JP2014048252A

JP2014048252A - キャピラリー等速電気泳動法を用いる複数回大容量注入−濃縮−分離−分取精製法

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Publication number: JP2014048252A
Application number: JP2012193742A
Authority: JP
Inventors: Shingo Saito; 伸吾齋藤; Taisho Tsujimura; 大翔辻村; Tomoko Haraga; 智子原賀
Original assignee: Japan Atomic Energy Agency; Saitama University NUC
Current assignee: Japan Atomic Energy Agency; Saitama University NUC
Priority date: 2012-09-04
Filing date: 2012-09-04
Publication date: 2014-03-17
Anticipated expiration: 2032-09-04
Also published as: JP6028997B2

Abstract

【課題】超高純度のＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡ、ＦＴＣ−ＰＤＡ等の水溶性物質の精製法を提供する。
【解決手段】キャピラリー等速電気泳動法を用いる複数回大容量注入−濃縮−分離−分取精製法が、精製対象水溶性物質を含むトリス−塩酸緩衝液がインレット側に配置され、トリスーグリシン緩衝液がアウトレット側に配置されて、上記精製対象水溶性物質がインレット側からアウトレット側に移動させられる工程（ａ）、上記精製対象水溶性物質がアウトレット側からインレット側に移動させられる工程（ｂ）、トリスーグリシン緩衝液がインレット側及びアウトレット側に配置されて、上記精製対象水溶性物質がインレット側からアウトレット側に移動させられる工程（ｃ）を実施し、上記工程（ａ）、（ｂ）がそれぞれ２回以上繰り返され、下記式（１）が満たされる。
｜μＧｌｙ^-｜＜｜μＬ^-｜＜｜μＣｌ^-｜（１）
ただし、｜μＧｌｙ^-｜はグリシンイオンの移動度、｜μＬ^-｜は上記精製対象水溶性物質イオンの移動度、｜μＣｌ^-｜は塩化物イオンの移動度を示す。
【選択図】なし

Description

本発明は、キャピラリー等速電気泳動法を用いる複数回大容量注入−濃縮−分離−分取精製法に関する。

一般に、蛍光ラベル化試薬、蛍光プローブ等の高純度が求められる化合物の精製は、クロマトグラフィー、固相抽出等の分離方法により行われる。クロマトグラフィーの理論段数は数千から数万段であり、クロマトグラフィーは大容量試料の高度な分取精製に適している。しかし、クロマトグラフィーは少量の希少試料の精製には適さず、更にクロマトグラフィーによる分離が困難な物質も存在する。例えば、本発明の発明者らが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した下記式（３）で示されるＮｄ検出用蛍光プローブＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡの純度は５８％程度である。

キャピラリー電気泳動法は、ｎＬレベルの試料の高度な分離方法であり、その理論段数は数万から百万段に及ぶ。この高い分離能の分取への利用は非常に有効であるが、ｎＬレベルの微小量の試料が数十μＬのバイアルに分取されると、当該試料は数千〜数万倍に希釈されるから、キャピラリー電気泳動法は一般的な分取精製法としては成立し難い。
微小量の試料をキャピラリーカラム内で電気泳動的に濃縮する方法の一つが等速電気泳動法（ＩＴＰ）である。ＩＴＰは先行イオンと終末イオンの間の移動度を有する物質を濃縮する方法であるが、ＩＴＰのみによる精製対象物質と不純物との分離は不可能である。

一時的なＩＴＰ濃縮後のゾーン電気泳動による分離方法がキャピラリー一時的等速電気泳動法（ｃｔＩＴＰ）であり、濃縮と分離を一段階で行える。ｃｔＩＴＰは分離過程を含み、分離効率を上げるために大容量の試料の注入は一般に行えない。更に、ｃｔＩＴＰの試料注入は一度のみであるため、大量の試料注入はできない。リポタンパク質を含有する試料が２種類のリーディングバッファからなるリーディングバッファサブシステムと２種類のターミネーティングバッファからなるターミネーティングバッファサブシステムに挟まれるｃｔＩＴＰによるリポタンパク質の亜分画分離方法が検討された（例えば、特許文献１参照）。

