JP3124036B2 - ライム病関連ボレリアに対する核酸増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本明細書に記載および特許請求される発明は、ライム
病に関連するボレリア（Borrelia）生物体に対する増幅
オリゴヌクレオチドおよび核酸プローブの設計および使
用に関し、それらは例えば、組織試料および体液から
の、および培養物からの試験試料中の生物体の検出を可
能にする。

背景技術 ライム病は北アメリカ、欧州および温帯気候を持つ世
界の他の地域において、しばしば診断されるヒト疾患で
あり、最も流行しているダニ媒介疾患である。A.G.Barb
our ＆ D.Fish,Science 260:1610−16（1993）:J.F.
Anderson,Rev.Insect Dis.11:51451−59（1989）;A.C.
Steere,N.Engl.J.Med.,331:586−96（1989）を参照され
たい。ライム病またはライムボレリア病はボレリアスピ
ロヘータにり引き起こされる多段階感染である。ボレリ
ア生物体は感染したマダニ属のダニによりヒトおよび動
物へ伝搬される。白尾シカおよび白足マウス（ペロミス
カス ロイコパス）が各々自然における成虫ダニおよび
幼虫型の一次保有体である。

ヒトおよび動物におけるライムボレリア病の感染は感
染の段階に依存して多くの異なった臨床症状発現を起こ
す。ヒトの初期感染は通常、遊走性紅斑と称される特徴
的な皮膚発疹を伴うインフルエンザ様の病気である。遊
走性紅斑は遠心的に広がり、通常環状の形をしている。
遊走性紅斑は通常、ダニに咬まれた後１−５週間以内に
現れ、数週間または数カ月後に自然に消散する。H.W.Pf
isterら、Lancet 343:1013（1994）を参照されたい。

ボレリア感染後数週間から数カ月以内に、感染は脳、
神経、眼、関節および心臓を含む種々の器官に広がるで
あろう。この感染の広がりは疾患のII期が進行状態にあ
ることを示している。ライムボレリア病の神経学的特色
には髄膜神経根神経炎（バンワース症候群）、髄膜炎、
顔面神経の脳神経炎、神経叢神経炎、多発性単神経炎、
および希に、脳炎、脊椎炎、心血管炎、CSFリンパ球多
サイトーシスが含まる。

ライム心臓炎は重度の病態であり、一般に種々の程度
の過渡的な房室ブロック、周期障害心筋心臓炎および心
不全を特徴とする。ライム心臓病の共通の徴候には動
悸、胸部不快感、息切れ、運動時のめまい感およびアダ
ムス−ストークス発作が含まれる。

筋骨格系のライムボレリア感染は筋痛炎症性ではない
関節炎、関節炎、筋炎、およびリンパ節症のような徴候
を起こす。眼へのボレリア感染は結膜炎、虹彩毛様体
炎、脈絡膜炎、瞳孔浮腫を伴う視神経障害、汎眼球炎の
ような徴候を起こす。他の器官への感染では肝腫、肝
炎、咳および精巣膨潤が起きるであろう。

感染して数カ月から数年後、慢性的な器官障害が起こ
り、ライムボレリア病がIII期に入ったことを示してい
る。この段階の徴候には慢性関節炎、単関節関節炎、少
数関節関節炎、慢性萎縮性先端皮膚炎、脳炎、筋炎、角
膜炎、慢性多発性神経炎および拡張型心筋症が挙げられ
る。

ライムボレリア病を起こすことが知られているボレリ
アスピロヘータは最初はボレリア ブルグドルフェリ
（Borrelia burgdorferi）と称されていたが、現在は
三つの主なゲノム種に分類されている。R.T.Marconi
＆ C.F.Guron,J.Clin.Microbiol.,30:2830−34（199
2）を参照されたい。一つの群は種呼称B.ブルグドルフ
ェリを保持しており、第二の群はボレリア ガルニー
（Borrelia garnii）と名付けられており、第三の群は
種の名前が未だ帰属されていず、VS461と称されてい
る。

別のボレリア種、B.ヘルムシー（hermsii）はB.ブル
グドルフェリと非常に近縁であるが異なったヒト疾患
（回帰熱）に関連している。B.ヘルムシーはDNAハイブ
リダイゼーションによりB.パルヘリ（parheri）および
B.トゥリカテ（turicatae）と同一の種に属していると
特性付けられているが、各々は特定の節足動物ベクター
に特異的である（Barberi ＆ Hayes,Microbiol Revi
ews 50:391−400,1986）。二つの他のボレリア種B.ア
ンセリナ（anserina）およびB.コリアセエ（coriacea
e）はB.ブルグドルフェリと非常に近縁であるが、ヒト
に対して感染性ではない。

ボレリア生物体は他のスピロヘータのように波打った
形および鞭毛を持っている。A.G.Barbour ＆ S.F.Hay
es,Microbiol.Rev.,50:381−400（1986）。これらの生
物体はまた、染色体および環状というよりむしろ線状の
いくつかの染色体外要素も持っている。A.G.Barbour
＆ C.F.Garon,Science,237:409（1987）。いくつかの
表面露出リポ蛋白質、OspAおよびOspBが同定されてお
り、血清学的実験室試験において抗原マーカーとして使
用された。

体液からのボレリア生物体の培養は困難であり、培養
によるライムボレリア病の微生物学的診断を不十分なも
のにしている。B.ブルグドルフェリを検出するための血
清学的試験が開発されており、酵素結合免疫吸着アッセ
イ［ELISA］、間接免疫蛍光アッセイ（IFA）およびウェ
スタンブロッティングが挙げられている。M.G.Golightl
y,Am.J.Clin.Pathol.,99:168−74（1993）を参照された
い。しかしながら、これらの血清学的試験では標準化が
難しく、偽りの陽性および偽りの陰性結果を与えるので
その有効性は制限されている。Barbour,Ann.Intern.Me
d.,110:504（1989）を参照されたい。

感染初期（Ｉ期）またはII期の患者では抗体が検出可
能なレベルには達していず、トレポネマ（Treponema）
またはライム病と関連しない他のボレリアとの交差反応
が起こるであろう。抗生物質による処置はライムボレリ
ア病患者における検出可能な抗体の発生を妨げまたは遅
延させるであろう。これらの欠陥は、ライムボレリア病
の診断および処置における血清学的試験の有用性および
信頼性を制限する。

感染作因の認識のためのプローブとして特異的ヌクレ
オチド配列を持つオリゴヌクレオチドの使用は問題のあ
る免疫学的検出アッセイの代替物になってきている。ボ
レリアのゲノムおよびプラスミドDNA配列の両方の少な
くとも一部が得られている。Schwanら、J.Clin.Microbi
ol.,27:1734（1989）;Schwanら、Ann.N.Y.Acad.Scl.,53
9:419（1988）を参照されたい。B.ブルグドルフェリの
直線状プラスミドから誘導された核酸ハイブリダイゼー
ションプローブが製造され、多数のボレリア種からのB.
ブルグドルフェリの同定の使用された。しかしながら、
これらのプローブはそのヌクレオチド配列が時間が経つ
と不安定になり、または病原性ボレリア単離物には存在
しないかもしれないプラスミドから誘導されているので
生来的に制限されている。特異的ボレリア遺伝子を標的
とする他の核酸ハイブリダイゼーションプローブもま
た、標的とされた遺伝子の進化的安定性の程度に依存し
て生来的に制限されている。例えば、Malloyら、J.Cli
n.Microbiol.,28:1089（1990）;Lebachら、J.Clin.Micr
obiol.,29:731−737;およびGoodmanら、Infect.Immun.,
59:269−278（1991）を参照されたい。

