para fornecer reagentes para a faixa 1 e a faixa 3. Do mesmo modo, a válvula B (VB) está ligada hidraulicamente à entrada V2 situada na extremidade oposta da célula de fluxo, e que proporciona reagentes para a faixa 2 e faixa 4. As entradas V1 e V2 estão situadas em lados opostos da célula de fluxo e a direção de fluxo de reagente ocorre em sentidos opostos para as faixas 1 e 3, em comparação com as faixas 2 e 4.
[046] Os sistemas fluídicos aqui descritos podem ser utilizados vantajosamente para a manipulação de fluidos de canais de células de fluxo durante o sequenciamento de ácidos nucléicos. Mais especificamente, um sistema de fluidos aqui descrito pode ser operativamente associado com um aparelho de detecção de uma configuração para a detecção de características de ácido nucléico na célula de fluxo pelo aparelho de detecção. Em algumas formas de realização, o aparelho de detecção pode compreender uma pluralidade de microfluorímetros, em que cada um dos microfluorímetros compreende um objetivo configurado para detecção de imagem de campo ampla num plano de imagem em dimensão x e y. Os sistemas fluídicos estabelecidos neste documento são particularmente úteis com qualquer uma das configurações do aparelho de detecção estabelecidos no Pedido de Patente US número de série 13 / 766.413 depositado em 13 de fevereiro de 2013 e intitulado “INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING,” cujo conteúdo está aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[047] Como um exemplo, em formas de realização particulares de sequenciamento de ácido nucléico, uma célula de fluxo que contém uma pluralidade de canais pode ser manipulada fluidicamente e opticamente detectada de forma escalonada. Mais especificamente, as manipulações de fluidos podem ser efetuadas em um primeiro subconjunto de canais na célula de fluxo, enquanto ocorre a detecção óptica para um segundo subconjunto de canais. Por exemplo, numa configuração, pelo menos, quatro canais lineares podem ser dispostos paralelos uns aos outros na célula de fluxo (por exemplo, canais de 1 a 4 podem ser ordenados em linhas sequenciais). As manipulações fluídicas podem ser efetuadas em todos os outros canais (por exemplo, os canais 1 e 3), enquanto que a detecção ocorre para os outros canais (por exemplo, canais 2 e 4). Esta configuração particular pode ser acomodada pelo uso de um cabeçalho que tem detectores posicionados numa configuração espaçada de tal modo que os objetivos são dirigidos para todos os outros canais da célula de fluxo. Neste caso, as válvulas podem ser acionadas para dirigir o escoamento de reagentes para um ciclo de sequenciamento a canais alternados, enquanto os canais que estão sendo detectados são mantidos em um estado de detecção. Neste exemplo, um primeiro conjunto de canais alternados pode ser submetido a etapas fluídicas de um primeiro ciclo de sequenciamento e um segundo conjunto de canais alternados submetidos a etapas de detecção de um segundo ciclo de sequenciamento. Uma vez que as etapas de fluidos do primeiro ciclo estejam completadas e as etapas de detecção do segundo ciclo estejam concluídas, o cabeçalho pode ser escalonado ao longo (por exemplo, ao longo da dimensão X) para o primeiro conjunto de canais alternantes e as válvulas podem ser atuadas para fornecer reagentes em sequência para o segundo conjunto de canais. Em seguida, as etapas de detecção para o primeiro ciclo podem ser completadas (no primeiro conjunto de canais) e as etapas de fluidos para um terceiro ciclo podem ocorrer (no segundo conjunto de canais). As etapas podem ser repetidas deste modo por várias vezes, até que um número desejado de ciclos seja realizado, ou até que o procedimento de sequenciamento esteja completo.
[048] Uma vantagem das etapas de detecção e de fluidos escalonados estabelecidos acima é proporcionar uma execução mais rápida de sequenciamento global. No exemplo acima, uma execução de sequenciamento mais rápida irá resultar da configuração escalonada (em comparação com a manipulação fluídica de todos os canais em paralelo seguido pela detecção de todos os canais em paralelo), se o tempo necessário para a manipulação de fluidos for aproximadamente o mesmo que o tempo necessário para detecção. Naturalmente que, em formas de realização em que o tempo para as etapas de detecção não é o mesmo que o sincronismo das etapas fluídicas, a configuração escalonada pode ser alterada a partir de todos os outros canais para um modelo mais apropriado para acomodar a digitalização em paralelo de um subconjunto de canais, enquanto um outro subconjunto de canais passa pelas etapas fluídicas.
[049] Uma vantagem adicional em se ter o fluxo de fluido em direções opostas é o de proporcionar um meio de comparação do desempenho do microfluorímetro individual. Por exemplo, quando são utilizados múltiplos microfluorímetros por faixa de célula de fluxo, pode ser difícil distinguir se o desempenho diminuído0 do microfluorímetro é ocasionado pelo detector ou pela diminuição da eficiência química a partir de uma extremidade da faixa para a outra. Por ter direções opostas do fluxo de líquido, o desempenho do microfluorímetro entre as faixas pode ser comparado, distinguindo eficazmente se uma diminuição do desempenho é devida ao microfluorímetro ou não.
[050] Um mapa de fluidos para um sistema de fluidos exemplificativo é mostrado na Fig. 9. A Célula de fluxo 2020 tem quatro faixas cada qual estando fluidicamente conectada a uma das duas linhas de fluido individual FV e RV que são acionados individualmente por válvulas de admissão VA e VB. A válvula de admissão VA e válvula de admissão VB controlam o fluxo de fluido de reservatórios de amostras, reservatórios de reagentes SBS e reservatórios de reagentes de amplificação no cartucho de reagente ou a bandeja 2035 fluidicamente ligado a vários orifícios dentro do coletor de reagente 2030.
