DE202017100081U1 - Detektionsvorrichtung mit einem Mikrofluorometer, einem fluidischen System und einem Durchflusszellen-Rastklemmenmodul - Google Patents

Detektionsvorrichtung mit einem Mikrofluorometer, einem fluidischen System und einem Durchflusszellen-Rastklemmenmodul Download PDF

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Abstract

Eine Detektionsvorrichtung, die Folgendes beinhaltet: ein Mikrofluorometer, das ein Objektiv, eine Anregungsstrahlungsquelle und einen Detektor beinhaltet, wobei das Mikrofluorometer für Weitfeldbilddetektion konfiguriert ist; ein fluidisches System zum Liefern von Reagenzien aus einer Reagenzkartusche an eine Durchflusszelle, wobei das fluidische System Folgendes beinhaltet: einen Verteilerkörper, der eine Vielzahl von fluidischen Kanälen aufweist, die für die Fluidkommunikation zwischen der Reagenzkartusche und einem Einlass der Durchflusszelle konfiguriert sind; eine Vielzahl von Reagenzsippern, die sich von Anschlüssen im Verteilerkörper nach unten erstrecken, wobei jeder der Reagenzsipper konfiguriert ist, um in einem Reagenzreservoir der Reagenzkartusche platziert zu werden, sodass Flüssigreagenz vom Reagenzreservoir in den Reagenzsipper gesaugt werden kann; und ein Ventil, das konfiguriert ist, um Fluidkommunikation zwischen den Reagenzreservoirs und dem Einlass der Durchflusszelle zu vermitteln, wobei die fluidischen Kanäle die Reagenzsipper mit dem Ventil fluidisch verbinden; und ein Durchflusszellen-Rastklemmenmodul, das eine Klemmenabdeckung zum Halten der Durchflusszelle aufweist, wobei das Objektiv konfiguriert ist, um Anregungsstrahlung aus der Strahlungsquelle zur Durchflusszelle zu leiten und um Emission aus der Durchflusszelle zum Detektor zu leiten, wobei das Mikrofluorometer bewegt werden kann, um Weitfeldbilder von unterschiedlichen Bereichen einer Innenfläche der Durchflusszelle zu erfassen.

Description

  • HINTERGRUND
  • Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung betreffen generell eine Vorrichtung und Verfahren für fluidische Manipulation und optische Detektion von Proben, zum Beispiel in Nukleinsäuresequenzierungsverfahren.
  • Unser Genom stellt eine Blaupause zum Vorhersagen vieler unserer inhärenten Prädispositionen bereit, wie etwa unserer Präferenzen, Talente, Anfälligkeit für Krankheiten und Empfindlichkeit gegenüber therapeutischen Arzneimitteln. Ein individuelles menschliches Genom enthält eine Sequenz von über 3 Milliarden Nukleotiden. Unterschiede in nur einem Bruchteil dieser Nukleotide vermitteln viele unserer einmaligen Charakteristiken. Die Forschungsgemeinschaft macht beeindruckende Fortschritte beim Entschlüsseln der Merkmale, die die Blaupause und damit ein umfassenderes Verständnis darüber ausmachen, wie die Informationen in jeder Blaupause die menschliche Gesundheit betreffen. Unser Verständnis ist jedoch bei weitem nicht umfassend und dies behindert den Fluss der Informationen von den Forschungslabors zur Klinik, wo die Hoffnung besteht, dass eines Tages jeder von uns eine Kopie unseres eigenen persönlichen Genoms besitzen wird, sodass wir uns mit unserem Arzt zusammensetzen können, um eine entsprechende Wahl für eine gesunde Lebensweise oder eine angemessene Behandlung zu bestimmen.
  • Der derzeitige Engpass liegt am Durchsatz und Umfang. Eine wesentliche Komponente des Entschlüsselns der Blaupause für ein gegebenes Individuum besteht darin, die exakte Sequenz der 3 Milliarden Nukleotide in seinem Genom zu bestimmen. Es sind Techniken verfügbar, um dies vorzunehmen, aber diese Techniken erfordern zum Durchführen typischerweise viele Tage und Tausende von Dollar. Des Weiteren ist die klinische Relevanz der genomischen Sequenz eines Individuums eine Sache des Vergleichens der einmaligen Merkmale seiner genomischen Sequenz (d. h. seines Genotyps) mit Bezugsgenomen, die mit bekannten Charakteristiken (d. h. Phänotypen) korreliert sind. Das Problem des Durchsatzes und Umfangs zeigt sich, wenn man bedenkt, dass die Bezugsgenomen basierend auf Korrelationen von Genotyp zu Phänotyp erzeugt werden, die aus Forschungsstudien resultieren, die typischerweise Tausende von Individuen mit Tausenden von Individuen arbeiten, um statistisch gültig zu sein. So können schließlich Milliarden von Nukleotiden für Tausende von Individuen sequenziert werden, um eine klinisch relevante Genotyp-zu-Phänotyp-Korrelation zu identifizieren. Ferner multipliziert mit der Anzahl von Krankheiten, Arzneimittelempfindlichkeiten und anderen klinisch relevanten Charakteristiken wird der Bedarf für sehr kostengünstige und schnelle Sequenzierungstechnologien immer deutlicher.
  • Was benötigt wird, ist eine Reduzierung der Kosten für Sequenzierung, die große genetische Korrelationsstudien antreibt, die von Wissenschaftlern ausgeführt werden, und die Sequenzierung in der klinischen Umgebung für die Behandlung von individuellen Patienten, die lebensverändernde Entscheidungen treffen, zugänglich macht. In dieser Schrift dargelegte Ausführungsformen der Erfindung erfüllen diesen Bedarf und stellen auch andere Vorteile bereit.
  • KURZDARSTELLUNG
  • Es wird in dieser Schrift eine Detektionsvorrichtung bereitgestellt, die ein Mikrofluorometer umfasst, das ein Objektiv, eine Anregungsstrahlungsquelle und einen Detektor umfasst. Das Mikrofluorometer ist für Weitfeldbilddetektion konfiguriert. Die Detektionsvorrichtung umfasst auch ein fluidisches System zum Liefern von Reagenzien aus einer Reagenzkartusche an eine Durchflusszelle. Das fluidische System umfasst einen Verteilerkörper, der eine Vielzahl von fluidischen Kanälen aufweist, die für die Fluidkommunikation zwischen der Reagenzkartusche und einem Einlass der Durchflusszelle konfiguriert sind. Das fluidische System umfasst auch eine Vielzahl von Reagenzsippern, die sich von Anschlüssen im Verteilerkörper nach unten erstrecken. Jeder der Reagenzsipper ist konfiguriert, um in einem Reagenzreservoir der Reagenzkartusche platziert zu werden, sodass Flüssigreagenz vom Reagenzreservoir in den Reagenzsipper gesaugt werden kann. Das fluidische System umfasst auch ein Ventil, das konfiguriert ist, um Fluidkommunikation zwischen den Reagenzreservoirs und dem Einlass der Durchflusszelle zu vermitteln. Die fluidischen Kanäle verbinden fluidisch die Reagenzsipper mit dem Ventil. Die Detektionsvorrichtung umfasst auch ein Durchflusszellen-Rastklemmenmodul, das eine Klemmenabdeckung zum Halten der Durchflusszelle aufweist. Das Objektiv ist konfiguriert, um Anregungsstrahlung aus der Strahlungsquelle zur Durchflusszelle zu richten und um Emission aus der Durchflusszelle zum Detektor zu richten. Das Mikrofluorometer kann bewegt werden, um Weitfeldbilder von unterschiedlichen Bereichen einer Innenfläche der Durchflusszelle zu erfassen.
  • Es wird in dieser Schrift eine Detektionsvorrichtung bereitgestellt, die Folgendes beinhaltet: (a) einen Wagen, der ein oder mehrere Mikrofluorometer beinhaltet, wobei jedes des einen oder der mehreren Mikrofluorometer ein Objektiv beinhaltet, das für Weitfeldbilddetektion konfiguriert ist, wobei das eine oder die mehreren Mikrofluorometer positioniert sind, um eine Vielzahl des Weitfelds von einem unterschiedlichen Bereich der gemeinsamen Ebene zu erfassen; (b) eine Translationsstufe, die konfiguriert ist, um den Wagen in mindestens eine Richtung parallel zur gemeinsamen Ebene zu bewegen; und (c) ein fluidisches System zum Liefern von Reagenzien aus einer Reagenzkartusche an eine Durchflusszelle, wobei das fluidische System Folgendes beinhaltet: einen Reagenzverteiler, der eine Vielzahl von Kanälen beinhaltet, die für die Fluidkommunikation zwischen einer Reagenzkartusche und einem Einlass einer Durchflusszelle konfiguriert sind; eine Vielzahl von Reagenzsippern, die sich von Anschlüssen im Verteiler nach unten erstrecken, wobei jeder der Reagenzsipper konfiguriert ist, um in einem Reagenzreservoir der Reagenzkartusche platziert zu werden, sodass Flüssigreagenz vom Reagenzreservoir in den Reagenzsipper gesaugt werden kann; mindestens ein Ventil, das konfiguriert ist, um Fluidkommunikation zwischen den Reservoirs und dem Einlass der Durchflusszelle zu vermitteln. In gewissen Ausführungsformen beinhaltet die Vorrichtung nicht mehr als ein einzelnes Mikrofluorometer.
  • Diese Offenbarung stellt ferner ein fluidisches System zum Liefern von Reagenzien aus einer Reagenzkartusche an eine Durchflusszelle bereit, wobei das fluidische System Folgendes beinhaltet: einen Reagenzverteiler, der eine Vielzahl von Kanälen beinhaltet, die für die Fluidkommunikation zwischen einer Reagenzkartusche und einem Einlass einer Durchflusszelle konfiguriert sind; eine Vielzahl von Reagenzsippern, die sich von Anschlüssen im Verteiler nach unten erstrecken, wobei jeder der Reagenzsipper konfiguriert ist, um in einem Reagenzreservoir der Reagenzkartusche platziert zu werden, sodass Flüssigreagenz vom Reagenzreservoir in den Reagenzsipper gesaugt werden kann; mindestens ein Ventil, das konfiguriert ist, um Fluidkommunikation zwischen den Reservoirs und dem Einlass der Durchflusszelle zu vermitteln.
  • Diese Offenbarung stellt ferner ein Sequenzierungssystem bereit, das Folgendes beinhaltet: eine wie oben beschriebene Detektionsvorrichtung; und eine Nukleinsäureprobe, die in einer Reagenzkartusche angeordnet ist, wobei die Reagenzkartusche aus der Detektionsvorrichtung entfernt werden kann.
  • Diese Offenbarung stellt ferner ein Sequenzierungssystem bereit, das Folgendes beinhaltet: eine wie oben beschriebene Detektionsvorrichtung; und eine Nukleinsäureprobe, die in einer Durchflusszelle angeordnet ist, wobei die Durchflusszelle aus der Detektionsvorrichtung entfernt werden kann.
  • Diese Offenbarung stellt ferner ein Sequenzierungsverfahren bereit, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Sequenzierungssystems, das (i) eine Durchflusszelle, die eine optisch transparente Fläche beinhaltet, (ii) eine Nukleinsäureprobe, (iii) eine Vielzahl von Reagenzien für eine Sequenzierungsreaktion und (iv) ein fluidisches System zum Liefern der Reagenzien an die Durchflusszelle beinhaltet; (b) Bereitstellen einer Detektionsvorrichtung, die (i) ein einzelnes Mikrofluorometer, wobei das Mikrofluorometer ein Objektiv beinhaltet, das für Weitfeldbilddetektion in einer Bildebene in x- und y-Abmessungen konfiguriert ist, und (ii) eine Probestufe beinhaltet; und (c) Ausführen von fluidischen Vorgängen eines Nukleinsäuresequenzierungsverfahrens in der Kartusche und Detektionsvorgängen des Nukleinsäuresequenzierungsverfahrens in der Detektionsvorrichtung, wobei (i) die Reagenzien durch das fluidische System an die Durchflusszelle geliefert werden, (ii) Weitfeldbilder der Nukleinsäuremerkmale durch das Mikrofluorometer detektiert werden.
  • Die Details von einer oder mehreren Ausführungsformen sind in den beiliegenden Zeichnungen und der Beschreibung unten dargelegt. Andere Merkmale, Absichten und Vorteile werden aus der Beschreibung und den Zeichnungen sowie aus den Ansprüchen zu entnehmen sein.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1A zeigt eine integrierte Optoelektronik- und fluidische Detektionsvorrichtung, die für Nukleinsäuresequenzierung nützlich ist.
  • 1B zeigt eine Explosionsansicht von mehreren der Module und Systeme, aus denen sich die in 1A gezeigte integrierte Optoelektronik- und fluidische Detektionsvorrichtung zusammensetzt.
  • 2A zeigt eine perspektivische Ansicht einer Verteilereinheit, die Reagenzsipper, ein Ventil und Ausrichtungsstifte aufweist. Sie zeigt auch eine Reagenzkartusche.
  • 2B zeigt eine perspektivische Ansicht einer Verteilereinheit, die Reagenzsipper, ein Ventil und Ausrichtungsstifte aufweist.
  • 2C zeigt eine Seitenansicht einer Verteilereinheit, die Reagenzsipper von unterschiedlicher Länge, ein Ventil und Ausrichtungsstifte aufweist. Sie zeigt auch eine Reagenzkartusche.
  • 2D zeigt eine Fluidikkarte für ein fluidisches System.
  • 3A zeigt eine perspektivische Oberansicht einer Reagenzkartusche.
  • 3B zeigt eine perspektivische Ansicht eines Fluidikautomationsmoduls.
  • 4A zeigt eine optische Auslegung für ein individuelles Mikrofluorometer mit orthogonalen Anregungs- und Emissionsstrahlenwegen.
  • 4B zeigt eine optische Auslegung für ein Mikrofluorometer.
  • 4C zeigt eine perspektivische Ansicht eines beispielhaften einzelnen Mikrofluorometers.
  • 5A zeigt eine perspektivische Vorderansicht eines Abbildungsmoduls, das ein einzelnes Mikrofluorometer aufweist.
  • 5B zeigt eine perspektivische Seitenansicht eines Abbildungsmoduls, das ein einzelnes Mikrofluorometer aufweist.
  • 6 zeigt eine Durchflusszelle.
  • 7A zeigt eine perspektivische Ansicht eines Durchflusszellen-Rastklemmenmoduls.