無作為にクローン化したB.ブルグドルフェリDNA配列
が核酸プライマーを構築するのに使用され、これらのプ
ライマーがB.ブルグドルフェリの標的DNA配列の増幅に
使用された。Rosaら、J.Infect.Dis.,160:1018（1989）
を参照されたい。しかしながら、B.ブルグドルフェリ単
離物の全ては検出されず、ライム病を起こす全てのB.ブ
ルグドルフェリを検出するためには不十分な核酸プライ
マーであった。

FukunagaおよびSohnaka、Biophys.Res.Ccmm.,183:952
−57（1992）；およびPosticら、Res.Microbiol.,141:4
65−475（1990）によりB.ブルグドルフェリのリボソー
ムRNA（rRNA）遺伝子の地図が作製され、クローン化さ
れた。B.ブルグドルフェリは染色体当たり23S RNA遺伝
子の二つのコピーおよび16S rRNAをコードしているた
った一つのコピーのみを含んでいるようである点におい
て通常と異なっている。（Fukunagaら、J.Gen.Microbio
l.,138:871−877,1992）。ボレリア16S RNAの配列が培
養B.ブルグドルフェリ生物体を検出できたハイブリダイ
ゼーションプローブの設計に使用された。Marconiら、
J.Clin.Microbiol.,30:628−32（1992）を参照された
い。生物体を培養せずに臨床試料中のB.ブルグドルフェ
リを検出することに対するこのプローブの有用性は証明
されていない。

これらの制限を克服するため、ボレリア16S rRNAを
増幅するための広範囲の特異性を持つプライマー対を用
いたリボソームRNA配列の核酸増幅が記載されている。M
alloyら、J.Clin.Microbiol.,28:1089−93（1990）を参
照されたい。しかしながら、使用された核酸プライマー
はS.オーレウス（aureus）およびP.アエルギノサ（aeru
ginosa）をもまた増幅し、従ってボレリア ブルグドル
フェリに特異的ではなかった。

16S rRNA配列由来の四つの組のプライマーが三つの
異なったボレリアゲノム群のDNAを増幅するのに使用さ
れた。R.T.MarconiおよびC.F.Baron,J.Clin.Microbio
l.,30:2830−34（1992）を参照されたい。ボレリア16S
rRNAの819−842および1153−1173位由来のたただ一つ
のプライマーの組のみが試験された種々の培養ライム病
単離物中に存在するすべてのボレリア生物体を検出し
た。他のプライマーの組はライム病ボレリアの三つすべ
てを認識しなかったまたはライム病に関係しないボレリ
アをも認識した。その他のプライマーの組は臨床単離物
から培養された種々のボレリア生物体のすべてを増幅し
なかった。16S rRNA配列および16S rRNA遺伝子のV4領
域が変化したボレリア ブルグドルフェリのサブタイプ
の増幅はAdamら、Infec.Immun.,59:2579−85、により記
載されている。PCRプライマーがB.ブルグドルフェリの2
3S rRNAの特異的領域を増幅するためおよびボレリアの
他の種からそれを区別するために使用された。Schwartz
ら、J.Clin.Micro.,30:3082（1992）を参照されたい。

ボレリア16S rRNA配列に相補的な他のプローブがWei
sburg、EPO公開番号EPO′0421 725A号、出願番号第903
10766.2号、により記載されている。WhiteおよびDodg
e、PCT US91/01574号、はB.ブルグドルフェリおよびB.
ヘルムシーの16S rRNA遺伝子由来のプライマーおよび
プローブを開示している。

ライム病の血清学的検出および同定において現在は制
限があるため、ライム病に関連するボレリアのすべての
地理的単離物を検出するための感度のよい方法に対する
要望が存在する。

発明の要約 本発明はボレリアのrRNA（リボソームRNA）またはrDN
A（リボソームDNA）ヌクレオチド配列の特定の領域に相
補的であるように設計された新規かつ有用な増幅オリゴ
ヌクレオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびオリ
ゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブ、またはボレリアrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列ま
たはその相補体の特定の部分に実質的に対応する核酸配
列を持つオリゴヌクレオチドを開示し、特許請求してい
る。これらの増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパーオリゴ
ヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブは病原性ボレリアの16Sおよび23S rRNA由来であ
るので、これらのrRNA遺伝子から発現されたRNAのレベ
ルがより高くなり、核酸配列の変化の速度が遅く、およ
び生物体間でのrRNA配列の側方伝達がなくなるためより
優れた検出アッセイが得られる。

増幅オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドハ
イブリダイゼーションアッセイプローブはストリンジェ
ントハイブリダイゼーションアッセイ条件下、標的ボレ
リア16Sおよび23S rRNAおよび／またはrDNA遺伝子配列
にハイブリダイズすることにより機能する。好適な態様
において、本明細書に記載したプローブおよび増幅オリ
ゴヌクレオチドはボレリア ブルグドルフェリ、ボレリ
ア ガルニーおよびV461群のボレリアを含むライム病関
連ボレリアを、血液または組織のような臨床試料中に観
察される他の微生物および他のボレリア種から区別でき
る。従って、本増幅オリゴヌクレオチドおよびハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブはライム病関連ボレリ
アを特異的に検出および／または定量するためのアッセ
イに使用されるであろう。好適な態様において、本明細
書に記載したハイブリダイゼーションアッセイプローブ
はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、ラ
イム病関連ボレリアからの核酸に選択的にハイブリダイ
ズすることができ、ボレリア ヘルムシーからの核酸に
はハイブリダイズしない。本発明のいくつかの態様にお
いて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは標的
配列へのプローブのハイブリダイゼーションの同定を助
けるため、アクリジニウムエステルまたは放射性同位元
素のようなレポーター基を含むオリゴヌクレオチドから
成っている。本発明のいくつかの態様において、増幅オ
リゴヌクレオチドは随意にRNAポリメラーゼにより認識
されるか、またはRNAポリメラーゼによる開始または伸
長を促進する核酸配列を持っているものである。

本発明はライム病関連ボレリアおよびボレリア ヘル
ムシーからの核酸の存在を検出するのに有用なハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブを特色とする。好適に
は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは以下の
ヌクレオチド配列から選択される： 本発明はライム病関連ボレリアからの核酸の存在を検出
するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブを特色とする。これらのハイブリダイゼーションアッ
セイプローブは、好適には以下のヌクレオチド配列から
選択される： 本発明はまたボレリア ヘルムシー核酸を検出するのに
有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブも特色
とする。好適には、これらのハイブリダイゼーションア
ッセイプローブは以下のヌクレオチド配列の一つから選
択されるヌクレオチド配列を持っている： 本発明の別の態様は本発明のハイブリダイゼーションア
ッセイプローブと一緒にヘルパーオリゴヌクレオチド
（プローブ）を含むプローブ混合物である。好適には、
ヘルパーオリゴヌクレオチドは標的核酸へのアッセイプ
ローブの特異的ハイブリダイゼーションを容易にするた
めに使用される；ヘルパーオリゴヌクレオチドは本明細
書において援用され、本発明と共通の所有権を享有する
HoganおよびMillimanの米国特許第5,030,557号に記載さ
れている。本発明においてヘルパープローブとして使用
されるオリゴヌクレオチドには以下の配列が含まれる： 本発明の別の態様はライム病関連ボレリアを検出するた
めの組成物であり、それは本発明のオリゴヌクレオチド
とライム病関連ボレリアからのヌクレオチドポリマーの
特定の領域との間で形成された核酸ハイブリッドであ
る。一般的に、ヌクレオチドポリマーは本発明のオリゴ
ヌクレオチド配列またはその相補体に実質的に対応する
核酸配列を含んでおり、ボレリアのリボソームRNAをコ
ードしているrRNAまたはrDNAから誘導される。これらの
組成物に存在するオリゴヌクレオチドは増幅オリゴヌク
レオチド、ヘルパーオリゴヌクレオチド、ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブ、またはそれらの混合物で
あろう。従って、本発明の組成物は一つまたはそれ以上
の増幅オリゴヌクレオチド、一つまたはそれ以上のヘル
パーオリゴヌクレオチドおよび一つまたはそれ以上のハ
イブリダイゼーションアッセイプローブを含んでいるで
あろう。