[051] O fluxo de fluidos através do sistema da Fig. 9 é impulsionado por duas bombas de seringa separadas 2041 e 2042. As bombas de seringa são posicionadas para puxar os fluidos através do sistema de fluidos e cada bomba pode ser acionada individualmente por válvulas 2051 e 2052. Assim, embora cada canal de fluxo da célula de fluxo possa ser controlado individualmente por uma fonte de pressão dedicada. As válvulas 2051 e 2052 também são configuradas para controlar o fluxo de fluidos para reservatório de descarte 2060.
[052] A Fig. 9 exemplifica um sistema de fluidos em que os fluidos são puxados por ação das bombas de seringa a jusante. Será compreendido que um sistema útil fluídico pode usar outros tipos de dispositivos em vez de bombas de seringa, na condução de fluidos, incluindo, por exemplo, a pressão positiva ou negativa, bomba peristáltica, bomba de diafragma, bomba de pistão, bomba de engrenagens ou parafuso de Arquimedes. Além disso, estes e outros dispositivos podem ser configurados para puxar os fluidos a partir de uma posição a jusante em relação a uma célula de fluxo ou impulsionar o fluidos a partir de uma posição a montante.
[053] A Fig. 9 também exemplifica a utilização de duas bombas de seringa para quatro canais de uma célula de fluxo. Assim, o sistema de fluidos inclui um número de bombas que é menos do que o número de canais em utilização. Deve entender-se que, um sistema de fluidos que é útil em um cartucho de fluidos da presente invenção pode ter qualquer número de bombas, por exemplo, um número equivalente ou menos de bombas (ou outras fontes de pressão) do que o número de canais em utilização. Por exemplo, vários canais podem ser fluidicamente ligados a uma bomba comum e uma válvula pode ser utilizada para acionar o fluxo de fluido através de um canal individual.
[054] O sistema de fluidos exemplificado na Fig. 9 também inclui um sensor BUB-4 para a detecção de bolhas de ar, posicionado ao longo do percurso do fluido entre a válvula VA e a entrada da célula de fluxo V1. Um sensor de bolha de ar BUB-3 adicional é posicionado ao longo do percurso do fluido FV entre a válvula VB e a entrada da célula de fluxo V2. Deve ficar entendido que uma linha fluídica, que é útil num sistema de fluidos da presente invenção, pode incluir qualquer número de sensores de bolha de ar, medidores de pressão e semelhantes. Os sensores e/ou medidores podem ser localizados em qualquer posição ao longo de qualquer parte do percurso do fluido no sistema de fluidos. Por exemplo, um sensor ou calibre pode ser posicionado ao longo de uma linha de fluidos entre uma das válvulas e a célula de fluxo. Alternativamente ou adicionalmente, um sensor ou calibre pode ser posicionado ao longo de uma linha de fluidos entre um reservatório de reagente e uma das válvulas, entre uma válvula e uma bomba, ou entre uma bomba e uma saída ou reservatório tal como um reservatório de resíduos.
[055] Um corte transversal de um cartucho de reagente exemplar é ilustrado na Fig. 6. O cartucho de reagente 400 mostrado na Fig. 6 inclui poços 401 de várias profundidades ao longo da dimensão Z em comparação com aqueles dos poços 402. Mais especificamente, o cartucho de reagente exemplificado na Fig. 6 tem poços concebidos para acomodar o comprimento de um tubo de sucção de reagente correspondente (não mostrado) de tal modo que cada tubo de sucção atinge uma profundidade desejada no seu correspondente poço de reagente, quando os tubos aspiradores e do cartucho estão em uma posição de encaixe completo. No cartucho de reagente exemplificado na Fig. 6, os poços estão dispostos em linha ou coluna ao longo da dimensão y, em que esses poços 401 do lado de fora da linha ou coluna estendem para baixo mais ao longo da dimensão Z do que os poços 402 no lado de dentro da linha ou coluna. Alguns ou todos os poços podem ser de diferentes profundidades. Alternativamente ou adicionalmente, alguns ou todos os poços podem ser da mesma profundidade. Quando os tubos aspiradores e o cartucho estão em posição completamente encaixada, a profundidade de penetração de qualquer ponta do tubo de sucção (isto é, a distância a partir da superfície do fundo do poço para o extremo da ponta do tubo de sucção) pode ser equivalente à profundidade de penetração de qualquer outra ponta do tubo de sucção em qualquer outro poço dado no cartucho de reagente. A profundidade de penetração de qualquer ponta do tubo de sucção não necessita ser a mesma da profundidade de penetração de qualquer outro poço determinado no cartucho de reagente. Quando, pelo menos, alguns poços de reagente tem uma profundidade de poço diferente, a profundidade do poço pode ser, por exemplo, pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 , 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, ou pelo menos 2,0 mm mais curto do que os outros tubos aspiradores de reagente. Da mesma forma, quando os tubos aspiradores e o cartucho estão em posição completamente encaixada, a profundidade de penetração de qualquer ponta de tubo de sucção pode ser de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, ou, pelo menos, 2,0 mm de diferente da profundidade de penetração de qualquer outra ponta de tubo de sucção no cartucho de reagente.
[056] A vista de topo de uma interface da bandeja reagente exemplar que têm poços de reagentes e ranhuras de interface para pinos de alinhamento é mostrada na Fig. 8. Como mostrado no cartucho de reagente exemplar 400 na Fig. 8, o cartucho inclui uma pluralidade de reservatórios de reagentes 401A, 401B, 402A e 402B. Os reservatórios de reagentes na Fig. 8 estão dispostos em dimensões X e Y em fileiras. Também mostrado na Fig. 8, o cartucho inclui ranhuras 403 e 404 de interface configuradas para engatar com os pinos de alinhamento correspondentes de um conjunto de distribuidor (não mostrado). O cartucho pode também incluir uma película de proteção cobrindo qualquer número de poços ou reservatórios de reagentes, que podem ser perfurados por tubos de perfuração quando o cartucho é colocado em contacto com os tubos aspiradores de perfuração.