  • 7B zeigt ein Durchflusszellen-Rastklemmenmodul ohne Durchflusszelle oder Abdeckung. 7C zeigt eine in einem Rastklemmenmodul montierte Durchflusszelle mit Abdeckung in entriegelter Position.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Diese Offenbarung stellt Verfahren und eine Vorrichtung zur Hochauflösungsdetektion von planaren Bereichen, wie etwa jenen, die auf Substratflächen vorhanden sind, bereit. Eine besonders nützliche Anwendung ist die optisch basierte Abbildung einer biologischen Probe, die auf einer Fläche vorliegt. Zum Beispiel können die in dieser Schrift dargelegten Verfahren und die in dieser Schrift dargelegte Vorrichtung verwendet werden, um Bilder von Nukleinsäuremerkmalen zu erhalten, die in Nukleinsäurearrays vorhanden sind, wie etwa jenen, die in Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen verwendet werden. Es kann eine Vielfalt von Nukleinsäuresequenzierungstechniken verwendet werden, die optisch detektierbare Proben und/oder Reagenzien benutzen. Diese Techniken sind besonders gut geeignet für die Verfahren und Vorrichtung der vorliegenden Offenbarung und zeigen daher verschiedene Vorteile für besondere Ausführungsformen der Erfindung. Einige dieser Vorteile sind unten zum Zweck der Illustration dargelegt und, obwohl Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen beispielhaft angegeben werden, können die Vorteile auch auf andere Anwendungen ausgedehnt werden.
  • In Bezug auf einige in dieser Schrift dargelegten Beispiele sind markante Charakteristiken von vielen Nukleinsäuresequenzierungstechniken (1) die Verwendung von Mehrfarbendetektion (z. B. oft werden vier unterschiedliche Fluorophore verwendet, eines für jeden der verschiedenen in Nukleinsäuren vorhandenen Nukleotidtypen A, C, G und T (oder U), (2) die Verteilung einer großen Anzahl von unterschiedlichen Fragmenten aus einer Nukleinsäureprobe (z. B. Fragmente aus einer Genomprobe, RNA-Probe oder einem Derivat davon) auf der Oberfläche eines Arrays und (3) wiederholte Zyklen von fluidischer Verarbeitung und Abbildung der Arrays. In dieser Schrift offenbarte Ausführungsformen der Verfahren und Vorrichtung sind besonders nützlich für Nukleinsäuresequenzierung, da sie die Fähigkeit der Hochauflösungsabbildung von Arrayflächen in mehreren Farben und in mehreren Wiederholungen bereitstellen können. Zum Beispiel erlauben in dieser Schrift dargelegte Ausführungsformen, ein Bild einer Fläche mit einer Auflösung zu erhalten, die im Bereich von mehreren hundert, zehn oder sogar einstelligen Mikrometern liegt. Als solches können Nukleinsäuremerkmale mit Nächstem-Nachbar-, durchschnittlichem Mitte-zu-Mitte-Abstand, der geringer als 100 Mikrometer, 50 Mikrometer, 10 Mikrometer, 5 Mikrometer oder weniger ist, aufgelöst werden. In besonderen Ausführungsformen können Weitfeldbilder von Flächen erfasst werden, einschließlich zum Beispiel Bilder, die einen Bereich von 1 mm2 oder mehr eines Arrays abdecken. Die Bilder können in mehreren Farben simultan oder sequentiell erfasst werden, zum Beispiel um fluoreszente Markierungen zu identifizieren, die eindeutig mit unterschiedlichen Nukleotidtypen verbunden sind. Außerdem können Bilder sequentiell für mehrere Zyklen einer Sequenzierungstechnik erfasst werden. Die Bilder von einem gegebenen Bereich des Arrays können von jedem Zyklus zuverlässig verglichen werden, um die Sequenz der Farbänderungen zu bestimmen, die für jedes Nukleinsäuremerkmal auf dem Array detektiert werden. Die Sequenz der Farbänderungen kann wiederum verwendet werden, um die Sequenzen der Nukleinsäurefragmente in jedem Merkmal herzuleiten.
  • In besonderen Ausführungsformen umfasst eine Vorrichtung der vorliegenden Offenbarung ein oder mehrere Mikrofluorometer. Jedes der Mikrofluorometer kann eine Anregungsstrahlungsquelle, einen Detektor und ein Objektiv umfassen, um eine integrierte Teileinheit eines Lesekopfes zu bilden. Andere optische Komponenten können in jedem Mikrofluorometer vorhanden sein. Zum Beispiel kann ein Strahlensplitter vorhanden sein, um eine kompakte Epifluoreszenzdetektionskonfiguration bereitzustellen, wobei der Strahlensplitter positioniert ist, um Anregungsstrahlung aus der Anregungsstrahlungsquelle an das Objektiv zu richten und um Emission aus dem Objektiv zum Detektor zu richten.
  • Ein Vorteil der Verwendung einer integrierten Mikrofluorometerkonstruktion besteht darin, dass das Mikrofluorometer praktischerweise bewegt werden kann, zum Beispiel in einem Abtastvorgang, um ein Abbilden eines Substrats zu erlauben, das größer als das Sichtfeld des Mikrofluorometers ist. In besonderen Ausführungsformen kann ein einzelnes Mikrofluorometer einen Lesekopf bilden. In besonderen Ausführungsformen können mehrere Mikrofluorometer kombiniert sein, um einen Lesekopf zu bilden. Verschiedene Konfigurationen für einen oder mehrere Leseköpfe werden unten dargelegt und können ausgewählt werden, um einem bestimmten Format für ein Substrat gerecht zu werden, das abgebildet werden soll, während eine relativ kompakte Größe für den gesamten Lesekopf beibehalten wird. Die relativ kleine Größe und geringe Masse des Lesekopfs in mehreren Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung resultiert in einer relativ geringen Trägheit, sodass der Lesekopf, nachdem er bewegt wurde, schnell zum Stillstand kommt, wodurch schnelles Abtasten eines Nukleinsäurearrays oder anderen Substrats begünstigt wird. In einigen Fällen kann das Mikrofluorometer an einem Wagen fixiert werden, sodass es in mindestens einigen Dimensionen während des Verlaufs einer analytischen Anwendung, wie etwa einem Nukleinsäuresequenzierungsablauf, nicht unabhängig bewegt werden kann. Das Mikrofluorometer kann jedoch in der z-Dimension unabhängig aktuiert werden, um eine unabhängige Fokusregelung bereitzustellen. Durch Reduzieren der Freiheitsgrade zwischen unterschiedlichen Mikrofluorometern einer Vorrichtung der vorliegenden Offenbarung wird ein Schutz gegen Ausrichtungsverlust während des Transports, der Handhabung und Verwendung der Vorrichtung bereitgestellt.
  • In einigen Ausführungsformen können mehrere Mikrofluorometer, die in einem Lesekopf oder Wagen vorhanden sind, jeweils ein zweckgebundenes Autofokusmodul aufweisen. Demgemäß kann jedes Mikrofluorometer unabhängig fokussiert werden. In einigen Ausführungsformen kann ein bestimmtes Autofokusmodul in einem Lesekopf, obwohl es für die Aktuierung eines bestimmten Mikrofluorometers zweckgebunden ist, trotzdem Informationen von mindestens einem anderen Autofokusmodul im Lesekopf empfangen und die Informationen von dem bestimmten Autofokusmodul und die Informationen von dem mindestens einem anderen Autofokusmodul können verwendet werden, um eine entsprechende Betätigung zu bestimmen, um den gewünschten Fokus für das bestimmte Mikrofluorometer zu erreichen. Auf diese Weise kann der Fokus für ein gegebenes Mikrofluorometer durch Konsensus zwischen zwei oder mehreren im gleichen Lesekopf oder Wagen vorhandenen Mikrofluorometern bestimmt werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann eine Probe, die detektiert werden soll, einer Detektionskammer unter Verwendung eines wie in dieser Schrift bereitgestellten fluidischen Systems bereitgestellt werden. Bei Betrachtung des spezifischeren Beispiels einer Nukleinsäuresequenzierungsanwendung kann das fluidische System eine Verteilereinheit umfassen, die mit einem oder mehreren Reservoirs zum Halten von Sequenzierungsreagenzien, Reservoirs zum Halten von Probenaufbereitungsreagenzien, Reservoirs zum Halten von während der Sequenzierung erzeugten Abfallprodukten und/oder Pumpen, Ventilen und anderen Komponenten, die fähig sind, Flüssigkeiten durch eine Durchflusszelle zu bewegen, in fluidische Kommunikation platziert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann ein fluidisches System konfiguriert sein, um die Wiederverwendung von einem oder mehreren Reagenzien zu erlauben. Zum Beispiel kann das fluidische System konfiguriert sein, um ein Reagenz an eine Durchflusszelle zu liefern, dann das Reagenz aus der Durchflusszelle zu entfernen und dann das Reagenz wieder in die Durchflusszelle einzuführen. Ein Vorteil des Wiederverwendens von Reagenzien besteht darin, das Abfallvolumen zu reduzieren und die Kosten der Prozesse zu reduzieren, die kostspielige Reagenzien und/oder Reagenzien, die mit hohen Konzentrationen (oder in hohen Mengen) geliefert werden, benutzen. Die Reagenzwiederverwendung nutzt den Vorteil des Verständnisses, dass Depletion des Reagenz nur oder primär an der Durchflusszellenoberfläche auftritt und daher ein Großteil des Reagenz ungenutzt bleibt und möglicherweise einer Wiederverwendung unterzogen werden kann.
  • 1A zeigt eine beispielhafte Detektionsvorrichtung 1, die Vorteile von integrierten Optoelektronik- und fluidischen Systemen nutzt, die durch mehrere in dieser Schrift dargelegte Ausführungsformen bereitgestellt werden. Die beispielhafte Detektionsvorrichtung 1 umfasst ein Gehäuse 2, das verschiedene fixierte Komponenten enthält, einschließlich zum Beispiel optische Komponenten, computertechnische Komponenten, Stromquelle, Gebläse und dergleichen. Ein Schirm 3, der zum Beispiel auf der Vorderfläche des Gehäuses 2 vorhanden ist, fungiert als grafische Benutzeroberfläche, die verschiedene Typen von Informationen bereitstellen kann, wie etwa Betriebsstatus, Status eines ausgeführten analytischen Verfahrens (z. B. eines Sequenzierungsablaufs), Status des Datentransfers an die oder von der Detektionsvorrichtung 1, Anweisungen für die Verwendung, Warnungen oder dergleichen. Eine Kartuschenaufnahme 4A ist ebenfalls auf der Vorderfläche des Gehäuses 2 vorhanden. Eine Abfallreservoiraufnahme 4B ist ebenfalls auf der Vorderfläche des Gehäuses 2 vorhanden. Wie gezeigt, können die Kartuschenaufnahme 4A und die Abfallreservoiraufnahme 4B als ein Schlitz konfiguriert sein, der eine Schutztür 5 aufweist. Eine Statusanzeige 6, in diesem Beispiel in Form eines Anzeigelichts auf dem Rahmen der Kartuschenaufnahme, ist vorhanden und kann konfiguriert sein, um das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Reagenzkartusche in der Detektionsvorrichtung 1 anzuzeigen. Zum Beispiel kann sich das Anzeigelicht 6 von ein auf aus oder von einer Farbe auf eine andere Farbe ändern, um das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Kartusche anzuzeigen. Eine Stromregelungstaste 7 ist in diesem Beispiel auf der Vorderseite des Gehäuses 2 vorhanden, sowie identifizierende Markierungen 8, wie etwa der Name des Herstellers oder Instruments.
  • In 1A wird auch eine beispielhafte Reagenzkartusche 10 gezeigt, die verwendet werden kann, um der Detektionsvorrichtung 1 eine Probe und Reagenzien bereitzustellen. Die Reagenzkartusche 10 umfasst ein Kartuschengehäuse 11, das verschiedene fluidische Komponenten, wie etwa Reservoirs, fluidische Verbindungen und dergleichen, schützt. Ein Barcode oder andere maschinenlesbare Markierungen können optional auf dem Kartuschengehäuse 11 vorhanden sein, zum Beispiel um Probenverfolgung und -verwaltung bereitzustellen. Andere Markierungen können ebenfalls zur praktischen Identifizierung durch einen menschlichen Benutzer auf dem Gehäuse vorhanden sein, zum Beispiel um den Hersteller, von der fluidischen Kartusche unterstützte analytische Analysen, die Losnummer, das Ablaufdatum, Sicherheitswarnungen und dergleichen zu identifizieren.
  • In 1A wird auch ein Abfallreservoir 12 gezeigt, das in die Abfallreservoiraufnahme 4B eingeführt werden kann. Das Abfallreservoir 12 ist konfiguriert, um Abfallflüssigkeit durch eine Öffnung auf der Oberseite des Reservoirs aufzunehmen.
  • Die in 1A gezeigte Vorrichtung ist beispielhaft. Weitere beispielhafte Ausführungsformen der Verfahren und Vorrichtung der vorliegenden Offenbarung, die alternativ oder zusätzlich zu dem Beispiel von 1A verwendet werden können, werden unten im weiteren Detail dargelegt.
  • 1B zeigt Komponenten der beispielhaften Detektionsvorrichtung 1, einschließlich einer fluidischen Pumpe 1001, die in Fluidkommunikation mit einem Fluidikautomationsmodul (FAM) 1002 ist. FAM 1002 ist konfiguriert, um in Fluidkommunikation mit Reagenzkartusche 1003, Durchflusszelle 1004 und Abfallreservoir 1005 platziert zu werden, um Flüssigreagenz aus Reagenzkartusche 1003 auf Durchflusszelle 1004 und zum Abfallreservoir 1005 zu bewegen. In 1B wird auch die XY-Stufe 1006 gezeigt, einschließlich Durchflusszellen-Klemmenmodul 1007. In 1B wird auch die Stromversorgungseinheit 1008 und Hauptleiterplatte (Printed Circuit Board, PCB) 1009 gezeigt.
  • 2A zeigt ein beispielhaftes fluidisches System 100, das Reagenzsipper 103 und 104 und Ventile 102 aufweist, das sich die Vorteile der fluidischen Systeme zunutze macht, die durch mehrere in dieser Schrift dargelegte Ausführungsformen bereitgestellt werden. Das fluidische System 100 umfasst eine Verteilereinheit 101, die verschiedene fixierte Komponenten enthält, einschließlich zum Beispiel Reagenzsipper, Ventile, Kanäle, Reservoirs und dergleichen. Es ist eine Reagenzkartusche 400 vorhanden, die Reagenzreservoirs 401 und 402 (nachstehend als „Gefäße“ bezeichnet) aufweist, die konfiguriert sind, um simultan einen Satz Reagenzsipper 103 und 104 entlang einer Dimension z in Eingriff zu nehmen, sodass Flüssigreagenz von den Reagenzreservoirs in die Sipper gesaugt werden kann.