その標的配列へハイブリダイズしたプローブを含んで
いる本発明の組成物は核酸配列の存在を検出するために
有用である。その標的核酸配列へハイブリダイズしたヘ
ルパーオリゴヌクレオチドを含んでいる本発明の組成物
はハイブリダイゼーションに利用可能な標的核酸配列の
特定の部分を作るために有用である。その標的配列へハ
イブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーを含ん
でいる本発明の組成物はプライマーの３′末端にポリメ
ラーゼのための開始部位を作り出すために有用である。

本発明のライム病に関連したボレリアの存在を検出す
るための方法もまた企図しており、核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブがボレリア ブルグドルフェ
リ標的核酸配列へハイブリダイズできるがボレリア ヘ
ルムシーからの核酸配列とはハイブリダイズしないスト
リンジェントハイブリダイゼーションアッセイ条件下、
試験試料を核酸ハイブリダイゼーションアッセイプロー
ブと接触させる。本発明はまたこれらの方法で使用され
るオリゴヌクレオチドおよびその均等物も企図してお
り、それらは標的配列へのプローブのハイブリダイゼー
ションの同定の助けとなるレポーター分子を随意に含ん
でいる。本発明は血液、血液由来試料、組織、組織由来
試料、他の体液および身体試料のようなヒトからの試験
試料におけるボレリア核酸の存在を検出するのに有用で
ある。

核酸が少なくとも一つの本発明の増幅オリゴヌクレオ
チドを用いて増幅される、ライム病関連ボレリアの存在
を検出するための方法も本発明はまた企図している。好
適な態様において、そのような増幅後に検出工程が続い
ており、そこで本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーションアッセイプローブを用いて増幅された核酸
が検出される。本発明の方法はまた、RNAプロモーター
のためのヌクレオチド配列を含む増幅オリゴヌクレオチ
ドの使用も企図している。

別の態様において、本発明は増幅アッセイにおける、
ボレリア ブルグドルフェリを含むライム病関連スピロ
ヘータの検出に有用な増幅オリゴヌクレオチドを特色と
している。そのようなオリゴマーは好適には以下の配列
の一つに実質的に対応している： ここで、オリゴマーは修飾されていなくてもよいし、ま
たはRNAポリメラーゼにより認識される５′末端への特
異的核酸配列（T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼのた
めのプロモーター配列が挙げられるが、これらに制限さ
れるわけではない）、および／またはRNAポリメラーゼ
によりRNA転写の開始または伸長を促進する配列の付加
のような修飾を含んでいてもよい。プロモーター配列の
一つの例としては、 配列ID番号:43、５′−AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA−
３′が挙げられる。有用なプロモーター配列の別の例に
は、例えば、Stratagene Cloning SystemsからのpBlu
escript^RベクターまたはPromega Biotec.からのpGEM^TM
ベクターを含む種々の市販品として入手可能なベクター
が含まれる。

本発明の別の態様において、増幅オリゴヌクレオチド
は以下の配列に実質的に対応する配列を介して結合する
かまたは配列の伸長を起こす： 本発明の別の態様は、増幅オリゴヌクレオチド、ヘルパ
ーオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーションア
ッセイプローブを含む一つまたはそれ以上の本発明のオ
リゴヌクレオチドを含むキットを含んでいる。好適な態
様において、本発明のキットは少なくとも一つの増幅オ
リゴヌクレオチド、および他の微生物および他のボレリ
ア種からライム病関連ボレリアを区別できる一つのハイ
ブリダイゼーションアッセイプローブを含んでいる。

特定の核酸配列を検出するための核酸ハイブリダイゼ
ーションの使用の基礎的な記述は、Kohne（1989年７月2
5日に公開された米国特許第4,851,330号）およびHogan
ら（“非ウイルス生物体の検出および／または定量のた
めの核酸プローブ”と題された国際特許出願番号PCT/US
87/03009）により与えられている（両方の参照文献とも
本明細書において援用される）。Hoganらは（上記文
献）試料（例えば、痰、尿、血液および組織切片、食
品、土壌および水）中の非ウイルス生物体または非ウイ
ルス生物体の群の存在を決定するための方法を記載して
いる。

発明の詳細な説明 A.定義 以下の用語は特別に異なった意味を持つように指示し
ない限り、本明細書においては指示された意味を持って
いる。

“標的核酸”とは標的ヌクレオチド配列を持っている
核酸を意味している。

“オリゴヌクレオチド”とはお互いに共有結合で結合
された二つ以上のヌクレオチドサブユニットから作製さ
れた一本鎖ヌクレオチドポリマーを意味している。好適
には、10から100の間のヌクレオチドユニットが存在
し、より好適には12から50の間のヌクレオチドサブユニ
ットがお互いに結合されている。ヌクレオチドサブユニ
ットの糖部分はリボースでも、デオキシリボースでも、
または０−メチルリボースのようなそれらの修飾誘導体
でもよい。オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニ
ットはホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結
合、メチルホスホネート結合またはオリゴヌクレオチド
のハイブリダイゼーションを妨害しない他の希なまたは
天然に存在しない結合により結合されているであろう。
さらに、オリゴヌクレオチドは普通には存在しないヌク
レオチドまたは非ヌクレオチド残基を持っていてもよ
い。本明細書で定義されるように、オリゴヌクレオチド
は核酸であるが（好適にはDNA）、RNAまたは共有結合で
結合されたリボ−およびデオキシリボヌクレオチドの組
み合わせでもよい。決められた配列のオリゴヌクレオチ
ドプローブおよび増幅オリゴヌクレオチドは、化学的ま
たは生化学的合成および例えば、細菌またはレトロウイ
ルスベクターのような組換え核酸分子からのインビトロ
またはインビボ発現によるような当業者には既知の技術
により製造される。本開示により意図されるように、オ
リゴヌクレオチドは野生型染色体DNAまたはそのインビ
ボ転写生成物からは成っていない。プローブの一つの使
用はハイブリダイゼーションアッセイプローブとしてで
あり；プローブは病気にかかった、感染したまたは病原
性の細胞においての遺伝子転写または翻訳を阻止または
阻害するためのインビボまたはインビトロ治療増幅オリ
ゴマーまたはアンチセンス剤としても使用されるであろ
う。