ところで、原子力発電所、放射性同位元素を扱う研究施設等の放射性物質を扱う施設から排出される廃液及び廃棄物はウラン化合物を含有し得る。当該廃液及び廃棄物がウラン化合物を含有する場合、当該廃液及び廃棄物が処分される前に、当該廃液及び廃棄物中のウラン濃度が測定されなければならない。従来、当該廃液及び廃棄物中のウランが、イオン交換樹脂、溶媒抽出等の煩雑な分離方法で分離され、当該廃液及び廃棄物中のウラン濃度が質量分析法により定量されていた。質量分析によるウランの検出限界値はｐｐｑ〜ｐｐｔ（１０^-12〜１０^-10Ｍ）レベルであった。しかし、質量分析法で使用される機器は非常に高価であり、分析設備は廃液及び廃棄物に含まれる様々な放射性核種により広範に放射能汚染されやすい。

そこで、本発明の発明者らは、下記式（４）で示される5-(2-(3-(3-carboxy-4-(3-hydroxy-6-oxo-6H-xanthen-9-yl)phenyl)thioureido)acetamido)1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid（ＦＴＣ−ＰＤＡ）を合成し、次いで高速液体クロマトグラフィーで精製して、ウラニルイオン測定用蛍光プローブとして使用してキャピラリー等速電気泳動法によりウラニルイオンの定性及び定量分析する方法を検討した（例えば、特許文献２参照）。

特開２００９−３１０９２号公報特願２０１２−３４７１１号

近年、分析対象物質検出に要求される検出限界値はますます小さくなってきており、高速液体クロマトグラフィーにより精製されたＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡ、ＦＴＣ−ＰＤＡ、蛍光ラベル化ＤＮＡのそれぞれより更に高い純度のＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡ、ＦＴＣ−ＰＤＡ、蛍光ラベル化ＤＮＡが希求されているが、そのような非常に高純度のＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡ、ＦＴＣ−ＰＤＡ、蛍光ラベル化ＤＮＡを提供できる精製方法は見出されていなかった。
本発明が解決使用する課題は、超高純度のＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡ、ＦＴＣ−ＰＤＡ、蛍光ラベル化ＤＮＡ等の水溶性物質の精製法の提供である。

本発明の発明者らは、高速液体クロマトグラフィーで精製されたＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡより更に高い純度のＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡが、ＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡを含むトリス−塩酸緩衝液がインレット側に配置され、トリスーグリシン緩衝液がアウトレット側に配置されて、ＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡがインレット側からアウトレット側に移動させられる工程（ａ）、及びＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡがアウトレット側からインレット側に移動させられる工程（ｂ）が交互に２回以上繰り返され、更に、トリスーグリシン緩衝液がインレット側及びアウトレット側に配置されて、ＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡがインレット側からアウトレット側に移動させられる工程（ｃ）が実施されるキャピラリー等速電気泳動法により得られることを見出した。
更に、本発明の発明者らは、ＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡ以外の水溶性物質、例えば、ＦＴＣ−ＰＤＡ、下記式（２）で示される蛍光ラベル化試薬ＦＩＴＣ−Ｉ、蛍光ラベル化ＤＮＡ等も、上記キャピラリー等速電気泳動法により非常に高い純度に精製されることを見出し、本発明を完成させた。