  • In 2B wird eine beispielhafte Verteilereinheit 101 gezeigt, die verwendet werden kann, um einer Durchflusszelle Flüssigreagenzien von Reagenzreservoirs bereitzustellen. Die Verteilereinheit 101 umfasst Reagenzsipper 103 und 104, die sich von Anschlüssen 106 im Verteiler in einer Dimension z nach unten erstrecken. Die Reagenzsipper 103 und 104 können in einem oder mehreren Reagenzreservoirs (nicht gezeigt) in einer Reagenzkartusche platziert werden. Der Verteilerkörper 108 umfasst auch fluidische Kanäle 107, die den Reagenzsipper 103 mit einem Ventil 102 fluidisch verbinden. Die Reagenzsipper 103 und 104, die fluidischen Kanäle 107 und das Ventil 102 vermitteln Fluidkommunikation zwischen den Reagenzreservoirs und einer Durchflusszelle (nicht gezeigt). Die Ventile 102 und 109 können individuell oder in Verbindung Reagenzsipper 103 oder 104 auswählen und durch fluidische Kanäle, wie etwa 107, Fluidkommunikation zwischen den Reagenzreservoirs und einer Durchflusszelle (nicht gezeigt) vermitteln.
  • 2C zeigt eine Seitenansicht eines beispielhaften fluidischen Systems 100, das Reagenzsipper und Ventile aufweist. Der Verteiler weist Ausrichtungsstifte 105 auf, die vom Verteiler in einer Achse parallel zu den Reagenzsippern nach unten vorstehen. Die Ausrichtungsstifte 105 sind verglichen mit den Reagenzsippern entlang der z-Dimension länger, obwohl sie in alternativen Ausführungsformen auch von gleicher Länge oder kürzer sein können. Die Ausrichtungsstifte 105 sind konfiguriert, um mit einem oder mehreren entsprechenden Schnittstellenschlitzen auf einer Reagenzkartusche (nicht gezeigt) in Eingriff gebracht zu werden. Die Reagenzsipper 103 und 104 sind über Anschlüsse 106, die in einem Verteilerkörper 108 der Verteilereinheit 101 untergebracht sind, mit dem Verteiler gekoppelt. Die Reagenzsipper 104 sind im Vergleich mit den Reagenzsippern 103 länger, um Flüssigkeit von Reagenzreservoirs von unterschiedlicher Tiefe, die der Tiefe der Reagenzsipper 103 oder 104 entspricht, zu saugen. In alternativen Ausführungsformen können die Reagenzsipper 103 und 104 von gleichen Längen sein oder können dominante Längen wechseln.
  • 2B zeigt eine Ansicht einer Verteilereinheit 101, die eine mögliche Auslegung der fluidischen Kanäle 107 innerhalb des Verteilerkörpers 108 zeigt. Jeder der fluidischen Kanäle 107 stammt von einem einzelnen Anschluss 106 und ist mit einem entsprechenden Anschluss 106 des Ventils 102 verbunden. In einigen Ausführungsformen können gewisse Kanäle ein Cachereservoir umfassen, das ein ausreichendes Volumen aufweist, um zu erlauben, dass eine Menge an Flüssigreagenz aus einer Durchflusszelle (nicht gezeigt) zum Cachereservoir fließt, sodass nach Kontaktieren der Durchflusszelle Flüssigreagenz aus der Durchflusszelle nicht zurück zum Reagenzreservoir (nicht gezeigt) gerichtet wird. In 2B werden auch beispielhafte Positionen von einem oder mehreren Ausrichtungsstiften 105 gezeigt. Die in 2B gezeigte Verteilereinheit umfasst auch Einlassanschlüsse 111 für geteilte Puffer. Das Ventil 102 ist mit Einlassanschlüssen, die jedem Anschluss 106 entsprechen, und mit einem gemeinsamen Auslassanschluss 110, der mit einer Durchflusszelle fluidisch verbunden ist, und einem Abfallanschluss, der mit einer Abfallaufnahme fluidisch verbunden ist, konfiguriert.
  • Wie durch die beispielhaften Ausführungsformen oben demonstriert, kann ein fluidisches System zum Liefern von Reagenzien aus einer Reagenzkartusche an eine Durchflusszelle einen Reagenzverteiler umfassen, der einen Reagenzkörper beinhaltet, der eine Vielzahl von Kanälen aufweist, die für die Fluidkommunikation zwischen einer Reagenzkartusche und einem Einlass einer Durchflusszelle konfiguriert sind. Die Verwendung eines Verteilerkörpers in fluidischen Systemen stellt gegenüber der Verwendung von Rohren allein mehrere Vorteile bereit. Zum Beispiel reduziert ein Verteilerkörper mit fixierten fluidischen Kanälen die Wahrscheinlichkeit eines Fehlers während des Zusammenbaus, wie etwa Verlegen von Rohraufsätzen, sowie zu starkes oder zu schwaches Festziehen von Verbindungen. Darüber hinaus stellt ein Verteilerkörper eine einfache Wartung bereit, wodurch zum Beispiel ein schnelles Auswechseln einer kompletten Einheit erlaubt wird, anstatt zeitaufwändigem Prüfen und Auswechseln von individuellen Leitungen.
  • Der eine oder die mehreren der Kanäle des Verteilers können eine fluidische Bahn durch ein festes Material umfassen. Die Bahn kann von einem beliebigen Durchmesser sein, um gewünschte Niveaus von Flüssigkeitstransfer durch die Bahn zu erlauben. Die Bahn kann einen Innendurchmesser von beispielsweise weniger als 0,1 mm, 0,2 mm, 0,3 mm 0,4 mm, 0,5 mm, 0,6 mm, 0,7 mm, 0,8 mm, 0,9 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm oder weniger als 10 mm Durchmesser aufweisen. Die Bahnkonfiguration kann zum Beispiel gerade oder gekrümmt sein. Alternativ oder zusätzlich kann die Bahn eine Kombination aus gekrümmten Abschnitten und geraden Abschnitten aufweisen. Der Querschnitt der Bahn kann zum Beispiel quadratisch, rund, „D“-förmig oder eine andere Form sein, die ein gewünschtes Niveau von Flüssigkeitstransfer durch die Bahn ermöglicht.
  • Der Kanal zwischen dem Sipper und dem Ventil kann vollständig innerhalb des Ventilkörpers 108 untergebracht sein. Alternativ oder zusätzlich kann der Kanal eine oder mehrere Abschnitte umfassen, die extern zum Verteiler sind. Zum Beispiel können Rohre, wie etwa zum Beispiel flexible Rohre, einen Abschnitt der fluidischen Bahn mit einem anderen Abschnitt der Bahn auf dem Verteiler verbinden. Alternativ oder zusätzlich können flexible Rohre eine Durchflusszelle mit fixierten fluidischen Komponenten des Systems verbinden, einschließlich zum Beispiel Pumpen, Ventilen, Sensoren und Messinstrumenten. Zum Beispiel können flexible Rohre verwendet werden, um eine Durchflusszelle oder einen Kanal des vorliegenden Systems mit einer Pumpe, wie etwa einer Spritzenpumpe oder einer Peristaltischen Pumpe, zu verbinden.
  • Der Verteilerkörper 108 kann zum Beispiel aus einem geeigneten festen Material gefertigt sein, das fähig ist, darin einen oder mehrere Kanäle zu stützen. Der Verteilerkörper 108 kann daher ein Harz sein, wie etwa Polycarbonat, Polyvinylchlorid, DELRIN® (Polyoxymethylen); HALAR®; PCTFE (PolyChlorTriFluorEthylen); PEEKTM (Polyetheretherketon); PK (Polyketon); PERLAST®; Polyethylen; PPS (Polyphenylensulfid); Polypropylen; Polysulfon; FEP; PFA; High-Purity-PFA; RADEL® R; 316 Edelstahl; TEFZEL® ETFE (Ethylen-Tetrafluorethylen); TPX®(Polymethylpenten); Titan; UHMWPE (ultrahochmolekulares Polyethylen); ULTEM® (Polyetherimid); VESPEL® oder ein anderes geeignetes festes Material, das mit den durch die Kanäle der in dieser Schrift präsentierten Ausführungsformen des Verteilers transportierten Lösungsmitteln und Flüssigkeiten kompatibel ist. Der Verteilerkörper kann aus einem einzelnen Stück Material gebildet sein. Alternativ oder zusätzlich kann der Verteilerkörper aus mehreren Lagen gefertigt sein, die miteinander verklebt sind. Verfahren des Verklebens umfassen zum Beispiel die Verwendung von Klebstoffen, Dichtungen und Diffusionsverbinden. Die Kanäle können im festen Material mittels eines beliebigen Verfahren gebildet werden. Kanäle können zum Beispiel in das feste Material gebohrt, geätzt oder gefräst werden.
  • Kanäle können im festen Material gebildet werden, bevor mehrere Lagen miteinander verklebt werden. Alternativ oder zusätzlich können Kanäle gebildet werden, nachdem Lagen miteinander verklebt wurden.
  • Die in dieser Schrift präsentierten Verteilereinheiten sind für die Lieferung von Flüssigreagenzien aus einer Reagenzkartusche an eine Durchflusszelle konfiguriert. Der Verteiler kann daher eine beliebige Anzahl von Anschlüssen aufweisen, die mit Reagenzsippern gekoppelt sind. Insbesondere kann die Anzahl von Anschlüssen der Anzahl und Konstruktion der Reagenzreservoirs in einer Reagenzkartusche entsprechen. In einigen Ausführungsformen beinhaltet der Verteiler mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mindestens 30 Anschlüsse, wobei jeder Anschluss konfiguriert ist, um einen Reagenzsipper mit einem Kanal in Fluidkommunikation mit mindestens einem Ventil zu koppeln.
  • Die in dieser Schrift präsentierten fluidischen Systeme können auch ein Array von Sipperrohren umfassen, die sich entlang der z-Dimension von Anschlüssen im Verteilerkörper nach unten erstrecken, wobei jeder der Reagenzsipper konfiguriert ist, um in ein Reagenzreservoir in einer Reagenzkartusche eingeführt zu werden, sodass Flüssigreagenz vom Reagenzreservoir in den Sipper gesaugt werden kann. Die Reagenzsipper können zum Beispiel einen rohrförmigen Körper mit einem proximalen Ende und einem distalen Ende beinhalten. Das distale Ende kann sich zu einer scharfen Spitze verjüngen, die konfiguriert ist, um eine Film- oder Folienlage zu perforieren, die als Versiegelung über einem Reagenzreservoir in einer Reagenzkartusche verwendet wird. Die Reagenzsipper können zum Beispiel mit einem einzelnen Lumen bereitgestellt sein, das vom distalen zum proximalen Ende durch den rohrförmigen Körper läuft. Das Lumen kann konfiguriert sein, um Fluidkommunikation zwischen der Reagenzkartusche an einem Ende des Sippers und dem Reagenzverteiler am anderen Ende des Sippers bereitzustellen. Wie in der beispielhaften 2B gezeigt, sind die Reagenzsipper 103 und 104 mit dem Verteilerkörper 108 über Anschlüsse 106, die im Verteilerkörper 108 untergebracht sind, gekoppelt.
  • In einigen Ausführungsformen, wie in 2C beispielhaft repräsentiert, ist ein Teilsatz der Reagenzsipper von einer Länge, die kürzer als andere Reagenzsipper ist. Zum Beispiel kann die Länge des Teilsatzes mindestens 1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 oder mindestens 2,0 mm kürzer als die anderen Reagenzsipper sein. Die Verteilung und die Reagenzsipper können in einer Vorrichtung verwendet werden, die einen Hebelmechanismus aufweist, der konfiguriert ist, um eine Reagenzkartusche bidirektional entlang der z-Dimension zu bewegen, sodass die Reagenzsipper in die entsprechenden Gefäße oder Reservoirs in der Reagenzkartusche eingeführt werden. In gewissen Ausführungsformen können die Reagenzgefäße mit Schutzfolien abgedeckt sein. Ein Vorteil des Bereitstellens von Sippern von unterschiedlicher Länge ist daher eine Reduzierung der vom Hebemechanismus erforderlichen Kraft, um eine Folienperforationskraft aufzunehmen, wenn eine Reagenzkartusche mit den Perforationssippern in Kontakt gebracht wird. Der Unterschied in der Sipperlänge kann vorteilhafterweise der Tiefe der Reagenzgefäße in einer Reagenzkartusche entsprechen, sodass jeder Sipper in seinem entsprechenden Reagenzgefäß eine gewünschte Tiefe erreicht, wenn die Sipper und die Kartusche in einer vollständig eingegriffenen Position sind.
  • Die Sipper können aus einem geeigneten Material gebildet sein, das Fluidtransfer durch ein Lumen erlaubt und das mit den durch die Kanäle der in dieser Schrift präsentierten Ausführungsformen des Verteilers transportierten Lösungsmitteln und Flüssigkeiten kompatibel ist. Die Sippers können aus einem einzelnen Rohr gebildet sein. Alternativ oder zusätzlich können ein oder mehrere Sipper aus mehreren Segmenten gefertigt sein, die zusammen einen Sipper von einer gewünschten Länge und einem gewünschten Durchmesser bilden.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst mindestens einer der Reagenzsipper eine nachgiebige Spitze, die konfiguriert ist, um sich zu biegen, wenn die Spitze auf den Boden eines Reagenzgefäßes in einer Reagenzkartusche auftrifft. Durch Biegen oder Verformen erlaubt eine nachgiebige Spitze dem Lumen des Sippers, sich dem Boden des Reagenzgefäßes vollständiger zu nähern oder diesen sogar zu kontaktieren, wodurch das Evakuierungsvolumen im Reagenzgefäß reduziert oder sogar eliminiert wird. Eine nachgiebige Spitze kann speziell für die Aufnahme der Probe oder Reagenzien vorteilhaft sein, wenn kleine Volumen verwendet werden, oder in Situationen, bei denen die Aufnahme der meisten oder sämtlichen Flüssigkeit in einem Reagenzreservoir wünschenswert ist. Der Körper des Sippers, der eine nachgiebige Spitze aufweist, kann vollkommen aus dem gleichen flexiblen Material wie die Spitze gefertigt sein. Alternativ oder zusätzlich kann der Körper des Sippers aus einem anderen Material als die Spitze gefertigt sein. Die nachgiebige Spitze kann aus einem beliebigen geeigneten Material gefertigt sein, sodass die nachgiebige Spitze sich verformen oder nachgeben kann, wenn sie mit dem Boden eines Reagenzreservoirs in Kontakt getrieben wird. Einige geeignete Materialien umfassen polymerische und/oder syntethische Schäume, Gummi, Silikon und/oder Elastomere, einschließlich thermoplastische Polymere, wie etwa Polyurethan.
