JP2007518977A - 分析物注入システム - Google Patents

Abstract

本発明はサンプル中の少なくとも第１成分及び第２成分を空間的に分離する方法及びデバイスを提供し、代表的な一態様ではスペーサー電解質溶液を含むキャリヤー流体中で第１成分及び第２成分をマイクロフルイディックデバイスの第１マイクロフルイディックチャネルに導入すること、第１成分及び第２成分を等速電気泳動によりリーディング電解質溶液とトレーリング電解質溶液との間にスタッキングすることを含み、該スペーサー電解質溶液はリーディング電解質溶液中に存在するイオンの移動度とトレーリング電解質溶液中に存在するイオンの移動度との中間の電場中移動度を有するイオンを含み、該スペーサー電解質溶液は以下のスペーサーイオン：ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ノナン酸、Ｄ−グルクロン酸、アセチルサリチル酸、４−エトキシ安息香酸、グルタル酸、３−フェニルプロピオン酸、フェノキシ酢酸、システイン、馬尿酸、ｐ−ヒト゛ロキシフェニル酢酸、イソプロピルマロン酸、イタコン酸、シトラコン酸、３，５−ジメチル安息香酸、２，３−ジメチル安息香酸、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、及び５−ｂｒ−２，４−ジヒドロキシ安息香酸のうちの少なくとも１種を含み、該第１成分はＤＮＡ−抗体コンジュゲートを含み、第２成分はＤＮＡ−抗体コンジュゲートと分析物との複合体を含む。

Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本願はＰａｒｋ他による先の米国仮出願第６０／５３２，０４２号“分析物注入システム（Ａｎａｌｙｔｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）”（出願日２００３年１２月２３日）の優先権及びその利益を主張する。この先の出願の開示内容全体をここで援用する。

（発明の技術分野）
本発明は分析電気泳動システム及び方法の分野に関する。本発明は高分解能高感度等速電気泳動（ＩＴＰ）及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ）アッセイを含むことができる。

電気泳動は一般に荷電分子が電場内を移動する現象である。電気泳動に基づく分析法は特に蛋白質と核酸の分析の分野で広く利用されている。対象分析物荷電分子を含むサンプルをサイズ排除媒体、イオン交換媒体、又はｐＨ勾配をもつ媒体等の選択媒体に加えると、分析物分子は他のサンプル分子から高分解能で分解できるように区別可能に移動することができる。分離した分子を同定と定量の目的で検出することができる。

キャピラリー及びマイクロフルイディックスケール電気泳動分離は低サンプル容量又は高スループットを必要とする分析に特に広く利用されている。例えば、マイクロスケールローディングチャネル、分離チャネル及び検出チャネルを備えるプラスチック又はガラス基板チップを作製することができる。マイクロウェルプレートからロボット操作式サンプル収集チューブを通してローディングチャネルにサンプルを移送することができる。電位印加により分離チャネル内の選択媒体中をサンプル成分が移動するように誘導し、成分が分離チャネルから検出チャネル内に溶出するにつれて順次検出することができる。アッセイシステムのマイクロスケール寸法により、マイクロスケール、又はナノスケールのサンプル容量を使用して迅速に分析することができる。しかし、複雑なサンプル又は希薄なサンプルには分解能又は感度が不十分な場合がある。

キャピラリー電気泳動（ＣＥ）法の分解能と感度を増加するための１つのアプローチはＣＥ分離前に等速電気泳動（ＩＴＰ）を使用してサンプルを予備分解及び予備濃縮する方法であった。ＩＴＰでは、サンプルよりも電気泳動移動度の大きいリーディング電解液（ＬＥ）とサンプルよりも電気泳動移動度の小さいトレーリング電解液（ＴＥ）の間でチャネルにサンプルをロードする。電場の作用下で、対象分析物はサンプルボーラスを通って移動し、ＬＥ及び／又はＴＥ溶液との界面に蓄積することができる。こうして、対象分析物をサンプルの他の所定成分から分離し、より検出し易い濃度まで濃縮することができる。このようにサンプルを濃縮し、脱塩すると、その後のキャピラリー電気泳動分離用として改善された注入材料が得られ、高分解能で高感度の検出が可能になる。例えば、“Ｔａｎｄｅｍ Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｖｉａ Ｂａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｓｔａｃｋｉｎｇ ｆｏｒ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｖｒｅｅｌａｎｄら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）ＡＳＡＰ Ａｒｔｉｃｌｅでは、ＩＴＰにより濃縮したサンプルをキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）により更に分解検出している。Ｖｒｅｅｌａｎｄでは、電気泳動移動度がＴｒｉｓ緩衝液のｐＨにより制御されるＴＥとＬＥの間でサンプルをＩＴＰにかける。分析物のＩＴＰ濃縮が進行する間に分離チャネルのカソード端に加水分解によりヒドロキシルイオン（−ＯＨ）が形成される。ヒドロキシルイオンは分離チャネルを通って移動し、最終的にＴｒｉｓ緩衝液を中和し、ＬＥ溶液とＴＥ溶液の間の移動度の差をなくす。Ｔｒｉｓ中和はＩＴＰ分離媒体をＣＺＥ分離媒体に変換する。その後、ＩＴＰアッセイ段階による有効なサンプル容量低減と分析物濃縮により、同一サンプルの標準ＣＺＥよりも高い感度と分解能で分析物を分離することができる。Ｖｒｅｅｌａｎｄ法は適合可能なサンプルのｐＨに基づくＩＴＰに限定されており、中和段階により時間がかかり、緩衝液調製又はヒドロキシルイオン発生の変動により非整合的になる可能性もある。

ＩＴＰをＣＥと併用する別のスキームでは、対象分析物がＣＥ分離チャネルとの交点に到達するまでＩＴＰモードで移動した後、分析物のキャピラリー電気泳動分離のために電場を分離チャネルに転換する。例えば、“Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ”，Ｗａｉｎｒｉｇｈｔら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．Ａ９７９（２００２），ｐｐ．６９−８０では、サンプルはＣＥチャネルとの交点に到達するまでＩＴＰチャネルで予備濃縮される。交点は交点に照準させた共焦点レンズを通って受光する光電子増倍管（ＰＭＴ）により顕微鏡でモニターされる。交点に流入する分析物を例えば蛍光又は光吸収により検出することができ、分析物をＣＥチャネルに注入するために電場を手動転換する。しかし、手動転換は非整合的であり、分析物によってはＰＭＴを使用して検出できないものもあり、マイクロスケールでのＰＭＴ検出は面倒で費用がかかるという問題がある。
"Ｔａｎｄｅｍ Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｖｉａ Ｂａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｓｔａｃｋｉｎｇ ｆｏｒ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ"，Ｖｒｅｅｌａｎｄら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）ＡＳＡＰ Ａｒｔｉｃｌｅ "Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ"，Ｗａｉｎｒｉｇｈｔら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．Ａ９７９（２００２），ｐｐ．６９−８０

上記に鑑み、感度と整合性と分解能の高いキャピラリーマイクロスケール電気泳動法が必要とされている。電気泳動モード間で自動的且つ整合的に転換することができるシステムを得ることが望ましい。本発明はこれらの構成と以下に記載する他の構成を提供する。

本発明は例えば電圧イベントのトリガにより分析物を分離媒体に整合的に注入するためのシステムと方法を提供する。等速電気泳動（ＩＴＰ）スタッキングにより分析物をチャネルでプレコンディショニング及び濃縮した後に、電圧イベントがチャネルで検出される場合にスタッキングされた分析物を分離チャネルセグメントに添加することができる。

本発明の方法は高い感度と速度と分解能で高度に反復可能な分析結果を提供することができる。本方法は例えば１種以上の分析物をスタッキングチャネルセグメントにスタッキングすることにより分析物を注入する段階と、チャネルで電位を検出する段階と、選択された電圧イベントが検出される場合には分離チャネルセグメントに電場又は差圧を印加することによりスタッキングされた分析物を分離チャネルセグメントに添加する段階を含むことができる。チャネルはマイクロスケールチャネルとすることができ、例えば交差又は共通チャネルセグメントと共にローディングチャネルセグメント、スタッキングチャネルセグメント及び／又は分離チャネルセグメントを構成する。

分析物のスタッキングはスタッキングチャネルセグメントで実施することができ、ＩＴＰ中に分析物を濃縮バンドに集束させるように選択された緩衝液間に対象分析物を挟むことができる。注入される典型的な分析物としては例えば蛋白質、核酸、炭水化物、糖蛋白質、イオン、及び／又は同等物が挙げられる。スタッキングチャネルセグメントは移動度の異なるトレーリング電解液及び／又はリーディング電解液をもつことができる。例えば、リーディング電解液は電場の作用下でトレーリング電解液又は対象分析物よりも速い移動度をもつことができる。多くの態様では、トレーリング電解液とリーディング電解液はｐＨ、粘度、導電率、サイズ排除、イオン強度、イオン組成、温度、及び／又は電解液の相対移動若しくはスタッキングに影響を与える可能性のある他のパラメーターが相違する。トレーリング電解液は分析物がＩＴＰ中にトレーリング界面に蓄積するように分析物よりも低い移動度をもつように調節することができる。場合により、リーディング電解液は１種以上の分析物がＩＴＰ分離中にリーディング界面に蓄積できるように分析物よりも高い移動度をもつように調節することができる。トレーリング電解液とリーディング電解液の移動速度を精密に調節することにより、非対象サンプル成分がスタッキングチャネルセグメントの他のゾーンに移動する間にリーディング電解液とトレーリング電解液の間に分析物を集束させることができる。即ち、１種以上の非対象サンプル成分が対象分析物と共に電解液間に集束されないように、１種以上の非対象サンプル成分よりも高い移動度をもつようにトレーリング電解液を調節するか、又は１種以上の非対象サンプル成分よりも低い移動度をもつようにリーディング電解液を調節することができる。

分析物注入法のチャネルが別々のスタッキングチャネルセグメントと分離チャネルセグメントを含む場合には、スタッキングチャネルセグメントから分離チャネルセグメントへの転換は例えばスタッキングされた分析物がスタッキングチャネルセグメントと分離チャネルセグメントの交点に流入するときにスタッキングチャネルセグメントから分離チャネルセグメントに電場を転換することにより実施することができる。例えば、分離チャネルセグメントへの電場印加は、分離チャネルセグメントが実質的に無電流でスタッキングチャネルセグメントに電流が流れている状態から分離チャネルセグメントに電流が流れ、スタッキングチャネルセグメントの電流が遮断される状態への転換とすることができる。チャネルセグメントにおける電流遮断（実質的無電流）はチャネルセグメントにおける電流を阻止するように浮動電圧を印加するか又は単にチャネルセグメントに高抵抗を提供する（例えばチャネルセグメントから有意電流流出が生じないようにする）ことにより実施することができる。場合により、分離チャネルセグメントに差圧を印加することにより転換することもできる。

注入法における分離チャネルセグメントは分析物を他の分析物又はサンプル成分から分離することができる。このような分離により対象分析物を同定又は定量することができる。分離チャネルセグメントは分析物とサンプル成分の移動に影響を与えるように選択条件又は分離媒体をもつことができる。例えば、分離チャネルはｐＨ勾配、サイズ選択媒体、イオン交換媒体、粘度増加媒体、疎水性媒体、及び／又は同等物を含むことができる。

分離チャネルセグメントで分離された分析物は同定及び／又は定量の目的で検出することができる。分離チャネルセグメントにおける分析物をモニターするか又は分析物が分離チャネルセグメントから溶出するにつれて検出するように検出器を照準させることができる。分析物の検出は例えば導電率、蛍光、吸光度、屈折率及び／又は同等物等の分析物に関連するパラメーターをモニターすることにより実施することができる。

サンプル溶液は例えば十分な感度と速度を提供するように各種技術により本方法のチャネルにロードすることができる。例えば、ローディングチャネルが所望検出に十分なサンプル分析物を保持していない場合には、複数サンプルを連続的にロード及びスタッキングした後に多重スタックを融合し、小容量の高濃度分析物を提供することができる。分析物の２個以上のサンプルのスタッキングは例えば第１のサンプルをローディングチャネルにロードし；電場をサンプルに印加することによりサンプルをスタッキングし；第２のサンプルをローディングチャネルにロードし；スタッキングしたサンプルと第２のサンプルに電場を印加して第２のサンプルをスタッキングすると共に、スタッキングした２個のサンプルを一緒にトレーリング電解液とリーディング電解液の間に集束させることにより実施することができる。多重スタッキング技術はスタッキングした第１のサンプルをローディングチャネルに向かって流し、過剰の電解液と消耗したサンプル溶液を除去してから第２のサンプルをロードすることにより助長することができる。サンプル分析物を濃縮する別の方法は例えば大きなサンプル容量からの分析物がトレーリング又はリーディング電解液界面に蓄積するほどまで移動しないようにスタッキングチャネルセグメント横断面よりも大きい横断面を含むローディングチャネルに分析物のサンプルをロードすることにより実施できる。

トレーリング電解液とリーディング電解液の中間にある２種以上の分析物種の中間の移動速度をもつスペーサー電解液をサンプル間及び／又はスタッキングした分析物間にロードし、サンプルを２種以上の対象分析物に分解することもできる。１態様では、スタッキングはトレーリング電解液よりも大きい移動度をもつ少なくとも一方の分析物種より大きい移動度で且つリーディング電解液よりも小さい移動度をもつ少なくとももう一方の分析物種よりも小さい移動度をもつ１種以上のスペーサー電解液を２個以上の分析物サンプルセグメントの間にロードすることにより実施される。別の態様では、２個以上の分析物サンプルセグメントの１個以上を予めスタッキングしておいたサンプル分析物とし、多重スタッキングロード段階中にスペーサー電解液を挿入する。このスペーサーは、分析物間に注入する代わりにサンプル中に含ませることもできる。スペーサー電解液はＩＴＰで分析物を分解するために分析物の２種以上の移動度の間の移動度を提供するように調節することができる。このようなスペーサー電解液調節は適当な電解液ｐＨ、スペーサー電解液成分、スペーサー電解液粘度、スペーサー電解液導電率、及び／又は同等物を選択することにより実施することができる。

所定注入方法では、電解液は注入のために分析物をＩＴＰ分解するように高度に調製することができる。例えば、分析物のｐＫを例えば実験又は計算から求める場合には、リーディング電解液に侵入する分析物が低電荷低移動性になり、及び／又はトレーリング電解液に侵入する分析物が高電荷高移動性になるように、ｐＫを挟むｐＨ値にリーディング電解液とトレーリング電解液を調節することができる。このような調節はスタッキングされた分析物の注入前にＩＴＰの選択性と濃縮を強化することができる。