本発明のキャピラリー等速電気泳動法による水溶性物質の精製法は、精製対象水溶性物質を含むトリス−塩酸緩衝液がインレット側に配置され、トリスーグリシン緩衝液がアウトレット側に配置されて、上記精製対象水溶性物質がインレット側からアウトレット側に移動させられる工程（ａ）、上記精製対象水溶性物質がアウトレット側からインレット側に移動させられる工程（ｂ）、トリスーグリシン緩衝液がインレット側及びアウトレット側に配置されて、上記精製対象水溶性物質がインレット側からアウトレット側に移動させられる工程（ｃ）が実施され、上記工程（ａ）、（ｂ）がそれぞれ２回以上繰り返され、下記式（１）が満たされる。
｜μＧｌｙ^-｜＜｜μＬ^-｜＜｜μＣｌ^-｜（１）
ただし、｜μＧｌｙ^-｜はグリシンイオンの移動度、｜μＬ^-｜は上記精製対象水溶性物質イオンの移動度、｜μＣｌ^-｜は塩化物イオンの移動度を示す。水溶液のｐＨは８．０〜９．０であってよい。
好ましい上記精製対象水溶性物質は上記式（２）、（３）、（４）で示される化合物又はＤＮＡ分子である。

本発明のキャピラリー等速電気泳動法による水溶性物質の精製法は、精製対象水溶性物質と不純物を分離し、非常に高純度の水溶性物質を多量に提供できる。

キャピラリー電気泳動装置を示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図キャピラリー中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図市販のＦＩＴＣ−Ｉのキャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法によるチャート液体高速クロマトグラフィーにより精製されたＦＩＴＣ−Ｉのキャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法によるチャートキャピラリー等速電気泳動により精製されたＦＩＴＣ−Ｉのキャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法によるチャートＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡの合成反応を示す図液体高速クロマトグラフィーにより精製されたＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡのキャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法によるチャートキャピラリー等速電気泳動により精製されたＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡのキャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法によるチャートＦＴＣ−ＰＤＡの合成反応を示す図液体高速クロマトグラフィーにより精製されたＦＴＣ−ＰＤＡのキャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法によるチャートキャピラリー等速電気泳動により精製されたＦＴＣ−ＰＤＡのキャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法によるチャートＤＮＡ分子F２９−ｍｅｒのキャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法によるチャートキャピラリー等速電気泳動により精製されたＤＮＡ分子F２９−ｍｅｒのキャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法によるチャート

本発明のキャピラリー等速電気泳動法による水溶性物質の精製法を図１〜１１により説明する。図１は、本発明のキャピラリー等速電気泳動法による水溶性物質の精製法に使用されるキャピラリー電気泳動装置の模式図である。図２〜１１は、当該キャピラリー電気泳動装置のキャピラリー３中の物質の移動と濃度分布を模式的に示す図である。最初に、インレット側泳動液２及びアウトレット側泳動液２’がトリス−塩酸緩衝液とされ、キャピラリー３内がトリス−グリシン緩衝液で満たされる（図２）。次に、トリスー塩酸緩衝液で希釈された精製対象水溶性物質Ｌの水溶液がインレット側に配置され、電源１に電圧が印加される。その際、グリシンイオン、精製対象水溶性物質イオン及び塩化物イオンの移動度は上記式（１）を満たしている。すると、グリシンイオン、精製対象水溶性物質イオン、塩化物イオンの順にインレット側からアウトレット側へ移動する（図３及び図４）。精製対象水溶性物質イオン濃度が、グリシンイオン濃度及び塩化物イオン濃度に比べて十分に小さいから、大きな電場勾配が精製対象水溶性物質イオンゾーンにかかり、精製対象水溶性物質イオンが加速され、塩化物イオンとの境界で減速し、精製対象水溶性物質イオンが濃縮される。濃縮された精製対象水溶性物質イオンが検出器に到達した時（図５）、電圧の印加が停止され、陰圧がポンプ等によりキャピラリー３内に付加され、精製対象水溶性物質イオンがインレット側に移動される（図６）。この時、精製対象水溶性物質イオンの移動に伴い、精製対象水溶性物質イオンゾーンが広がる。次に、トリスー塩酸緩衝液で希釈された精製対象水溶性物質Ｌの水溶液がインレット側から再度注入され、電圧が印加されて精製対象水溶性物質Ｌイオンがアウトレット側へ移動される。その際、２つの精製対象水溶性物質Ｌイオンゾーンが存在する（図７）が、精製対象水溶性物質Ｌイオンのアウトレット側への移動に伴い、精製対象水溶性物質Ｌイオンゾーンは１つに融合され、検出器に到達する（図８）。その際、電圧の印加が停止され、陰圧がキャピラリー３内に再度付加され、精製対象水溶性物質Ｌイオンがインレット側に移動される（図９）。図２〜９で示される工程が２回以上繰り返され、大量の精製対象水溶性物質Ｌイオンが濃縮される。濃縮された精製対象水溶性物質Ｌイオンがインレット側へ移動された後、インレット側泳動液２がトリスーグリシン緩衝液とされ、電圧が印加される（図１０）。すると、精製対象水溶性物質Ｌイオンと精製対象水溶性物質の水溶液に含まれる不純物が分離される（図１１）。その後、精製された精製対象水溶性物質Ｌの水溶液がアウトレット側から分取される。