  • Die in dieser Schrift präsentierten fluidischen Systeme können zum Beispiel auch Pumpen und Ventile umfassen, die selektiv betreibbar sind, um die Fluidkommunikation zwischen den Reservoirs und dem Einlass der Durchflusszelle zu regeln. Wie durch die in 2D gezeigte Verteilereinheit 101 beispielhaft repräsentiert, können die Kanalauslässe auf dem Verteilerkörper 108 konfiguriert sein, um mit entsprechenden Einlassanschlüssen auf dem Ventil 102 verbunden zu werden, sodass jeder fluidische Kanal 107 mit einem Einlassanschluss auf dem Ventil 102 in Fluidkommunikation ist. So können über die fluidischen Kanäle 107 des Verteilerkörpers 108 einer oder mehrere oder jeder der Einlassanschlüsse mit einem Reagenzsipper in Fluidkommunikation sein. Das Ventil 102 kann mit einem gemeinsamen Auslassanschluss 110 konfiguriert sein, der mit einem Einlass von einer oder mehreren Bahnen auf einer Durchflusszelle fluidisch verbunden ist. Alternativ oder zusätzlich 102 kann das Ventil mit einem Abfallanschluss 112 konfiguriert sein, der mit einem oder mehreren Abfallreservoirs 1005 fluidisch verbunden ist.
  • Die in 2A, 2B, 2C und 2D gezeigten Vorrichtungen sind beispielhaft. Weitere beispielhafte Ausführungsformen der Verfahren und Vorrichtung der vorliegenden Offenbarung, die alternativ oder zusätzlich zu dem Beispiel von 2A, 2B, 2C und 2D verwendet werden können, werden unten im weiteren Detail dargelegt.
  • Eine beispielhafte Reagenzkartusche wird in 3A gezeigt. Die in 3A gezeigte Reagenzkartusche 400 kann Gefäße 401 von unterschiedlichen Tiefen entlang der z-Dimension, verglichen mit jenen der Gefäße 402, umfassen. Insbesondere weist die in 3A beispielhaft repräsentierte Reagenzkartusche Gefäße auf, die ausgelegt sind, um die Länge eines entsprechenden Reagenzsippers (nicht gezeigt) aufzunehmen, sodass jeder Sipper in seinem entsprechenden Reagenzgefäß eine gewünschte Tiefe erreicht, wenn die Sipper und die Kartusche in einer vollständig eingegriffenen Position sind. In der in 3A beispielhaft repräsentierten Reagenzkartusche sind die Gefäße reihenförmig oder spaltenförmig entlang der y-Dimension angeordnet, wo sich diese Gefäße 401 an der Außenseite der Reihe oder Spalte entlang der z-Dimension weiter nach unten erstrecken als jene Gefäße 402 an der Innenseite der Reihe oder Spalte. Einige oder alle Gefäße können von unterschiedlichen Tiefen sein. Alternativ oder zusätzlich können einige oder alle der Gefäße von gleicher Tiefe sein. Wenn die Sipper und die Kartusche in einer vollständig eingegriffenen Position sind, kann die Penetrationstiefe einer Sipperspitze (d. h. die Distanz von der Bodenfläche des Gefäßes zum Ende der Sipperspitze) gleich der Penetrationstiefe einer anderen Sipperspitze in einem anderen gegebenen Gefäß in der Reagenzkartusche sein. Die Penetrationstiefe einer Sipperspitze muss nicht die gleiche wie die Penetrationstiefe eines anderen gegebenen Gefäßes in der Reagenzkartusche sein. Wo mindestens einige Reagenzgefäße eine unterschiedliche Gefäßtiefe aufweisen, kann die Gefäßtiefe zum Beispiel mindestens 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 oder mindestens 2,0 mm kürzer als die anderen Reagenzsipper sein. Gleichermaßen kann sich, wenn die Sipper und die Kartusche in einer vollständig eingegriffenen Position sind, die Penetrationstiefe einer Sipperspitze um mindestens 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 oder mindestens 2,0 mm von der Penetrationstiefe einer anderen Sipperspitze in der Reagenzkartusche unterscheiden.
  • Wie in der beispielhaften Reagenzkartusche 400 in 3A gezeigt, umfasst die Reagenzkartusche eine Vielzahl von Reagenzreservoirs 401A, 401B, 402A und 402B. Die Reagenzreservoirs in 3A sind in x- und y-Dimensionen in Reihen angeordnet. In 3A wird auch gezeigt, dass die Kartusche Ausrichtungsschlitze 403 und 404 umfasst, die konfiguriert sind, um mit entsprechenden Ausrichtungsstiften einer Verteilereinheit (nicht gezeigt) in Eingriff zu kommen. Die Kartusche kann auch eine Schutzfolie umfassen, die eine beliebige Anzahl der Reagenzgefäße oder -reservoirs abdeckt, die durch Perforationssipper perforiert werden können, wenn die Kartusche mit den Perforationssippern in Kontakt gebracht wird.
  • Die in dieser Schrift präsentierten Reagenzkartuschen können eine beliebige Anzahl von Reagenzreservoirs oder -gefäßen umfassen. Die Reagenzreservoirs oder -gefäße können in einem beliebigen Format entlang der x- und y-Dimensionen angeordnet werden, um Transport und Lagerung von Reagenzien in der Kartusche zu erleichtern. Alternativ oder zusätzlich können die Reagenzreservoirs oder -gefäße in einem beliebigen Format entlang der x- und y-Dimensionen angeordnet werden, das für die Interaktion mit einem Array von Sipperrohren geeignet ist, die sich entlang der z-Dimension von Anschlüssen im Verteiler nach unten erstrecken. Insbesondere können die Reagenzreservoirs in jedem beliebigen Format angeordnet werden, das für simultanen Eingriff einer Matrix von Reagenzsippern geeignet ist, sodass Flüssigreagenz vom Reagenzreservoir in die Sipper gesaugt werden kann.
  • Nicht alle Reagenzgefäße müssen simultan mit allen Sipperrohren einer Verteilereinheit interagieren. Zum Beispiel kann die Reagenzkartusche einen Teilsatz von einem oder mehreren Reagenzreservoirs oder -gefäßen umfassen, die konfiguriert sind, um in einem nicht interagierenden Zustand zu bleiben, während andere Reservoirs oder Gefäße durch ein Array von Sipperrohren im Eingriff sind. Um ein Beispiel zu nennen, kann eine in dieser Schrift präsentierte Kartusche eine Vielzahl von Waschreservoirs beinhalten, die in einer der Vielzahl von Reagenzreservoirs entsprechenden Konfiguration angeordnet sind, wobei die Waschreservoirs konfiguriert sind, um simultan die Reagenzsipper in Eingriff zu nehmen, wenn die Reagenzsipper nicht mit den Reagenzreservoirs im Eingriff sind, sodass der Waschpuffer von den Waschreservoirs in die Sipper gesaugt werden kann. Eine beispielhafte Ausführungsform wird in 3A präsentiert, die eine Reihe von Reagenzgefäßen 401A zeigt. Die Kartusche umfasst auch eine Reihe von entsprechenden Gefäßen 401B, die die gleiche Ausrichtung in der x-Dimension in Bezug zueinander beibehält, die aber in der y-Dimension von den Gefäßen 401A versetzt sind. Die versetzten Gefäße 401B können zum Beispiel einen Waschpuffer umfassen, der zum Spülen der Sipperrohre und fluidischen Leitungen nach Verwendung einer Kartusche und vor Verwendung einer anderen Kartusche bereitgestellt wird.
  • Alternativ oder zusätzlich können andere Reservoirs, die leer sind, oder Puffer, die Proben oder andere Reagenzien enthalten, auf der Kartusche vorliegen. Die zusätzlichen Reservoirs können, aber müssen nicht mit einem Sipperrohr interagieren. Ein Reservoir kann zum Beispiel konfiguriert sein, um während der Kartuschenverwendung mit Abfall oder Überlaufreagenz oder -puffer gefüllt zu werden. Ein ein solches Reservoir kann zum Beispiel über einen Anschluss zugänglich sein, der nicht mit einem Sipperrohr eine Schnittstelle bildet.
  • Um korrekte Ausrichtung von Kartuschenreservoirs auf entsprechende Sipperrohre zu erleichtern, können in der Kartusche Ausrichtungsschlitze positioniert sein. Zum Beispiel in besonderen Ausführungsformen, wo ein Array von Sipperrohren von einem Satz von Reservoirs entfernt wird und zu einem anderen Satz von Reagenz- oder Waschreservoirs verlagert wird, können Ausrichtungsschlitze in der Kartusche positioniert sein, um korrekte Ausrichtung des Arrays von Reagenzsippern auf einen oder beide Sätze von Reservoirs sicherzustellen. Wie in 3A gezeigt, umfasst die beispielhafte Kartusche Ausrichtungsschlitze 404, die die gleiche Ausrichtung in der x-Dimension beibehalten, die aber in der y-Dimension in Bezug auf den Ausrichtungsschlitz 403 versetzt sind. Eine Kartusche der in dieser Schrift präsentierten Ausführungsformen kann eine beliebige Anzahl von Ausrichtungsschlitzen aufweisen, die geeignete Ausrichtung auf die Merkmale einer fluidischen Einheit bereitstellen. Zum Beispiel kann eine Kartusche 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Ausrichtungsschlitze umfassen, die konfiguriert sind, um entsprechende Ausrichtungsschlitze des fluidischen Systems in Eingriff zu nehmen, sodass Reagenzsipper des fluidischen Systems in Ausrichtung auf die Reagenz- und/oder Waschreservoirs positioniert sind.
  • Ein beispielhaftes Fluidikautomationsmodul (FAM) wird in 3B gezeigt. Das FAM 470 kann eine Hebeeinheit 471 zum Heben und Senken der Reagenzkartusche zum Perforieren und zur Blasenbildung beinhalten. Die Bandeinheit 473 bewegt die Reagenzkartuschenaufnahme 474 während des Kartuschenladens und bewegt die Reagenzkartusche außerhalb der Vorrichtung während des Entladens. Eine Abfallreservoiraufnahme 475 ist auf der Vorderfläche des FAM 470 vorhanden und konfiguriert, um das Abfallreservoir 476 aufzunehmen. Das FAM 470 beinhaltet ferner eine Verteilereinheit 472, die in 2B detailreicher dargelegt wird.
  • Es wird in dieser Schrift eine Detektionsvorrichtung bereitgestellt, die Folgendes aufweist: (a) einen Wagen, der ein oder mehrere Mikrofluorometer umfasst, wobei jedes des einen oder der mehreren Mikrofluorometer ein Objektiv umfasst, das für Weitfeldbilddetektion konfiguriert ist, wobei das eine oder die mehreren Mikrofluorometer positioniert sind, um eine oder mehrere Weitfeldbilder in einer gemeinsamen Ebene aufzunehmen, und wobei jedes der Weitfeldbilder von einem unterschiedlichen Bereich der gemeinsamen Ebene ist; (b) eine Translationsstufe, die konfiguriert ist, um den Wagen in mindestens eine Richtung parallel zur gemeinsamen Ebene zu bewegen; und (c) eine Probestufe, die konfiguriert ist, um ein Substrat in der gemeinsamen Ebene zu halten.
  • Eine Detektionsvorrichtung (oder ein individuelles Mikrofluorometer) der vorliegenden Offenbarung kann verwendet werden, um ein oder mehrere Bilder mit einer Auflösung zu erhalten, die ausreicht, um Merkmale auf einer Mikrometerskala zu unterscheiden. Zum Beispiel kann ein Mikrofluorometer, das in einer Detektionsvorrichtung verwendet wird, eine Auflösung aufweisen, die ausreicht, um Merkmale zu unterscheiden, die um maximal 500 µm, 100 µm, 50 µm, 10 µm, 5 µm, 4 µm, 3 µm, 2 µm oder 1 µm getrennt sind. Eine geringere Auflösung ist ebenfalls möglich, zum Beispiel eine Auflösung, die Merkmale unterscheidet, die um mehr als 500 µm getrennt sind.
  • Eine Detektionsvorrichtung (oder ein individuelles Mikrofluorometer) der vorliegenden Offenbarung ist für Hochauflösungsdetektion von Flächen gut geeignet. Demgemäß sind Arrays, die Merkmale mit durchschnittlichem Abstand im Mikrometerbereich aufweisen, besonders nützliche Substrate. In besonderen Ausführungsformen kann eine Detektionsvorrichtung oder ein Mikrofluorometer verwendet werden, um ein oder mehrere Bilder eines Arrays zu erhalten, das Merkmale mit Mitte-zu-Mitte-Abstand für nächste Nachbarn aufweist, der im Durchschnitt bei oder unter 500 µm, 100 µm, 50 µm, 10 µm, 5 µm, 4 µm, 3 µm, 2 µm oder 1 µm liegt. In vielen Ausführungsformen sind die Merkmale eines Arrays nicht zusammenhängend, wobei sie zum Beispiel um weniger als 100 µm, 50 µm, 10 µm, 5 µm, 1 µm, oder 0,5 µm getrennt sind. Die Merkmale müssen jedoch nicht getrennt sein. Stattdessen können einige oder alle der Merkmale eines Arrays miteinander zusammenhängen.
  • Es können beliebige einer Vielfalt von Arrays (auch als „Mikroarrays“ bezeichnet), die auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden. Ein typisches Array enthält Merkmale, die jeweils eine individuelle Sonde oder eine Population von Sonden aufweisen. Im letzteren Fall ist die Population von Sonden an jeder Stelle typischerweise homogen mit einer einzelnen Sondenart. Zum Beispiel im Fall eines Nukleinsäurearrays kann jedes Merkmal mehrere Nukleinsäurearten aufweisen, die jeweils eine gemeinsame Sequenz aufweisen. In einigen Ausführungsformen können die Populationen an jedem Merkmal eines Array jedoch heterogen sein. Gleichermaßen können Proteinarrays Merkmale mit einem einzelnen Protein oder einer Population von Proteinen aufweisen, die typischerweise, aber nicht immer, die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen. Die Sonden können an der Oberfläche eines Array angebracht werden, zum Beispiel über kovalente Verknüpfung der Sonden mit der Oberfläche oder über nicht-kovalente Interaktion(en) der Sonden mit der Oberfläche. In einigen Ausführungsformen können Sonden, wie etwa Nukleinsäuremoleküle, über eine Gellage an einer Oberfläche angebracht werden, wie zum Beispiel in US 2011/0059865 A1 beschrieben, das in dieser Schrift durch Bezugnahme einbezogen ist.