[057] Os cartuchos de reagentes aqui apresentados podem incluir qualquer número de reservatórios de reagentes ou poços. Os reservatórios de reagentes ou poços podem ser dispostos em qualquer formato ao longo das dimensões X e Y a fim de facilitar o transporte e armazenamento de reagentes no cartucho. Alternativamente ou adicionalmente, os reservatórios de reagente ou os poços podem ser dispostos em qualquer formato ao longo das dimensões X e Y adequadas para a interação com uma série de tubo de sucção que se prolongam para baixo ao longo da dimensão Z a partir de orifícios no coletor. Mais especificamente, os reservatórios de reagente ou poços podem ser dispostos em qualquer formato adequado para engatar simultaneamente uma matriz de tubos aspiradores de reagente de tal modo que, o reagente líquido pode ser retirado do reservatório de reagente para os tubos aspiradores.
[058] Nem todos os poços de reagente precisam interagir simultaneamente com todos os tubos aspiradores de um conjunto de distribuidor. Por exemplo, o cartucho de reagente pode incluir um subconjunto de um ou mais reservatórios de reagentes ou de poços que estão configurados para permanecer num estado sem interação entre eles, enquanto outros reservatórios ou poços são envolvidos por uma matriz de tubos aspiradores. Como um exemplo, um cartucho aqui apresentado podem compreender uma pluralidade de reservatórios de lavagem dispostos em uma configuração correspondente à pluralidade de reservatórios de reagentes, em que os reservatórios de lavagem são configurados para engatar simultaneamente, os tubos aspiradores de reagente quando os tubos aspiradores de reagente não estão encaixados com os reservatórios de reagentes, de modo que o tampão de lavagem pode ser retirado a partir dos reservatórios de lavagem para os tubos aspiradores. Uma forma de realização exemplar é apresentada na Fig. 8, que mostra uma linha de poços de reagentes 401A. O cartucho também inclui uma fileira de poços correspondentes 401B que retém a mesma orientação na dimensão X com respeito um ao outro, mas que são compensados na dimensão y a partir de poços 401A. Os poços deslocados 401B podem incluir um tampão de lavagem, por exemplo, fornecido para a lavagem dos tubos aspiradores e as linhas fluídicas depois de usar um cartucho e antes de usar um outro cartucho.
[059] Em alternativa ou adicionalmente, outros reservatórios que estão vazios, ou que contém tampão, amostra, ou outros reagentes podem estar presentes no cartucho. Os reservatórios adicionais podem, mas não precisam interagir com um tubo de sucção. Por exemplo, um reservatório pode ser configurado para ser cheio com resíduos ou reagente em excesso ou tampão ao longo da utilização do cartucho. Um tal reservatório pode ser acessado, por exemplo através de um orifício que não interage com um tubo de sucção.
[060] Para facilitar o alinhamento correto dos reservatórios de cartucho com os correspondentes tubos aspiradores, ranhuras de alinhamento podem ser posicionadas no cartucho. Por exemplo, em formas de realização particulares em que uma matriz de tubos aspiradores é removida a partir de um conjunto de reservatórios e translocada para outro conjunto de reservatórios de reagentes de lavagem, ranhuras de alinhamento podem ser posicionadas no cartucho, para garantir o alinhamento correto da matriz de tubos aspiradores de reagente com um ou os dois conjuntos de reservatórios. Como mostrado na Fig. 8, o cartucho exemplar inclui ranhuras de alinhamento 404 que retêm a mesma orientação na dimensão X, mas que são desviadas na dimensão y em relação à correspondente ranhura de alinhamento 403. Um cartucho das formas de realização aqui apresentadas pode ter qualquer número de ranhuras de alinhamento que proporcionam o alinhamento adequado com as características de uma montagem fluídica. Por exemplo, um cartucho pode conter 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais ranhuras de alinhamento configuradas para engatar com os correspondentes pinos de alinhamento do sistema fluídico, de modo que tubos aspiradores de reagente do sistema fluídico fiquem posicionados em alinhamento com o reagente e/ou os reservatórios de lavagem.
[061] Em formas de realização particulares um sistema fluídico pode ser configurado para permitir a reutilização de um ou mais reagentes. Por exemplo, o sistema fluídico pode ser configurado para fornecer um reagente para uma célula de fluxo, em seguida, remover o reagente a partir da célula de fluxo, e, em seguida, reintroduzir o reagente para a célula de fluxo. Uma configuração é exemplificada na Fig. 7A, que mostra uma vista de topo das linhas de depósito em um conjunto de coletor. Como mostrado no diagrama esquemático na porção superior da fig. 7A, um depósito de reagente pode ser usado para manter um gradiente de concentração de reagente mais utilizado para menos utilizado (fresco). Em algumas formas de realização, o reservatório cache pode ser configurado para reduzir a mistura de fluidos no interior do reservatório cache, mantendo assim um gradiente de reagente líquido ao longo do comprimento do reservatório a partir da extremidade proximal para a célula de fluxo para a extremidade distal para a célula de fluxo. À medida que o reagente é fornecido de volta para a célula de fluxo a partir do reservatório cache o gradiente é mantido de tal modo que o reagente que fluiu através da célula de fluxo forme um gradiente de reagente de mais usado para menos usado (fresco).
[062] Como exemplificado no diagrama na porção inferior da Fig. 7A, os fluidos do coletor podem ser configurados de tal modo que um reservatório de reagente está em comunicação fluida com o orifício de entrada de uma célula de fluxo (não mostrado) através da válvula de entrada de 1804. A válvula 1804 controla o fluxo de fluidos entre a célula de fluxo (não mostrado) e cada um dos reservatórios CLM, reservatório SRE, reservatório IMF, e reservatórios LAM1 e LPM1. O canal 1802 conecta de modo fluido o reservatório CLM através do orifício 1801 com entrada da válvula 1804. Uma porção de canal 1802 inclui um depósito de reagente 1803 configurado para conter um volume de reagente equivalente ao volume de uma ou mais faixas de célula de fluxo (não mostrado). O aumento do volume do depósito de reagente 1803 em comparação com outras partes do canal 1802 permite que um reagente utilizado seja armazenado para reutilização, mantendo um estoque de reagente não utilizado no reservatório do reagente, evitando assim, a contaminação do estoque de reagente não utilizado no reservatório de reagente com o reagente utilizado.