スタッキングされた分析物の分離チャネルセグメントへの注入は選択された電圧イベントの検出によりトリガすることができる。チャネル内の種々の位置で電圧をモニターすることができ、好ましい注入タイミングを正確に指示する電圧イベントを決定することができる。例えば、電圧イベントの検出は分離チャネルセグメントに無電流（又は他の規定電流）条件を維持するために必要な浮動電圧をモニターすることにより実施できる。分離開始をトリガするために使用される典型的な電圧イベントとしては例えば電圧ピーク、電圧の谷、予め指定された電圧、相対電圧、電圧の絶対的な大きさ、時間の関数としての電圧の微分（例えば一次微分は電圧変化率を示し、二次微分は電圧変化率の変化率を示す）（例えば電圧曲線の頂部に観察される傾きゼロ）、上記いずれかのイベント間の時間又は上記の任意の組み合わせが挙げられる。スタッキングされた分析物をＩＴＰから分離チャネルセグメントに注入するための転換は電圧イベントが検出された場合に電場又は差圧をチャネルセグメントに自動印加することにより実施することができる。

本発明の分析物注入システムは確実で整合的な高感度の分析のためにスタッキングされた分析物を自動注入することができる。分析物注入システムは例えばチャネルにスタッキングする分析物と、チャネルと電気的に接触しており、コントローラーと連動する電圧検出器を含み、選択された電圧イベントが電圧検出器により検出された場合にコントローラーはチャネルの分離セグメントの電流供給又はチャネルセグメントの差圧印加を開始することができる。一般に、チャネルはローディングチャネルセグメントと、スタッキングチャネルセグメントと、分離チャネルセグメントをもつマイクロスケールチャネルである。

システムのスタッキングチャネルセグメントは通常、トレーリング電解液（ＴＥ）及び／又はリーディング電解液（ＬＥ）による等速電気泳動法に適合するように構成される。電解液は調節可能な異なる移動度をもつことができる。例えば、電解液は異なるｐＨ値、粘度、導電率、サイズ排除カットオフ、イオン強度、イオン組成、温度、濃度、又は対イオン及び共イオンをもつことができる。チャネルにスタッキングする分析物としては蛋白質、核酸、炭水化物、糖蛋白質、誘導体化分子、イオン、及び同等物等の分子が挙げられる。電解液は他のサンプル成分を排除しながら対象分析物を選択的にスタッキングするように調整することができる。例えば、トレーリング電解液は対象分析物がＴＥの前端に蓄積し、非対象サンプル成分がＴＥを通過するように、対象分析物の移動度よりも小さい移動度と非対象サンプル成分の移動度よりも大きい移動度をもつように調製することができる。ＬＥは対象分析物がＬＥ界面に蓄積し、非対象サンプル成分がＬＥ界面を通過できるように、対象分析物の移動度よりも大きい移動度と非対象サンプル成分の移動度よりも小さい移動度をもつように調製することができる。

システムの分離チャネルセグメントはスタッキングカラムにスタッキングされた分析物と成分を分解するための条件又は選択媒体を含むことができる。例えば、分離カラムはｐＨ勾配、サイズ選択媒体、イオン交換媒体、疎水性媒体、粘度増加媒体等を含むことができる。

コントローラーは選択された電圧イベントが検出された場合に注入を開始するために電圧検出器からの出力を受信することができる。コントローラーは例えば論理装置又はシステムオペレーターとすることができる。所定態様では、注入イベントはスタッキングチャネルＩＴＰ電場条件からスタッキングされた分析物を分離チャネルセグメントに挿入するために必要な駆動力への転換とすることができる。例えば、注入は電圧イベントが検出された場合に分離チャネルセグメントで電場又は圧力を開始しながらスタッキングチャネルセグメントでＩＴＰ電流から実質的無電流に転換することにより実施できる。

システムのチャネルセグメントはスタッキングチャネルセグメントと流体接触するローディングチャネルセグメントを含むことができる。特定分析の必要に合うように各種ローディングスキームを利用することができる。１態様では、ローディングチャネルセグメントはより多量のサンプル分析物がより短時間でスタッキングチャネルセグメントに蓄積できるようにスタッキングチャネルセグメント横断面よりも大きな横断面をもつことができ、即ち平均分析物分子は横断面の大きいローディングチャネルセグメントのほうが同一容量の長いローディングチャネルセグメントよりも移動距離が短い。別のローディング側面では、分析物濃度とアッセイ感度を増加するために多重スタッキングスキームで第２のサンプルをロードする前にスタッキングされた第１の分析物サンプルをローディングチャネルセグメントにプルバックさせることができる。「プルバック」は例えばスタッキングされた第１のサンプルをローディングチャネルセグメントに逆流させるようにスタッキングチャネルセグメントに差圧を印加することにより実施することができる。ローディングチャネルセグメントは例えばマイクロフルイディックチップのウェルから充填することもできるし、あるいは流体操作システムにより例えばコレクターチューブ（シッパー）を通してマイクロアレーからサンプルを充填することもできる。

システムでは例えば２種以上の対象分析物間の分離を強化するためにスペーサー電解液を使用することができる。例えば、スタッキングチャネルセグメントで分析物を含むサンプルセグメント間に、又はサンプルセグメントと共に２種以上の分析物の移動度の間の移動度をもつスペーサー電解液を導入することができる。スペーサー電解液よりも遅い分析物はスペーサーの後に分配され、速い分析物はスペーサーの手前に分配することができる。代替態様では、例えばＩＴＰで過渡的又は定常状態条件の作用下で例えば別々の分析物ゾーンに分配するために、サンプル分析物をスペーサー電解液と併用することができる。

本発明のシステムはチャネル内の電圧イベントを検出してこれに応答するためにコントローラーと連動する電圧検出器をもつことができる。電圧検出器はチャネルのセグメント間の２個以上の電気接点間、又はチャネル内の任意位置の接点と基準電圧（例えばアース）の間の電圧を検出することができる。本システムの所定態様では、電圧検出器はスタッキングが進行する間に分離チャネルセグメント内の電圧をモニターすることができる。スタッキング中の分離チャネルセグメントの電圧は例えば分離チャネルセグメントに実質的電流が流れない場合（例えば浮動電圧レギュレーターにより分離チャネルセグメントに浮動電圧が印加されている場合、チャネルセグメントの一端からの電気流出がない場合、又はチャネルセグメントの制御スイッチがオフ位置の場合）にスタッキングチャネルセグメントとの交点又は分離チャネルセグメントの任意位置でモニターすることができる。

コントローラーは選択された電圧イベントが検出された場合にシステムをスタッキングモードから分離モードに自動的に転換し、スタッキングされた分析物を分離チャネルセグメントに注入することができる。電圧イベントは例えば電圧ピーク、選択された電圧、電圧の谷、相対電圧、電圧変化率、及び／又は同等物とすることができる。自動転換は例えばスタッキングされた分析物の分離チャネルセグメントにおける移動を誘導するためのチャネルセグメントの電流供給、チャネルセグメントを通る相対電圧の変化、又はチャネルセグメントへの差圧印加とすることができる。

分離チャネルセグメントで分離された分析物は対象分析物を同定及び／又は定量するためにシステムの分析物検出器により検出することができる。分析物検出器は分離チャネルセグメント内の分析物、又は分離チャネルセグメントから溶出する分析物をモニターするように構成することができる。分析物検出器は蛍光光度計、分光光度計、屈折計、導電率計、及び／又は同等物を含むことができる。

本発明のシステムはマイクロフルイディック用途に好適である。例えば、ローディングチャネルセグメント、スタッキングチャネルセグメント、分離チャネルセグメント、検出チャンバー等をマイクロフルイディックチップに組込むことができる。マイクロフルイディックデバイスのマイクロスケール寸法は本発明の多数のシステムに対応可能である。当分野で公知のマイクロフルイディックシステムは本発明のシステムの実施に有用な電圧、圧力、流体操作、連動、及び検出器等を提供することができる。

定義
本欄及び本明細書の他の欄で特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。

本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定方法又はシステムに限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。

本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「成分」と言う場合には２種以上の成分の組合せを含むことができ、「複数の分析物」と言う場合には１種の分析物を含むことができ、他の用語についても同様である。

本発明の実施には過度の実験を要することなしに本明細書に記載するものの類似、改変又は等価の多数の方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料と方法は本明細書に記載するものである。本発明の記載及び特許請求の範囲において、以下の用語は以下の定義に従って使用する。

本明細書で使用する「分析物」なる用語は分析物検出器により検出されるサンプルの成分を意味する。本明細書で使用する「対象分析物」とはアッセイで検出及び／又は定量が所望される分析物を意味する。

本明細書で使用する「チャネル」なる用語は本発明の方法及びシステムで流体を流動させるため及び／又は保持するための導管を意味する。チャネルは例えばチューブ、カラム、キャピラリー、マイクロフルイディックチャネル、及び／又は同等物とすることができる。チャネルはチャネルのセクションを共有するか及び／又はチャネルの他のセグメントと交差する種々のチャネルセグメントを例えばチャネルの別々のセクションに含むことができる。チャネルセグメントは一般にチャネルの機能的セクション（例えばローディングチャネルセグメント、スタッキングチャネルセグメント、及び分離チャネルセグメント）である。

本発明における「スキューイングチャネル」はチャネルを流れるサンプル成分のスキューイングを生じるチャネルセグメントとすることができる。例えば、スキューイングチャネルの内面形状はバンド又はピークがスキューイングチャネルを通過しながらチャネル軸に対して斜めの向きとなるようにすることができる。

本明細書で使用する「移動度」なる用語はチャネル内で電場の作用下の溶液中における荷電分子（例えば分析物又は電解液）の移動速度を意味する。

本明細書で使用する「浮動電圧」なる用語はセグメントに実質的に電流が流れないようにするため又はセグメント中に所望定電流を設定するためにチャネルセグメント内で必要な電圧を意味する。

本明細書で使用する「マイクロスケール」なる用語は約１０００μｍ〜約０．１μｍの寸法を意味する。

詳細な説明
本発明は分析物を分離チャネルに注入するための方法とシステムに関する。サンプル分析物のスタッキングにより、電気泳動分離の目的でアッセイ感度及び分解能を改善しながらより少ない注入容量でより高い分析物濃度が得られる。多くの場合には、注入前に分析物をスキューイングチャネルにスタッキングすることにより、感度と分離を改善することができる。電圧イベントの検出によりトリガされた自動注入タイミングは複数回のアッセイ間の結果の整合性を改善することができる。

本発明の方法とシステムは高レベルの感度と分解能で分析物を分離、同定及び／又は定量するために使用することができる。本発明の分析物は例えば荷電分子（例えば蛋白質、核酸、炭水化物、糖蛋白質、イオン、誘導体化分子、及び／又は同等物）とすることができる。

分析物注入方法
本発明の方法はスタッキングされた分析物を高感度で反復可能な高分解能アッセイのために分離チャネルに正確なタイミングで注入することができる。本発明の方法は一般に例えばスタッキングチャネルセグメントでの等速電気泳動（ＩＴＰ）の前にサンプルをローディングチャネルセグメントにロードする段階と、スタッキングされたサンプル分析物が注入位置にあることを示す電圧イベントを検出する段階と、電場又は差圧を印加し、スタッキングされたサンプル分析物を分離チャネルセグメントに添加する段階と、分離された対象分析物を検出する段階を含む。ＩＴＰはスキューイングチャネルを通して分析物を移動させることを含む。検出シグナルを評価し、分析物の存在又は量を測定することができる。

対象分析物のスタッキング
等速電気泳動法（ＩＴＰ）により対象分析物を元の分析物サンプルよりも小容量にスタッキングすることができる。例えば、サンプルボーラスをチャネル内の２種の異なる緩衝液系の間にロードし、電場を印加し、移動度の降順に移動する溶質ゾーンの定常状態を作ることができる。定常状態では、ゾーンはリーディング電解液と同一濃度であり、同一速度でチャネルを移動することができる。あるいは、サンプルボーラスを電解液に隣接する位置に添加し、例えばＩＴＰ電解液間で定常状態平衡に到達することなしに、注入のために界面に動的（例えば過渡的）条件下でスタッキングすることができる。

スタッキングは例えばマイクロフルイディックチップのチャネルで実施することができ、サンプルをトレーリング電解液とリーディング電解液のチャネル領域間にロードする。図１Ａに示すように、分析物サンプル１０は真空ウェル１２とサンプルウェル１３の差圧によりローディングチャネルセグメント１１にロードすることができる。電場をスタッキングチャネルセグメント１４に印加すると、図１Ｂに示すように、高移動度（例えば高電荷対質量比）のリーディング電解液１５、中間移動度の分析物１６、及び低移動度のトレーリング電解液１７により電流が輸送される。ＩＴＰが進行するにつれ、荷電分析物１６の濃度がリーディング電解液１５の濃度に等しくなる点まで分析物１６の容量が低下する定常状態に達することができる。定常状態では、図１Ｃに示すように、スタッキングされた分析物溶液はリーディング電解液及びトレーリング電解液と同一速度でスタッキングチャネルセグメント１４を移動し、電解液と荷電分析物はスタッキングチャネルセグメントにおいて同一量の単位容量当たり電流を輸送する。分析物と電解液の電荷密度や過渡的移動速度差等の因子はＩＴＰ中に分析物と電解液をゾーンに分けて集束させる傾向がある。本発明のスタッキングチャネルセグメントは任意サイズとすることができ、約１０００μｍ〜約０．１μｍ、又は約１００μｍ〜約１μｍ、又は約１０μｍの幅又は深さ等の寸法をもつマイクロスケールチャネルが挙げられる。

スタッキングは過渡状態で実施することもできる。例えば、図２Ａに示すように、当初は希薄で分散した分析物分子２０は例えば図２Ｂに示すようにリーディング電解液界面２１に蓄積することができる。界面におけるこの分析物濃縮は定常状態の均一な分析物及び電解液キャリヤー濃度に達する前に行うことができる。場合により、分析物は例えばＩＴＰにおける初期電場印加中に過渡状態でトレーリング電解液界面２２に蓄積することができる。他の態様又は過渡的ＩＴＰでは、分析物はＩＴＰ電解液の界面以外のゾーンで濃縮することができる。

複数の対象分析物が定常状態又は過渡状態で例えば電解液界面の一方又は両方に蓄積することができる。例えば図３Ａ〜３Ｃに示すように、第１の対象分析物３１と第２の対象分析物３２を含有するサンプル溶液３０をトレーリング電解液３３とリーディング電解液３４の間にロードすることができる。第１の分析物の移動度が第２の分析物よりも遅く且つトレーリング電解液の移動度よりも速い場合には、第１の分析物は電場の存在下でトレーリング電解液との界面に蓄積することができる。他方、図３Ｂに示すように過渡状態では、第１の分析物よりも多少高い移動度をもつ第２の分析物は高移動度のリーディング電解液との界面でサンプルボーラスの他端に蓄積することができる。このような状況では、当業者に自明の通り、第１の分析物と第２の分析物を１個以上の分離チャネルセグメントに別々に逐次又は同時に添加することができる。ＩＴＰで定常状態に一旦達すると、図３Ｃに示すように、第１及び第２の荷電分析物は例えば分離チャネルセグメントで分解するために同時に添加できるように狭い隣接バンドに圧縮することができる。