  • Beispielhafte Arrays umfassen, ohne Beschränkung, ein BeadChip-Array, erhältlich von Illumina®, Inc. (San Diego, CA) oder andere, wie etwa jene, wo Sonden an Kügelchen angebracht sind, die auf einer Oberfläche vorliegen (z. B. Kügelchen in Gefäßen auf einer Oberfläche), wie jene, die in US-Patent Nr. 6,266,459 ; 6,355,431 ; 6,770,441 ; 6,859,570 ; oder 7,622,294 ; oder PCT-Publikation Nr. WO 00/63437 beschrieben werden, welche jeweils in dieser Schrift durch Bezugnahme einbezogen sind. Weitere Beispiele von kommerziell erhältlichen Mikroarrays, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel ein Affymetrix®-GeneChip®-Mikroarray oder anderes Mikroarray, synthetisiert in Übereinstimmung mit Technikern, die gelegentlich als VLSIPSTM (Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis)-Technologien bezeichnet werden. Es kann auch ein Punkt-Mikroarray in einer Vorrichtung oder einem System gemäß einigen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden. Ein beispielhaftes Punkt-Mikroarray ist ein CodeLinkTM -Array, das von Amersham Biosciences erhältlich ist. Ein anderes Mikroarray, das nützlich ist, ist eines, das unter Verwendung von Tintenstrahldruckverfahren, wie etwa SurePrintTM Technology, erhältlich von Agilent Technologies, hergestellt wird.
  • Andere nützliche Arrays umfassen jene, die in Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen verwendet werden. Zum Beispiel sind Arrays, die Amplicons von genomischen Fragmenten (oft als Cluster bezeichnet) aufweisen, besonders nützlich, wie jene, die in Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008), WO 04/018497 ; US 7,057,026 ; WO 91/06678 ; WO 07/123744 ; US 7,329,492 ; US 7,211,414 ; US 7,315,019 ; US 7,405,281 , oder US 2008/0108082 beschrieben werden, welche jeweils in dieser Schrift durch Bezugnahme einbezogen sind. Ein weiterer Typ eines Arrays, das für Nukleinsäuresequenzierung nützlich ist, ist ein Array aus Partikeln, die von einer Emulsion-PCR-Technik produziert werden. Beispiele werden in Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8817-8822 (2003), WO 05/010145 , US 2005/0130173 oder US 2005/0064460 beschrieben, welche jeweils in dieser Schrift durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einbezogen sind. Obwohl die obigen Arrays im Kontext von Sequenzierungsanwendungen beschrieben wurden, versteht es sich, dass die Arrays in anderen Ausführungsformen verwendet werden können, einschließlich zum Beispiel jene, die keine Sequenzierungstechnik umfassen.
  • Ob für die Detektion eines Arrays oder einer anderen Probe konfiguriert, können ein oder mehrere Mikrofluorometer, die in einer Detektionsvorrichtung vorhanden sind, für Weitfelddetektion konfiguriert sein. Der Felddurchmesser für ein individuelles Mikrofluorometer kann zum Beispiel mindestens 0,5 mm, 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm oder größer sein. Durch Auswahl von passenden optischen Komponenten kann der Felddurchmesser auch auf einen maximalen Bereich beschränkt werden, als solches kann der Felddurchmesser zum Beispiel nicht größer als 5 mm, 4 mm, 3 mm, 2 mm oder 1 mm sein. Demgemäß kann in einigen Ausführungsformen ein durch ein individuelles 2Mikrofluorometer erhaltenes Bild einen Bereich aufweisen, der im Bereich von 0,25 mm bis 25 mm2 liegt.
  • Zusätzlich zu Konfiguration für Weitfelddetektion kann ein Mikrofluorometer konfiguriert sein, um eine numerische Apertur (NA) aufzuweisen, die größer als 0,2 ist. Zum Beispiel kann die NA eines in einem Mikrofluorometer der vorliegenden Offenbarung verwendeten Objektivs mindestens 0,2, 0,3, 0,4 oder 0,5 sein. Alternativ oder zusätzlich kann es wünschenswert sein, die NA des Objektivs zu beschränken, sodass sie nicht größer als 0,8, 0,7, 0,6 oder 0,5 ist. Die in dieser Schrift dargelegten Verfahren und dargelegte Vorrichtung sind besonders nützlich, wenn die Detektion durch ein Objektiv auftritt, das eine NA zwischen 0,2 und 0,5 aufweist.
  • In Arraydetektionausführungsformen kann eine Detektionsvorrichtung (oder ein individuelles Mikrofluorometer) konfiguriert sein, um ein digitales Bild des Arrays zu erhalten. Typischerweise wird jedes Pixel der digitalen Detektionsvorrichtung (oder des individuellen Mikrofluorometers) in einer gegebenen Bilderfassung Signale von nicht mehr als einem einzelnen Merkmal sammeln. Diese Konfiguration minimiert ungewolltes „Übersprechen“ zwischen Merkmalen im Bild. Die Anzahl von Pixeln, die Signale von jedem Merkmal detektieren, kann basierend auf der Größe und Form der abgebildeten Merkmale und basierend auf der Konfiguration der digitalen Detektionsvorrichtung (oder des individuellen Mikrofluorometers) angepasst werden. Zum Beispiel kann jedes Merkmal in einem gegebenen Bild durch nicht mehr als etwa 16 Pixel, 9 Pixel, 4 Pixel oder 1 Pixel detektiert werden. In besonderen Ausführungsformen kann jedes Bild durchschnittlich 6,5 Pixel pro Merkmal, 4,7 Pixel pro Merkmal oder 1 Pixel pro Merkmal benutzen. Die Anzahl der pro Merkmal verwendeten Pixel kann reduziert werden, zum Beispiel durch Reduzieren der Variabilität in der Position von Merkmalen im Muster des Arrays und und Einengen der Toleranz für die Ausrichtung der Detektionsvorrichtung auf das Array. Am Beispiel eines digitalen Detektors, der konfiguriert ist, um weniger als 4 Pixel pro Merkmal zu verwenden, lässt sich feststellen, dass die Bildqualität durch Verwendung eines Arrays von geordneten Nukleinsäuremerkmalen anstelle eines Arrays von unregelmäßig verteilten Nukleinsäureclustern verbessert werden kann.
  • Es versteht sich, dass eine Detektionsvorrichtung, die einen oder mehrere Mikrofluorometer aufweist, einen Bereich einer gemeinsamen Ebene detektieren kann, der ungefähr der Anzahl von Mikrofluorometern multipliziert mit dem von jedem Mikrofluorometer detektierten Weitfeldbereich entspricht. Die Bereiche müssen nicht zusammenhängend sein. Zum Beispiel können 2 oder mehrere Mikrofluorometer positioniert sein, um diskrete Regionen einer gemeinsamen Ebene zu detektieren, die durch einen undetektierten Bereich getrennt sind. Falls jedoch gewünscht, können mehrere Mikrofluorometer positioniert werden, um Bereiche zu detektieren, die zusammenhängend, aber nicht überlappend sind. In alternativen Ausführungsformen kann eine Detektionsvorrichtung, die einen oder mehrere Mikrofluorometer aufweist, einen Bereich einer gemeinsamen Ebene detektieren, der im Wesentlichen geringer ist als die Anzahl von Mikrofluorometern multipliziert mit dem von jedem Mikrofluorometer detektierten Weitfeldbereich. Dies kann zum Beispiel resultieren, wenn mehrere Mikrofluorometer positioniert sind, um Bereiche zu detektieren, die mindestens eine teilweise Überlappung aufweisen. Wie an anderer Stelle in dieser Schrift im weiteren Detail dargelegt, müssen mehrere Bilder nicht in einem Format erfasst werden, das für die Rekonstruktion eines vollständigen Bildes eines Arrays oder einer anderen gemeinsamen Ebene, die detektiert worden ist, verwendet wird oder diese überhaupt unterstützt.
  • Die Detektionsvorrichtung kann eine beliebige der Detektionsvorrichtungskonfigurationen und Sequenzierungsverfahren verwenden, die in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 13/766,413, eingereicht am 13. Februar 2013 und mit dem Titel „INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING“ dargelegt werden, deren Inhalt in dieser Schrift unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit einbezogen ist.
  • Die in dieser Schrift präsentierte beispielhafte Detektionsvorrichtung wird mit einem einzelnen Mikrofluorometer gezeigt. In anderen Ausführungsformen kann die Detektionsvorrichtung zwei oder mehrere Mikrofluorometer aufweisen, in einer beliebigen von vielen verschiedenen Konfigurationen. Es ist zu bemerken, dass ein einzelnes Mikrofluorometer aus vielen verschiedenen Standpunkten vorteilhaft sein kann. Erstens stellt das einzelne Mikrofluorometer Vorteile aus dem Standpunkt der Produktions- und Wartungskosten bereit, speziell wenn andere Konfigurationen eine Kalibrierung von jedem individuellen Mikrofluorometer erfordern. In der in dieser Schrift präsentierten Konfiguration mit dem einzelnen Mikrofluorometer kann der optische Lesekopf in einer intakten Einheit präsentiert sein, die in die Detektionsvorrichtung in einem modularen Ansatz einbezogen werden kann, wodurch die Herstellung vereinfacht und Kosten weiter reduziert werden. Diese Kosteneinsparungen können an den Endanwender weitergeleitet werden, wodurch Anwendern Zugang zu einer großen Anzahl von Nukleinsäurearraydetektionsanwendungen gestattet wird. Ein weiterer Vorteil der in dieser Schrift präsentierten Konfiguration mit dem einzelnen Mikrofluorometer kommt von der relativen Einfachheit der Interaktionen mit den fluidischen Komponenten des Systems. Zum Beispiel kann eine im System verwendete Durchflusszelle mit einem einzelnen Durchflusskanal konfiguriert sein, wodurch die Anforderungen für mehrere Ventile und Pumpen, die in Systemen nach dem Stand der Technik vorzufinden sind, reduziert werden. Während Durchflusszellen, die 2 oder mehr Durchflusskanäle aufweisen, ein Wechseln des Fluidflusses zwischen unterschiedlichen Durchflusskanälen erfordern können, kann ein einzelner Durchflusskanal eine zweckgebundene Versorgungsleitung in Fluidkommunikation mit einem einzelnen Ventil aufweisen. Zusätzlich können fluidische Verteilerkörper verwendet werden, die eine einzelne Lage von Kanälen aufweisen, wodurch wiederum die Konstruktion und Herstellung des fluidischen Systems vereinfacht und Kosten für die Fertigung und Wartung des Systems reduziert werden.
  • Eine beispielhafte optische Auslegung eines Mikrofluorometers 500 wird in 4A gezeigt. Das Mikrofluorometer 500 ist auf eine Durchflusszelle 600 gerichtet, die eine obere Lage 671 und eine untere Lage 673 aufweist, die durch einen fluidgefüllten Kanal 675 getrennt sind. In der gezeigten Konfiguration ist die obere Lage 671 optisch transparent und das Mikrofluorometer 500 ist auf einen Bereich 676 auf der Innenfläche 672 der oberen Lage 671 fokussiert. In einer alternativen Konfiguration kann das Mikrofluorometer 500 auf die Innenfläche 674 der unteren Lage 673 fokussiert sein. Eine oder beide der Flächen können Arraymerkmale umfassen, die durch das Mikrofluorometer 500 zu detektieren sind.
  • Das Mikrofluorometer 500 umfasst ein Objektiv 501, das konfiguriert ist, um Anregungsstrahlung aus einer Strahlungsquelle 502 zur Durchflusszelle 600 zu richten und Emission aus der Durchflusszelle 600 an einen Detektor 508 zu richten. In der beispielhaften Auslegung geht Anregungsstrahlung auf ihrem Weg zur Durchflusszelle 600 von der Strahlungsquelle 502 durch eine Linse 505, dann durch einen Strahlensplitter 506 und dann durch das Objektiv. In der gezeigten Ausführungsform umfasst die Strahlungsquelle zwei lichtemittierende Dioden (LEDs) 503 und 504, die Strahlung mit voneinander unterschiedlichen Wellenlängen produzieren. Die Emissionsstrahlung von der Durchflusszelle 600 wird durch das Objektiv 501 eingefangen und vom Strahlensplitter durch Aufbereitungsoptik 507 und zum Detektor 508 (z. B. einem CMOS-Sensor) reflektiert. Der Strahlensplitter 506 fungiert dahingehend, dass er die Emissionsstrahlung in eine Richtung richtet, die zum Emissionsstrahlungsweg orthogonal ist. Die Position des Objektivs kann in der z-Dimension bewegt werden, um den Fokus des Mikrofluorometers zu ändern. Das Mikrofluorometer 500 kann in der y-Richtung hin und her bewegt werden, um Bilder von mehreren Bereichen der Innenfläche 672 der oberen Lage 671 der Durchflusszelle 600 einzufangen.
  • 4B zeigt eine Explosionsansicht eines beispielhaften Mikrofluorometers zum Zweck des Demonstrierens der funktionalen Anordnung für verschiedene optische Komponenten. Es werden zwei Anregungsquellen gezeigt, einschließlich einem grünen LED (LEDG) und einem roten LED (LEDR). Anregungslicht geht von jedem durch eine grüne LED-Sammellinse (L6) bzw. eine rote LED-Sammellinse (L7). Die grüne Anregungsstrahlung geht von der grünen LED-Sammellinse (L6) zur Kombinator-Dichroic (F5), die die grüne Anregungsstrahlung durch einen Anregungsfilter (F2) reflektiert, dann durch eine LED-Feldlinse (L8) und einen Laserdiodenstrahlensplitter (F3), dann durch einen Anregungsfeldstopp (FS), dann durch eine Anregungsschutzlinsengruppe L2 zu einer Anregungs-/Emission-Dichroic (F4), die die grüne Anregungsstrahlung durch eine Objektivlinsengruppe (L4) zur Oberfläche einer Durchflusszelle (FC) reflektiert. Ein LED-Klappspiegel (M1) reflektiert die rote Anregungsstrahlung an eine Kombinator-Dichroic (F5), wonach die rote Anregungsstrahlung dem gleichen Weg wie die grüne Anregungsstrahlung zur Oberfläche der Durchflusszelle (FC) folgt. Wie im Bild gezeigt, wird das Fokussieren durch Bewegen der translatierenden Objektivlinsengruppe (L4) nach oben und unten (d. h. entlang der z-Dimension) aktuiert. Emission von der Oberfläche der Durchflusszelle (FC) geht durch die translatierende Objektivlinsengruppe (L4) zurück zur Anregungs-/Emission-Dichroic (F4), welche die Anregungsstrahlung zur Emissionsschutzlinsengruppe (L1), durch zum Emissionsfilter und dann zum CMOS-Bildsensor (S1) leitet. Eine Laserdiode (LD) wird auch über eine Laserdiodenkopplungslinsengruppe (L5) zum Laserdiodenstrahlensplitter (F3) gerichtet, welcher die Laserdiodenstrahlung durch den Anregungsfeldstopp (FS), die Anregungsschutzlinsengruppe (L2), die Anregungs-/Emission-Dichroic (F4), Objektivlinsengruppe (L4) zur Durchflusszelle (FC) reflektiert. Eine LED-Wärmesenke (HS) ist über dem grünen LED (LEDG) und roten LED (LEDR) angeordnet.