[063] A configuração mostrada na Fig. 7A é exemplar. Outras configurações são possíveis, bem como para alcançar a reutilização. Por exemplo, um ou mais dos reservatórios depósito podem ter um volume que é de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1500%, 2000%, 2500%, 3000% ou mais do volume de um canal de célula de fluxo em comunicação fluida com o reservatório cache. Alternativamente ou adicionalmente, o reservatório cache pode compreender um volume suficiente para permitir que uma quantidade de reagente líquido em um ou mais canais de células de fluxo a fluir para o reservatório cache de tal modo que o reagente líquido da célula de fluxo não seja direcionado de volta para o reservatório de reagente após o contacto com a célula de fluxo. Por exemplo, a quantidade de reagente líquido pode compreender 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600% , 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1500%, 2000%, 2500%, 3000% ou mais do reagente líquido em um ou mais canais de célula de fluxo.
[064] Um reservatório cache, tal como aqui apresentado pode ser configurado para reduzir a mistura do fluido no interior do reservatório cache. Em algumas de tais formas de realização, a mistura reduzida pode assim, manter um gradiente de reagente líquido ao longo do comprimento do reservatório a partir da extremidade proximal para a célula de fluxo para a extremidade distal para a célula de fluxo. Alternativamente ou adicionalmente, um reservatório cache, tal como aqui apresentado pode compreender um ou mais elementos de mistura configurados para promover a mistura do fluido no interior do reservatório cache. Qualquer elemento de mistura ativo ou passivo adequado pode ser utilizado em tais formas de realização. Por exemplo, o elemento de mistura pode compreender elementos defletores estruturas curvas, ou qualquer outra característica estrutural ou fluídica passiva ou ativa configurado para promover a mistura quando o fluido é transportado através de um reservatório cache. Alternativamente ou adicionalmente, qualquer bomba adequada, rotor, lâmina, entrada e semelhantes podem ser utilizados para a mistura ativa dentro de um reservatório cache.
[065] Um reservatório cache, tal como aqui apresentado pode ter qualquer forma, volume e comprimento que seja adequado para os propósitos de um reservatório cache. Em formas de realização específicas, os reservatórios de depósito, de qualquer forma, volume e/ou comprimento podem ser usados nos sistemas fluídicos aqui apresentados, que permitem uma quantidade de reagente líquido em um ou mais canais de células de fluxo a fluir para o reservatório cache de tal modo que o reagente líquido da célula de fluxo não seja direcionado de volta para o reservatório de reagente após o contacto da célula de fluxo. Por exemplo, um reservatório cache pode compreender um canal de serpentina. A título de outro exemplo, um reservatório cache pode compreender um canal de forma cilíndrica ou não cilíndrica. Além disso, qualquer número de canais de fluido no sistema de fluidos aqui apresentado pode incluir um ou mais reservatórios de depósito individuais.
[066] Um reservatório cache, tal como aqui apresentado pode estar em comunicação fluida com uma bomba configurada para mover o reagente líquido do reservatório cache para a célula de fluxo e da célula de fluxo de volta para o reservatório cache, em que a entrada do reagente para a célula de fluxo e saída do reagente a partir da célula de fluxo ocorre por meio do mesmo orifício da célula de fluxo. Alternativamente ou adicionalmente, a entrada de reagente para a célula de fluxo e saída de reagente a partir da célula de fluxo pode ocorrer através de diferentes orifícios da célula de fluxo e ainda conseguir a reutilização do reagente. Por exemplo, os sistemas fluídicos aqui apresentados podem fazer uso de qualquer dos reservatórios de reutilização e configurações descritas em ligação com as configurações do aparelho de acordo com Pedido de Patente US Número de Série 13/766,413 depositado em 13 de Fevereiro de 2013, e intitulado "INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING,”, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[067] O esquema da fig. 7B apresenta uma ilustração exemplar de um método de reutilização aqui apresentado que utiliza o fluxo recíproco de reagente a partir de uma linha de depósito para uma célula de fluxo, seguido de novo enchimento parcial da linha de depósito da célula de fluxo. No estado mostrado no painel de topo da Fig. 7B, o reservatório cache 1903 contendo 100μL de reagente 1906 está em comunicação fluida com as faixas da célula de fluxo 1905 via divisor 1904 e válvula 1911. A válvula 1904 é acionada para permitir que o reagente 1906 flua para as faixas de células de fluxo 1905. Ao mesmo tempo, o reagente fresco 1907 é puxado a partir do reservatório de reagente para encher o vazio deixado no reservatório cache 1903. Após o uso do reagente na célula de fluxo, a válvula 1911 direciona uma parte (75 μL) de reagente utilizado 1906 de volta para o reservatório cache 1903. Outra parcela (25 μL) de reagente usado 1906 é desviado pela válvula 1911 para um recipiente de resíduos. No final do ciclo 1, o reservatório cache 1903 tem um gradiente com 25μl de reagente fresco 1907 e 75μL, de reagente 1906 utilizado em todo o comprimento do reservatório cache. O ciclo de fluxo inverso de reagente a partir do reservatório cache para a célula de fluxo e de volta para o reservatório cache é repetido, com uma porção (25μL) de reagente utilizado 1906 desviada em cada ciclo pela válvula 1911 para um recipiente de resíduos e o restante do reagente utilizado 1906 é escoado de volta para o reservatório cache 1903. No final de quatro ciclos repetidos iguais, o reservatório cache 1903 contém 25μL de reagente fresco 1910, 25μL do reagente que tenha sido utilizado apenas uma vez 1909, 25μL de reagente que foi utilizado duas vezes 1908, e 25μL de reagente que foi utilizado três vezes 1907.