“標的核酸配列”、“標的ヌクレオチド配列”または
“標的配列”とは一本鎖核酸分子の全部または一部のヌ
クレオチド配列およびそれらに相補的なデオキシリボヌ
クレオチドまたはリボヌクレオチド配列からなる特異的
デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列
を意味している。

核酸ハイブリダイゼーションとは、完全にまたは一部
が相補的であるヌクレオチド配列を持つ二つの核酸鎖が
前もって決定された反応条件下でお互いに一緒になって
特異的水素結合を持つ安定な二本鎖ハイブリッドを形成
する過程である。

どちらの核酸鎖もデオキシリボ核酸（DNA）かまたは
リボ核酸（RNA）であり；従ってハイブリダイゼーショ
ンによりRNA:RNAハイブリッド、DNA:DNAハイブリッドま
たはRNA:DNAハイブリッドが生成する。

本明細書で使用する場合の用語“ハイブリダイゼーシ
ョン”とは二つの相補的または部分的に相補的な一本鎖
核酸が逆平行配位で一緒になって二本鎖領域を持つ安定
な構造を形成する能力を指している。この二本鎖構造
（しばしばハイブリッドと呼ばれる）の構成鎖は水素結
合によりお互いに保たれている。これらの水素結合は一
本鎖核酸上に塩基アデニンおよびチミンまたはウラシル
（ＡおよびＴまたはＵ）またはシトシンおよびグアニン
（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で最も普通に形成
されるが、これらの“規範的”対の構成要素ではない塩
基間でも塩基対形成は形成できる。非規範的塩基対形成
は本分野ではよく知られている。例えば、The Biochem
istry of the NucleicAcids（Adamsら、編、1992）
を参照されたい。

“ストリンジェント”ハイブリダイゼーションアッセ
イ条件とは、特異的ハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブが他の微生物（例えば、ボレリア ヘルムシー）
またはヒトに由来する試験試料中に存在する他の核酸の
中で標的核酸（好適にはライム病関連ボレリアのrRNAま
たはrDNA）とハイブリダイズできる条件を意味してい
る。これらの条件は、GC含量およびプローブの長さ、ハ
イブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試
薬または溶液の組成、および考えられたハイブリダイゼ
ーション特異性の程度を含む因子に依存して変化するで
あろうことが理解されるであろう。特異的ストリンジェ
ント条件は以下の開示で提供される。

“プローブ”とは検出されるべきと考えられた核酸配
列にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイズするようにその配列と部分的または完全
に相補的である配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドを
意味している。用語“プローブ”では天然に存在する核
酸は除かれる。精製されたオリゴヌクレオチドプローブ
は化学合成および組換え核酸分子（例えば、レトロウイ
ルスベクター）からのインビトロおよびインビボ発現の
ような本分野で知られている技術により製造される。好
適には、プローブは10から100ヌクレオチドの長さであ
る。プローブは、ストリンジェントハイブリダイゼーシ
ョン条件下でハイブリダイゼーションに実質的に影響を
与えない限り、標的配列に相補的でない領域を持ってい
てもよい。もしそのような領域が存在するならば、それ
らはRNA転写のための５′プロモーター配列および／ま
たは結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む
か、またはプローブまたは標的核酸上に、またはその両
方に触媒活性部位またはヘアピン構造のような所望の二
次または三次構造を与えるであろう配列を含んでいるで
あろう。プローブが標的配列へハイブリダイズしたこと
を検出または確認するために使用できる放射性同位元
素、蛍光または化学発光残基のようなレポーター基残
基、酵素または他のリガンドで修飾されているであろ
う。

本開示において使用される特異的配列の群“より選択
される配列から本質的に成る核酸配列を持つプローブ
（またはオリゴヌクレオチド）”という句は、そのプロ
ーブが（基本的はおよび新規で特徴的なものとして）ス
トリンジェントハイブリダイゼーション条件下、掲げた
核酸配列の群の一つの配列の正確な相補体を持つ核酸へ
安定にハイブリダイズできることを意味している。正確
な相補体には対応するDNAまたはRNA配列が含まれる。

句“核酸配列に実質的に対応している”とは引き合い
に出された核酸は十分に核酸配列と類似しており、スト
リンジェントハイブリダイゼーション条件下、同一の標
的核酸配列とハイブリダイズするであろうという点で引
き合いに出された核酸は核酸配列と類似のハイブリダイ
ゼーション特性を持っている。

本発明の実質的に対応するプローブおよびプライマー
は引き合いに出された配列と変わっていてもよいが、依
然として同一の標的核酸配列にハイブリダイズすること
を当業者は理解するであろう。当業者はまた、この変異
はプローブまたはプライマー中の同一でない塩基の数、
または標的核酸配列の対応する塩基へハイブリダイズし
ないプローブの不適正塩基の数として表現できることも
理解するであろう。本発明のプローブまたはプライマー
は、もしこれらのパーセントが100％から80％である
か、または10ヌクレオチド標的配列中の不適正が０塩基
から10ヌクレオチド標的配列中の不適正が２塩基である
ならば実質的に対応している。

好適な態様において、このパーセントは100％から85
％である。より好適な態様において、このパーセントは
90％から100％であり；別の好適な態様において、この
パーセントは95％から100％である。当業者は受容不可
能なレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを起こす
ことなく、特異的標的配列へのハイブリダイゼーション
を可能にする相補性の種々のパーセントで必要とされる
であろうハイブリダイゼーション条件の種々の変更を理
解するであろう。

“核酸ハイブリッド”または“ハイブリッド”とは二
本鎖、水素結合領域（好適には10から100ヌクレオチド
の間の長さで、最も好適には約12から50ヌクレオチドの
間の長さで）を含む核酸構造を意味しており、ここで各
々の鎖は相手と相補的であり、およびこの領域は化学発
光または蛍光光検出、オートラジオグラフィーまたはゲ
ル電気泳動含む（これらに制限されるわけではない）方
法により検出されるようにストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件下で十分に安定である。そのようなハ
イブリッドはRNA:RNA、RNA:DNAまたはDNA:DNAデュープ
レックス分子から成っている。

“相補的”とは二つの一本鎖核酸の類似の領域または
同一の一本鎖核酸の異なった領域のヌクレオチド配列が
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、一本
鎖が一緒になって安定な二本鎖水素結合領域にハイブリ
ダイズすることを可能にするヌクレオチド塩基組成を持
っていることを意味している。一つの一本鎖領域のヌク
レオチドの隣接する配列が他の一本鎖領域のヌクレオチ
ドの類似の配列と一連の“規範的”水素結合塩基対（Ａ
はＵまたはＴと対合し、ＣがＧと対合するような）を形
成できるとき、ヌクレオチド配列は“完全に”相補的で
ある。

“保存的に修飾された変異体”とは別の核酸の核酸領
域と相補的であるヌクレオチド配列を持っている核酸ま
たはオリゴヌクレオチドを意味しており、そのような領
域は順番に参照核酸と完全に相補的である。そのような
保存的に修飾された変異体はストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下、ボレリアヌクレオチド配列を持
つ標的核酸領域と安定にハイブリダイズできる。