  • 4C zeigt eine beispielhafte Ausführungsform eines einzelnen Kameramoduls, einschließlich Laserdiode (LD) für Autofokussystem, CMOS-Bildsensor (S1) und Z-Stufe-Schwingspulenmotor zum Anpassen der Objektivlinse (L4). LEDG und LEDR werden in dieser Ansicht nicht gezeigt.
  • Wie durch die beispielhaften Ausführungsformen von 4A, 4B und 4C demonstriert, kann jedes der Mikrofluorometer einen Strahlensplitter und einen Detektor umfassen, wobei der Strahlensplitter positioniert ist, um Anregungsstrahlung aus einer Anregungsstrahlungsquelle an das Objektiv zu richten und um Emission aus dem Objektiv zum Detektor zu richten. Wie in den Figuren gezeigt, kann jedes Mikrofluorometer optional eine Anregungsstrahlungsquelle, wie etwa ein LED, umfassen. In diesem Fall kann jedes Mikrofluorometer eine zweckgebundene Strahlungsquelle umfassen, sodass der Lesekopf mehrere Strahlungsquellen umfasst, die jeweils in individuelle Mikrofluorometer getrennt sind. In einigen Ausführungsformen können zwei oder mehrere Mikrofluorometer Anregungsstrahlung von einer gemeinsamen Strahlungsquelle empfangen. Als solches können sich die zwei oder mehr Mikrofluorometer eine Strahlungsquelle teilen. In einer beispielhaften Konfiguration kann eine einzelne Strahlungsquelle Strahlung an einen Strahlensplitter richten, der positioniert ist, um die Anregungsstrahlung in zwei oder mehrere Strahlen zu trennen und die Strahlen an zwei oder mehrere entsprechende Mikrofluorometer zu richten. Zusätzlich oder alternativ kann Anregungsstrahlung von einer Strahlungsquelle über eine oder mehrere optische Fasern an ein, zwei oder mehrere Mikrofluorometer gerichtet werden.
  • Es versteht sich, dass die in den Figuren gezeigten bestimmten Komponenten beispielhaft sind und durch Komponenten mit ähnlicher Funktion ersetzt werden können. Zum Beispiel kann jede einer Vielfalt von Strahlungsquellen anstatt einem LED verwendet werden. Besonders nützliche Strahlungsquellen sind Bogenlampen, Laser, Halbleiterlichtquellen (SLSs) oder Laserdioden. LEDs können zum Beispiel von Luminus (Billerica, Mass) gekauft werden. Gleichermaßen sind verschiedene Detektoren nützlich, einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen Sensor mit ladungsgekoppelter Vorrichtung (Charge-Coupled Device, CCD); Photovervielfacherröhren (PhotoMultiplier Tubes, PMTs); oder Sensor mit komplementärem Metalloxid-Halbleiter (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor, CMOS). Ein besonders nützlicher Detektor ist ein 5-Megapixel-CMOS-Sensor (MT9P031), der von Aptina Imaging (San Jose, CA) erhältlich ist.
  • 4A, 4B und 4C stellen beispielhafte Ausführungsformen eines Mikrofluorometers bereit, der zwei Anregungsquellen umfasst. Diese Konfiguration ist für das Detektieren von mindestens zwei Fluorophoren nützlich, die jeweils mit unterschiedlichen Wellenlängen angeregt werden. Falls gewünscht, kann ein Mikrofluorometer konfiguriert sein, um mehr als zwei Anregungsquellen zu umfassen. Zum Beispiel kann ein Mikrofluorometer 2, 3, 4 oder mehr unterschiedliche einige Anregungsquellen (d. h. Quellen, die voneinander unterschiedliche Wellenlängen produzieren) umfassen. Alternativ oder zusätzlich können Strahlensplitter und optische Fasern verwendet werden, um den Bereich der von einer individuellen Strahlungsquelle erhältlichen Anregungswellenlängen zu erweitern. Eine ähnliche Verwendung von mehreren Strahlungsquellen und/oder optischen Filtern von geteilten Anregungsstrahlen kann für Ausführungsformen verwendet werden, bei denen sich mehrere Mikrofluorometer die Anregung von einer oder mehreren Strahlungsquellen teilen. Wie an anderer Stelle in dieser Schrift im weiteren Detail dargelegt, ist die Verfügbarkeit von mehreren Anregungswellenlängen besonders nützlich für Sequenzierungsanwendungen, die verschiedene unterschiedliche Fluorophormarkierungen benutzen.
  • Das Mikrofluorometer der beispielhaften Ausführungsform ist eine Komponente eines Abbildungsmoduls. 5A präsentiert eine Vorderansicht einer beispielhaften Ausführungsform. Es wird ein Abbildungsmodul 700 gezeigt, das sich aus einer Kameraeinheit 701, XY-Stufe 702 und einem Durchflusszellen-Rastklemmenmodul 900, auf fixierter Basis 704 montiert, zusammensetzt. Die Kameraeinheit beinhaltet die Wärmesenke 711 über dem Kameragehäuse 705, das wiederum an der fixierten Basis 704 montiert ist und eine Einhausung für die untere Hälfte des in 4A, 4B und 4C präsentierten Mikrofluorometers bereitstellt. Zwei Motoren stellen individuell die Bewegung der X-Stufe und Y-Stufe bereit. Der X-Motor 706 treibt die X-Leitschraube 707, welche die Kameraeinheit 701 wie angegeben entlang der X-Achse bewegt. Der Y-Motor (712, nicht gezeigt) treibt die Bewegung der Y-Leitschraube 708, welche das Durchflusszellen-Rastklemmenmodul 900 wie angegeben entlang der Y-Achse auf der Führungsschiene 709 bewegt. Das Durchflusszellen-Rastklemmenmodul 900 kann auch ein RFID-Modul 710 zum Detektieren von RFID-codierten Durchflusszellen beinhalten.
  • 5B zeigt eine Seitenansicht des Abbildungsmoduls 700. Gezeigt wird ein Y-Motor 712, eine Y-Leitschraube 708, eine Führungsschiene 709 und eine X-Leitschraube 707.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform wird eine fluidische Vorrichtung zum Analysieren von Proben bereitgestellt. Die fluidische Vorrichtung umfasst eine Durchflusszelle, die Einlass- und Auslassanschlüsse und einen Durchflusskanal, der sich dazwischen erstreckt, aufweist. Die Durchflusszelle ist konfiguriert, um eine Probe von Interesse zu halten. Die fluidische Vorrichtung umfasst auch ein Gehäuse, das einen Aufnahmeraum aufweist, der konfiguriert ist, um die Durchflusszelle aufzunehmen. Der Aufnahmeraum ist bemessen und geformt, um der Durchflusszelle zu gestatten, relativ zum Gehäuse zu schweben. Die fluidische Vorrichtung umfasst auch eine Dichtung, die mit dem Gehäuse gekoppelt ist. Die Dichtung weist Einlass- und Auslassgänge auf und beinhaltet ein kompressibles Material. Die Dichtung ist relativ zum Aufnahmeraum positioniert, sodass die Einlass- und Auslassanschlüsse der Durchflusszelle ungefähr auf die Einlass- bzw. Auslassgänge der Dichtung ausgerichtet sind.
  • In einer anderen Ausführungsform ist eine entfernbare Kartusche bereitgestellt, die konfiguriert ist, um eine Durchflusszelle für das Abbilden zu halten und ihr Positionieren zu erleichtern. Die Kartusche umfasst ein entfernbares Gehäuse, das einen Aufnahmeraum aufweist, der konfiguriert ist, um die Durchflusszelle im Wesentlichen in einer Objektebene zu halten. Das Gehäuse umfasst ein Paar Gehäuseseiten, die in entgegengesetzte Richtungen weisen. Der Aufnahmeraum erstreckt sich entlang mindestens einer der Gehäuseseiten, sodass die Durchflusszelle durch die mindestens eine der Gehäuseseiten gegenüber einer Außenseite des Gehäuses exponiert ist. Die Kartusche umfasst auch ein Abdeckungselement, das mit dem Gehäuse gekoppelt ist und eine Dichtung umfasst. Die Dichtung weist Einlass- und Auslassgänge auf und beinhaltet ein kompressibles Material. Die Dichtung ist konfiguriert, um über einem exponierten Abschnitt der Durchflusszelle montiert zu werden, wenn die Durchflusszelle durch das Gehäuse gehalten wird.
  • Beispielhafte fluidische Vorrichtungen, einschließlich Durchflusszellen, die für die Verwendung mit den in dieser Schrift beschriebenen Vorrichtungen geeignet sind, werden im weiteren Detail in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 13/766,413, eingereicht am 13. Februar 2013 und mit dem Titel „INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING“, dargelegt, deren Inhalt in dieser Schrift unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit einbezogen ist.
  • 6 illustriert eine fluidische Vorrichtung 800, die in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform gebildet ist. Wie in 6 gezeigt, umfasst die fluidische Vorrichtung 800 eine Kartusche (oder einen Durchflusszellenträger) 802 und die Durchflusszelle 850. Die Kartusche 802 ist konfiguriert, um die Durchflusszelle 850 zu halten und das Ausrichten der Durchflusszelle 850 für eine Abbildungssitzung zu erleichtern.
  • In einigen Ausführungsformen können die fluidische Vorrichtung 800 und die Kartusche 802 entfernbar sein, sodass die Kartusche 802 von einer Person oder Maschine aus einem Abbildungssystem (nicht gezeigt) ohne Beschädigung an der fluidischen Vorrichtung 800 oder Kartusche 802 entfernt werden kann. Zum Beispiel kann die Kartusche 802 konfiguriert sein, um ohne Beschädigen der Kartusche 802 oder Ungeeignetmachen der Kartusche 802 für ihren beabsichtigten Zweck wiederholt in das Abbildungssystem eingeführt und aus diesem entfernt zu werden. In einigen Ausführungsformen können die fluidische Vorrichtung 800 und die Kartusche 802 bemessen und geformt sein, um von einer Person mit der Hand gehalten zu werden. Des Weiteren können die fluidische Vorrichtung 800 und die Kartusche 802 bemessen und geformt sein, um von einem automatisierten System getragen zu werden.
  • Wie in 6 gezeigt, kann die Kartusche 802 ein Gehäuse oder einen Trägerrahmen 804 und ein Abdeckungselement 806, das mit dem Gehäuse 804 gekoppelt ist, umfassen. In 6 wird auch gezeigt, dass die fluidische Vorrichtung 800 ein Vorrichtungsfenster aufweisen kann, das vollständig durch die Kartusche 802 entlang der Z-Achse durchgeht. Mit Bezug auf 6 kann das Abdeckungselement 806 einen Abdeckungskörper 840 und eine Dichtung 842 umfassen, die miteinander gekoppelt sind. Die Dichtung 842 umfasst Einlass- und Auslassgänge 846 und 844, die nahe zueinander liegen. In der illustrierten Ausführungsform sind das Abdeckungselement 840 und die Dichtung 842 zusammen zu einer einheitlichen Struktur geformt. Wenn geformt, können das Abdeckungselement 840 und die Dichtung 842 unterschiedliche kompressible Eigenschaften aufweisen. Zum Beispiel kann die Dichtung 842 in besonderen Ausführungsformen ein Material beinhalten, das kompressibler als das Material des Abdeckungskörpers 840 ist. In alternativen Ausführungsformen können jedoch der Abdeckungskörper 840 und die Dichtung 842 getrennte Teile sein, die miteinander gekoppelt sind (z. B. mechanisch oder unter Verwendung eines Klebstoffs). In anderen Ausführungsformen können der Abdeckungskörper 840 und die Dichtung 842 unterschiedliche Abschnitte oder Regionen einer einzelnen kontinuierlichen Struktur sein.
  • Das Abdeckungselement 806 kann mit dem Gehäuse 804 beweglich gekoppelt sein. Das Abdeckungselement 806 kann zum Beispiel mit dem Basiselement 826 des Gehäuses 804 drehbar gekoppelt sein. Das Gehäuse 804 kann einen Kartuschenhohlraum definieren, der zugänglich ist, wenn das Abdeckungselement 806 in der gelösten Position ist. In einigen Ausführungsformen kann ein Identifizierungssender im Kartuschenhohlraum positioniert sein. Der Identifizierungssender ist konfiguriert, um Informationen über die Durchflusszelle 850 an einen Leser zu kommunizieren. Der Identifizierungssender kann zum Beispiel ein RFID-Tag sein. Die vom Identifizierungssender bereitgestellten Informationen können zum Beispiel die Probe in der Durchflusszelle 850, eine Losnummer der Durchflusszelle oder Probe, ein Datum der Herstellung und/oder das durchzuführende Assayprotokoll, wenn die Durchflusszelle 850 in das Abbildungssystem eingeführt ist, identifizieren. Der Identifizierungssender kann außerdem andere Informationen kommunizieren.
  • In 7A wird ein Durchflusszellen-Rastklemmenmodul (FCLM) 900 (nachstehend bezeichnet als Rastklemmenmodul) gezeigt, dass direkt auf der Y-Platte der XY-Stufe 702 montiert ist. Die Durchflusszellen-Rastklemmenabdeckung 901 hält die Durchflusszelle 800 und richtet sie auf die Kamera im Mikrofluorometer aus. Innerhalb der Klemmenabdeckung 901 ist der Verteiler 902 mit Einlass- und Auslassanschlüssen 944, 946 konfiguriert, um mit den Positionen von Einlassgang 846 und Auslassgang 844 in der Dichtung des Durchflusszellengehäuses zusammengepasst zu werden. Ein Heizblock 903 ist auf der Y-Platte montiert und stellt für die Durchflusszelle Heizung bereit, um Chemie zu ermöglichen. Die Riegeltaste 904 kann gedrückt werden, um die Klemmenabdeckung 901 zu öffnen.
  • 7B zeigt eine Schnittansicht des Rastklemmenmoduls 900, die den direkt auf der Abbildungsmodul-Y-Platte 702 montierten Heizblock 903 zeigt. 7C zeigt das Rastklemmenmodul 900 mit der in Position montierten Durchflusszelle 850. Die Durchflusszellen-Datumskanten 807 und 808 sind gegen einen anderen Satz Spannstifte 907 und 908, montiert am Heizblock, vorgespannt. Der federbelastete Hebel 909 spannt die Durchflusszelle 850 gegen die Heizblock-Spannstifte 907 und 908 vor. Wie gezeigt, ist die Durchflusszelle 850 in X- und Y-Positionen gegen die Bezugsstifte und in Z-Position gegen die Heizblockfläche vorgespannt. Das Durchflusszellen-Klemmenmodul 900 stellt eine Dichtung für Fluidik bereit, wobei negativer und positiver Druck in der Fluidikverbindung zwischen dem FAM und der Durchflusszellendichtung unterstützt wird.