本発明の方法では、非対象サンプル成分を分析物から分離しながら対象分析物の選択的予備濃縮を実施できるようにトレーリング電解液とリーディング電解液の移動度を調節することができる。例えば、図４Ａに示すように、対象分析物４１と低移動度の非対象サンプル成分４２と高移動度の非対象サンプル成分４３を含有するサンプル溶液４０をトレーリング電解液４４とリーディング電解液４５の間にロードすることができる。電場をチャネルに印加すると、図４Ｂに示すように、移動度の遅い非対象サンプル成分４２はトレーリング電解液よりも遅れ、移動度の速い非対象サンプル成分４３はリーディング電解液を追い越すことができる。定常状態までＩＴＰを続けると、例えば図４Ｃに示すように、非対象サンプル成分を分析物から更に分離することができる。非対象サンプル成分を対象分析物から除去すると、分離チャネルセグメントで分離するための改善された注入材料が得られる。サンプルをＩＴＰにより前処理して非対象サンプル成分を除去した後、分離チャネルセグメントに添加した対象分析物を分析すると、例えばバックグラウンドノイズが低下し、注入容量低下により分解能が増加し、基線の改善とオーバーラップするピークの減少により定量確度が増す等の効果が得られる。

非対象サンプル成分を除去しながら対象分析物の高度に特異的な保持とスタッキングを実現するように電解液移動度を調節することにより、当分野で公知の方法によりトレーリング電解液とリーディング電解液を調整することができる。本方法の１態様では、対象分析物のｐＫを挟むように電解液のｐＨを選択し、この範囲外のｐＫをもつ非対象サンプル成分をＩＴＰで除去する。対象分析物のｐＫは例えば実験によるか又は分析物の既知分子構造に基づいて求めることができる。他の態様では、例えば対象分析物よりも遅い移動度と速い移動度をもつことがわかっている選択されたトレーリング電解液とリーディング電解液の組成の間に分析物を厳密に挟むことができる。分析物を挟むために電解液では例えば塩化物、ＴＡＰＳ、ＭＯＰＳ、及びＨＥＰＥＳ等の多数のイオンと緩衝液を使用することができる。場合により、サンプル溶液、トレーリング電解液、及び／又はリーディング電解液の粘度又はサイズ排除特性を調節することにより、電解液及び／又は分析物の移動度を調節することができる。ＩＴＰ溶液の移動度を調節するための別の手段としては、溶液の濃度、イオン強度、又は導電率を調節することにより、特に過渡的ＩＴＰ移動中に、分析物溶液及び／又は電解液の移動度を調節することができる。分析物、電解液、又はＩＴＰ溶液の移動度を調節するための更に他の手段として、溶液の温度を選択することができる。

本発明の方法では種々のサンプル溶液ローディング方法を分析に利用することができる。以下に詳述するように、スタッキングチャネルには単一サンプル溶液ロード、複数サンプル溶液ロード、及びサンプル溶液ロード間のスペーサー電解液をロードすることができる。

単一サンプルロードは例えば図５Ａ〜５Ｃに示すように、当分野で公知の技術に従ってサンプルローディングチャネルセグメントにロードすることができる。図５Ａに示すように、例えば電気浸透流（ＥＯＦ）又は差圧を使用してサンプルウェル５２からサンプル溶液５０をローディングチャネルセグメント５１に添加することができ、サンプル溶液はローディングチャネルセグメントを通り、ローディングチャネルセグメントから分岐する廃液チャネル５３を通って流出する。あるいは、図５Ｂに示すようにサンプルウェル５２と廃液ウェル５４の間の差圧の作用下でサンプル溶液５０をローディングチャネルセグメント５１に分岐ロードすることもできる。図５Ａ及び５Ｂにおいて、非流動下の他のウェルにおける圧力は無流動を確保するように調節する必要がある。別のサンプルローディング方法では、図５Ｃに示すように、サンプル容量を正確で整合的に規定するために廃液ウェル５４の相対減圧によりサンプル溶液５０、トレーリング電解液、及びリーディング電解液を「ピンチ流」として吸引することができる。

多重スタッキング技術を使用して付加量のサンプル溶液をＩＴＰのためにロードすることができる。図６Ａに示すように第１のサンプルをローディングチャネルセグメント６０にロードすることができる。電場をスタッキングチャネルセグメント６１に印加し、図６Ｂに示すように、サンプル分析物６２をスタッキングすることができる。図６Ｃに示すように、スタッキングされたサンプル分析物６２をローディングチャネルセグメント側に逆流させ、スタッキングされた第１の分析物に隣接するようにサンプル溶液の第２のロード６３をロードすることができる。スタッキングチャネルセグメントに２回目の電場印加を実施し、図６Ｄに示すように、第２のサンプル分析物６４をスタッキングすることができる。２回目のスタッキング中の初期にはトレーリング緩衝液から実質的に構成される分離ゾーン６５が存在するが、トレーリング電解液が電場で第２のスタック分析物よりも遅れるにつれて消滅する。最終的に、図６Ｅに示すように、スタッキングされた第１及び第２の分析物は電場の作用下で結合し、例えば第１のスタックの２倍の分析物量の多重スタック６６を形成する。多重スタックにおける分析物量はスタックプルバック、サンプルローディング、及びスタッキングのサイクルを追加することにより更に増加することができる。

場合により、スタッキングチャネルセグメントの横断面よりも大きい横断面をもつローディングチャネルセグメントに多量のサンプル溶液をロードすることができる。図７Ａに示すように、例えばサンプルウェル７２と廃液ウェル７３の間の差圧により大横断面ローディングチャネルセグメント７１にサンプル溶液７０をロードすることができる。電場の作用下で、図７Ｂに示すようにスタッキングチャネルセグメント入口の近傍にサンプル分析物７４を濃縮することができる。大横断面をもつローディングチャネルセグメントは横断面の小さい同等容量のローディングチャネルセグメントに比較して分析物の軸方向移動距離７５が短いため、短時間で分析物を濃縮することができる。場合により、例えば図７Ｃに示すように例えば差圧を印加してローディングチャネルセグメントをトレーリング電解液でフラッシュすることにより、その後のＩＴＰのために濃縮済みサンプル分析物７４に隣接する位置にトレーリング電解液７６を誘導することができる。

本発明の方法ではＩＴＰのためにスペーサー電解液を分析物サンプルセグメント間に挿入することにより利点が得られる。スペーサー電解液はトレーリング電解液とリーディング電解液の中間の移動度をもつことができる。スペーサー電解液は２種以上の対象分析物の中間の移動度をもつことができる。スペーサー電解液は例えば複数の対象分析物間に高い分解能を提供することができる。１態様では、ロードしたサンプル溶液にスペーサー電解液を加え、電場を印加すると分析物間のスペーサーゾーンを提供することができる。別の態様では、多重スタッキングサイクル間にスペーサー電解液をロードすることができる。例えば、最初のスタックの左側にスペーサー電解液を加えるか、ロードした１個以上のサンプル溶液セグメントにスペーサー電解液を加えるか、サンプル溶液セグメントのローディングサイクル間にスペーサー電解液をロードする以外は上記のように多重スタッキングを実施することができる。スペーサー電解液は対象分析物間のスペーサー移動を調整するようにトレーリング電解液とリーディング電解液の移動度を上記のように調節することができる。

電圧イベントの検出
例えばスタッキングチャネルセグメントにおける溶液、分析物、及び／又は電解液の移動に関連する電圧イベントを検出することにより、例えばスタッキングされた分析物の分離チャネルセグメントへの添加を開始するための整合的シグナルを提供することができる。ＩＴＰ中に、スタッキングチャネルセグメントの電位又はスタッキングチャネルセグメントの任意点で測定可能な電圧は経時的に変化し得る。各回のＩＴＰ間で整合性のある測定可能な電圧イベントが存在し、このような電圧イベントは整合的注入トリガとＩＴＰから別の分離スキームへの転換に有用なタイミンギマーカーとして利用することができる。

電圧イベントを検出する典型的態様では、ＩＴＰ中にトレーリング電解液、分析物、及びリーディング電解液がスタッキングチャネルセグメントを流れている。トレーリング電解液はリーディング電解液よりも電流に対する抵抗が大きい。例えば図８に示すようにスタッキングチャネルセグメントの中間点に電圧をモニターする電圧計を配置すると、ＩＴＰの進行と共に電圧イベントを検出することができる。サンプル溶液８０を最初にスタッキングカラム入口にロードして添加したときには、リーディング電解液８１がスタッキングチャネルセグメントを満たしており、チャネルセグメントの中間の接点８２で検出される電圧はＩＴＰ電場電圧の約２分の１である。分析物とトレーリング電解液８３がスタッキングチャネルセグメントを移動するにつれ、スタッキングチャネルセグメントの入口側の抵抗は増加し、その結果、図８Ｂに示すように、電圧計接点に検出可能な電圧が発生する。図８Ｃに示すように、スタッキングされた分析物がほぼ電圧計接点に到達する時点で接点の両側の電気抵抗の差は検出される電圧と共に最大に達する。最終的に、分析物がトレーリング電解液で実質的に満たされるようになったスタッキングチャネルセグメントの末端に近づくにつれ、接点の両側の抵抗は等しくなり、検出される電圧は図８Ｄに示すようにＩＴＰ電場電圧の約２分の１に戻る。電圧イベントはこの例では出発電圧値、電圧上昇開始、電圧上昇又は低下の変化率（傾き、凹状など）、最大電圧（電圧ピーク）、最大電圧で観察される傾きゼロ、出発電圧への復帰、予め決定された任意電圧、チャネルセグメントにおける位置間の任意相対電圧、２個以上の任意例イベント間の時間及び／又は同等物を含むことができる。例えばスタッキングチャネルセグメントの異なる点に配置された１個以上の電圧計接点で多少の差はあるが整合的な電圧曲線を観測することができる。これらの整合的な測定可能な電圧イベントは例えばスタッキングされた分析物を分離チャネルセグメントに添加するためにチャネルセグメントで電流又は差圧の転換をトリガするように選択することができる。

分離チャネルが完全な回路の一部でない場合（例えばアース接続のない「デッドエンド」）又は浮動電圧を分離チャネルセグメントに印加する場合には、スタッキングチャネルセグメントと電気的に接触している分離チャネルセグメントには実質的電流が流れない。電圧イベントを検出するための１好適構成では、分離チャネルセグメントとスタッキングチャネルセグメントの間の点、又は分離チャネルセグメントの任意位置に電圧計接点を配置することができる。１好適態様では、分離チャネルセグメント浮動電圧をモニターすることにより電圧イベントを検出することができる。

スキューイングチャネルにおける分離強化
スキューイングチャネルセグメントの通過中及び／又は通過後に分析物をスタッキングすることにより他のサンプル成分からの対象分析物の分離を強化することができる。例えば、対象分析物が等速電気泳動法で電解液により集束され続けている間に非対象サンプル成分がカーブにより分散される場合にはアッセイの感度を増加することができる。

分析システムのチャネルを流れる分析物バンドはチャネルが直線経路から分岐するときに分散することができる。例えば、図９Ａ〜９Ｄに示すように、カーブ９１の内側を流れる分析物９０はカーブの外側を流れる分析物よりも短い距離を移動する。最初は小さいバンドが図９Ｃに示すようにチャネルのより長い距離にスキューイング及び分散することができる。図９Ｄに示すように、スキューイングされたバンドの軸方向拡散はバンドを希釈し、バンドの再整列を阻止することができる。図９Ａのバンドに照準させた検出器はスキューイング及び拡散後の図９Ｄのバンドに照準させた検出器よりも強く狭い最大シグナルをバンドに検出する。バンドのこのような分散はピークが幅広く短くなるので多くのクロマトグラフィー分析で問題となる。しかし、本発明は例えば意図的に強化したスキューイングをＩＴＰ技術と併用し、非対象サンプル成分を分散させながら対象分析物をスタッキングすることにより分離を強化することができる。

例えば、１態様では、高い感度と改善された定量で少量の対象分析物を多量の非対象サンプル成分から分離することができる。例えば図１０Ａに模式的に示すようにスキューイングチャネルを備えないＩＴＰシステムでは、少量のスタッキング対象分析物１００が例えば選択されたトレーリング電解液とリーディング電解液の間で移動することができ、トレーリング電解液と同等の移動度をもつ多量の非対象サンプル成分１０１はトレーリング電解液の前端の近傍で移動する。検出器出力シグナルチャート１０３に示すように、チャネルに照準させた検出器１０２は分析物とサンプル成分のピークを分離することができない。例えば１個以上のスキューイングチャネルセグメントをスタッキングチャネルに導入することにより分析物感度と定量能を強化することができる。区分チャネル（図１０Ｂ）内を移動する分析物１００とサンプル成分１０１はスキューイングチャネル１０４（図１０Ｃ）でスキューイング及び分散することができる。スキューイングチャネルを出てからしばらくすると、リーディング電解液とトレーリング電解液の区分力によりチャネル内で分析物ピークを集束させて再整列することができるが、誘導されないサンプル成分ピークはスキューイングされたままであり、拡散される。チャネルに照準させた検出器は低下した低侵入性のサンプル成分バックグラウンドに対して分析物の存在と量を検出することができる。

電解液とサンプル成分の移動度の差を増加しながら分析物のスタッキング集束を強化するようにトレーリング及び／又はリーディング電解液を選択することによりスキューイングチャネルにおけるＩＴＰ分離の効果を増すことができる。選択的ＩＴＰでは、例えば分析物の既知移動度に近づくように及び／又は電解液と１種以上の非対象サンプル成分の移動度の差を増加するようにリーディング電解液とトレーリング電解液の移動度を選択する。例えば、対象分析物の移動度が非対象サンプル成分よりも大きい上記状況では、例えば分析物が厳密に誘導され、サンプル成分が遅れてスキューイングと拡散の効果を受けるように、サンプル成分よりも分析物に近い移動度をもつようにトレーリング電解液を選択することができる。同様に、対象分析物の移動度が非対象サンプル成分よりも小さい場合には、スキューイングチャネルＩＴＰ分離を強化するために分析物移動度とサンプル成分移動度の間にリーディング電解液の移動度を選択することができる。１好適態様では、対象分析物と１種以上の非対象サンプル成分の間で分析物の移動度に近くなるように電解液の移動度を選択する。別の例では、リーディング電解液とトレーリング電解液の両方を対象分析物の既知移動度に近くなるように選択することができる。これは速いサンプル成分と遅いサンプル成分の両方が分析物付近を移動する場合及び／又はＩＴＰ中に過渡的スタッキングが主流である場合に特に有利である。