“増幅オリゴヌクレオチド”とは標的核酸配列とハイ
ブリダイズでき、および核酸合成のためのプライマーま
たは核酸合成開始のためのプロモーター鋳型（例えば、
相補鎖合成のための、それにより機能性プロモーター配
列が形成される）またはその両方として働くことができ
るオリゴヌクレオチドを意味している。もし増幅オリゴ
ヌクレオチドがRNA合成を開始させるように設計されて
いるとしたら、オリゴヌクレオチドは標的配列とは相補
的ではないが、RNAポリメラーゼ（T7、T3およびSP6 RN
Aポリメラーゼのような）により認識されるヌクレオチ
ド配列を含んでいるであろう。増幅ヌクレオチドはプラ
イマー伸長を阻害するまたはその量を少なくするように
修飾された３′末端を持っていてもよいし、持っていな
くてもよい。本明細書で定義されたように、増幅ヌクレ
オチドは好適には10から100ヌクレオチドの間の長さで
あろう；最も好適であるのは約12から50ヌクレオチドの
間の長さであろう。本発明の増幅オリゴヌクレオチドは
化学的に合成されるかまたはベクターから誘導される
が、そのようなオリゴヌクレオチドは天然に存在する核
酸ではない。

“核酸増幅”または“標的増幅”とは少なくとも一つ
の標的核酸配列を持つ核酸分子の数を増加させることを
意味している。

“アンチセンス”または“負のセンス”とは参照核酸
配列と相補的な核酸配列を持っていることを意味してい
る。

“センス”、“同一センス”または“正のセンス”と
は参照核酸配列と類似の核酸配列を持っていることを意
味している。

“ヘルパーオリゴヌクレオチド”とは標識プローブと
異なった場所で標的核酸とハイブリダイズするように設
計された核酸プローブを意味しており、それにより標識
プローブのハイブリダイゼーション速度を増加させ、ま
たは標的：標識プローブハイブリッドの融解温度（T_m）
を高め、またはその両方を行う。

“ライム病関連ボレリア”とはライム病を起こすボレ
リア種であり、亞種ボレリア ブルグドルフェリ、ボレ
リア ガルニーおよびボレリアVS461が含まれる。典型
的には、ライム病関連ボレリアはライム病に罹患した哺
乳類から単離できる。

“系統発生的に密接に関係した”とは生物体が進化的
意味においてお互いに密接に関係しており、従ってより
遠い関係の生物体より形態学における著しい類似性およ
びより高い全核酸配列相同性を持っているであろう。系
統発生樹上で隣りおよび隣の次の位置を占める生物体は
密接に関係している。系統発生樹上で隣りおよび隣の次
よりさらに離れた位置を占める生物体は、もしそれらが
著しい全核酸配列相同性を持っているならば密接に関係
しているであろう。

B.ハイブリダイゼーション条件およびプローブ／プライ
マー設計 ハイブリダイゼーション反応条件（ハイブリダイゼー
ションの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩
濃度が最も重要）は本発明の増幅オリゴヌクレオチドま
たはハイブリダイゼーションプローブが標的ボレリアヌ
クレオチド配列を持つ核酸と優先的にハイブリダイズ可
能にし、試験試料中に存在していると疑われる他の選ば
れていない核酸とはハイブリダイズしないように選択で
きる。塩濃度が減少および／または温度が上昇（ストリ
ンジェンシーの増加と呼ばれる）すると、二本鎖ハイブ
リッド分子において対合したヌクレオチド塩基間の水素
結合が破壊されるので核酸ハイブリダイゼーションの程
度が減少する；この過程は“融解”と呼ばれている。

一般的に言って、最も安定なハイブリッドは最も多く
の隣接する完全に一致した（即ち、水素結合された）ヌ
クレオチド塩基対を持つものである。従って、そのよう
なハイブリッドは通常ハイブリダイゼーション条件のス
トリンジェンシーを増加させた場合最も遅く融解するこ
とが期待されるであろう。しかしながら、一つまたはそ
れ以上の不適正な（“非規範的”）または不完全な塩基
対（核酸のヌクレオチド配列のその位置でより弱い塩基
対合を生じるかまたは塩基対合が存在しない結果を生
む）を含む二本鎖核酸領域は、それでも試験試料中に存
在する他の選ばれていない核酸と交差反応することなく
ハイブリダイゼーションアッセイで検出されるべき核酸
ハイブリッドを与える比較的高いストリンジェンシー条
件下で十分に安定である。

これ故、標的核酸のヌクレオチド配列および系統発生
的に別個のものに属するが一方密接に関係した非標的核
酸のヌクレオチド配列間の類似性の程度、および特定の
増幅オリゴヌクレオチドまたはハイブリダイゼーション
プローブのヌクレオチド配列および他の標的および非標
的核酸のヌクレオチド配列間の相補性の程度に依存し
て、一つまたはそれ以上の不適正は標的核酸へハイブリ
ダイズし、非標的核酸へハイブリダイズしないオリゴヌ
クレオチドの能力を必ずしもくじくわけではないであろ
う。

本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは
プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（T_m、与えられ
た反応混合物中の潜在的二本鎖分子の半分が一本鎖の変
性された状態にある温度として定義される）およびプロ
ーブと試験試料中に存在すると予想される系統発生的に
最も密接に関係した生物体のrRNAまたはrDNA（検出され
るべきとは求められていない）のT_m間の相違が最大にな
るように選択、抜粋および／または設計された。非標識
増幅オリゴヌクレオチドおよびヘルパーオリゴヌクレオ
チドは本発明で有用な標識ハイブリダイゼーションアッ
セイプローブのように非常に高程度の特異性を持つ必要
はないので、それらは他の核酸を制して一つまたはそれ
以上の標的核酸へ優先的にハイブリダイズするための同
様の方法で設計された。

原核生物のヌクレオチド配列は5S、16Sおよび23S rR
NAをコードしているrRNA遺伝子を含んでいる。レプトス
ピラ、レプトネマ、セルピュラ、スピロヘータおよびト
レポネマ16S核酸配列のリボソームRNA遺伝子（rRNA）の
ボレリア核酸配列もまた比較のために使用された。ボレ
リア核酸配列情報は実験室での研究および発表された論
文（MarconiおよびGaron、J.Gen.Microbiol.138:533−5
36（1992）;Pasterら、J.Bacteriol.173:8181−6109（1
991）;MarconiおよびGaron、J.Bacteriol.174:241−244
（1992）;Merconi ＆ Garon、J.Clin.Microbiol.30:2
830−34（1992）;Davidsonら、J.Bacteriol.174:3776−
74（1992）から得られた。

プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドとして使用さ
れるべき核酸配列の同定を容易にするため、生物体の異
なった種からヌクレオチド配列を最初に整列させて相同
性を最大限に活用した。rRNA分子内では、全体にわたる
構造および機能間に緊密な関係が存在する。このことは
一次配列の進化的変化に制限を賦課し、そのため二次構
造が維持されている。例えば、もしヘリックスの一つの
側で塩基が変化していると、相補性を保存するために他
の側に補償する変化がなされている（このことは共変異
と呼ばれている）。このことは保存された一次配列にお
よび保存された二次構造要素に基づいて整列されるべき
二つの非常に異なった配列を可能にする。ハイブリダイ
ゼーションプローブのための可能性のある標的配列は整
列させた配列の相同性の変異に注目して同定された。

変異領域の各々での配列進化ほとんど分岐的である。
分岐のため、ライム病関連ボレリアのより遠い系統発生
的関係種は系統学的により近い関係種よりも変異領域に
より大きな変異性を示す。ライム病関連ボレリアおよび
同一の試料中に観察されるであろう他のボレリア種の間
に、好適な標的部位を同定および有用なプローブを設計
するための十分な変異が観察された。