本発明のキャピラリー等速電気泳動法により精製される水溶性物質は、上記式（１）を満たすものであり、特定の化合物に限定されない。上記水溶性物質の具体例は、蛍光プローブ、ＤＮＡ分子、タンパク質などがあげられる．

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。実施例及び比較例で使用された超純水は、MERCK MILLIPORE製Direct-Q UVにて採水されたもの（抵抗値１８．２ＭΩ）である。

キャピラリー等速電気泳動装置
Agilent社製G1602BAがキャピラリー電気泳動装置として使用された。GL Sciences社製溶融シリカキャピラリー（内径１００μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ、有効長９１．５ｃｍ）がキャピラリー３用チューブとして使用された。キャピラリー等速電気泳動により分取された溶液は、Invitrogen社製Safe Imager（登録商標）でランプ照射され、ＡＴＴＯ社製AE-6933FXCFゲルイメージングプリントグラフで撮影された。

泳動液の調製
（１）濃縮用トリス−グリシン溶液
上記１Ｍトリス水溶液３７５μL、SIGMA社製グリシン（純度９９％以上）が超純水で希釈されて調製された２Mグリシン水溶液１０００μLがポリプロピレン製容器に入れられ、超純水で１０ｍLに定容され、濃縮用トリス−グリシン溶液（泳動液ａ、ｐＨ８．５）が調製された。

（２）分離用トリス−グリシン溶液
上記１Ｍトリス水溶液５６０μL、上記２Mグリシン水溶液１５００μLがポリプロピレン製容器に入れられ、超純水で１０ｍLに定容され、分離用トリス−グリシン溶液（泳動液ｂ、ｐＨ８．５）が調製された。

（３）濃縮用トリス−塩酸溶液
上記１Ｍトリス水溶液５００μL、上記１Ｍ塩酸１５０μLがポリプロピレン製容器に入れられ、超純水で１０ｍLに定容され、濃縮用トリス−塩酸溶液（泳動液ｃ、ｐＨ８．５）が調製された。

（４）純度評価用ホウ酸緩衝溶液
関東化学（株）製四ホウ酸ナトリウム十水和物（純度９９％以上）が超純水に溶解されて調製された０．１Ｍ四ホウ酸緩衝溶液４００μLのｐＨが、上記１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で９．６に調製され、超純水で１０ｍLに定容された。

分取用溶液の調製
MERCK社製ホウ酸（純度９９．９９９９％）が超純水で調製された０．１Ｍホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．８９）４００μLが超純水で１０００μLに定容され、分取用溶液（ｐＨ９．８）が調製された。