[068] As configurações mostradas na Fig. 7A e fig. 7B são exemplares. Outras configurações são possíveis, bem como para alcançar a reutilização de um ou mais dos reagentes utilizados nos processos particulares. Será entendido que, em algumas configurações de reutilização de reagente, as configurações fluídicas para reutilização de reagente serão usadas somente para um subconjunto dos reagentes utilizados em um processo particular. Por exemplo, um primeiro subconjunto de reagentes pode ser suficientemente robusto para ser reutilizado enquanto que um segundo subconjunto pode ser propenso a contaminação, degradação ou outros efeitos indesejados após uma única utilização. Por conseguinte, o sistema de fluidos pode ser configurado para reutilização do primeiro subconjunto de reagentes, enquanto que os fluidos para o segundo conjunto de reagentes serão configurados para uma única utilização.
[069] Um reagente específico pode ser reutilizado em qualquer número de vezes desejado para atender um determinado processo. Por exemplo, um ou mais dos reagentes aqui exemplificados, descrito na referência aqui citada, ou de outro modo conhecido para ser utilizado num processo aqui estabelecido pode ser reutilizado pelo menos, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50 ou mais vezes. Na verdade, qualquer de uma variedade de regentes desejados pode ser reutilizado pelo menos várias vezes. Qualquer porção de um reagente particular, pode ser desviado de volta para um reservatório cache para reutilização. Por exemplo, um ou mais dos reagentes aqui exemplificados, descrito na referência citada, ou de outro modo conhecido para ser utilizado num processo aqui estabelecido pode ter de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% do volume de reagente em uma ou mais faixas de célula de fluxo direcionada de volta ao reservatório cache para reutilização subsequente. Alternativamente ou adicionalmente, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40 %, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% do volume de reagente em uma ou mais faixas de células de fluxo pode ser desviado para um recipiente de resíduos ou de outra forma removido do uso subsequente em uma célula de fluxo.
[070] Configurações fluídicas e métodos para a reutilização de reagente, embora exemplificados por um processo de sequenciamento de ácido nucléico, podem ser aplicados a outros processos, em particular, processos que envolvem ciclos repetidos de fornecimento de reagente. Processos exemplificativos incluem o sequenciamento de polímeros, tais como polipeptídios, polissacarídeos ou polímeros sintéticos e também incluem a síntese desses polímeros.
[071] Como demonstrado pelas formas de realização exemplificativas acima, um método de reutilização de reagente pode incluir as etapas de: a) retirada de um reagente líquido de um reservatório de reagente para um reservatório cache, o reservatório cache em comunicação fluida com o reservatório de reagente e, pelo menos, um canal de um célula de fluxo; b) transporte do reagente a partir do reservatório cache para o pelo menos um canal de célula de fluxo; c) o transporte de, pelo menos, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% do reagente no canal da célula de fluxo para o reservatório cache de tal modo que o reagente líquido da célula de fluxo não é dirigido de volta para o reservatório de reagente após o contacto da célula de fluxo; d) repetir as etapas b) e c) para se conseguir a reutilização do reagente líquido na célula de fluxo. O um ou mais dos reservatórios de depósito pode estar em comunicação fluida com uma bomba configurada para mover o reagente líquido do reservatório cache para a célula de fluxo e a partir da célula de fluxo de volta para o reservatório cache, de tal modo que a entrada de reagente para a célula de fluxo e a saída de reagentes a partir da célula de fluxo ocorre por meio do mesmo orifício da célula de fluxo. Alternativamente ou adicionalmente, a entrada de reagente para a célula de fluxo e saída de reagente a partir da célula de fluxo pode ocorrer através de diferentes orifícios da célula de fluxo e ainda assim, conseguir a reutilização do reagente. Em algumas formas de realização, o reagente de célula de fluxo que não é transportado para o reservatório cache na etapa c) pode ser desviado. Como um exemplo, o reagente da célula de fluxo que não é transportado para o reservatório cache pode ser transportado para um reservatório de resíduos. O transporte de reagente em uma ou ambas as etapas b) e c) pode ser realizado através de uma válvula, que liga de forma fluídica, o reservatório cache e a célula de fluxo. O transporte do reagente em uma ou ambas as etapas b) e c) pode ser realizado, por exemplo com o fluxo de fluido num único sentido, ou pode ser realizado com fluxo alternativo.
[072] As concretizações dos presentes sistemas e métodos fluídicos encontram utilização particular para técnicas de sequenciamento de ácido nucléico. Por exemplo, os protocolos de sequenciamento por síntese (SBS) são particularmente aplicáveis. No SBS, a extensão de um iniciador de ácido nucléico ao longo de um molde de ácido nucléico é monitorizada para se determinar a sequência de nucleotídeos no molde. O processo químico subjacente pode ser de polimerização (por exemplo, como catalisada por uma enzima polimerase) ou de ligação (por exemplo, catalisada por uma enzima ligase). Em uma modalidade SBS de base polimerase em particular, os nucleotídeos marcados com fluorescência são adicionados a um iniciador (prolongado assim o iniciador) em um modo dependente do modelo, de tal modo que a detecção da ordem e tipo de nucleotídeos adicionados ao iniciador pode ser usada para determinar a sequência do modelo. Uma pluralidade de diferentes modelos pode ser submetida a uma técnica de SBS numa superfície sob condições em que os eventos que ocorrem em diferentes modelos podem ser distinguidos. Por exemplo, os moldes podem estar presentes na superfície de uma matriz de tal forma que os diferentes modelos são espacialmente distinguíveis um do outro. Normalmente os modelos ocorrem em recursos cada um tendo várias cópias do mesmo modelo (às vezes chamados de "grupamentos" ou "colônias"). No entanto, também é possível realizar o SBS em matrizes onde cada função tem uma única molécula do modelo presente, de tal forma que as moléculas de modelo individuais podem ser resolvidas uma das outras (às vezes chamado "matrizes de única molécula").