ライム病に関連するボレリア種と、文献で発表されて
いるまたは実験室で決定されたrRNA配列の比較分析によ
る他のボレリア種との間で変化している配列が同定され
た。本明細書で開示されている目的のために使用される
または適用されるであろうコンピューターおよびコンピ
ュータープログラムは市販品として入手可能である。本
プローブを設計するため、標的生物体および同一の試料
中に観察されるであろう最も近い系統発生的関係種間に
十分な変異が観察された。

推定の独特で可能性のある標的ヌクレオチド配列を単
に同定するだけでは、その配列を含むボレリアrRNAまた
はrDNAへハイブリダイズする機能的な種特異的ハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブが製作できることを保
証してはいない。種々の他の因子が種特異的プローブの
ための標的部位としての核酸座の適性を決定するであろ
う。本明細書に記載したようなハイブリダイゼーション
反応の程度および特異性は多くの因子により影響される
ため、一つまたはそれ以上のこれらの因子の操作が特定
のオリゴヌクレオチド（その標的に完全に相補的である
にしろまたはないにしろ）の正確な感受性および特異性
を決定するであろう。種々のアッセイ条件の重要性およ
び影響はHoganら（本出願と同一の譲受人および本明細
書において援用される）およびHoganおよびHammond、米
国特許第5,216,143号（国際特許番号PCT/US87/03009号
に譲渡されている）、Kohne、米国特許第4,851,330号に
より記載されているように当業者には知られている。

例としては：可能な標的ヌクレオチド配列の（および
従って二本鎖プローブ：標的ハイブリッドの）GC含量が
より高いと一般的に安定性および従ってハイブリッドの
T_mが上昇する。一つまたはそれ以上の“選ばれなかっ
た”生物体と同一である配列内のヌクレオチドの数もま
た安定性、従って、ボレリアrRNAと完全に相補的である
プローブと選ばれなかった生物体（類）のrRNAヌクレオ
チド配列を持っている核酸の間の部分的に不適正なハイ
ブリッドのT_mに影響する。

ハイブリダイゼーションの望まれる温度およびハイブ
リダイゼーション溶液組成（濃度、界面活性剤および他
の溶質のような）もまた二本鎖ハイブリッドの安定性に
大きな影響を与える。イオン強度およびプローブが標的
にハイブリダイズされるであろう温度のような条件は、
群−または種−特異的プローブの構築に考えに入れなけ
ればならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は一般に反
応混合物のイオン強度の増加とともに増加する。一方、
ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアル
コールのような水素結合を破壊する化学試薬はハイブリ
ッドの熱安定性を非常に減少させることができる。

標的に対するプローブの特異性を最大限に活用するた
め、本発明の目的プローブは高いストリンジェンシーの
条件下で標的とハイブリダイズするように設計された。
そのような条件下では程度の高い相補性を持つ核酸一本
鎖のみがお互いにハイブリダイズするであろう；そのよ
うな程度の高い相補性を持たない核酸一本鎖はハイブリ
ッドを形成しないであろう。従って、アッセイ条件のス
トリンジェンシーはハイブリッドを形成するために二つ
の核酸鎖間に存在しなければならない相補性の量を決定
する。ストリンジェンシーは、プローブと標的核酸の間
で形成されるハイブリッドおよびプローブと存在する任
意の非標的核酸の間で形成される可能性のあるハイブリ
ッドの安定性の相違を最大限に活用するように選択され
る。

適切な特異性は、非標的生物体の配列に対する完全な
相補性を持つプローブの長さを最少にすることにより、
非標的配列に対する相同性のＧおよびＣが豊富な領域を
避けることにより、および可能な限り非標的配列に対す
る多くの不安定化不適正を含むようにプローブを構築す
ることにより達成される。プローブ配列が生物体の特定
の型のみを検出するのに有効かどうかは、プローブ：標
的ハイブリッド対潜在的プローブ：非標的ハイブリッド
間の熱安定性の相違に大きく依存している。プローブの
設計において、これらのハイブリッド間のT_m値の相違は
可能な限り大きくしなければならない（好適には約５℃
またはそれ以上）。T_mの操作はプローブ長およびプロー
ブ組成（GC含量に対するAT含量）を変化させることによ
り達成できる。

一般に、約10−50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチ
ドプローブに対する至適ハイブリダイゼーション温度
は、与えられたデュープレックスに対する融解温度の約
５℃下である。至適温度以下の温度でのインキュベーシ
ョンは不適正塩基配列のハイブリダイズを可能にし、従
って特異性を減少できる。プローブをより長くすると
（塩基対間の水素結合が多くなる）、一般にT_mが高くな
る。また、ＧおよびＣのパーセントを多くすると、Ｇ−
Ｃ塩基対は追加の水素結合を示してＡ−Ｔ塩基対よりも
熱安定性が大きくなるのでT_mは高くなる。

T_mを決定するための好適な方法では、“均一保護アッ
セイ”と題したArnoldら（上記文献）によるハイブリダ
イゼーション保護アッセイ（HPA）を用いてハイブリダ
イゼーションが測定される。T_mは以下の方法によりHPA
を用いて測定できる。プローブ：標的ハイブリッドはコ
ハク酸リチウム緩衝化溶液（0.1Mコハク酸リチウム緩衝
液、pH5.0、2mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、2mM
エチレン グリコール−ビス（β−アミノ−エチルエー
テル）N,N,N′,N′−四酢酸（EGTA）、10％（w/v）ラウ
リル硫酸リチウム）中、過剰量の標的を用いて形成させ
る。ハイブリッドの一部は次にクエン酸リチウム緩衝化
溶液で希釈し、予期されるT_m（典型的には55℃）より下
の温度から始め、２−５℃づつ高くした種々の温度で５
分間インキュベートする。この溶液は続いて温和なアル
カリ性ホウ酸緩衝液（0.15M四ホウ酸ナトリウム、pH7.
6、５％（v/v）TRITON^RX−100）で希釈してより低い温
度（例えば、50℃）で10分間インキュベートする。これ
らの条件下、一本鎖プローブに結合されているアクリジ
ニウムエステルは加水分解されるが、一方ハイブリダイ
ズされたプローブに結合されているアクリジニウムエス
テルは加水分解から比較的保護されている。従って、残
存するアクリジニウムエステルはハイブリッドの量に比
例し、過酸化水素続いてのアルカリの添加によりアクリ
ジニウムエステルから発生される化学発光により測定で
きる。化学発光はルミノメーター（例えば、Gen−Probe
LEADER^RIまたはLEADER^R50）により測定できる。得ら
れたデータは温度に対して最大信号（通常最も低い温
度）のパーセントとしてプロットする。T_mは残存する最
大信号の50％を示す温度として定義される。上記の方法
に加え、当業者にはよく知られている同位元素法（例え
ば、Hoganら、上記文献）によってもT_mが決定されるで
あろう。

与えられたハイブリッドのT_mは使用されたハイブリダ
イゼーション溶液に依存して変化することに注意しなけ
ればならない。塩濃度、界面活性剤および他の溶質のよ
うな因子は熱変性の間のハイブリッド安定性に影響を及
ぼすことができる（J.Sambrook,E.F.FritschおよびT.Ma
niatis,Molecular Cloning,11章（第ニ版、1989））。
プローブの標的へのハイブリダイズに使用されるであろ
うイオン強度およびインキュベーション温度のような条
件はプローブの構築の際に考えに入れなければならな
い。一方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキスド
およびアルコールのような水素結合を破壊する化学試薬
はハイブリッドの熱安定性を大きく減少させることがで
きる。