  • Die in 7A, 7B und 7C gezeigten Ausführungsformen sind beispielhaft. Weitere beispielhafte Ausführungsformen der Verfahren und Vorrichtung der vorliegenden Offenbarung, die alternativ oder zusätzlich zu dem Beispiel von 7A, 7B und 7C verwendet werden können, werden in weiteren Detail in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 13/766,413, eingereicht am 13. Februar 2013 und mit dem Titel „INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING“, dargelegt, deren Inhalt in dieser Schrift unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit einbezogen ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen kann ein fluidisches System konfiguriert sein, um die Wiederverwendung von einem oder mehreren Reagenzien zu erlauben. Zum Beispiel kann das fluidische System konfiguriert sein, um ein Reagenz an eine Durchflusszelle zu liefern, dann das Reagenz aus der Durchflusszelle zu entfernen und dann das Reagenz wieder in die Durchflusszelle einzuführen. Eine Konfiguration wird in der Vorrichtung und den Verfahren beispielhaft präsentiert, die in der US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 14/453,868, eingereicht am 7. August 2014 und mit dem Titel „FLUIDIC SYSTEM FOR REAGENT DELIVERY TO A FLOW CELL“, dargelegt werden, deren Inhalt in dieser Schrift unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit einbezogen ist.
  • Ausführungsformen der vorliegenden fluidischen Systeme und Verfahren finden besondere Verwendung für Nukleinsäuresequenzierungstechniken. Zum Beispiel sind die Sequenzierung-nach-Synthese-Protokolle (SBS-Protokolle) besonders anwendbar. Bei der SBS wird die Erweiterung eines Nukleinsäureprimers entlang einer Nukleinsäurevorlage überwacht, um die Sequenz der Nukleotide in der Vorlage zu bestimmen. Der zugrundeliegende chemische Prozess kann Polymerisation (z. B als durch ein Polymeraseenzym katalysiert) oder Ligation (z. B als durch ein Ligaseenzym katalysiert) sein. In einer besonderen polymerasebasierten SBS-Ausführungsform werden fluoreszent markierte Nukleotide einem Primer auf eine vorlagenabhängige Weise hinzugefügt (wodurch der Primer erweitert wird), sodass die Detektion der Reihenfolge und des Typs der dem Primer hinzugefügten Nukleotide verwendet werden kann, um die Sequenz der Vorlage zu bestimmen. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Vorlagen kann einer SBS-Technik auf einer Oberfläche unter Bedingungen unterzogen werden, wo für unterschiedliche Vorlagen auftretende Ereignisse unterschieden werden können. Zum Beispiel können die Vorlagen auf der Oberfläche eines Arrays vorliegen, sodass die unterschiedlichen Vorlagen voneinander räumlich unterschieden werden können. Typischerweise treten die Vorlagen an Merkmalen auf, die jeweils mehrere Kopien der gleichen Vorlage (gelegentlich „Cluster“ oder „Kolonien“ genannt) aufweisen. Es ist jedoch auch möglich, SBS an Arrays durchzuführen, wo jedes Merkmal ein einzelnes Vorlagenmolekül vorliegen hat, sodass einzelne Vorlagenmoleküle (gelegentlich „Einzelmolekülarrays“ genannt) voneinander auflösbar sind.
  • Durchflusszellen stellen ein praktisches Substrat zum Einhausen eines Arrays von Nukleinsäuren bereit. Durchflusszellen sind für Sequenzierungstechniken praktisch, da die Techniken typischerweise wiederholte Lieferung von Reagenzien in Zyklen beinhaltet. Um zum Beispiel einen ersten SBS-Zyklus zu initiieren, können ein oder mehrere markierte Nukleotide, DNA-Polymerase etc., in eine/durch eine Durchflusszelle strömen gelassen werden, die ein Array von Nukleinsäurevorlagen beherbergt. Jene Merkmale, wo Primererweiterung bewirkt, dass ein markiertes Nukleotid einbezogen wird, können zum Beispiel unter Verwendung der in dieser Schrift dargelegten Verfahren oder Vorrichtung detektiert werden. Optional können die Nukleotide ferner eine reversible Terminationseigenschaft umfassen, welche weitere Primererweiterung terminiert, nachdem einem Primer ein Nukleotid hinzugefügt worden ist. Zum Beispiel kann ein Nukleotidanalog, das einen reversiblen Terminatorrest aufweist, einem Primer hinzugefügt werden, sodass keine anschließende Erweiterung auftreten kann, bis ein Entblockungsmittel geliefert wird, um den Rest zu entfernen. Für Ausführungsformen, die reversible Termination verwenden, kann daher ein Entblockungsmittel an die Durchflusszelle geliefert werden (vor oder nach dem Auftreten der Detektion). Waschgänge können zwischen den verschiedenen Lieferschritten ausgeführt werden. Der Zyklus kann dann n Mal wiederholt werden, um den Primer um n Nukleotide zu erweitern, wodurch eine Sequenz mit der Länge n detektiert wird. Beispielhafte Sequenzierungstechniken werden zum Beispiel in Bentley et al., Nature 456: 53–59 (2008), WO 04/018497 ; US 7,057,026 ; WO 91/06678 ; WO 07/123744 ; US 7,329,492 ; US 7,211,414 ; US 7,315,019 ; US 7,405,281 und US 2008/0108082 beschrieben, welche jeweils in dieser Schrift durch Bezugnahme einbezogen sind.
  • Für den Nukleotidlieferschritt eines SBS-Zyklus kann entweder jeweils ein einzelner Typ von Nukleotid geliefert werden oder können mehrere unterschiedliche Nukleotidtypen (z. B. A, C, T und G zusammen) geliefert werden. Für eine Nukleotidlieferkonfiguration, bei der jeweils nur ein einzelner Typ von Nukleotid vorliegt, müssen die unterschiedlichen Nukleotide keine separaten Markierungen aufweisen, da sie basierend auf zeitlicher Trennung, die der individualisierten Lieferung innewohnt, unterschieden werden können. Demgemäß kann ein Sequenzierungsverfahren oder eine Vorrichtung Einzelfarbendetektion verwenden. Zum Beispiel muss ein Mikrofluorometer oder Lesekopf nur Anregung mit einer einzelnen Wellenlänge oder in einem einzelnen Bereich von Wellenlängen bereitstellen. Ein Mikrofluorometer oder Lesekopf muss daher nur eine einzelne Anregungsquelle aufweisen und Multiband-Filtration der Anregung muss nicht notwendig sein. Für eine Nukleotidlieferkonfiguration, bei der die Lieferung darin resultiert, dass jeweils mehrere unterschiedliche Nukleotide in der Durchflusszelle vorliegen, können Merkmale, die unterschiedliche Nukleotidtypen einbeziehen, basierend auf unterschiedlichen fluoreszenten Markierungen unterschieden werden, die an jeweiligen Nukleotidtypen in der Mischung angebracht sind. Zum Beispiel können vier unterschiedliche Nukleotide verwendet werden, die jeweils einen von vier unterschiedlichen Fluorophoren aufweisen. In einer Ausführungsform können die vier unterschiedlichen Fluorophore unter Verwendung von Anregung in vier unterschiedlichen Regionen des Spektrums unterschieden werden. Zum Beispiel kann ein Mikrofluorometer oder Lesekopf vier unterschiedliche Anregungsstrahlungsquellen umfassen. Alternativ kann ein Lesekopf weniger als vier unterschiedliche Anregungsstrahlungsquellen umfassen, kann aber optische Filtration der Anregungsstrahlung von einer einzelnen Quelle benutzen, um unterschiedliche Bereiche von Anregungsstrahlung an der Durchflusszelle zu produzieren.
  • In einigen Ausführungsformen können vier unterschiedliche Nukleotide in einer Probe (d. h. Array der Nukleinsäuremerkmale) unter Verwendung von weniger als vier unterschiedlichen Farben detektiert werden. Als erstes Beispiel kann ein Paar Nukleotidtypen mit der gleichen Wellenlänge detektiert werden, aber basierend auf einem Unterschied in der Intensität für ein Element des Paars verglichen mit dem anderen oder basierend auf einer Änderung gegenüber einem Element des Paars (z. B. über chemische Modifikation, fotochemische Modifikation oder physikalische Modifikation), die bewirkt, dass verglichen mit dem für das andere Element des Paars detektierten Signal das sichtbare Signal erscheint oder verschwindet, unterschieden werden. Als zweites Beispiel können drei von vier unterschiedlichen Nukleotidtypen unter besonderen Bedingungen detektierbar sein, während einem vierten Nukleotidtyp eine Markierung fehlt, die unter diesen Bedingungen detektierbar ist. In einer SBS-Ausführungsform des zweiten Beispiels kann die Einbeziehung der ersten drei Nukleotidtypen in einer Nukleinsäure basierend auf dem Vorhandensein ihrer jeweiligen Signale bestimmt werden und kann die Einbeziehung des vierten Nukleotidtyps in der Nukleinsäure basierend auf dem Nichtvorhandensein eines Signals bestimmt werden. Als drittes Beispiel kann ein Nukleotidtyp in zwei unterschiedlichen Bildern oder in zwei unterschiedlichen Kanälen detektiert werden (z. B. kann eine Mischung von zwei Arten, die die gleiche Basis, aber unterschiedliche Markierungen aufweisen, verwendet werden, oder kann eine einzelne Art, die zwei Markierungen aufweist, verwendet werden, oder kann eine einzelne Art, die eine aufweist, die in beiden Kanälen detektiert wird, verwendet werden), während andere Nukleotidtypen in nicht mehr als einem der Bilder oder Kanäle detektiert werden. In diesem Beispiel dient der Vergleich der zwei Bilder oder der zwei Kanäle dazu, die unterschiedlichen Nukleotidtypen zu unterscheiden.
  • Die drei beispielhaften Konfigurationen im obigen Absatz schließen sich nicht gegenseitig aus und können in verschiedenen Kombinationen verwendet werden. Eine beispielhafte Ausführungsform ist ein SBS-Verfahren, das reversibel blockierte Nukleotide (rbNTPs) verwendet, die fluoreszente Markierungen aufweist. In diesem Format können vier unterschiedliche Nukleotidtypen an ein Array von Nukleinsäuremerkmalen geliefert werden, die zu sequenzieren sind, und aufgrund der reversiblen Blockierungsgruppen wird bei jedem Merkmal ein und nur ein Einbeziehungsereignis auftreten. Die in diesem Beispiel an das Array gelieferten Nukleotide können Folgendes umfassen: einen ersten Nukleotidtyp, der in einem ersten Kanal detektiert wird (z. B. rbATP, der eine Markierung aufweist, die im ersten Kanal detektiert wird, wenn durch eine erste Anregungswellenlänge angeregt), einen zweiten Nukleotidtyp, der in einem zweiten Kanal detektiert wird (z. B. rbCTP, der eine Markierung aufweist, die im zweiten Kanal detektiert wird, wenn durch eine zweite Anregungswellenlänge angeregt), einen dritten Nukleotidtyp, der sowohl im ersten als auch im zweiten Kanal detektiert wird (z. B. rbTTP, der mindestens eine Markierung aufweist, die in beiden Kanälen detektiert wird, wenn durch die erste und/oder zweite Anregungswellenlänge angeregt), und einen vierten Nukleotidtyp, dem eine Markierung fehlt, die in einem Kanal detektiert wird (z. B. rbGTP, der keine extrinsische Markierung aufweist).
  • Nachdem die vier Nukleotidtypen mit dem Array im obigen Beispiel kontaktiert worden sind, kann ein Detektionsverfahren ausgeführt werden, zum Beispiel um zwei Bilder des Arrays einzufangen. Die Bilder können in getrennten Kanälen erhalten werden und können entweder simultan oder sequentiell erhalten werden. Ein erstes Bild, das unter Verwendung der ersten Anregungswellenlänge und Emission im ersten Kanal erhalten wird, wird Merkmale zeigen, die den ersten und/oder dritten Nukleotidtyp (z. B. A und/oder T) einbeziehen. Ein zweites Bild, das unter Verwendung der zweiten Anregungswellenlänge und Emission im zweiten Kanal erhalten wird, wird Merkmale zeigen, die den zweiten und/oder dritten Nukleotidtyp (z. B. C und/oder T) einbeziehen. Eindeutige Identifizierung des an jedem Merkmal einbezogenen Nukleotidtyps kann durch Vergleichen der zwei Bilder bestimmt werden, um zu Folgendem zu gelangen: Merkmale, die sich nur im ersten Kanal zeigen, habe den ersten Nukleotidtyp (z. B. A) einbezogen, Merkmale, die sich nur im zweiten Kanal zeigen, haben den zweiten Nukleotidtyp (z. B. C) einbezogen, Merkmale, die sich in beiden Kanälen zeigen, haben den dritten Nukleotidtyp (z. B. T) einbezogen, und Merkmale, die sich in keinem Kanal zeigen, haben den vierten Nukleotidtyp (z. B. G) einbezogen. Es wird darauf hingewiesen, dass die Stelle der Merkmale, die G einbezogen haben, in diesem Beispiel von anderen Zyklen bestimmt werden kann (wobei mindestens einer der anderen drei Nukleotidtypen einbezogen ist). Beispielhafte Vorrichtung und Verfahren zum Unterscheiden von vier unterschiedlichen Nukleotiden unter Verwendung der Detektion von weniger als vier Farben werden zum Beispiel in der US-Pat.-Anm. mit der laufenden Nummer 61/538,294 beschrieben, die in dieser Schrift unter Bezugnahme einbezogen ist.
  • In einigen Ausführungsformen können Nukleinsäuren an einer Oberfläche angebracht und vor oder während der Sequenzierung amplifiziert werden. Amplifikation kann zum Beispiel unter Verwendung der Brückenamplifikation ausgeführt werden, um auf einer Oberfläche Nukleinsäurecluster zu bilden. Nützliche Brückenamplifikationsverfahren werden zum Beispiel in US 5,641,658 ; US 2002/0055100 ; US 7,115,400 ; US 2004/0096853 ; US 2004/0002090 ; US 2007/0128624 ; oder US 2008/0009420 beschrieben, welche jeweils in dieser Schrift durch Bezugnahme einbezogen sind. Ein weiteres nützliches Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuren auf einer Oberfläche ist die Rolling-Circle-Amplifikation (RCA), wie zum Beispiel in Lizardi et al., Nat. Genet. 19: 225–232 (1998) und US 2007/0099208 A1 beschrieben, welche jeweils in dieser Schrift durch Bezugnahme einbezogen sind. Emulsion-PCR an Kügelchen kann ebenfalls verwendet werden, wie zum Beispiel in Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8817–8822 (2003), WO 05/010145 , US 2005/0130173 oder US 2005/0064460 beschrieben, welche jeweils in dieser Schrift durch Bezugnahme einbezogen sind.