スキューイングチャネルＩＴＰの有効性は例えば任意該当カーブの半径、チャネルの内径、チャネル壁の形状、スキューイングチャネルの横断面、流速、及び溶液の粘度等の因子に広く変動し得る。例えば、下記スキューイングチャネルＩＴＰシステムのセクションに記載するように、カーブ半径を短くしたり、同一方向のカーブを反復したり、対向するチャネル壁の表面長差を増加するチャネル形状にしたり、カーブの軸に垂直なチャネル横断面を広くすることにより、チャネル内のスキューイングを増すことができる。特定方法又はシステムに適した条件は例えば計算及び／又は実験により求めることができる。

拡散がカーブにより生じるスキューイングの量にどのように影響するかを検討するためには、二次元非定形移流拡散方程式（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ７３，Ｎｏ．６，１３５０−１３６０，Ｍａｒｃｈ １５，２００１も参照）：

（式中、Ｌは屈曲チャネルの長さであり、ｗは屈曲チャネルの内幅であり、Ｐｅ’_ｗは分散ペクレ数であり、ｕ’、ｃ’、ｔ’、ｘ’及びｙ’は夫々正規化速度、濃度、時間、軸方向チャネル寸法、及び横断方向チャネル寸法である）を検討することができる。本発明におけるスキューイングチャネルの影響下の分析物のスキューイングと分散には３個のパラメーターＰｅ’_ｗ、Ｌ、及びｗが特に重要であることが分かった。

ペクレ数（Ｐｅ）は分析物の移流（ないし前進）と拡散の比を表す無次元数である。Ｐｅが大きい場合には、第１のスキューイングチャネルの通過によりスキューイングされるピークは逆方向の第２のカーブにより反転させるに十分長い安定な斜め形状を維持することができる。Ｐｅが小さい場合には、スキューイングチャネルでスキューイングされるピークはスキューイングされたピークを拡散した幅広いピークに変換するために比較的短時間でチャネルの幅方向に拡散することができる。本発明の方法では、例えばスキューイングチャネル長とスキューイングチャネル内幅の概数比よりも大きいペクレ数を提供する条件（即ちＰｅ＞Ｌ／ｗ）がスキューイングチャネルに存在する場合に非対象サンプル成分を対象分析物から最も容易にスキューイング及び分散させることができる。条件がスキューイングチャネル長とスキューイングチャネル幅の比の約０．０１倍、０．１倍、１倍、１０倍、１００倍、又はそれ以上のペクレ数を提供する場合に、スキューイングチャネルＩＴＰで非対象サンプル成分のスキューイング、拡散、及び分散の有意効果を得ることができる。

ペクレ数に影響を与える条件としては例えば当業者に公知のようにチャネル内の分子の移流及び／又は拡散に影響を与える条件が挙げられる。例えば、Ｐｅは溶液の粘度、ゲルの存在、温度、分子濃度、チャネルを通る分子の速度、チャネルの直径、及び／又は同等物の影響を受ける。移流と拡散を制御する条件を調節することにより、例えば本発明のスキューイングチャネルセグメントの通過中及び／又は通過後にサンプル成分の望ましいレベルの分散を生じるようなペクレ数が得られる。

スタッキングされた分析物の分離チャネルへの添加
ＩＴＰによりスタッキングされた分析物は例えば分離チャネルセグメントとスタッキングされた分析物に電場又は差圧を印加することにより分離チャネルセグメントに注入することができる。電場及び／又は圧力は分析物を分離チャネルセグメントに移動又は流入させることができる。電場又は圧力の印加は上記のように整合的で機能的な分析物注入タイミングを提供するように電圧イベントを検出することによりトリガすることができる。分離チャネルセグメントへの電場又は差圧印加はスタッキングチャネルセグメントにおける電流の除去に一致し得る。電圧イベントと注入の間のタイミングはチャネル、交点、及び溶液セグメントの特定構造に適合するように設定することができる。このタイミングは転換後に残存する過渡的等速電気泳動量に影響すると思われるのでピーク分解能とシグナル強度の決定にも重要な役割を果たすと考えられる。

分離チャネルセグメントは分析物の電気泳動分離及び／又は選択媒体による分離の条件を提供することができる。好適態様では、分離チャネルセグメントは例えば小さい分析物サンプル容量を迅速に分離するために、マイクロスケール寸法（例えば、約１０００μｍ〜約０．１μｍ、又は約１００μｍ〜約１μｍの深さ又は幅）をもつ。分離チャネルセグメントは例えば分析物の分解に寄与することが可能な分離媒体（例えばｐＨ勾配、サイズ選択媒体、イオン交換媒体、粘度増加媒体、疎水性媒体、及び／又は同等物）をもつことができる。分離チャネルセグメント（及びスタッキングチャネルセグメント）はＥＯＦが望ましくない分離モードで電気浸透流（ＥＯＦ）を低減するためにゲル等の粘度増加媒体をもつことができる。分離チャネルセグメントは他のチャネルセグメントから独立していてもよいし、他のチャネルセグメント（例えばローディングチャネルセグメント及びスタッキングチャネルセグメント）とチャネルの全部又は一部を共有していてもよい。１好適態様では、分離チャネルセグメントは独立しているが、スタッキングチャネルセグメントの長手方向の所定点で流体接触により交差している。

典型的な態様では、ピーク電圧がスタッキングチャネルセグメントと分離チャネルセグメントの交点で検出されると、ＩＴＰ分離からのスタッキングされた分析物が分離チャネルセグメントに注入される。例えば、図１１Ａに示すように、トレーリング電解液１１２とリーディング電解液１１３の間に挟まれたスタッキングされた分析物１１１がＩＴＰで分離チャネルセグメントとスタッキングチャネルセグメントの交点の電圧計接点を越えて移動するにつれて分離チャネルセグメント１１０内の浮動電圧は最大に達する（と共に電圧変化速度ないし電圧曲線の傾きはゼロになる）。図１１Ｂに示すように、電圧最大値はスタッキングされた分析物１１１の分離チャネルセグメントへの移動（添加）を誘導するために、スタッキングチャネルセグメントにおけるＩＴＰ電場の除去と、分離チャネルセグメントにおける電気泳動電場の印加をトリガすることができる。分析物が分離チャネルセグメントの選択媒体を通って移動すると、図１１Ｃに示すように、ＩＴＰ中にスタッキングチャネルセグメントを通って分析物と共に同時移動した非対象サンプル成分１１５から対象分析物１１４を分離（分解）することができる。所定態様では、ＩＴＰ中に一緒に又は相互に近接してスタッキングされた複数の対象分析物は分離チャネルセグメントで例えばキャピラリーゾーン電気泳動により相互に分離することができる。

代替注入タイミングスキームも当業者に自明である。このような代替スキームは例えば計算もしくはモデルに基づくものでもよいし、実験により決定してもよい。例えば、チャネル容量、チャネル形状、電圧計接点位置、電圧イベントの選択、電圧イベントに影響を与える溶液特徴に対する分析物の位置、及び／又は同等物に基づいてトリガされた応答に時間遅延を組込むことができる。分析物が（定常状態にまだ達していない）過渡的ＩＴＰでトレーリング電解液界面の近傍にスタッキングされ、残りのサンプル溶液ボーラスが高抵抗をもつ１特定例では、適切なトリガタイミングはスタッキングされた分析物が分離チャネルセグメントとの交点に到達するまでの付加移動時間を見越して電圧ピークから所定時間後とすることができる。

分離チャネルセグメントへの電場印加は自動とすることができる（即ち手動転換が不要）。このような自動電場印加は例えば当分野で公知の電子装置とアルゴリズムにより実施することができる。例えば、接点の電圧が設定レベルに達したらスイッチを作動させるように電圧計を設定することができる。１好適態様では、予め設定されたパラメーター（例えば規定電圧イベントの発生）に従ってアクチュエーターの転換を開始するように論理装置（例えば集積回路やコンピューター）をプログラムすることができる。

分析物の検出
本発明の方法により分離された分析物は分離チャネルセグメントで及び／又は分離チャネルセグメントから溶出後に逐次検出することができる。検出チャネルで分析物をモニターするか、チャネルセグメントで分析物を逐次走査するか、又は完全なチャネルの連続イメージングを提供するのに適した検出器を例えば固定することができる。

適切な検出器は多くの場合には検出する分析物の種類により決定される。例えば、蛋白質と核酸は多くの場合には特定光吸収波長の分光光学的モニターにより検出することができる。多くのイオン性対象分析物は溶液導電率の変化をモニターすることにより検出することができる。多くの分析物は蛍光性であるか又は蛍光光度計を使用して検出できるように蛍光マーカーで標識することができる。溶液中の多くの分析物、特に炭水化物は屈折率測定により検出することができる。

典型的な態様では、検出は顕微鏡レンズでチャネルに照準させた光電子増倍管（ＰＭＴ）を使用して光源の分離チャネルセグメント透過をモニターすることにより実施することができる。適当な励起光源（例えばレーザー又はランプからのフィルター光）の付加によりこのような装置を蛍光検出器として構成する方法は当業者に自明である。場合により、マイクロフルイディックチップ上の任意位置をモニターするようにＸ−Ｙ軸走査メカニズムにレンズを搭載してもよい。このような装置では、例えばｐＨ勾配に伴って分解された分析物を分離チャネルセグメントの長さ方向に走査することができる。別の態様では、チャネルセグメントから溶出する荷電分析物をモニターするように、分離チャネル出口に導電率計センサーを搭載することができる。

検出器はアッセイ結果を文書化するためにデータ保存装置及び／又は論理装置と連動させることができる。検出器（例えばＰＭＴや導電率計）からのアナログ出力をチャートプロッターに供給し、分析物分離プロフィルのパターンを用紙に記録することができる。アナログディジタルコンバーターによりデータ保存、分離プロフィル表示、及び／又はアッセイ評価のために検出シグナルを論理装置に伝達することができる。ディジタル論理装置は回帰分析からの適当な標準曲線との比較により分析物の定量を著しく容易にすることができる。

分析物注入システム
本明細書に記載する動電学的分析物注入システムは高度に整合的な方法で高分解能の高感度分析物検出を実施することができる。スタッキングチャネルセグメントに選択的にスタッキングされた分析物をチャネルにおける電圧イベントの検出に基づく精密なタイミングで分離チャネルセグメントに注入（添加）することができる。このような精度は自動注入サブシステムを備えることにより高めることができる。

本発明のシステムは一般に例えばチャネルにスタッキングする分析物と、コントローラーと連動しており、１個以上の位置でチャネルと接触している電圧検出器を含み、選択された電圧イベントが電圧検出器により検出され、コントローラーに伝達された場合に電流又は差圧がチャネルに設定される。チャネルは相互に交差するか、連続チャネルを形成するか、又は共通チャネルセクションを共有するスタッキングチャネルセグメントと分離チャネルセグメントを含むことができる。分離チャネルセグメントに添加され、分離された分析物は例えば論理装置と連動する検出器により検出され、特定分析物の存在を測定するか又は分析物の量を評価することができる。

チャネル
本発明のチャネルは例えばローディングセグメント、スタッキングセグメント、分離セグメント、及び／又は検出セグメントを含む単一の多機能チャネルとすることができる。場合により、チャネルは交点で流体接触する別々のローディングチャネルセグメントとスタッキングチャネルセグメントと分離チャネルセグメントを含むことができる。１好適態様では、図１１に模式的に示すように、ローディングチャネルセグメントはスタッキングチャネルセグメントの延長であり、分離チャネルセグメントは分析物注入が行われる交点を介してスタッキングチャネルセグメントと流体接触する。システムのチャネルは当分野で公知の任意のもの（例えばチューブ、カラム、キャピラリー、マイクロフルイディックチャネル、及び／又は同等物）とすることができる。１好適態様では、チャネルは例えばマイクロフルイディックチップのマイクロスケールチャネルである。

マイクロフルイディックデバイスのチャネルは射出成形、フォトリソグラフィー、エッチング、レーザーアブレーション等により基板の表面に形成することができる。チャネルはマイクロスケール寸法（例えば約１０００μｍ〜約０．１μｍ、又は約１００μｍ〜約１μｍの幅又は深さ）をもつことができる。流体は例えば電気浸透流、毛管作用（表面張力）、差圧、重力及び／又は同等手段によりチャネル内を流れることができる。チャネルの末端は例えば溶液のウェル及び／又は他のチャネルもしくはチャンバーとの交点に配置することができる。チャネルは分析物を分離するため又はＥＯＦを誘導するために電場及び／又は電流を提供するように例えば各末端に電気接点を備えることができる。検出器は該当パラメーター（例えば電圧、導電率、抵抗、キャパシタンス、電流、屈折率、吸光度、蛍光、圧力、流速、及び／又は同等物）をモニターするためにチャネルと機能的に連動することができる。マイクロフルイディックチップは機能的情報通信接続及び補助計器とのユーティリティー接続（例えば電力接続、真空源、空気圧源、油圧源、アナログ及びディジタル通信ライン、光ファイバー等）を備えることができる。

チャネルは例えば１個以上のサンプル溶液容量をチャネルに導入するためのロードチャネルセグメントを含むことができる。このようなローディングチャネルは当業者に自明の方法で構成することができ、例えば図１２に示すようにコレクターチューブ１２０をマイクロフルイディックチップに付加するようにインジェクターループとして構成するか、及び／又は図５Ａ〜５Ｃに模式的に示すようにフラッシュ型チャネルセグメントとして構成することができる。ローディングチャネルセグメントは大量のサンプル溶液からスタッキングチャネルセグメント入口の近傍で分析物を迅速に濃縮するように、図７に示すようにスタッキングチャネルセグメントの横断面よりも大きい横断面をもつことができる。

システムのチャネルは移動とチャネルの流量特性に有利な効果を与えるようにゼラチン状物質を添加することができる。これは、例えば米国特許出願第６０／５００，１７７号，“Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ”（出願日２００３年９月４日）に記載されており、その内容全体を参考のためここに組み入れる。分離の電気泳動性を高めながら溶液の望ましくない電気浸透流を低減するためにゲルをチャネルに添加することができる。ゲルは大型分子の進行を遅らせることにより分析物及び／又は電解液の相対移動速度に影響を与えることができる。ゲルはスタッキングチャネルセグメントにおける分析物とＩＴＰ電解液の移動ゾーンの調節を助長するツールとして機能することができる。例えば、対象分析物は一般に通常使用されるＩＴＰ電解液よりも大きい。スタッキングチャネルセグメントにゲルを添加することにより、迅速な分析物（大型で電荷対質量比が大きい）をリーディング電解液の小分子塩又は緩衝液の後から移動するように遅らせることができる。場合により、ゲルはトレーリング電解液よりもほんの僅かだけ先に移動するように分析物を遅らせることができる。大型分子移動に対するゲル抵抗性は例えばゲルの種類、ゲルマトリックスの濃度、及びゲルマトリックス架橋度を変えることにより調節可能である。ゲルはスタッキング又は分離チャネルセグメントで分析物の濃縮及び／又は分解を強化することができる。スタッキングチャネルセグメント又は分離チャネルセグメントに１種以上の異なるゲルを添加することができる。本願発明の方法を実施する際、ポリアクリルアミドゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、スクロースとエピクロロヒドリンとのコポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ｐＤＭＡ）、又はアガロースゲルを含めて、種々の異なるゲルを制限なく使用できる。好ましくはこのゲルは、本デバイスのマイクロフルイディックチャネル中に約０．１〜３．０％、例えば約０．９〜１．５％の濃度にて存在する。