プローブがその標的に特異的であることを確かにする
ため、高いストリンジェンシーの条件下でのみハイブリ
ダイズするプローブを持つことが望まれる。高ストリン
ジェンシー条件下では高度に相補的である核酸ハイブリ
ッドのみが形成される；十分な程度の相補性のないハイ
ブリッドは形成されないであろう。従って、アッセイ条
件のストリンジェンシーがハイブリッドを形成するため
の二つの核酸鎖間に必要とされる相補性の量を決定す
る。ストリンジェンシーは標的および他の核酸配列で形
成されるハイブリッド間の安定性の相違を最大にするよ
うに選ばれる。

適切な特異性は、非標的核酸に対して完全な相補性の
長さを最少にすることにより、非標的配列に対する相同
性のＧおよびＣが豊富な領域を避けることにより、およ
び可能な限り非標的配列に対する多くの不安定化不適正
を含むようにすることにより達成される。プローブ配列
が生物体の特定の型のみを検出するのに有効かどうか
は、プローブ：標的ハイブリッドおよびプローブ：非標
的ハイブリッド間の熱安定性の相違に大きく依存してい
る。プローブの設計において、これらのT_m値間の相違は
可能な限り大きくしなければならない（好適には約５℃
またはそれ以上）。

標的核酸配列の長さ、および、従ってプローブ配列の
長さもまた重要である。ある場合には、特定の領域、例
えば、位置および長さが変化している変異領域からのい
くつかの配列が存在し、それらから所望のハイブリダイ
ゼーション特性を持つプローブが得られる。別の場合に
は、あるプローブが単一の塩基が異なっているヌクレオ
チド配列を持つプローブよりも著しく良好であろう。核
酸はハイブリダイズするために完全に相同性ではなくて
もよく、完全に相同的な塩基配列の最も長い広がりが一
般的にハイブリッド安定性を決定し、塩基対の組成もま
たそれに対して役割を果たしている。標的核酸配列の長
さ、および、従ってプローブ配列の長さもまた重要であ
る。ある場合には、特定の“変異”領域（位置および長
さが変化している）からのいくつかの配列が存在し、そ
れらは所望のハイブリダイゼーション特性を持つプロー
ブの設計に使用される。

本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌク
レオチドは種々の長さである。好適なプローブは10から
100ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである。

ハイブリダイゼーションの阻害となる強い内部構造を
形成するrRNA領域は、少なくともヘルパープローブが使
用されないアッセイではより好ましくない標的領域であ
る。同様に、強い自己相補性を生じるプローブ設計も避
けるべきである。前に説明したように、ハイブリダイゼ
ーションとは相補的核酸の二つの一本鎖が会合して水素
結合で結合されたニ本鎖ハイブリッドを形成することで
ある。従って、二つの鎖の一つが完全にまたは部分的に
分子内または分子間ハイブリッドに含まれているとした
ら、新しい分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成に
関与しにくいであろう。リボソームRNA分子は水素結合
により非常に安定な分子内ヘリックスおよび二次構造を
形成することが知られている。標的化された配列の実質
的な部分がプローブとのハイブリダイゼーションまで一
本鎖状態で残っているようにハイブリダイゼーションア
ッセイを設計することにより、プローブおよび標的間の
ハイブリダイゼーションの速度および程度が著しく増加
するであろう。このことの一つの方法は、標的ヌクレオ
チド配列として分子内水素結合に含まれていない配列を
選ぶことにより達成されるであろう。もしくはまたはさ
らに、標的部位をハイブリダイゼーションのためにハイ
ブリダイゼーションアッセイプローブにより近づき易く
するようにできるヘルパーオリゴヌクレオチドとのプロ
ーブ混合物としてハイブリダイゼーションアッセイプロ
ーブが使用される。

DNA標的は自然にはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の生
成物のようにニ本鎖の形で存在する。これらのニ本鎖標
的は自然にはプローブとのハイブリダイゼーションには
阻害的であり、ハイブリダイゼーションに先立って変性
を必要とする。適した変性およびハイブリダイゼーショ
ン条件は本分野では既知である（例えば、E.M.Souther
n,J.Mol.Biol.98:503（1975））。

その標的核酸へ完全に一致したオリゴヌクレオチドの
ために融解温度の推定値を提供するであろう多くの式が
利用可能である。そのような式の一つ、T_m＝81.5＋16.6
（log₁₀［Na⁺］）＋0.41（分画Ｇ＋Ｃ）−（600/N）
（式中、Ｎ＝ヌクレオチドの数でのオリゴヌクレオチド
の長さ）は14から60または70ヌクレオチドの長さのオリ
ゴヌクレオチドに対して良好な推定値を提供する。その
ような計算から、続いての経験的確認またはT_mの“微細
な調製”が本分野ではよく知られているスクリーニング
技術を用いて行われる。ハイブリダイゼーションおよび
オリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報は、
例えば、本明細書において援用されるSambrookら、Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring
Harbor Laboratory Press 1989）を参照されたい
（11章）。この参照文献は特に本分野でよく知られてお
り、ハイブリッドのT_mに対する不適正の影響の推定値も
提供している。従って、二つまたはそれ以上の生物体の
リボソームRNA（またはrDNA）の与えられた既知のヌク
レオチド配列から、これらの生物体をお互いに区別する
であろうオリゴヌクレオチドが設計される。

C.核酸増幅 好適には、本発明の増幅オリゴヌクレオチドはオリゴ
デオキシヌクレオチドであり、核酸ポリメラーゼによる
伸長生成物合成のための基質として使用するのに十分な
長さである。至適プライマー長は反応温度、構造および
プライマーの塩基組成およびいかにプライマーが使用さ
れるべきかなどのいくつかの因子を考えに入れなければ
ならない。例えば、至適特異性のためにはオリゴヌクレ
オチドプライマーは一般的には標的核酸配列の複雑さに
依存して少なくとも約12のヌクレオチドを含んでいなけ
ればならない。もしそのような特異性が必須ではないな
ら、より短いプライマーが使用されるであろう；そのよ
うな場合、鋳型核酸との安定なハイブリッド複合体を形
成させるためにより冷たい温度で反応を実施することが
望ましいであろう。

所望の特性を持つ増幅オリゴヌクレオチドおよびプロ
ーブのための有用なガイドラインが本明細書に記載され
ている。我々の最良の様式設計部位は、単一核酸分子の
約15塩基より大きく約350塩基以内の、およびより好適
には150保存ヌクレオチド以内のライム病関連ボレリア
核酸の二つおよび好適には三つの保存領域を含んでい
る。

プライマーまたはプロモータープライマーの組で観察
される増幅の程度は、その相補的配列へハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドの能力および酵素的に伸長また
はコピーされるそれらの能力を含むいくつかの因子に依
存している。異なった長さおよび塩基組成のオリゴヌク
レオチドが使用できるが、本発明で好適なオリゴヌクレ
オチドは18−40塩基の標的結合領域を持ち、約65℃の標
的との予想T_mを持っている。