水溶性物質の純度の測定方法
水溶性物質の純度は、キャピラリー用チューブとしてGL Sciences社製溶融シリカキャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長６０ｃｍ、有効長４７．５ｃｍ）、レーザー励起蛍光検出器としてPicometrics社製ZETALIF、レーザー装置としてSpectra-Physics社製ＡｒレーザーシステムModel263D（波長４８８ｎｍ）、高圧電源として松定プレシジョン（株）製HCZE-30P、記録計として（株）日立製作所製D-2500 Chromato-Integratorを組み合わせた装置により、キャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出法（ＣＥ−ＬＩＦ）により測定された。
最初に、キャピラリーが和光純薬工業（株）製水酸化ナトリウム（純度９７％）が超純水に溶解されて調製された１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で１０分間、超純水で１０分間、下記純度評価用ホウ酸緩衝溶液で１５分間順次洗浄された。その後、５ｎLの試料が落差法により（高低差５ｃｍ）３６秒間で注入され、２０ｋＶの電圧が印加されてキャピラリー電気泳動が２５℃で行われた。

ＦＩＴＣ−Ｉ試料溶液の調製
SIGMA-ALDRICH社製トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（純度９９．８％）が超純水に溶解されて調製された１Ｍトリス水溶液１０μL、和光純薬工業（株）製塩酸が超純水で希釈されて調製された１Ｍ塩酸２．６μL、上記式（２）で示される（株）同人化学研究所製Fluorescein-4-isothiocyanate（ＦＩＴＣ−Ｉ）が超純水で希釈されて調製された１０^-3ＭのＦＩＴＣ−Ｉ１０μLがポリテトラフルオロエチレン製バイアルに加えられ、超純水で２００μLに定容され、ＦＩＴＣ−Ｉ試料溶液が調製された。
図１２に示すチャートが、上記ＦＩＴＣ−Ｉ試料溶液のＣＥ−ＬＩＦの定量分析により得られた。上記市販のＦＩＴＣ−Ｉの純度は８１．６％であった。

比較例１
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるＦＩＴＣ−Ｉの精製
上記ＦＩＴＣ−Ｉ試料溶液がＨＰＬＣにより精製された．ＨＰＬＣにより精製されたＦＩＴＣ−ＩのＣＥ−ＬＩＦによる定量分析
ＨＰＬＣにより精製されたＦＩＴＣ−Ｉ溶液は上記ＣＥ−ＬＩＦにより定量分析され、図１３に示されるチャートが得られた。ＨＰＬＣにより精製されたＦＩＴＣ−Ｉの純度は８１．６％程度であった。

実施例１
キャピラリー等速電気泳動によるＦＩＴＣ−Ｉの精製
キャピラリー３が、上記１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で１０分間、次いで超純水で１０分間、その後泳動液ａで１５分間洗浄された。キャピラリー３内が泳動液ａで満たされ、ＦＩＴＣ−Ｉ試料溶液１μLが、圧力５０ｍｂａｒ、注入時間７２秒でキャピラリー３のインレット側から注入され、泳動液ｃがインレット側、泳動液ａがアウトレット側に配置され、電気泳動が２０ｋＶの電圧が印加されて２５℃で行われた。試料ピークが検出され、濃縮された試料が検出器に到達した後、電圧の印加が停止され、−５０ｍｂａｒの陰圧が５１０秒印加され、濃縮された試料プラグがキャピラリー３のインレット側先端から１ｃｍの箇所まで移動させられた。その後、試料注入、電圧印加、陰圧印加が同様に繰り返された。次いで、試料注入と電圧印加されて試料が濃縮され、電圧の印加が停止され、アウトレット側の泳動液ａが泳動液ｂに代えられ、陰圧が印加されて濃縮試料プラグがキャピラリー３のインレット側先端へ移動させられた。その後、インレット側の泳動液ａが泳動液ｂに代えられ、電圧が印加されて試料が濃縮され、ＦＩＴＣ−Ｉのピークが検出器で確認された後、濃縮されたＦＩＴＣ−Ｉがアウトレット側に配置され、分取用溶液２０μLが入った分取用ポリテトラフルオロエチレン製バイアルに２０秒ごとに１０回以上分取された。