スタッキングチャネルセグメントはその後の分解と検出のために分離チャネルセグメントに注入するために対象分析物を例えばＩＴＰにより対象分析物を選択的にスタッキングするように機能することができる。スタッキングチャネルセグメントは分析物スタッキングに適した電場を印加するために例えば各末端に電気接点を備えることができる。スタッキングチャネルセグメントは圧力駆動流（例えば上記「対象分析物のスタッキング」のセクションに記載した多重スタッキング技術の電解液ローディング又はプルバック）を実施できるように例えば外部駆動空気圧又は油圧マニホールドと流体接触することができる。スタッキングチャネルセグメントは上記方法のセクションに記載したように、例えば等速電気泳動（ＩＴＰ）に適した電解液（例えばトレーリング電解液、スペーサー電解液、及び／又はリーディング電解液）を添加することができる。スタッキングチャネルセグメントは図１に示すようなトレーリング電解液ウェル１８と電解液をチャネルセグメントに導入するためのリーディング電解液ウェル１９を備えることができる。

分離チャネルセグメントは例えばＩＴＰの付加サイクル、イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、及び／又は同等技術等の分離技術によるその後の分解のためにスタッキングされた分析物をスタッキングチャネルセグメントからの注入により受け取ることができる。分離チャネルセグメントはチャネルセグメントに電場を印加するための電気接点及び／又は流体流を駆動するための圧力源との外部接続を含むことができる。分離チャネルセグメントは例えばスタッキングチャネルセグメントと交差するチャネルセグメント、スタッキングチャネルセグメントとの共通チャネルに連続するチャネルセグメント、及び／又はスタッキングチャネルセグメントとチャネルセクションを機能的に共有するチャネルセグメントとすることができる。典型的な態様では、分離チャネルセグメントは図１１に示すように、スタッキングチャネルセグメントの長手方向の所定点でスタッキングチャネルセグメントと交差する。この態様では、スタッキングされた対象分析物が分離チャネルセグメントに注入された後に非対象サンプル成分は別個のスタッキングチャネルセグメントセクションに残存することができる。他の態様では、例えばスタッキングチャネルセグメントと分離チャネルセグメントは介在交点なしに共通チャネルに機能的に存在することができる。例えば、図１３Ａに示すように、例えば電圧イベントが検出されるまでチャネルセグメントでスタッキングが持続することができる。電圧イベントが検出されると、分離モードに遷移するようにチャネル内の条件が変化し得る。このような遷移としては例えば図１３Ｂに示すように、サイズ排除樹脂１３１への分析物流を誘導するためのチャネル末端１３０間の差圧印加が挙げられる。小分子は大分子の前に検出器１３２を越えて溶出する。分離モードへの遷移の他の例としては例えば電流の方向の変化、流体流の方向の変化、チャネルへの分離用緩衝液の注入、電場電圧の変化、及び／又は同等物が挙げられる。

スキューイングチャネルＩＴＰシステム
本発明の等速電気泳動システムは非対象サンプル成分からの対象分析物の分離を強化するためにスタッキングチャネル内及び／又はその手前にスキューイングチャネルセグメントを含むことができる。対象分析物がスタッキングにより例えばスキューイングチャネルに集束される間にサンプル成分を分散させることができる。分離強化は例えば累積的に大きな角度でカーブさせるか、鋭くカーブさせるか、スキューイングチャネル横断面の幅を比較的大きくするか、異なる長さの対向表面をもつスキューイングチャネル形状とするか、及び／又はスキューイングチャネル長とスキューイングチャネル幅の概数比よりも大きいペクレ数を提供する条件をもつスキューイングチャネルシステムとすることにより助長することができる。

スキューイングチャネルセグメントにおけるスキューイングと分散を増加する１つの方法はチャネルのカーブ角度を大きくする方法である。二次元面において、カーブ角度は例えば図１４Ａ〜１４Ｃに示すように連続スパイラルカーブや交互蛇行カーブにより累積することができる。スパイラルカーブはカーブ角度が１方向に大きな角度で累積できると同時にスキューイングが累積するという利点がある。スパイラルスキューイングチャネルの欠点としてはカーブ半径の連続拡大という固有の特徴により曲率の効果が低下する点が挙げられる。スパイラルスキューイングチャネル構成は内側チャネル末端との接続のためのアクセスが困難であるという問題もある。スパイラルスキューイングチャネル構成でアクセスし易いチャネル末端を提供する１つの方法は図１４Ｂに示すように、中心から内側と外側に並列してスパイラルチャネルを延ばす方法である。あるいは、例えば図１４Ａに示すように、例えば別の面のシッパーチューブ又はバックチャネルにより第３の次元にスパイラルチャネル末端とのアクセスを提供することができる。スパイラルチャネルの長さに関する別の制約はスパイラルチャネルの長さが増加するにつれて最適スキューイングに必要なペクレ数が増加するという点である。図１４Ｃに示すような蛇行スキューイングチャネルはチャネル末端にアクセスし易いが、特にペクレ数が大きい場合やカーブ間の時間が短い場合には相補的カーブが先のカーブのスキューイングを相殺する可能性がある。場合により、ヘリックスやコイル等の三次元スキューイングチャネルを利用することができる。

スキューイングチャネルセグメントの通過によるスキューイングと分散はチャネル内径に対して鋭いカーブを形成するチャネルでより強化することができる。例えば、チャネル内径とカーブ幅の比が大きいスキューイングチャネルのほうがスキューイングは増加する。１態様では、チャネルの横断面がカーブ半径に垂直な方向（スキューイングチャネル深さ）よりもカーブの半径方向（スキューイングチャネル内幅）に大きい寸法をもつ場合に、カーブしたスキューイングチャネルセグメントによるスキューイングは増加する。

スキューイングチャネルセグメントの形状は移動する分析物のスキューイングと分散に影響を与え得る。例えば、カーブの外側の移動距離とカーブの内側の移動距離の比を増加するようなチャネル表面外形はスキューイングを増加することができる。カーブ点におけるチャネル内幅とチャネル深さの比を増加することによりスキューイングを増加することができる。図１５に示すように、分析物１５０は球状カーブ外面をもつカーブを流れることにより高度にスキューイングすることができる。図１６に示すように、スキューイングチャネル全体がカーブしていなくても、スキューイングチャネルの第１の側１５１の表面移動距離がスキューイングチャネルの第２の側１５２の表面移動距離よりも大きいスキューイングチャネルではスキューイングを強化することができる。例えば、対向表面間の移動距離の差を＞約５００％〜１００％、〜５０％、〜１０％、又はそれ以下までの範囲とすることにより有意スキューイングを提供することができる。

本発明のスキューイングチャネルＩＴＰシステムの重要な１側面はリーディング電解液とトレーリング電解液の間に対象分析物を選択的にスタッキングする点である。スキューイング中及び／又はその後に非対象サンプル成分を分散させながら対象分析物を電解液間に連続的に再集束させることができる。対象分析物の移動度は計算又は実験データから知ることができる。トレーリング電解液及び／又はリーディング電解液は対象分析物と侵入性の非対象サンプル成分の間の移動度をもつように選択することができる。分析物の集束とサンプル成分の分散を強化するためには、サンプル成分よりも対象分析物に近い移動度をもつように電解液を選択することができる。

上記分析物注入システム及び方法にスキューイングＩＴＰチャネルセグメントを組込むことができる。スキューイングチャネルＩＴＰによる他のサンプル成分の分散後に対象分析物をより高純度で分離チャネルに注入することができる。電圧イベントが検出されたら分析物の注入を開始することができる。

スペーサー分子を用いたＩＴＰ及びサンプル成分ピークの単離
本発明は本発明の等速電気泳動システムの分解能の精密さを改善する更なる技術を提供する。これらの更なる技術は、例えば同時係属の米国特許出願第６０／５００，１７７号、“Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ”（出願日２００３年９月４日）に記載の蛍光標識抗体コンジュゲートを用いて移動度シフトイムノアッセイを行う本発明の教示を用いるとき格別の利用可能性が見いだされる。移動シフトイムノアッセイは生体分子間の関連性を検出し定量化するのに有効な方法である。例えば電気泳動又はクロマトグラフアッセイ中の分子の滞留時間の変化は、結合分子の存在を示し得る。結合は例えば抗体?抗原相互作用の場合に特異的となり、例えば正に荷電した分子と負に荷電したポリマーとのイオン引力の場合に非特異的となり得る。

移動シフトは親和性分子と分析物とのその他の相互作用でも観測できる。移動シフトは例えば抗体が抗原に結合するとき、又は多糖がレクチンに結合するとき観察できる。しかしながら、これらの分子のクロマトグラフィー又は電気泳動では、しばしば、それらの分子の複数の配座と不安定な電荷密度ゆえに広くて不十分に分解されたピークが得られる。可能な親和性分子／分析物の対は多様なので、各対に対して特別の移動シフトアッセイの開発も必要となる。これらの問題は、もし親和性分子が１組の標準的な条件下でのアッセイにおいて高度に分解されるキャリヤーポリマーに結合されているならば、回避できる。キャリヤー／親和性分子コンジュゲートを用いた技術の例が、例えば日本国特許出願番号ＷＯ０２／０８２０８３，“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ“に記載されており、参考としてその全体をここに組み込む。移動シフト分析において親和性分子に一様なキャリヤー分子を使用することで分解能を改善できるが、特に結合反応の動力学を加速しかつアッセイのダイナミックレンジを改善するために、標識抗体コンジュゲートが非常に過剰に使用されるとき、過剰な標識抗体コンジュゲートピークによる干渉の問題が残る。例えば、過剰な標識抗体コンジュゲートを加える際に生じる問題は、しばしば電気泳動分離パターン中に大きなピークが生成されることであり、この大きなピークはサンプル中の抗原又は分析物の存在を検出するのに用いられる抗原結合コンジュゲート（すなわち抗原複合体）の検出と干渉し得る。

したがって、移動シフトアッセイ、特に親和性分子キャリヤーを利用するアッセイにおける過剰な標識コンジュゲート移動ピークからの干渉を阻止又は実質的に除去する方法が依然として必要とされている。例えば、第２の抗体コンジュゲートを結合反応混合物に添加すると抗原複合体の移動度が抗体コンジュゲートピークからさらにシフトするといった、この問題に対処するのに用いることのできるいくつかの技術が、例えば米国特許第５，９４８，２３１号に記載されており、その内容全体を参考のためここに組み込む。加えて、リーディング電解液イオンとトレーリング電解液イオンとの中間の移動度のスペーサー分子を用いた等速電気泳動技術の使用により、抗体コンジュゲートと抗原複合体ピークとの間のさらなる開きが得られ、それらのピークの分解能の改善に役立ち得る。例えば、Ｋｏｐｗｉｌｌｅｍ，Ａ．他，“Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｐａｃｅｒｓ”Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ．（１９７６）１１８：３５−４６、及びＳｖｅｎｄｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．他，“Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ Ｃａｒｒｉｅｒ Ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ ａｓ Ｂｕｆｆｅｒ ａｎｄ Ｓｐａｃｅｒ Ｉｏｎｓ ｉｎ ａｎ Ｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ” ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ，ｔｈｅ ＫＬＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９７０）１７：１３−１７に記載されており、その内容全体を各々参考としてここに組み込む。

しかしながら、このような技術を使用してさえも、大濃度の標識抗体コンジュゲートが用いられ、少量（例えば約１ピコモル以下のオーダー）の分析物（例えば抗原）がサンプル、例えば複雑なヒトの血清サンプル中に存在しているときには、抗体コンジュゲート移動ピークは依然として抗原複合体の領域中に分散する傾向にあり、それによりアッセイの検出感度が影響されることが分かった。

ここに記載の本発明の教示は、複合体をマイクロフルイディックデバイスの分離チャネルに注入する前にコンジュゲートを抗原複合体から分離することにより、干渉の抗体コンジュゲート源を実質的に除去するのに用いることができる（例えば抗原複合体がサンプル中の他の汚染成分から分離される場合）。特に、後にさらに説明するように、サンプル（例えば体液又は組織サンプルに由来する臨床サンプル）中の少なくとも第２の成分（例えば過剰な標識抗体コンジュゲート）から第１の対象成分（例えば抗原複合体）を分離する方法が開示され、一般にこれは、等速電気泳動により第１の成分及び第２の成分を第１チャネルセグメント中にスタッキングし；スタッキングされた第２の成分を、交点にて第１チャネルセグメントに流体連結された第２のチャネルセグメントを通して流し；交点にて、又は該交点の近くにてスタッキングされた第１及び／又は第２の成分に対応する予め選択された電気信号を検出し；そして予め選択された電気信号が検出されると、該交点に流体連結された第３のチャネルセグメントに沿って電場又は差圧を加え、それによりスタッキングされた第１の成分を第３のチャネルセグメントに導入することを含む。この方法はさらに、スタッキングされた第１の成分を第３のチャネルセグメント内で分離成分に分離し、該分離成分を検出することを含んでもよい。

特定の１態様では、上記スタッキングは、リーディング電解質緩衝液と、トレーリング電解質緩衝液と、リーディング電解液イオンとトレーリング電解液イオンの電気泳動移動度の中間の電気泳動移動度のスペーサー分子を有するスペーサー緩衝溶液とを第１のチャネルセグメントに導入し、そして等速電気泳動により第１及び第２の成分をスタッキングすることを含む。リーディング電解液は、例えば塩化物、臭化物、フッ化物、リン酸塩、酢酸塩、硝酸塩及びカコジル酸塩の塩からなる群から選択できる。トレーリング電解液は、例えば、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＭＯＰＳ（３−（４−モル−ホルニル）−１−プロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（４−モルホリニル）エタンスルホン酸）、グリシン、アラニン、β−アラニンなどからなる群から選択できる。スペーサー分子は、例えば、ＭＯＰＳ（３−（４−モル−ホルニル）−１−プロパンスルホン酸）、アンフォライン、アミノ酸、ＭＥＳ、ノナン酸、Ｄ−グルクロン酸、アセチルサリチル酸、４−エトキシ安息香酸、グルタル酸、３−フェニルプロピオン酸、フェノキシ酢酸、システイン、馬尿酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、イソプロピルマロン酸、イタコン酸、シトラコン酸、３，５−ジメチル安息香酸、２，３−ジメチル安息香酸、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、及び５−ｂｒ−２，４−ジヒドロキシ安息香酸からなる群から、又はリーディング電解質緩衝液とトレーリング電解質緩衝液とに存在するイオンの電気泳動移動度の間にある電気泳動移動度のイオンを含む他の任意の適当なスペーサーから選択できる。スペーサー分子は、スペーサー分子とリーディング及びトレーリング電解液との間のイオンフロントにて、スタッキングされた第１の成分とスタッキングされた第２の成分との間に分離領域を与える。