[073] As células de fluxo fornecem um substrato conveniente para alojar uma matriz de ácidos nucléicos. As células de fluxo são convenientes para técnicas de sequenciamento porque as técnicas envolvem, tipicamente, a liberação de reagentes repetida em ciclos. Por exemplo, para iniciar um primeiro ciclo de SBS, um ou mais nucleotídeos marcados, polimerase DNA etc., podem ser vertidos em / através de uma célula de fluxo que aloja uma matriz de moldes de ácido nucléico. Estas características, onde a extensão do iniciador provoca um nucleotídeo marcado para ser incorporado pode ser detectada, por exemplo, utilizando os métodos e aparelhos aqui estabelecidos. Opcionalmente, os nucleotídeos podem ainda incluir uma propriedade de terminação reversível que termina além da extensão do iniciador uma vez que um nucleotídeo tenha sido adicionado a um iniciador. Por exemplo, um análogo de nucleotídeo tendo uma fração terminadora reversível pode ser adicionado a um iniciador, de tal forma que uma extensão subsequente não poderá ocorrer até que um agente desbloqueador seja liberado para remover a fração. Assim, para formas de realização que utilizam uma terminação reversível um reagente de desbloqueio pode ser fornecido à célula de fluxo (antes ou após a detecção ocorrer). As lavagens podem ser realizadas entre as várias etapas de distribuição. O ciclo pode, então, ser repetido n vezes para estender o iniciador por n nucleotídeos, detectando-se assim uma sequência de comprimento n. Exemplos de técnicas de sequenciamento são descritos, por exemplo, em Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008), WO 04/018497; US 7057026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405..281, e US 2008/0108082, cada uma das quais sendo ora incorporada por referência.
[074] Para a etapa de distribuição de nucleotídeos de um ciclo de SBS, ou um único tipo de nucleotídeo pode ser distribuído de cada vez, ou vários tipos de diferentes de nucleotídeos (por exemplo, A, C, T e G em conjunto) podem ser distribuídos. Para uma configuração de distribuição de nucleotídeos em que apenas um único tipo de nucleotídeo está presente por vez, os diferentes nucleotídeos não precisam ter rótulos distintos, uma vez que podem ser distinguidos com base na separação temporal inerente ao fornecimento individualizado. Por conseguinte, um método ou aparelho de sequenciamento pode utilizar a detecção de cor única. Por exemplo, um microfluorímetro ou cabeçalho só precisa fornecer excitação a um único comprimento de onda, ou em uma única gama de comprimentos de onda. Assim, um microfluorímetro ou cabeçalho precisa apenas ter uma única fonte de excitação e a filtração em múltiplas faixas de excitação não se faz necessária. Para uma configuração de fornecimento de nucleotídeos onde os resultados do fornecimento em vários nucleotídeos diferentes estão presentes na célula de fluxo ao mesmo tempo, características que incorporam diferentes tipos de nucleotídeos podem ser distinguidas com base em diferentes marcadores fluorescentes que estão ligados aos respectivos tipos de nucleotídeos na mistura. Por exemplo, quatro nucleotídeos diferentes podem ser utilizados, tendo cada um de quatro diferentes fluoróforos. Numa concretização, os quatro fluoróforos diferentes podem ser distinguidos utilizando excitação em quatro regiões diferentes do espectro. Por exemplo, um microfluorímetro ou cabeçalho pode incluir quatro fontes de radiação de excitação diferentes. Alternativamente, uma cabeça de leitura pode incluir menos de quatro fontes diferentes de radiação de excitação, mas pode utilizar filtração óptica da radiação de excitação a partir de uma única fonte para produzir diferentes faixas de radiação de excitação na célula de fluxo.
[075] Em algumas formas de realização, quatro nucleotídeos diferentes podem ser detectados numa amostra (por exemplo, matriz de características de ácido nucléico) utilizando menos do que quatro cores diferentes. Como um primeiro exemplo, um par de tipos de nucleotídeos pode ser detectado ao mesmo comprimento de onda, mas distingue-se com base numa diferença na intensidade de um membro do par em relação ao outro, ou com base em uma mudança para um membro do par (por exemplo, via modificação química , modificação fotoquímica ou modificação física) que faz com que o sinal evidente apareça ou desapareça em comparação com o sinal detectado para o outro membro do par. Como um segundo exemplo, três dos quatro tipos de nucleotídeos diferentes podem ser detectáveis sob condições particulares, enquanto um quarto tipo de nucleotídeo carece de um rótulo que é detectável sob essas condições. Numa forma de realização SBS do segundo exemplo, a incorporação dos três primeiros tipos de nucleotídeo num ácido nucléico pode ser determinada com base na presença dos seus respectivos sinais, e incorporação do quarto tipo de nucleotídeo no ácido nucléico pode ser determinada com base na ausência de qualquer sinal. Como um terceiro exemplo, um tipo de nucleotídeo pode ser detectado em duas imagens diferentes ou em dois canais diferentes (por exemplo, uma mistura de duas espécies com a mesma base, mas diferentes rótulos pode ser usada, ou uma única espécie com dois rótulos pode ser usada ou espécies individuais tendo um rotulo que é detectado em ambos os canais pode ser igualmente utilizada, ao passo que são detectados outros tipos de nucleotídeos em não mais do que uma das imagens ou canais. Neste terceiro exemplo, a comparação das duas imagens ou dois canais presta-se a distinguir os diferentes tipos de nucleotídeos.
[076] As três configurações exemplificativas no parágrafo anterior não são mutuamente exclusivas e podem ser utilizadas em várias combinações. Uma forma de realização exemplar é um método SBS que utiliza nucleotídeos reversivelmente bloqueados (rbNTPs) possuindo marcadores fluorescentes. Neste formato, quatro tipos diferentes de nucleotídeos podem ser liberados a um conjunto de funcionalidades de ácido nucléico que devem ser sequenciados e, devido aos grupos de bloqueio reversíveis, um e apenas um evento de incorporação irá ocorrer em cada característica. Os nucleotídeos fornecidos à matriz, neste exemplo, podem incluir um primeiro tipo de nucleotídeos que é detectado num primeiro canal (por exemplo rbATP tendo um rótulo que é detectado no primeiro canal, quando excitado por um primeiro comprimento de onda de excitação), um segundo tipo de nucleotídeo que é detectado num segundo canal (por exemplo rbCTP tendo um rótulo que é detectado no segundo canal, quando excitado por um segundo comprimento de onda de excitação), um terceiro tipo de nucleotídeos que é detectado em ambos o primeiro e o segundo canal (por exemplo rbTTP possuindo pelo menos um rótulo que é detectado em ambos os canais, quando excitado pelo primeiro e/ou segundo comprimento de onda de excitação) e um quarto tipo de nucleotídeo que carece de um rótulo que é detectado em qualquer um dos canais (por exemplo, rbGTP que não possui um rótulo extrínseco).