目的分画の確認
分取用バイアルがゲルイメージングプリントグラフ装置上に置かれ、波長４７０ｎｍの光が照射され、ＦＩＴＣ−Ｉ溶液が分取されているバイアルが探索された。蛍光を発するバイアルが確認され、分取用バイアル由来の汚染防止のため、分取用バイアル中のＦＩＴＣ−Ｉ溶液が５００μLポリテトラフルオロエチレン製バイアルに移された。

ＣＥ−ＬＩＦによる定量分析
５００μLポリテトラフルオロエチレン製バイアルに保存されている、キャピラリー等速電気泳動により精製されたＦＩＴＣ−Ｉ溶液は上記ＣＥ−ＬＩＦにより定量分析され、図１４に示されるチャートが得られた。キャピラリー等速電気泳動により精製されたＦＩＴＣ−Ｉの純度は９９．１％以上であった。

Ｎｄ検出用試薬ＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡの合成（図１５）
下記式（５）で示されるMACROCYCLICS社製ＡＢＮＯＴＡが超純水で希釈されて調製された１０^-3ＭのＡＢＮＯＴＡ水溶液５０ｍL、０．１Ｍマレイン酸水溶液１０ｍL、上記式（２）で示される（株）同人化学研究所製ＦＩＴＣ−Ｉ（純度９５％）が超純水で希釈されて調製された１０^-3ＭのＦＩＴＣ−Ｉ７．５ｍL、超純水３２．５ｍLが、この順番で、アルミホイルで覆われて遮光されたポリテトラフルオロエチレン製１００ｍL広口試薬瓶に加えられ、攪拌され、４０℃の恒温槽に６時間放置され、図１５で示される反応が行われた。１５ｍLの１−ブタノールが合成された溶液に加えられ、攪拌され、冷暗所で静置され、２相が形成され、１−ブタノールに富む上層が除かれた（工程Ｉ）。工程Ｉが更に２回繰り返され、１−ブタノール層は分液漏斗により３回目の操作で完全に除去された。

比較例２
ＨＰＬＣによるＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡの精製
抽出されたＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡ溶液は、高速液体クロマトグラフィー装置（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製製ＬＣ―１０ＡＤ）とカラム（ChromaNik Technologies lnc. 社Sunrise C18(4.6 ´ 150 mm)により、反応生成物から分離された。（溶離液：０．０１Ｍ BES｛N,N-Bis(2-hydraxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid｝緩衝溶液（ｐＨ７．０）７０体積％／アセトニトリル３０％）で２回分取された。
３６％高純度塩酸(和光純薬工業株式会社製)が、２回目に分取された溶液に加えられ、溶液のｐＨが２．５程度になると沈殿が発生した。当該沈殿が冷暗所で２０〜３０分間静置され、その後、メンブランフィルターで吸引濾過され、結晶物が得られた。当該結晶物は暗所に置かれたデシケーター中で常温で２日間乾燥された。

ＨＰＬＣにより精製されたＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡのＣＥ−ＬＩＦによる定量分析
ＨＰＬＣにより精製されたＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡ試料溶液は上記ＣＥ−ＬＩＦにより定量分析され、図１６に示されるチャートが得られた。ＨＰＬＣにより精製されたＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡの純度は５７．６％程度であった。

実施例２
ＦＩＴＣ−Ｉ試料溶液に代えて上記ＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡ試料溶液が使用される以外、実施例１と同じ操作が行われた。その結果、図１７に示されるチャートが得られた。キャピラリー等速電気泳動により精製されたＦＴＣ−ＡＢＮＯＴＡの純度は９５．２％であった。

ＦＴＣ−ＰＤＡの合成（図１８）
硝酸（和光純薬工業（株）製特級原液）５ｍＬ及び硫酸（和光純薬工業（株）製特級原液）１０ｍＬが混合された混酸が、図１８の式（Ａ）で示される２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリン（和光純薬工業（株）製）０．５ｇに加えられ、１１５℃で１時間加熱された。１００ｇの氷が得られた溶液に加えられ、冷却された溶液のｐＨが水酸化ナトリウムで８．０に調整された。生成した沈殿が濾過され、１１０℃で乾燥され、図１８の式（Ｂ）で示される５−ニトロ−２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンが得られた。