サンプルの等速電気泳動は、第１及び第２のチャネルセグメントの両端に電位を加えて第２の成分をスタッキングして第２のチャネルセグメントに流すことによって行うことができる（スタッキングされた第１の対象成分から単離されている場合）。上述したように、第１の成分は、例えば蛍光標識抗原−抗体複合体を含むことができ、第２の成分は蛍光標識抗体（例えば標識ＤＮＡ−抗体コンジュゲート）を含むことができる。好ましくは第１及び第２の成分は、両方とも荷電し、その際、第１及び第２の成分は両方とも負に荷電していてもよいし、若しくは両方とも正に荷電していてもよいし、又は一方の成分が正に荷電し、もう一方が負に荷電してもよい。第１及び第２の荷電成分はまた、例えば核酸、蛋白質、ポリペプチド、多糖、及び合成ポリマーからなる群から選択することもできる。

電気信号を検出するステップは、例えば、第１及び第２のチャネルセグメントの交点にて、又は交点の近くで光信号、電圧信号、又は電流信号を検出することを含み得る。したがって、等速電気泳動スペーサー分子と、主要分離チャネルから単離されたサイドチャネル中の不要な成分移動ピークを捕らえることを可能にするマイクロフルイディックチャネル網設計及びアッセイスクリプトとの組み合わせを用いることによって、等速電気泳動により得ることのできる分解能の精密さを実質的に改善できることが分かった。

次に図１７には、スペーサー分子を用いて等速電気泳動を行うのに有効であり、かつ対象成分ピークを望ましくない成分ピークから分離及び単離するのに有効な１つの代表的なマイクロフルイディックチップチャネル構成の模式図が示されている。図１７のマイクロフルイディックチップは、全体的に示されたチャネル網１５０を含み、該チャネル網１５０はいくつかのチャネル又はチャネルセグメントを含み、そのいくつかは緩衝液又は電解液レザバーが終点である。具体的には、このチャネル網は、トレーリング電解質緩衝液レザバー１６０が終点のチャネルセグメント１６２と、廃液レザバー１６８が終点のチャネルセグメント１６６と、ＭＯＰＳなどのスペーサー緩衝液を含んだサンプル（及びスペーサー緩衝液）レザバー１７４が終点であるチャネルセグメント１７２と、廃液レザバー１８０が終点のチャネルセグメント１７８と、ＩＴＰスタッキングチャネルセグメント１８２と分離チャネルセグメント１９４との流体接合部にある短い相互連結チャネルセグメント１８４（これはさらにチャネルセグメント１８６及び１９０に接合し、これらの終点はそれぞれスペーサー緩衝液レザバー１８８とリーディング電解質緩衝液レザバー１９２である）と、それぞれリーディング電解質緩衝液レザバー１９８及び２０２が終点のチャネルセグメント１９６及び２００とを含む。それぞれの緩衝液レザバーの組成はマイクロフルイディックチップの特定の使用に依存して変わり得ることに留意されたい。リーディング電解液レザバー１９２、１９８、及び２０２には、いずれのサンプル成分の移動度よりも高い電気泳動移動度のイオンを有する電解質溶液が充填される。トレーリング電解液レザバー１６０には、いずれのサンプル成分の移動度よりも低い電気泳動移動度のイオンを有する電解質溶液が充填される。スペーサー緩衝液レザバー１７４及び１８８には、リーディング電解液とトレーリング電解液の中間の電場中の電気泳動移動度のイオンを有する電解質溶液が充填される。この場合、サンプルは、スペーサー緩衝液レザバー１７４中に置かれ、少なくとも２つの異なるサンプル成分、例えばＤＮＡ抗体コンジュゲートと抗原−ＤＮＡ−抗体複合体とを含む。

マイクロフルイディックチップはまた、いくつかの連結チャネルセグメント１６４、１７０、及び１７６、並びにＩＴＰスタッキングチャネルセグメント１８２とそれに流体連結された分離チャネルセグメント１９４とを含み、全チャネル網を完成する。該チップのレザバーは、真空（又は圧力）源に連結されるよう適合し、かつ／又は電極を受け入れるよう適合しているか、又はその両方である。システムのレザバー内で圧力及び／又は電圧を選択的かつ独立に変えるための手段を備えたマルチポート圧力制御マイクロフルイディックデバイス及びシステムの例が、例えば、同時係属の米国特許出願第０９／７９２，４３５号，“Ｍｕｌｔｉ−Ｐｏｒｔ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ”（２００１年２月２３日出願）に記載されており、その内容全体を参考のためここに組み入れる。どこに使用されても適当なレザバー内に配置される電極は、電極と関連レザバー内の液体が接触するように基板上に形成するか、又は例えば基板上に配置するための電極プレート上に独立に形成することができる。各電極は、様々な電極への出力電圧（又は電流）を制御する制御装置又は電圧コントローラー（図示せず）に動作可能に接続される。真空又は圧力源（図示せず）もまた設けられ、適当な真空（又は圧力）を１個以上の関連のレザバーに供給する。上記の同時係属の米国特許出願第０９／７９２，４３５号に記載のように、マルチレザバー圧力コントローラーを複数の独立に制御される圧力調節器に接続し、マイクロフルイディックチャネル網のチャネル内で流体を圧力により移動させることができる。マイクロフルイディックデバイスのレザバーに加える圧力を選択的に制御し変えることにより、交差するマイクロフルイディックチャネル内で流体力学的な流れを所望の流速に正確に制御できる。圧力により誘導された流れを、動電学的な流体制御と組み合わせることもでき、それにより、サンプルをシステムのチャネルにロードするのに有効でかつ本発明によりＩＴＰに基づいたアッセイを実行するのに有効な複合的な圧力／動電学によるフロー制御システムが提供される。図１７には１つのチャネル網のみが示されているが、本デバイスは上記チャネル網の一般的な特徴を各々が有するチャネル網アレーを含み得ることが分かる。

スペーサー分子を用いた等速電気泳動を使用して最初のサンプルスタッキング段階を実行するためにサンプルをチャネル網にロードするには、動電学的な流体輸送に関連した電場により生じるサンプルバイアス効果の低下を支援するために、圧力により誘導されるフロー制御を用いてサンプルをロードするのが好ましい。しかしながら、ここに記載のサンプルローディング技術はまた、必要に応じて動電学的な流体制御及び輸送に基づくこともできる（例えばシステムにマルチポート圧力制御能力が備わっていない場合）ことが分かる。まず真空が廃液レザバー１６８及び１８０に印加され、一方で対応する逆圧力（又は真空）がレザバー１８８に印加されてスペーサー緩衝溶液がチャネルセグメント１８６に流れるのを阻止する。真空がレザバー１６８及び１８０に印加されると、終端の電解液１６０がチャネルセグメント１６４に流入して充填され、一方でスペーサー緩衝液レザバー１７４内に配置されたサンプルはチャネルセグメント１７０及び１７６に流入して充填される。加えて、緩衝液レザバー１９２、１９８及び２０２からのリーディング電解液はチャネルセグメント１８２及び１９４に流入して充填される。よって、このようなフローパターンにより、サンプル及びスペーサー緩衝溶液がチャネルセグメント１６４中のトレーリング電解質溶液とチャネルセグメント１８２及び１９４中のリーディング電解質緩衝溶液との間に挟まれて配置される。

次に、ＩＴＰによってサンプルを２つ（又はそれより多くの）小容量（例えばサンプル中のＤＮＡ抗体コンジュゲート及び抗原複合体に対応する）にスタッキングさせるために、レザバー１６０及び１９２に流体接触した電極間に正の電圧勾配が作られ、これにより、サンプルがそれらの夫々のチャネルセグメントを通って移動する際にチャネルセグメント１７０、１７６及び主要スタッキングチャネルセグメント１８２中でＩＴＰが生じる。スペーサー緩衝液（図１８Ａ〜Ｄ中“ＳＰ”で示す）により、スペーサーとリーディング及びトレーリング電解質緩衝溶液（図１８Ａ〜Ｄ中それぞれ“Ｌ”と“Ｔ”で示す）との間のイオンフロントにて、サンプル中のこれら２つのスタッキングされた容量２１０及び２１２間、例えばこの場合にはスタッキングされた抗体コンジュゲートピーク２１０とスタッキングされた抗原複合体ピーク２１２との間に分離領域が与えられる。このことは図１８Ａ〜Ｄ及び図１９に最もよく示されている。抗原複合体ピーク２１２より速く進む抗体コンジュゲートピーク２１０は、まずサイドチャネル１８４に移動してチャネルセグメント１９０を通ってレザバー１９２に向かうことが可能にされる。電圧検出器（例えば電圧計）及び／又は光検出器をチャネルセグメント１８８及び１９２の交点１８７とセンシング自在に配置し、サンプルが交点１８７を通る際にサンプルの電圧サイン及び／又は光信号をモニターする。ここで用いられているように、「センシング自在に」なる表現は、特定の場所、例えばマイクロスケールチャネルから特定の信号を受け取るよう配置されている検出システムについていう。例えば、センシング自在な光検出器とは、マイクロスケールチャネルの透明な領域又は当該流体交点若しくは接合部に隣接して配置され、かつ光検出器がチャネルからの光信号、例えば蛍光、化学ルミネセンスなどを受光して検出するように構成された検出器をいう。一般にこのような構成は、適当な対物レンズと、検出可能なレベルの光信号を集めるべく流体要素又はチャネルに十分に近接して配置された光学部品類との使用を含む。顕微鏡ベースの検出器、例えば蛍光検出器は当該技術においてはよく知られている。例えば米国特許第５，２７４，２４０号及び米国特許第５，０９１，６５２号を参照のこと。これら各々は参考のためここに組み込む。

上述したように、スタッキングされた第２の成分２１０に対応するピーク電圧が交点１８７で検出されると、図１８Ｃ〜Ｄに示されるように、検出された電圧サインが、適当な処理手段を介してレザバー１６０及び１９２間で生成されたＩＴＰ電場の除去をトリガし、それに続いてキャピラリー電気泳動（ＣＥ）電場を分離チャネルセグメント１９４に印加してスタッキングされた第１の成分ピーク２１２を分離チャネルセグメントに移動（添加）させることができる。上述したように電圧勾配の切り替えのタイミングを取るために、交点１８７から（又は例えば図１９のチップ構成ではＩＴＰスタッキングチャネルセグメント１８２と分離チャネルセグメント１９４との流体接合部交点から）の電圧、電流及び／又は光信号データを使用できる。後に説明するようにこのようなデータに基づいて、レザバー１９２と接触している電極を浮かせてチャネルセグメント１９０中に電流が存在しないようにしつつ、電圧勾配を切り替えてレザバー１８８とレザバー２０２の間に存在するようにできる。

図２０Ａ〜Ｃは、適当なスペーサー分子を用いた等速電気泳動と図１７に類似のマイクロフルイディックチャネル網とを使用して互いに分離したＤＮＡ−抗体コンジュゲート及び抗原複合体の代表的な電圧及び光学的サインを示す。図示されているように、サンプル中の成分は、それぞれ光の２つの極大２１６及び２１８と、電圧信号２２０及び２２２中にそれぞれ２つの電圧傾き変化とを生成する。図２０Ｂ〜Ｃによく示されているように、光の極大信号２１６、２１８とその後の電圧傾き変化２２０、２２２の発生とは、約１／２秒内で生じる。換言すれば、第１の電圧傾き変化２２０は第１の光の最大２１６の発生後約１／２秒で発生し、第２の電圧傾き変化２２２は第２の光の最大２１８の発生後約１／２秒で発生する。したがって、電圧傾き変化２２０、２２２（及び／又は光信号極大２１６、２１８）のどちらか一方の発生の測定は、アッセイのＩＴＰ段階のためのウェル１６０及び１９２からアッセイの分離段階のためのウェル１８８と２０２への電圧勾配変化の切り替えを知らせるために使用できる。緩衝液及びスペーサーの相対導電率を制御することにより、電圧傾き変化の大きさを制御して上記測定値の検出を容易にできる。

図２１では、特定のアッセイ構成において電圧（及び光信号曲線）が２より多くの、例えば３個以上の別個の電圧傾き変化を含み、これらは時間的に相対的に互いに近接して（例えば約１／２秒以下のオーダーで）発生していることも観察された。これは、例えば、上記で参考のため組み込んだ同時係属の米国特許出願第６０／５００，１７７号，“Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ”（出願日２００３年９月４日）に記載されたように胎児の卵黄嚢、肝臓、及び胃腸管により生成されるアルブミンと機能的に等価な早期の胎児の血漿蛋白質であるα?フェトプロテイン（ＡＦＰ）の検出用のマイクロフルイディックデバイス中でのイムノアッセイの実施状況であることが分かっている。ＡＦＰイムノアッセイの場合、しばしば異なるレベルの種々のＡＦＰフラクションを区別し比較する必要がある。ＡＦＰはレンズマメレクチン（ＬＣＡ）を用いたレクチン−親和性電気泳動により少なくとも３フラクションに分割されることが明らかになっている。ＬＣＡはＡＦＰを３つのバンド、すなわちＬＣＡ−無反応型（ＡＦＰ−Ｌ１）、弱反応型（ＡＦＰ−Ｌ２）、及び強反応型（ＡＦＰ−Ｌ３）に分離する。例えばＡＦＰＬ１〜ＡＦＰＬ３のレベルの相対比較は、肝細胞癌のマーカーとして有効であり、総ＡＦＰは妊婦の胎児の神経管の欠陥の発生の可能性のマーカーとして有効であることが分かっている。上記米国特許出願第６０／５００，１７７号に詳細に記載されているようなマイクロフルイディックシステム中で種々の対象ＡＦＰフラクションを捕らえるべくＤＮＡ−抗体コンジュゲートを用いてＡＦＰイムノアッセイを実施する際には、ウェル１６０及び１９２からアッセイのＣＥ分離段階のためのウェル１８８及び２０２への電圧勾配変化の切り替えを知らせるのに電圧傾き変化のいずれか１つが使用できるが、時間的に最後の電圧微分（例えば本デバイスによる４つの特許サンプル実施の各々について図２１中に示された第３の別個の電圧変化２２４）の使用がその切り替えをトリガする上で最適な結果を与えることが観察された。