  • Wie oben dargelegt, sind Sequenzierungsausführungsformen ein Beispiel eines sich wiederholenden Prozesses. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind für sich wiederholende Prozesse gut geeignet. Einige Ausführungsformen werden in dieser Schrift unten und an anderer Stelle dargelegt.
  • Demgemäß werden in dieser Schrift Sequenzierungsverfahren bereitgestellt, die Folgendes umfassen: (a) Bereitstellen eines fluidischen Systems, das (i) eine Durchflusszelle, die eine optisch transparente Fläche beinhaltet, (ii) eine Nukleinsäureprobe, (iii) eine Vielzahl von Reagenzien für eine Sequenzierungsreaktion und (iv) ein fluidisches System zum Liefern der Reagenzien an die Durchflusszelle beinhaltet; (b) Bereitstellen einer Detektionsvorrichtung, die (i) eine Vielzahl von Mikrofluorometern beinhaltet, wobei jedes der Mikrofluorometer ein Objektiv beinhaltet, das für Weitfeldbilddetektion in einer Bildebene in x- und y-Abmessungen konfiguriert ist, und (ii) eine Probestufe beinhaltet; und (c) Ausführen von fluidischen Vorgängen eines Nukleinsäuresequenzierungsverfahrens in der Kartusche und Detektionsvorgängen des Nukleinsäuresequenzierungsverfahrens in der Detektionsvorrichtung, wobei (i) die Reagenzien durch das fluidische System an die Durchflusszelle geliefert werden, (ii) Weitfeldbilder der Nukleinsäuremerkmale durch die Vielzahl von Mikrofluorometern detektiert werden, und (iii) mindestens einige Reagenzien von der Durchflusszelle an ein Cachereservoir entfernt werden.
  • In dieser gesamten Anmeldung werden verschiedene Publikationen, Patente und/oder Patentanmeldungen angeführt. Die Offenlegung dieser Publikationen wird hiermit in ihrer Gesamtheit unter Bezugnahme in diese Anmeldung einbezogen.
  • Der Begriff beinhalten ist in dieser Schrift als offener Begriff gedacht und schließt nicht nur die zitierten Elemente ein, sondern umfasst ferner alle zusätzlichen Elemente.
  • Es wurde eine Reihe von Ausführungsformen beschrieben. Dennoch wird man verstehen, dass verschiedene Modifikationen gemacht werden können. Demgemäß liegen andere Ausführungsformen im Schutzumfang der folgenden Ansprüche.
    Bezugszeichen Beschreibung
    Fig. 2D
    200 Druckleitung
    202 Pufferleitung
    204 Postleitung
    206 Gemeinsame Leitung
    208 Abfallleitung
    210 Luft / Vermeidung
    212 Luft 2
    Fig. 4B
    F1S Emissionsfilter (quadratisch)
    F1C Emissionsfilter (kreisförmig)
    F2 Anregungsfilter
    F3 Laserdiodenstrahlensplitter
    F4 Anregungs-/Emissions-Dichroic
    F5 Kombinator-Dichroic
    FC Durchflusszelle
    FS Anregungsfeldstopp
    HS LED-Wärmesenke
    L1 Emissionsprojektionslinsengruppe
    L2 Anregungsprojektionslinsengruppe
    L4 Objektivlinsengruppe
    L5 Laserdiodenkopplungslinsengruppe
    L6 Grüne LED-Sammellinse
    L7 Rotes LED-Sammellinse
    L8 LED-Feldlinse
    LA Laserdiodenapertur
    LD Laserdiode
    LEDG Grünes Laser-Die
    LEDR Rotes Laser-Die
    M1 LED-Klappspiegel
    N1 Neutraldichtefilter 1
    N2 Neutraldichtefilter 2
    S1 CMOS-Bildsensor
    40 Autodfokussystem
    42 Abbildungssystem
    44 Projektionslinse
    46 Objektivlinse
    48 Beleuchtung optische Auslegung
    50 Fokus – Z-Stufe
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • US 2011/0059865 A1 [0065]
    • US 6266459 [0066]
    • US 6355431 [0066]
    • US 6770441 [0066]
    • US 6859570 [0066]
    • US 7622294 [0066]
    • WO 00/63437 [0066]
    • WO 04/018497 [0067, 0095]
    • US 7057026 [0067, 0095]
    • WO 91/06678 [0067, 0095]
    • WO 07/123744 [0067, 0095]
    • US 7329492 [0067, 0095]
    • US 7211414 [0067, 0095]
    • US 7315019 [0067, 0095]
    • US 7405281 [0067, 0095]
    • US 2008/0108082 [0067, 0095]
    • WO 05/010145 [0067, 0100]
    • US 2005/0130173 [0067, 0100]
    • US 2005/0064460 [0067, 0100]
    • US 5641658 [0100]
    • US 2002/0055100 [0100]
    • US 7115400 [0100]
    • US 2004/0096853 [0100]
    • US 2004/0002090 [0100]
    • US 2007/0128624 [0100]
    • US 2008/0009420 [0100]
    • US 2007/0099208 A1 [0100]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008) [0067]
    • Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8817-8822 (2003) [0067]
    • Bentley et al., Nature 456: 53–59 (2008) [0095]
    • Lizardi et al., Nat. Genet. 19: 225–232 (1998) [0100]
    • Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 8817–8822 (2003) [0100]

Claims (40)

  1. Eine Detektionsvorrichtung, die Folgendes beinhaltet: ein Mikrofluorometer, das ein Objektiv, eine Anregungsstrahlungsquelle und einen Detektor beinhaltet, wobei das Mikrofluorometer für Weitfeldbilddetektion konfiguriert ist; ein fluidisches System zum Liefern von Reagenzien aus einer Reagenzkartusche an eine Durchflusszelle, wobei das fluidische System Folgendes beinhaltet: einen Verteilerkörper, der eine Vielzahl von fluidischen Kanälen aufweist, die für die Fluidkommunikation zwischen der Reagenzkartusche und einem Einlass der Durchflusszelle konfiguriert sind; eine Vielzahl von Reagenzsippern, die sich von Anschlüssen im Verteilerkörper nach unten erstrecken, wobei jeder der Reagenzsipper konfiguriert ist, um in einem Reagenzreservoir der Reagenzkartusche platziert zu werden, sodass Flüssigreagenz vom Reagenzreservoir in den Reagenzsipper gesaugt werden kann; und ein Ventil, das konfiguriert ist, um Fluidkommunikation zwischen den Reagenzreservoirs und dem Einlass der Durchflusszelle zu vermitteln, wobei die fluidischen Kanäle die Reagenzsipper mit dem Ventil fluidisch verbinden; und ein Durchflusszellen-Rastklemmenmodul, das eine Klemmenabdeckung zum Halten der Durchflusszelle aufweist, wobei das Objektiv konfiguriert ist, um Anregungsstrahlung aus der Strahlungsquelle zur Durchflusszelle zu leiten und um Emission aus der Durchflusszelle zum Detektor zu leiten, wobei das Mikrofluorometer bewegt werden kann, um Weitfeldbilder von unterschiedlichen Bereichen einer Innenfläche der Durchflusszelle zu erfassen.
  2. Detektionsvorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die Detektionsvorrichtung nicht mehr als ein einzelnes Mikrofluorometer beinhaltet.
  3. Detektionsvorrichtung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Mikrofluorometer einen Strahlensplitter umfasst, der positioniert ist, um Anregungsstrahlung aus der Anregungsstrahlungsquelle an das Objektiv zu leiten und um Emission aus dem Objektiv zum Detektor zu leiten.
  4. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei das Mikrofluorometer ein integriertes Mikrofluorometer ist, das eine kompakte Epifluoreszenzdetektionskonfiguration aufweist.
  5. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei das Mikrofluorometer bewegt werden kann, um ein Abbilden der Durchflusszelle zu erlauben, die größer als ein Sichtfeld des Mikrofluorometers ist.
  6. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–5, die ferner ein Gehäuse und einen auf einer Vorderfläche des Gehäuses präsentierten Schirm beinhaltet, wobei der Schirm als grafische Benutzeroberfläche fungiert.
  7. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–5, die ferner ein Gehäuse beinhaltet, das eine Kartuschenaufnahme zum Aufnehmen der Reagenzkartusche aufweist.
  8. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–7, die ferner ein Fluidikautomationsmodul beinhaltet, das eine Hubeinheit zum Heben und Senken der Reagenzkartusche umfasst.
  9. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–7, die ferner ein Fluidikautomationsmodul beinhaltet, das eine Bandeinheit umfasst, die die Reagenzkartusche während des Ladens bewegt.
  10. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–7, die ferner ein Fluidikautomationsmodul beinhaltet, das eine Hubeinheit zum Heben und Senken der Reagenzkartusche und eine Bandeinheit umfasst, die die Reagenzkartusche während des Ladens bewegt.
  11. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–10, wobei der Verteilerkörper aus mehreren Lagen aus festem, miteinander verklebtem Material gebildet ist.
  12. Detektionsvorrichtung gemäß Anspruch 11, wobei die Kanäle in dem festen Material gebildet werden, bevor die mehreren Lagen miteinander verklebt werden.
  13. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–12, wobei die fluidischen Kanäle gänzlich im Verteilerkörper untergebracht sind.
  14. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–13, wobei der Verteilerkörper mindestens sechzehn (16) Anschlüsse aufweist, die mit jeweiligen Reagenzsippern verbunden sind.
  15. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–14, wobei das Ventil mit Einlassanschlüssen konfiguriert ist, die jedem der Anschlüsse der fluidischen Kanäle entsprechen und mit einem einzelnen gemeinsamen Auslassanschluss konfiguriert sind, der mit der Durchflusszelle fluidisch verbunden ist.
  16. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–15, wobei das fluidische System nicht mehr als ein Ventil aufweist, das Fluidkommunikation zwischen den Reagenzreservoirs und der Durchflusszelle vermittelt.
  17. Detektionsvorrichtung gemäß Anspruch 16, wobei jeder der fluidischen Kanäle von einem einzelnen Anschluss stammt und mit einem entsprechenden Anschluss des Ventils verbunden ist.
  18. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–17, wobei der Verteilerkörper eine einzelne Lage von fluidischen Kanälen aufweist.
  19. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–18, wobei die Reagenzsipper distale Enden aufweisen, die konfiguriert sind, um eine Film- oder Folienlage der Reagenzkartusche zu perforieren.
  20. Direktionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–19, wobei die Strahlungsquelle Strahlung mit unterschiedlichen Wellenlängen produziert.
  21. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–20, wobei der Detektor ein Bildsensor mit komplementärem Metalloxid-Halbleiter (CMOS) ist.
  22. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–21, wobei das Mikrofluorometer eine Komponente eines Abbildungsmoduls ist, wobei das Abbildungsmodul auch das Durchflusszellen-Rastklemmenmodul umfasst.
  23. Detektionsvorrichtung gemäß Anspruch 22, wobei das Abbildungsmodul auch eine XY-Stufe umfasst, in der ein X-Motor und ein Y-Motor Bewegung der X-Stufe bzw. der Y-Stufe bereitstellt.
  24. Detektionsvorrichtung gemäß Anspruch 23, wobei der X-Motor eine Kameraeinheit entlang einer X-Achse bewegt, wobei die Kameraeinheit ein Mikrofluorometer aufweist, wobei der Y-Motor das Durchflusszellen-Rastklemmenmodul entlang einer Y-Achse bewegt.
  25. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–24, die ferner eine fluidische Vorrichtung beinhaltet, die eine Durchflusszellenkartusche und die Durchflusszelle umfasst, wobei die Durchflusszellenkartusche konfiguriert ist, um die Durchflusszelle zu halten und das Ausrichten der Durchflusszelle für eine Abbildungssitzung zu erleichtern.
  26. Detektionsvorrichtung gemäß Anspruch 25, wobei die fluidische Vorrichtung und die Durchflusszellenkartusche entfernt werden können, sodass die Durchflusszellenkartusche von einer Person oder Maschine aus dem Durchflusszellen-Rastklemmenmodul ohne Beschädigung an der fluidischen Vorrichtung oder der Durchflusszellenkartusche entfernt werden kann.
  27. Detektionsvorrichtung gemäß Anspruch 25, wobei die Durchflusszellenkartusche konfiguriert ist, um ohne Beschädigen der Durchflusszellenkartusche oder Ungeeignetmachen der Durchflusszellenkartusche für ihren beabsichtigten Zweck wiederholt in das Durchflusszellen-Rastklemmenmodul eingeführt und aus diesem entfernt zu werden.
  28. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–27, wobei die Durchflusszellenkartusche ein Gehäuse und ein Abdeckungselement umfasst, das mit dem Gehäuse der Durchflusszellenkartusche gekoppelt ist, wobei das Abdeckungselement eine Dichtung umfasst, die Einlass- und Auslassgänge aufweist, die nahe zueinander liegen, wobei die Klemmenabdeckung einen Abdeckungsverteiler mit Einlass- und Auslassanschlüssen umfasst, die konfiguriert sind, um mit dem Einlassgang bzw. dem Auslassgang zusammengepasst zu werden.
  29. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–28, wobei das Durchflusszellen-Rastklemmenmodul einen federbelasteten Hebel umfasst, der die Durchflusszelle gegen Spannstifte vorspannt.
  30. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–29, wobei ein Felddurchmesser für das Mikrofluorometer mindestens 0,5 mm ist.
  31. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–30, wobei ein Felddurchmesser für das Mikrofluorometer mindestens 2 mm ist.
  32. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–31, wobei ein Felddurchmesser für das Mikrofluorometer nicht größer als 5 mm ist.
  33. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–32, wobei eine numerische Apertur für das Mikrofluorometer mindestens 0,2 ist.
  34. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–33, wobei eine numerische Apertur für das Mikrofluorometer nicht größer als 0,8 ist.
  35. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–34, wobei eine numerische Apertur für das Mikrofluorometer nicht größer als 0,5 ist.
  36. Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–35, wobei das Mikrofluorometer eine Auflösung aufweist, die ausreicht, um Merkmale zu unterscheiden, die um maximal 100 μm getrennt sind.
  37. Ein Sequenzierungssystem, das die Detektionsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–36 und die Reagenzkartusche, die die Reagenzreservoirs aufweist, umfasst, wobei die Reagenzreservoirs Sequenzierungsreagenzien umfassen.
  38. Sequenzierungssystem gemäß Anspruch 37, wobei mindestens eines der Reagenzreservoirs eine Nukleinsäureprobe umfasst.
  39. Sequenzierungssystem gemäß Anspruch 37 oder Anspruch 38, wobei die Reagenzkartusche aus der Detektionsvorrichtung entfernt werden kann.
  40. Sequenzierungssystem gemäß Anspruch 37 oder Anspruch 38 oder Anspruch 39, wobei das Sequenzierungssystem konfiguriert ist, um ein Sequenzierung-nach-Synthese-Protokoll durchzuführen.
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