次に、１ｇの５−ニトロ−２，９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンと１ｇの二酸化セレンの混合物が５ｍＬの９６％ジオキサン水溶液に溶解され、３時間加熱還流され、セライトパッド（登録商標）（Celite Corporation製）で濾過された。図１８の式（Ｃ）で示されるジアルデヒド化合物が黄赤色の沈殿として得られた。当該ジアルデヒド化合物が、１０ｍＬの硝酸（和光純薬工業（株）製特級原液）で３時間加熱還流され、得られた溶液が氷で冷却され、沈殿物が得られた。当該沈殿物がテトラヒドロフラン水溶液で再結晶させられ、図１８の式（１）で示される化合物が得られた。

１１０ｍｇの図１８の式（１）で示される化合物が５ｍＬのエタノールに溶解され、１５ｍｇのパラジウム触媒（Aldrich社製パラジウム炭素、パラジウムの担持率１０％）が更に添加され、水素ガス圧６０ｐｓｉで水素化還元が実施され、図１８の式（２）で示される化合物が溶解する溶液が得られた。当該溶液が空気に触れると、当該溶液の色が黄色から鮮紅色に変色した。１０ｍＬの３Ｍ塩酸が変色した溶液に添加され、パラジウム触媒が濾過により除去された。次いで、０℃で減圧が実施され、エタノールが蒸発させられた。２０ｍＬのジクロロメタンで希釈された０.４２ｍＬのクロロアセチルクロリド溶液が、攪拌されている溶液に添加され、溶液は室温で一晩攪拌され続けた。得られた２相の混合物が減圧蒸留され、固体が得られた。当該固体が１０ｍＬの冷水で洗浄され、減圧下で乾燥され、図１８の式（３）で示される化合物が得られた。

図１８の式（３）で示される化合物１００ｍｇは２０ｍＬの２５％アンモニア水とシールドチューブの密閉された系内で２５℃で１６時間反応させられ、図１８の式（４）で示される化合物が得られた。
６０ｍｇの図１８の式（４）で示される化合物が２ｍＬの１０^-2Ｍマレイン酸緩衝水溶液に懸濁させられ、２ｍＬのテトラヒドロフランが懸濁液に添加されて溶解された。更に、６８ｍｇの図１８の式（５）で示されるフルオレセイン−４−イソチアネート（Aldrich社製）が混合され、暗所にて４０℃で１２時間加熱され、ＦＴＣ−ＰＤＡ溶液（Ａ）が調製された。

比較例３
ＨＰＬＣによるＦＴＣ−ＰＤＡの精製
上記ＦＴＣ−ＰＤＡ溶液（Ａ）が、高速液体クロマトグラフィー装置（日本分光（株）製ＨＰＬＣ−２０００）とカラム（サーモサイエンティフィック（株）製ＨｙｐｅｒｓｉｌＢＤＳＣ１８）により、反応生成物から分離された。アセトニトリル（Ａ液）と０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ｂ液）が移動相として使用され、Ａ液とＢ液の体積比（Ａ／Ｂ）が、開始時５／９５、開始時〜６分後まで５／９５、６分〜１５分後まで４０／６０、１５分〜２０分後まで９０／１０と変化するグラジエント法が採用され、移動相の流量は１．２０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は３０℃とされた。ピークが開始から１８．４分後に現れ、その時点で集められた溶液の溶媒が減圧下で蒸発させられ、ＦＴＣ−ＰＤＡ５２ｍｇが精製された。

ＨＰＬＣにより精製されたＦＴＣ−ＰＤＡのＣＥ−ＬＩＦによる定量分析
ＨＰＬＣにより精製されたＦＴＣ−ＰＤＡがホウ酸緩衝溶液に溶解され、ＦＴＣ−ＰＤＡ試料溶液（Ｂ）が調製された。ＦＴＣ−ＰＤＡ試料溶液（Ｂ）は上記ＣＥ−ＬＩＦにより定量分析され、図１９に示されるチャートが得られた。ＨＰＬＣにより精製されたＦＴＣ−ＰＤＡの純度は８９．３％であった。