[077] Uma vez que os quatro tipos de nucleotídeos foram colocados em contacto com a matriz no exemplo acima, um processo de detecção pode ser realizado, por exemplo, para capturar duas imagens da matriz. As imagens podem ser obtidas em canais separados e podem ser obtidas, simultaneamente ou sequencialmente. Uma primeira imagem obtida utilizando o primeiro comprimento de onda de excitação e emissão no primeiro canal mostrará características que incorporaram o primeiro e/ou terceiro tipo de nucleotídeo (por exemplo, A e/ou T). Uma segunda imagem obtida utilizando o segundo comprimento de onda de excitação e emissão no segundo canal mostrará características que incorporaram o segundo e/ou terceiro tipo de nucleotídeo (por exemplo, C e/ou T). Identificação inequívoca do tipo de nucleotídeo incorporado em cada característica pode ser determinada por comparação das duas imagens para chegar às seguintes características: que aparecem apenas no primeiro canal incorporaram ao primeiro tipo de nucleotídeo (por exemplo, A), características que aparecem apenas no segundo canal incorporaram ao segundo tipo de nucleotídeos (por exemplo, C), características que aparecem em ambos os canais incorporaram o terceiro tipo de nucleotídeo (por exemplo, T) e características que não aparecem em qualquer canal incorporaram o quarto tipo de nucleotídeo (por exemplo G). Note-se que a localização das características que incorporaram G neste exemplo pode ser determinada a partir de outros ciclos (onde pelo menos um dos outros três tipos de nucleotídeos são incorporados). Aparelhos e métodos para distinguir quatro nucleotídeos diferentes, utilizando detecção de menos do que quatro cores são descritos por exemplo na Pat. US. App. N° de Série 61 / 538.294, que é aqui incorporada por referência.
[078] Em algumas formas de realização, os ácidos nucléicos podem ser ligados a uma superfície e amplificados antes ou durante o sequenciamento. Por exemplo, a amplificação pode ser realizada utilizando amplificação por ponte para formar grupos de ácido nucléico numa superfície. Os métodos de amplificação de ponte úteis são descritos, por exemplo, em US 5.641.658; US 2002/0055100; US 7.115.400; US 2004/0096853; US 2004/0002090; US 2007/0128624; ou US 2008/0009420, cada uma das quais estando ora incorporada por referência. Outro método útil para a amplificação de ácidos nucléicos numa superfície é a amplificação de rolamento circular (RCA), por exemplo, como descrito em Lizardi et al., Nat. Genet. 19: 225-232 (1998) e US 2007/0099208 A1, cada uma das quais estando orai incorporada por referência ao presente. Emulsão de PCR em microesferas também pode ser utilizada, por exemplo, como descrito em Dressman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8817-8822 (2003), WO 05/010145, US 2005/0130173 ou US 2005/0064460, cada uma das quais estando ora incorporadas por referência.
[079] Como acima descrito as concretizações de sequenciamento são um exemplo de um processo repetitivo. Os métodos da presente invenção são bem adequados para processos repetitivos. Algumas formas de realização são apresentadas abaixo e algures, em outro local.
[080] Por conseguinte, são aqui proporcionados métodos de sequenciamento que incluem: (a) proporcionar um sistema de fluidos que compreende (i) uma célula de fluxo que compreende uma superfície opticamente transparente, (ii) uma amostra de ácido nucléico, (iii) uma pluralidade de reagentes para uma reação de sequenciamento, e (iv) um sistema de fluidos para distribuir os reagentes para a célula de fluxo; (b) proporcionar um aparelho de detecção que compreende (i) uma pluralidade de microfluorímetros, em que cada um dos microfluorímetros compreende um objetivo configurado para detecção de imagem de campo ampla num plano de imagem em dimensões X e Y, e (ii) uma fase de amostra; e (c) a realização de operações fluídicas de um procedimento de sequenciamento de ácido nucléico nas operações de cartucho e de detecção do processo de sequenciamento de ácido nucléico no aparelho de detecção, em que (i) os reagentes são fornecidos à célula de fluxo pelo sistema de fluidos, (ii) imagens de campo amplo das características de ácido nucléico que são detectadas pela pluralidade de microfluorímetros, e (iii) pelo menos alguns reagentes são removidos da célula de fluxo de um reservatório cache.
[081] Ao longo deste pedido de patente, várias publicações, patentes e/ou pedidos de patentes foram referenciados. A revelação destas publicações na sua totalidade é aqui incorporada por referência neste pedido.
[082] O termo compreendendo destina-se aqui a ser indefinido, incluindo não somente os elementos descritos, mas ainda abrangendo quaisquer elementos adicionais.
[083] Foram aqui descritas algumas formas de realização. Não obstante, será entendido que, várias modificações podem ser feitas. Por conseguinte, outras concretizações encontram-se no âmbito das reivindicações apensas.