図１８Ｄに示されるように、スタッキングされた第１の対象成分２１２が分離チャネルセグメント１９４を通る移動により、サンプル中の対象成分２１４をキャピラリーゾーン電気泳動により分離（分解）できる。レザバー１８８とチャネルセグメント１８６（及び１８４）を介してスペーサー緩衝液を分離チャネルセグメント１９４に導入することにより、スタッキングされた第１の成分２１２がその上流及び下流の流体境界の両方にてスペーサー緩衝溶液の間に挟まれ、これにより、アッセイのＩＴＰ段階中にＩＴＰスタッキングチャネルセグメント１８２中にスタッキングされた他の汚染種からスタッキングされた成分２１２が逆スタッキング及び分離される。

スタッキングされた第２の成分２１０のすべてをチャネルセグメント１８４に転換することができず、分離チャネルセグメント１９４中にスタッキングされた成分２１０がいくらかキャリーオーバーするかもしれないので、分離チャネルセグメント中のトレーリング緩衝液としてのスペーサー緩衝液の存在は、分離チャネル中の望ましくないキャリーオーバー成分物質２１０がより遅いスペーサー緩衝液とより速いリーディング電解質緩衝液との間に挟まれることで分離チャネルセグメント１９４中でさらにスタッキングされることを意味する。よって、このＩＴＰ界面の自己先鋭化特性が、分離チャネルセグメント中にキャリーオーバーした第２の成分２１０の存在により生じる干渉と、移動のより遅い成分ピーク２１２中への移動のより速い成分２１０の拡散とを最小にする。このように、対象成分２１２（例えば抗原複合体）によりスタッキングされ且つ移動度シフトアッセイを妨害し得るかなりの量の成分２１０とその他の非対象標識物質が、スタッキングされた成分２１２から実質的に分離される。このことが、分離チャネルセグメントの検出領域の基線信号に影響を与える物質の量を著しく減少させ、よってアッセイの感度を上げることができる。種々の緩衝溶液中のふるい媒体の存在によって、アッセイのＩＴＰ段階中に対象成分の移動度の調節を支援でき、またアッセイのＣＥ段階中に成分２１２からの汚染種の分離を改善できることが分かる。

さらに分離チャネルセグメント１９４中へのコンジュゲートピークのキャリーオーバーによる起こり得る干渉を最小にするために、図１９に示されるようなチャネル網構成の代替の態様を用いることができる。図中、チャネルセグメント１８６及び１９０をＩＴＰスタッキングチャネルセグメント１８２と分離チャネルセグメント１９４との流体接合部に連結する相互連結チャネルセグメント１８４の存在は削除されている。この代替の態様では、電圧検出器及び／又は光検出器が、ＩＴＰスタッキングチャネルセグメント１８２と分離チャネルセグメント１９４との流体接合部に対してセンシング自在に配置される。加えて、この特定の態様では、対象成分ピーク２１２に対応する第２の電圧傾き変化２２２（又は第２の光の最大２１８）の検出は、分離チャネルセグメント１９４内でアッセイのＩＴＰ段階からアッセイのＣＥ段階への電圧勾配の切り替えをトリガするのに用いられ、第２の成分２１０のほとんどすべてがサイドチャネル１９０に入り、流体レザバー１９２に廃棄されることが保証される。本発明の別の代替態様では、チャネルセグメント１８６はチャネルセグメント１９０に対してチャネルセグメント１８２、１９４の反対側に配置されそれに交差させることもできる。

電圧検出器
本発明のシステムにおける電圧検出器はコントローラーに伝達される電圧イベントを検出するためにチャネルと接触することができる。電圧検出器の種類と複雑度は例えばチャネルハードウェア構成や検出する電圧イベントの種類により異なる。

電圧検出器は例えば電圧により作動させる単純なリレースイッチからアナログガルバノメーター、チャートレコーダー付きアナログ装置、論理装置による評価用ディジタル出力をもつ電圧計に及ぶ。電圧計は一般に例えばチャネルの接点位置とアース等の２つの位置の電極間、又はチャネルの２つの異なる位置間の電位を検出する。チャネルとの電圧電極接点の位置はスタッキング中に検出される電圧曲線を変化させる。しかし、多くの場合には広範なチャネル位置の電圧計接点について注入の整合的で明白なトリガのために明確な電圧イベントを決定することができる（例えばスタッキングチャネルセグメントと分離チャネルセグメントの交点に電圧計接点を配置する必要はない）。

１態様では、チャネルの両端に電圧計接点を配置することができる。比較的高抵抗のトレーリング電解液がチャネルでリーディング電解液に置換するにつれ、選択された電流をチャネルに維持するために必要な電圧は増加する。この場合に注入をトリガするための電圧イベントは例えば予め設定された電圧とすることができる。

別の態様では、アース（又は他の基準電圧）とスタッキングチャネルセグメントと交差する分離チャネルセグメントの任意点に電圧計接点を配置することができる。電流が分離チャネルセグメントに流れないようにする場合（例えば分離チャネルセグメントを浮動電圧により無電流に維持する場合、又は分離チャネルセグメントが完全回路の一部でない場合）には、分離チャネルセグメントの任意位置が交点のスタッキングチャネルセグメント電圧に反映する。当業者に自明の通り、分離チャネルセグメントで検出される電圧は図８の電圧曲線と同様にＴＥ／ＬＥ界面が交点を通過するにつれてピークまで上昇し、低下する。

無電流でスタッキングチャネルセグメントと接触している分離チャネルセグメントで電圧をモニターしている場合には、無電流は例えば浮動電圧調節又は回路絶縁により得られる。浮動電圧調節装置はチャネルセグメントで電流を検出し、チャネルセグメントの任意電位を中和する電圧をチャネルセグメントに印加して電流を阻止する当分野で公知の電子装置とすることができる。浮動電圧レギュレーターは場合により選択された定電流をチャネルセグメントに提供するようにチャネルセグメント電圧差を調節するように構成することができる。チャネルセグメントに電流が流れないようにする別の方法はチャネルセグメントが完全な回路の一部とならないようにする方法である。例えば、任意関連電気回路を選択的に開閉するようにチャネルセグメントの一端に電気スイッチを配置することができる。

電圧計は分離チャネルセグメントへの分析物添加（注入）を開始するようにコントローラーと連動することができる。注入の開始は手動でも自動でもよい。例えば、電圧計は選択された電圧又は電圧ピーク等の電圧イベントが観察されるとチャネル電場又は流体流を手動転換するようにシステムオペレーター（コントローラー）の可視電圧読み取り値を提供することができる。別の例では、コントローラーは電圧計と電子連動し、選択された電圧イベントが検出されるとスタッキングされた分析物を分離チャネルセグメントに自動的に添加するように設定されたディジタル論理装置である。

分析物検出器
本発明のシステムには分析物を検出するために適切な分析物検出器を組込むことができる。検出器の種類と構造は例えば検出する分析物の種類及び／又はチャネル配置により異なる。分析物検出器は分析物検出プロフィルを保存し、分析結果を評価するための論理装置と連動することができる。

システムで検出する分析物は多様なものとすることができ、多くは荷電分子又は電荷をもつように修飾された分子である。例えば、対象分析物は蛋白質、核酸、炭水化物、糖蛋白質、イオン、及び／又は同等物とすることができる。スタッキングはサイズ排除等の代替メカニズムにより実施することもできるが、本発明の多くのシステムでは電場内の荷電分析物の移動によりスタッキングを誘導する。当業者に自明の通り、電気泳動スタッキングのために適当なｐＨ調節又は荷電化学基による分析物の誘導体化により非荷電対象分析物に電荷を付与することができる。

システムにおける分析物検出器は当分野で公知の適切な任意検出器とすることができる。例えば、検出器は蛍光光度計、分光光度計、屈折計、導電率計、及び／又は同等物とすることができる。利用可能な検出器により検出できない分析物は多くの場合にはマーカー分子で誘導体化して検出できるようにすることができる。検出器は例えば交点及び／又は分離チャネルセグメント等のチャネルセグメントで分析物をモニターするように搭載又は照準させることができる。検出器は分離チャネルセグメントから流出する分析物を例えばチャンバーの検出チャネルでモニターすることができる。

分析物検出器はチャネル位置をモニターし、チャネル長を逐次走査し、又は分離された分析物の連続画像を提供することができる。１態様では、定置分光光度測定検出器は特定チャネル位置又は交点に照準させた光電子増倍管とすることができる。別の態様では、分析物検出器はマイクロフルイディックデバイスのチャネルで分離された分析物を逐次走査するためにＸ−Ｙ軸移動メカニズムに搭載された共焦点顕微鏡でマイクロチャネルに照準させた蛍光光度計とすることができる。別の態様では、分析物検出器は複数の分離チャンバーで同時に多数の分離の画像を提供することが可能な電荷結合デバイス（ＣＣＤ）アレーとすることができる。

分析物検出器は分析結果の保存と評価のために論理装置と連動することができる。システムの論理装置としては例えばチャートレコーダー、トランジスター、回路基板、集積回路、中央処理装置、コンピューターモニター、コンピューターシステム、コンピューターネットワーク、及び／又は同等物が挙げられる。コンピューターシステムとしては例えばソフトウェアシステムに組込まれたデータセットと命令セットを備えるディジタルコンピューターハードウェアが挙げられる。コンピューターは分析物の存在、同一性、量、及び／又は位置を評価するために検出器と連動することができる。コンピューターとしては例えばＰＣ（ＤＯＳ（登録商標）、ＯＳ２（登録商標）、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）オペレーティングシステム対応Ｉｎｔｅｌ ｘ８６又はＰｅｎｔｉｕｍチップ）、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨ（登録商標）、Ｐｏｗｅｒ ＰＣ、又はＳＵＮ（登録商標）ワークステーション（ＬＩＮＵＸ又はＵＮＩＸオペレーティングシステム対応）又は当業者に公知の他の市販コンピューターが挙げられる。センサーシグナルを解釈するため又は検出シグナルをモニターするためのソフトウェアも入手可能であり、あるいはＶｉｓｕａｌ ｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ等の標準プログラミング言語を使用して当業者により容易に構築することができる。コンピューター論理システムは例えばサンプル同定を指定して分析を開始するシステムオペレーターから入力を受信し、システムのローディングチャネルセグメントにサンプルを移送するようにロボットシステムに命令し、流体操作システムを制御し、検出器モニターを制御し、検出器シグナルを受信し、標準サンプル結果から回帰曲線を作成し、分析物量を測定し、及び／又は分析結果を保存することができる。

当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。

以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記技術及び装置の多くは種々に組合せて使用することができる。

本明細書に引用する全公報、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各公報、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。

図１は等速電気泳動システムの模式図である。 図２はリーディング電解液との界面で分析物を濃縮する過渡的ＩＴＰの模式図である。 図３は対象分析物の過渡的ＩＴＰ分離と分析物の定常状態ＩＴＰ並置の模式図である。 図４はＩＴＰ中のサンプル成分の選択的除去の模式図である。 図５Ａ〜５Ｃは代表的サンプル溶液ローディング技術の模式図である。 図６Ａはサンプル分析物の多重ロードスタッキング技術を示す連続模式図である。 図６Ｂはサンプル分析物の多重ロードスタッキング技術を示す連続模式図である。 図６Ｃはサンプル分析物の多重ロードスタッキング技術を示す連続模式図である。 図６Ｄはサンプル分析物の多重ロードスタッキング技術を示す連続模式図である。 図６Ｅはサンプル分析物の多重ロードスタッキング技術を示す連続模式図である。 図７Ａ〜７Ｃはスタッキングチャネルセグメントの横断面よりも大きい横断面をもつローディングチャネルセグメントを使用した大容量サンプル溶液ローディングを示す模式図である。 図８Ａ〜８Ｄはスタッキングチャネルセグメント内の接点における電圧イベント検出の模式図である。 図９Ａ〜９Ｄはスキューイングチャネルを通る流れにより生じる分析物バンドスキューイングの模式図である。 図１０Ａは対象分析物バンドに照準した状態のスキューイングチャネルＩＴＰにおけるサンプル成分のスキューイングと分散の模式図である。 図１０Ｂは対象分析物バンドに照準した状態のスキューイングチャネルＩＴＰにおけるサンプル成分のスキューイングと分散の模式図である。 図１０Ｃは対象分析物バンドに照準した状態のスキューイングチャネルＩＴＰにおけるサンプル成分のスキューイングと分散の模式図である。 図１０Ｄは対象分析物バンドに照準した状態のスキューイングチャネルＩＴＰにおけるサンプル成分のスキューイングと分散の模式図である。 図１０Ｅは対象分析物バンドに照準した状態のスキューイングチャネルＩＴＰにおけるサンプル成分のスキューイングと分散の模式図である。 図１１Ａ〜１１Ｃはスタッキングされた分析物の分離チャネルセグメントへの添加の模式図である。 図１２Ａ及び１２Ｂはサンプル溶液をローディングチャネルセグメントに供給するコレクターチューブを備えるマイクロフルイディックチップの模式図である。 図１３Ａ及び１３Ｂはスタッキングチャネルセグメントが分離チャネルセグメントと共通チャネルを共有する分析物注入システムの模式図である。 図１４Ａ〜１４Ｃはスパイラル及び蛇行構造のスキューイングチャネルを組込んだ分析物注入システムの模式図である。 図１５はカーブの外側移動距離と内側移動距離の比が大きいスキューイングチャネルの模式図である。 図１６Ａ〜１６Ｃはチャネルの片側の表面移動距離を反対側よりも大きくすることによりスキューイング機能をもたせたスキューイングチャネルの模式図である。 図１７は本発明の代替態様によりスペーサー分子を用いて等速電気泳動を行うのに有効であり且つ対象成分ピークを望ましくない成分ピークから分離し単離するのに有効な代表的マイクロフルイディックチップチャネル構成の模式図である。 図１８Ａは対象成分ピークを望ましくない成分ピークから分離するのに有効であり且つ対象成分ピークを分離成分に分離して該分離成分を検出するのに有効な図１７のチャネル構成の一部の模式図である。 図１８Ｂは対象成分ピークを望ましくない成分ピークから分離するのに有効であり且つ対象成分ピークを分離成分に分離して該分離成分を検出するのに有効な図１７のチャネル構成の一部の模式図である。 図１８Ｃは対象成分ピークを望ましくない成分ピークから分離するのに有効であり且つ対象成分ピークを分離成分に分離して該分離成分を検出するのに有効な図１７のチャネル構成の一部の模式図である。 図１８Ｄは対象成分ピークを望ましくない成分ピークから分離するのに有効であり且つ対象成分ピークを分離成分に分離して該分離成分を検出するのに有効な図１７のチャネル構成の一部の模式図である。 図１９は図１８Ａ〜Ｄに示されたチャネル構成の代替のチャネル構成であり、対象成分ピークを望ましくない成分ピークから分離し単離するのに有効であり且つ対象成分ピークを分離成分に分離して該分離成分を検出するのに有効である。 図２０Ａは適当なスペーサー分子を用いた等速電気泳動を使用して互いに分離したＤＮＡ−抗体コンジュゲート及び抗原複合体についての電圧及び光学的サインを示す。 図２０Ｂは図２０Ａに示されたＤＮＡ抗体コンジュゲートピークの分解図（図２０Ｂ）と抗原複合体ピークの分解図（図２０Ｃ）であり、夫々の成分ピークについて電圧傾きの変化が最適極大信号曲線の検出から約１／２秒内に発生していることを示している。 図２０Ｃは図２０Ａに示されたＤＮＡ抗体コンジュゲートピークの分解図（図２０Ｂ）と抗原複合体ピークの分解図（図２０Ｃ）であり、夫々の成分ピークについて電圧傾きの変化が最適極大信号曲線の検出から約１／２秒内に発生していることを示している。 図２１は血清中のＡＦＰレベルの検出のためのイムノアッセイの実行中でのＤＮＡ−抗体コンジュゲート及び抗原複合体の代表的電圧及び光学的サインを示し、少なくとも３つの電圧傾き変化が存在し、等速電気泳動スタッキング段階からアッセイのＣＥ分離段階への切り替えをトリガするのに使用できることが示されている。