実施例３
ＦＩＴＣ−Ｉ試料溶液に代えて上記ＦＴＣ−ＰＤＡ溶液（Ａ）が使用される以外、実施例１と同じ操作が行われた。その結果、図２０に示されるチャートが得られた。キャピラリー等速電気泳動により精製されたＦＴＣ−ＰＤＡの純度は９７．９％であった。

比較例４
アプタマー試料の調整
Integrated DNA Technologies社の合成品であり、タンパク質であるトロンビンの検出に有効であるF２９−ｍｅｒ（5’ -FAM-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3’）３１．６μｇが１６５μＬの超純水に溶解させられ、２．０×１０^-5 Ｍの溶液が調整された。当該F２９−ｍｅｒが上記ＣＥ−ＬＩＦにて定量分析された。その結果、図２１に示されるチャートが得られた。当該F２９−ｍｅｒの純度は８６．１％であった。

実施例４
ＦＩＴＣ−Ｉ試料溶液に代えて上記F２９−ｍｅｒ溶液が使用され、試料が注入された後（図３）、濃縮限界の向上を図るため、上記濃縮用トリスー塩酸溶液とは異なる濃いトリスー塩酸溶液（１Ｍトリス水溶液４１５μL及び１Ｍ塩酸１１０μＬがポリプロピレン製容器に入れられ、超純水で１ｍLに定容されて調製された）が注入され（圧力５０ｍｂａｒ、注入時間３０秒で約４２０ｎＬに相当）、その後、トリス‐塩酸溶液がインレット側泳動液２に設置される以外、実施例１と同じ操作が行なわれた。なお、当該濃いトリス‐塩酸溶液の注入は、各試料注入後と試料プラグが陰圧にてインレット側へと戻された後（図９の後）に行なわれたに上記の改善を加え行なった。その結果、図２２に示されるチャートが得られた。キャピラリー等速電気泳動により精製されたF２９−ｍｅｒの純度は９９．４％であった。

本発明のキャピラリー等速電気泳動法による水溶性物質の精製法は、精製対象水溶性物質と不純物を分離し、非常に高純度の水溶性物質を多量に提供できる。本発明のキャピラリー等速電気泳動法による水溶性物質の精製法は、微量の検出対象物質と結合するプローブの高純度精製に特に適している。

１・・・電源、２、２’・・・泳動液、３・・・キャピラリー

Claims

精製対象水溶性物質を含むトリス−塩酸緩衝液がインレット側に配置され、トリスーグリシン緩衝液がアウトレット側に配置されて、上記精製対象水溶性物質がインレット側からアウトレット側に移動させられる工程（ａ）、
上記精製対象水溶性物質がアウトレット側からインレット側に移動させられる工程（ｂ）、
トリスーグリシン緩衝液がインレット側及びアウトレット側に配置されて、上記精製対象水溶性物質がインレット側からアウトレット側に移動させられる工程（ｃ）が実施され、
上記工程（ａ）、（ｂ）がそれぞれ２回以上繰り返され、下記式（１）が満たされる、キャピラリー等速電気泳動法を用いる複数回大容量注入−濃縮−分離−分取精製法。
｜μＧｌｙ^-｜＜｜μＬ^-｜＜｜μＣｌ^-｜（１）
ただし、｜μＧｌｙ^-｜はグリシンイオンの移動度、｜μＬ^-｜は上記精製対象水溶性物質イオンの移動度、｜μＣｌ^-｜は塩化物イオンの移動度を示す。
上記精製対象水溶性物質が下記式（２）、（３）、（４）で示される化合物又はＤＮＡ分子である、請求項１に記載されるキャピラリー等速電気泳動法を用いる複数回大容量注入−濃縮−分離−分取精製法。