Claims (12)

1. Sistema, compreendendo:um sistema de fluidos (100) para a distribuição de reagentes a partir de um cartucho de reagente (400) para uma célula de fluxo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:um conjunto coletor de reagente (101) compreendendo um corpo coletor tendo um material sólido e uma pluralidade de canais (107) configurados para conectar fluidamente um cartucho de reagente (400) a uma entrada de uma célula de fluxo, em que a pluralidade de canais (107) do conjunto coletor de reagente (101), inclui, cada, um canal de fluidos (302) através do material sólido do corpo coletor;uma pluralidade de tubos aspiradores de reagente (103, 104) acoplados ao conjunto coletor de reagente (101) e se estendendo para baixo a partir de orifícios que estão alojados no conjunto coletor de reagente (101), cada um da pluralidade de tubos aspiradores de reagente (103, 104) configurados para serem colocados dentro de um reservatório de reagente (401, 402) em um cartucho de reagente (400) de modo que os reagentes líquidos possam ser extraídos a partir dos reservatórios de reagentes (401, 402) para o tubo aspirador (103, 104);pelo menos uma válvula (102, 109) configurada para mediar a comunicação fluida entre os reservatórios de reagentes (401, 402) e a entrada da célula de fluxo;pelo menos um da pluralidade de canais (107) no coletor (101) compreendendo um reservatório cache (108, 1903) no conjunto coletor de reagente (101) e em comunicação fluida com um reservatório de reagente (401, 402) e pelo menos um canal da célula de fluxo, em que o reservatório cache (108, 1903) tem um volume que é pelo menos 30% do volume de um canal da célula de fluxo, em que o reservatório cache (108, 1903) tem volume suficiente para permitir uma quantidade de reagente líquido para fluir da célula de fluxo para o reservatório cache (108, 1903) de modo que o reagente líquido da célula de fluxo não seja direcionado de volta para o reservatório de reagente (401, 402) após entrar em contato com a célula de fluxo e em que um ou mais dos reservatórios cache (108, 1903) estão em comunicação fluida com uma bomba configurada para mover reagente líquido do reservatório cache (108, 1903) para a célula de fluxo e da célula de fluxo de volta para o reservatório cache (108, 1903), em que a entrada de reagente para a célula de fluxo e a saída de reagente a partir da célula de fluxo ocorre por meio do mesmo orifício da célula de fluxo; eum dispositivo de detecção operacionalmente associado ao sistema de fluidos (100) e configurado para detectar características de ácido nucléico na célula de fluxo.
2. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma válvula (102, 109) é configurada para direcionar diferencialmente reagente líquido da célula de fluxo de volta para o reservatório cache (108, 1903) ou para o reservatório de resíduos (109).
3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido reservatório cache (108) está configurado para reduzir a mistura de fluidos no interior do reservatório cache, mantendo assim um gradiente de reagente líquido ao longo do comprimento do reservatório desde a extremidade proximal para a célula de fluxo para a extremidade distal para a célula de fluxo.
4. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido reservatório cache compreende uma pluralidade de elementos de mistura configurados para promover a mistura do fluido no interior do reservatório cache e, opcionalmente, em que os elementos de mistura compreendem características estáticas no reservatório cache ou em uma superfície interna do reservatório cache, ou em que os elementos de mistura compreendem elementos defletores.
5. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido reservatório cache compreende um canal de forma não cilíndrica.
6. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o coletor (101) está configurado para distribuir reagente a partir de um primeiro reservatório de reagente para uma primeira válvula através de um primeiro canal e a partir do primeiro reservatório de reagente para uma segunda válvula através de um segundo canal.
7. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o aparelho de detecção compreende uma pluralidade de microfluorímetros, em que cada um dos microfluorímetros compreende um objetivo configurado para detecção de imagem de campo amplo em um plano de imagem em uma dimensão x e y.
8. Método de reutilização de reagentes CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a) fornecer um conjunto coletor de reagente (101) compreendendo um corpo coletor tendo um material sólido e uma pluralidade de canais (107) configurados para fornecer reagentes líquidos de reservatórios de reagente (401, 402) de um cartucho de reagente (400) para uma entrada de uma célula de fluxo;b) extrair um reagente líquido de um reservatório de reagente (401, 402) para um reservatório cache (108, 1903), o reservatório cache (108, 1903) estando em comunicação fluida com o reservatório de reagente (401, 402) e pelo menos um canal de uma célula de fluxo, o reservatório cache (108 , 1903) tendo um volume que é pelo menos 30% do volume do pelo menos um canal, em que o reservatório cache (108, 1903) tem um volume suficiente para permitir que uma quantidade de reagente líquido flua da célula de fluxo para o reservatório cache (108, 1903) de modo que o reagente líquido da célula de fluxo não seja direcionado de volta para o reservatório de reagente (401, 402) depois de contatar a célula de fluxo, e em que um ou mais dos reservatórios cache (108, 1903) está em comunicação fluida com uma bomba configurada para mover o reagente líquido do reservatório cache (108, 1903) para a célula de fluxo e da célula de fluxo de volta para o reservatório cache (108, 1903), em que a entrada de reagente para a célula de fluxo e a saída do reagente da célula de fluxo ocorre por meio do mesmo orifício da célula de fluxo;c) transportar o reagente (1906) a partir do reservatório cache (108, 1903) para o pelo menos um canal de célula de fluxo;d) transportar pelo menos 30% do reagente no canal de célula de fluxo para o reservatório cache (108, 1903), de tal modo que, o reagente líquido da célula de fluxo não seja direcionado de volta para o reservatório de reagente (401, 402) após o contato da célula de fluxo; ee) repetir as etapas c) e d) para se alcançar a reutilização do reagente líquido na célula de fluxo.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente da célula de fluxo que não é transportado para o reservatório cache (108, 1903) na etapa c) é transportado para o reservatório de resíduo.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o transporte em uma ou ambas as etapas c) e d) é realizado por meio de uma válvula (1911) que conecta fluidamente o reservatório cache (108, 1903) e a célula de fluxo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente líquido compreende um reagente para realizar o sequenciamento de ácido nucléico, uma polimerase, nucleotídeo ou mistura de diferentes nucleotídeos.
12. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente fluiu de volta (1906) para o reservatório cache (108, 1903) na etapa d) é misturado com reagente semelhante (1907) no reservatório cache (108, 1903), formando assim uma mistura reagente compreendendo reagentes semelhantes de uma pluralidade de repetições das etapas c) e d).
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