Claims (58)

1. サンプル中の少なくとも１種の第２成分から第１対象成分を分離する方法であって：
   第１チャネルセグメントにおいて第１成分と第２成分をスタッキングするステップ；
   スタッキングされた第２成分を交点にて第１チャネルセグメントに流体連結された第２チャネルセグメントに流すステップ；
   スタッキングされた第１成分及び／又は第２成分に対応する予め選択された電気信号を該交点にて又は該交点の近傍で検出するステップ；及び
   前記予め選択された電気信号が検出されたとき、該交点にて前記第１チャネルセグメントに流体連結された第３チャネルセグメントに沿って電場又は差圧を印加することで前記スタッキングされた第１成分を第３チャネルセグメントに導入するステップを含む方法。
2. 前記スタッキングのステップが、第１チャネルセグメントにリーディング電解質緩衝溶液、トレーリング電解質緩衝溶液、及び前記リーディング電解質溶液と前記トレーリング電解質溶液との間にスペーサー緩衝溶液を導入するステップを含み、前記スペーサー緩衝溶液がリーディング電解質溶液中に存在するイオンの移動度とトレーリング電解質溶液中に存在するイオンの移動度との中間の電場中移動度を有するイオンを含む、請求項１に記載の方法。
3. 第３チャネルセグメント中で前記スタッキングされた第１成分を分離成分に分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 第１チャネルセグメントと第３チャネルセグメントが単一の連続チャネルからなるチャネル部分を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記流すステップが前記第１チャネルセグメント及び第２チャネルセグメントに電位を発生させ前記スタッキングされた第２成分を前記第２チャネルセグメントに流入させることを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記第１成分が蛍光標識抗原?抗体複合体を含み、前記第２成分が蛍光標識抗体を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記第１成分と第２成分が両方とも荷電している、請求項１に記載の方法。
8. 前記第１成分と第２成分が両方とも負に荷電しているか又は両方とも正に荷電している、請求項１に記載の方法。
9. 前記第１成分と第２成分の少なくとも一方が正に荷電している、請求項１に記載の方法。
10. 前記第１荷電成分と第２荷電成分が核酸、蛋白質、ポリペプチド、多糖、及び合成ポリマーからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
11. 前記第１荷電成分と第２荷電成分が別個の電気泳動移動度を有する標識分子を含む、請求項７に記載の方法。
12. 前記分離成分を検出することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
13. 前記サンプルが体液又は組織サンプルに由来する臨床サンプルである、請求項１に記載の方法。
14. 前記リーディング電解液が塩化物、臭化物、フッ化物、リン酸塩、酢酸塩、硝酸塩及びカコジル酸塩の塩からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
15. 前記トレーリング電解液がＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＭＯＰＳ（３−（４−モル−ホルニル）−１−プロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（４−モルホリニル）エタンスルホン酸）、グリシン、アラニン、及びβ−アラニンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法
16. 前記スペーサー緩衝溶液が第１成分の移動度と第２成分の移動度との中間の電場中移動度を有するイオンを含む、請求項２に記載の方法。
17. 前記第２成分がＤＮＡ−抗体コンジュゲートを含み、前記第１成分が該ＤＮＡ−抗体コンジュゲートと分析物との複合体を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記電気信号を検出するステップが光信号を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記電気信号を検出するステップが電圧信号を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
20. 前記電気信号を検出するステップが電流信号を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
21. 前記第２チャネルセグメントが一方の端部で第１チャネルセグメントと交差しもう一方の端部で第２チャネルセグメントと交差する相互連結チャネルセグメントによって交点に流体連結され、前記予め選択された電気信号を該交点にて又は該交点の近傍で検出するステップが、予め選択された電気信号を第２チャネルセグメントと相互連結チャネルセグメントとの交点で検出することを含む、請求項１に記載の方法。
22. サンプル中の第１対象成分を分離成分に分離し、検出中にサンプル中の少なくとも１種の第２成分からの干渉を最小にしつつ該分離成分を検出する方法であって、該サンプルを分離チャネルに導入し、分離チャネルの長さ方向に沿って電場を印加してそれらの電気泳動移動度によって第１対象成分を分離成分に分離し、それに付随して分離チャネル中の第２成分をリーディング電解質溶液とトレーリング電解質溶液との間にスタッキングし、そして該分離成分を検出することを含む方法。
23. 前記トレーリング電解質溶液がスペーサー緩衝溶液を含み、前記第１対象成分が分離チャネル中の第１成分の両側にてスペーサー緩衝溶液間に挟まれる、請求項２１に記載の方法。
24. ＩＴＰスタッキングチャネル領域と分離チャネル領域とを備えた主チャネル、及びＩＴＰスタッキングチャネル領域と分離チャネル領域との交点での共通流体接合部にて前記主チャネルに流体連結された少なくとも第１サイドチャネル及び第２サイドチャネルを含んだマイクロフルイディックデバイスであって、前記第１サイドチャネル及び第２サイドチャネルがそれぞれ第１流体レザバー及び第２流体レザバー中に終点を有するマイクロフルイディックデバイス。
25. 前記第１流体レザバーにスペーサー緩衝溶液が充填され、第２流体レザバーにリーディング電解質溶液が充填された、請求項２４に記載のマイクロフルイディックデバイス。
26. 前記第１サイドチャネル及び第２サイドチャネルの両方が前記共通の流体接合部にて前記主チャネルと交差する、請求項２４に記載のマイクロフルイディックデバイス。
27. 一方の端部で前記共通の流体接合部と交差し、もう一方の端部で第１サイドチャネル及び第２サイドチャネルと交差する連結チャネルをさらに備える、請求項２４に記載のマイクロフルイディックデバイス。
28. 前記共通の流体接合部が、電圧検出器及び／又は光検出器でセンシング自在に配置構成された検出領域を含む、請求項２４に記載のマイクロフルイディックデバイス。
29. 前記電圧検出器及び／又は光検出器は検出領域にてサンプル中のスタッキングされた第１成分及び／又はスタッキングされた第２成分から電気信号を検出するよう構成されている、請求項２８に記載のマイクロフルイディックデバイス。
30. マイクロフルイディックデバイスにおいてサンプル中の少なくとも第１成分及び第２成分を空間的に分離する方法であって、スペーサー電解質溶液を含むキャリヤー流体中にて第１成分及び第２成分を該デバイスの第１マイクロフルイディックチャネルに導入し、該第１成分及び第２成分を等速電気泳動によってリーディング電解質溶液とトレーリング電解質溶液との間にスタッキングすることを含み、前記スペーサー電解質溶液が、リーディング電解質溶液中に存在するイオンの移動度とトレーリング電解質溶液中に存在するイオンの移動度との中間の電場中移動度を有するイオンを含み、前記スペーサー電解質溶液が以下のスペーサーイオン：ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ノナン酸、Ｄ−グルクロン酸、アセチルサリチル酸、４−エトキシ安息香酸、グルタル酸、３−フェニルプロピオン酸、フェノキシ酢酸、システイン、馬尿酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、イソプロピルマロン酸、イタコン酸、シトラコン酸、３，５−ジメチル安息香酸、２，３−ジメチル安息香酸、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、及び５−ｂｒ−２，４−ジヒドロキシ安息香酸のうちの少なくとも１種を含み、前記第１成分がＤＮＡ−抗体コンジュゲートを含み、前記第２成分がＤＮＡ−抗体コンジュゲートと分析物との複合体を含む前記方法。
31. 前記ＤＮＡ−抗体コンジュゲートと分析物との複合体がさらに第２抗体、Ｆａｂ’抗体フラグメント、受容体、親和性ペプチド、又はアプタマーと複合化される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ＤＮＡ−抗体コンジュゲートは蛍光色素、酵素、化学発光標識、又は燐光標識で標識する、請求項３０に記載の方法。
33. 前記第２抗体、Ｆａｂ’抗体フラグメント、受容体、親和性ペプチド、又はアプタマーは蛍光色素、酵素、化学発光標識、又は燐光標識で標識する、請求項３１に記載の方法。
34. 前記キャリヤー溶液がＴｒｉｓ緩衝液又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液と以下の追加成分：ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ又は他のキャリヤー蛋白質又は界面活性剤のうちの少なくとも１種とを含む、請求項３０に記載の方法。
35. 濃度が約０．１〜３．０％の第１マイクロフルイディックチャネル内に含まれるゲル中で等速電気泳動により前記スタッキングを行う、請求項３０に記載の方法。
36. 前記ゲルがポリアクリルアミドゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、スクロースとエピクロロヒドリンとのコポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ｐＤＭＡ）、又はアガロースゲルを含む、請求項３５に記載の方法。
37. 第１マイクロチャネル又は第１マイクロチャネルに流体連結された第２マイクロチャネル中のキャピラリー電気泳動によって前記第１成分及び／又は第２成分を更なる分離成分に分離することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
38. 前記スペーサー電解質溶液がｐＨ約８のＭＥＳを含む、請求項３０に記載の方法。
39. 前記スペーサー電解質溶液がｐＨ約８のノナン酸を含む、請求項３０に記載の方法。
40. 前記スペーサー電解質溶液がｐＨ約８のグルタル酸を含む、請求項３０に記載の方法。
41. 前記スペーサー電解質溶液がｐＨ約８のＤ−グルクロン酸を含む、請求項３０に記載の方法。
42. 前記ＤＮＡ−抗体コンジュゲートは蛍光色素、酵素、化学発光標識、又は燐光標識で標識する、請求項３１に記載の方法。
43. サンプル中の少なくとも１種の第２成分から第１対象成分を分離する方法であって：
    前記第１成分と第２成分を第１チャネルセグメントにスタッキングし；
    前記スタッキングされた第２成分を前記第１チャネルセグメントと交点にて流体連結した第２チャネルセグメントに流し；
    前記スタッキングされた第１及成分び／又は第２成分に対応する電圧信号曲線を前記交点にて又は前記交点の近傍にて測定し、前記電圧信号曲線は時間的に分離される少なくとも３つの別個の電圧傾きの変化を含み；そして、
    時間的に最後の電圧傾き変化が検出されると、前記交点にて前記第１チャネルセグメントに流体連結された第３チャネルセグメントに沿って電場又は差圧を印加し、それにより前記スタッキングされた第１成分を第３チャネルセグメントに導入することを含む方法。
44. 前記スタッキングのステップが、前記第１チャネルセグメント中にリーディング電解質緩衝溶液、トレーリング電解質緩衝溶液、及び該リーディング電解質溶液とトレーリング電解質溶液との間にスペーサー電解質緩衝溶液を導入することを含み、前記スペーサー緩衝溶液が、リーディング電解質溶液中に存在するイオンの移動度とトレーリング電解質溶液中に存在するイオンの移動度との中間の電場中移動度を有するイオンを含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記スペーサー緩衝溶液が以下のスペーサーイオン：ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ノナン酸、Ｄ−グルクロン酸、アセチルサリチル酸、４−エトキシ安息香酸、グルタル酸、３−フェニルプロピオン酸、フェノキシ酢酸、システイン、馬尿酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、イソプロピルマロン酸、イタコン酸、シトラコン酸、３，５−ジメチル安息香酸、２，３−ジメチル安息香酸、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、及び５−ｂｒ−２，４−ジヒドロキシ安息香酸のうちの少なくとも１種を含み、前記第１成分がＤＮＡ−抗体コンジュゲートを含み、前記第２成分が前記ＤＮＡ−抗体コンジュゲートと分析物との複合体を含む、請求項４４に記載の方法。
46. 前記ＤＮＡ−抗体コンジュゲートと分析物との複合体がさらに第２抗体、Ｆａｂ’抗体フラグメント、受容体、親和性ペプチド、又はアプタマーと複合化される、請求項４５に記載の方法。
47. 前記ＤＮＡ−抗体コンジュゲートは蛍光色素、酵素、化学発光標識、又は燐光標識で標識する、請求項４５に記載の方法。
48. 前記第２抗体、Ｆａｂ’抗体フラグメント、受容体、親和性ペプチド、又はアプタマーが蛍光色素、酵素、化学発光標識、又は燐光標識で標識する、請求項４６に記載の方法。
49. 前記スペーサー緩衝溶液がＴｒｉｓ緩衝液又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液と、以下の追加成分：ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ又は他のキャリヤー蛋白質又は界面活性剤のうちの少なくとも１種とを含む、請求項４５に記載の方法。
50. 濃度が約０．１〜３．０％の第１マイクロフルイディックチャネル内に含まれるゲル中で等速電気泳動により前記スタッキングを行う、請求項４５に記載の方法。
51. 前記ゲルがポリアクリルアミドゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、スクロースとエピクロロヒドリンとのコポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ｐＤＭＡ）、又はアガロースゲルを含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記第１マイクロチャネル又は該第１マイクロチャネルに流体連結した第２マイクロチャネル中のキャピラリー電気泳動によって前記第１成分及び／又は第２成分を更なる分離成分に分離することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
53. 前記スペーサー緩衝溶液がｐＨ約８のＭＥＳを含む、請求項４４に記載の方法。
54. 前記スペーサー緩衝溶液がｐＨ約８のノナン酸を含む、請求項４４に記載の方法。
55. 前記スペーサー緩衝溶液がｐＨ約８のグルタル酸を含む、請求項４４に記載の方法。
56. 前記スペーサー緩衝溶液がｐＨ約８のＤ−グルクロン酸を含む、請求項４４に記載の方法。
57. 前記スペーサー緩衝溶液が、第１成分の移動度と第２成分の移動度との中間の電場中移動度を有するイオンを含む、請求項４４に記載の方法。
58. 前記方法が異なるレベルの種々のＡＦＰフラクションを区別し比較するのに用いられる、請求項４３に記載の方法。