T_mのようなプローブのハイブリダイゼーションに影響
するパラメーター、相補性および標的配列の二次構造も
またプライマーハイブリダイゼーションおよびその結果
としての性能に影響する。非特異的伸長（プライマー−
ダイマーまたは補標的のコピー）の程度もまた増幅効率
に影響し、従ってプライマーは低自己−または交差−相
補性を持つように選択される（特に配列の３′末端
で）。長いホモポリマー領域および高GC含量は見せかけ
のプライマー伸長を減少させるために避けられる。設計
のこの局面を助けるためにコンピュータープログラムが
利用可能である。

本発明の増幅オリゴヌクレオチドに関連して使用され
る核酸ポリメラーゼは化学的、物理的または生物学的作
用剤を意味し、それは鋳型依存的様式で核酸ポリマーま
たは鎖内へリボーまたはデオキシリボヌクレオチドまた
はその両方を取り込む。核酸ポリメラーゼの例として
は、DNA−指向DNAポリメラーゼ、RNA−指向DNAポリメラ
ーゼおよびRNA−指向RNAポリメラーゼが含まれる。DNA
ポリメラーゼは鋳型依存的様式でおよび５′から３′方
向への核酸合成を引起こす。ニ本鎖核酸中の二つの鎖は
逆平行配向のため、この方向は鋳型の３′領域から鋳型
の５′領域である。DNA−指向DNAポリメラーゼの例には
大腸菌DNAポリメラーゼＩ、テルムス アクアチクス（T
hermus aquaticus）（Taq）からの熱安定性DNAポリメ
ラーゼおよびバシルス ステアロテルモフィルス（Baci
llus stearothermophilus）（Bst）からのDNAポリメラ
ーゼＩのラージフラグメントが含まれる。RNA−指向DNA
ポリメラーゼの例にはモロニーマウス白血球ウイルス
（MMLV）逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス（AM
V）逆転写酵素のような種々のレトロウイルス逆転写酵
素が含まれる。

ほとんどの核酸増幅反応の間に、核酸ポリメラーゼは
鋳型として標的核酸を用いてプライマーの３′末端にヌ
クレオチド残基を付加するので、標的核酸領域に部分的
にまたは完全に相補的である核酸配列を持つ第二の核酸
鎖を合成する。多くの核酸増幅反応において、生じたニ
本鎖構造を含む二つの鎖は、増幅反応の進行を可能にす
るために化学的または物理的手段により分離されなけれ
ばならない。もしくは、新しく合成された鋳型鎖は、鎖
置換または本来の標的鎖の一部または全部を消化する核
酸分解性酵素の使用により第二のプライマーまたはプロ
モーター−プライマーによるハイブリダイゼーションに
利用可能なようにされるであろう。このように、本過程
を多くのサイクル繰り返され、標的ヌクレオチド配列を
持つ核酸分子の数が多量に増加する。

第一または第二の増幅オリゴヌクレオチドまたはその
両方がプロモーター−プライマーであろう。そのような
プロモーター−プライマーは通常標的核酸分子またはプ
ライマー伸長生成物のヌクレオチド配列と相補的ではな
いヌクレオチド配列を含んでいる。これらの非相補的配
列は増幅オリゴヌクレオチドの相補的配列の５′に位置
しており、核酸ポリメラーゼの作用によりニ本鎖が作製
された場合、RNA合成開始のための座を提供するであろ
う。このように提供されたプロモーターは標的核酸配列
の複数のRNAコピーのインビトロ転写を可能にするであ
ろう。本明細書のプライマーに言及する場合、言及の文
脈において明白に他のものを示していない限り、そのよ
うな言及はプロモーター−プライマーのプライマー的見
地を含んでいるつもりである。

いくつかの増幅系において（例えば、Dattaguptaら、
上記文献、の増幅法）、増幅オリゴヌクレオチドは鎖置
換を助ける５′非相補的ヌクレオチドを含んでいるであ
ろう。さらに、５′エキソヌクレアーゼ活性を持つ核酸
ポリメラーゼと関連して使用された場合、増幅オリゴヌ
クレオチドは酵素的消化を防止するためにそれらの５′
末端が修飾されているであろう。もしくは、核酸ポリメ
ラーゼは５′エキソヌクレアーゼを除去するように修飾
（そのようなヌクレアーゼを持たない活性なポリメラー
ゼ断片を発生するプロテアーゼでの処理によるような）
されているであろう。そのような場合、オリゴヌクレオ
チドはその５′末端が修飾される必要はない。

1.オリゴヌクレオチドの製造 オリゴヌクレオチドはお互いに共有結合で連結された
ヌクレオチドサブユニットから作られている。ヌクレオ
チドサブユニットの糖基はリボース、デオキシリボース
またはＯ−メチルリボースのようなそれらの修飾された
誘導体である。ヌクレオチドサブユニットはホスホジエ
ステル結合、修飾結合またはオリゴヌクレオチドのハイ
ブリダイゼーションを阻害しない非ヌクレオチド残基の
ような結合で連結されている。修飾結合には標準ホスホ
ジエステル結合がホスホロチオエート結合またはメチル
ホスホネート結合のような異なった結合で置き換えられ
ている結合が含まれる。前記のように、ハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブとして使用された場合、オリ
ゴヌクレオチドは好適には、標的配列へのプローブのハ
イブリダイゼーションの同定を助けるためアクリジニウ
ムエステルまたは放射性同位元素のようなレポーター基
を含んでいる。

本発明のすべての増幅オリゴヌクレオチドは本分野で
は既知の方法により容易に製造できる。好適には、プラ
イマーは固相法を用いて合成された。例えば、Carruthe
rsらはホスホジエステル結合によりヌクレオチドを連結
するために標準ホスホロアミダイト固相化学の使用を記
載している。シアノエチルホスホロアミダイト前駆体を
用いる自動化固相化学合成がBaroneら、Nucleic Acids
Research,12:405（1984）、により記載されている。
（Methods in Enzymology,143巻、287ページ（198
7））。同様に、Bhattはホスホロチオエート結合を含む
オリゴヌクレオチド合成のための方法を記載している。
（本発明と共通の所有権を有する“有機リン化合物の硫
化のための方法および試薬”と題した米国特許出願第07
/319,570号）。また、Klemら（“オリゴマー合成の改良
法”と題したPCT WO92/07864）は、メチルホスホネー
ト結合を含む異なった結合を持つオリゴヌクレオチドの
合成を記載している。後の三つの参照文献は本発明にお
いて援用される。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合
成のための方法は当業者には既知であり,Sambrookらに
より記載されている（上記文献、前に本明細書において
援用されている）。

特定のオリゴヌクレオチドの合成および精製に続い
て、いくつかの異なった方法が大きさおよび純度の点で
のプローブまたはプライマーの受容可能性を決定するた
めに利用される。適した方法にはポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーが含まれ
る。これらの方法は両方とも当業者にはよく知られてい
る。

本発明のすべてのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダ
イゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴヌクレオチ
ドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドにせよ、それらの
性能を高めるためまたは増幅精製物の特性決定を容易に
するために化学基で修飾される。例えば、オリゴヌクレ
オチドをある種のポリメラーゼの核酸分解活性耐性にす
るホスホロチオエートまたはメチルホスホネート基を持
つオリゴヌクレオチドのような主鎖修飾オリゴヌクレオ
チドは増幅または他の反応でのそのような酵素の使用を
可能にする。修飾の別の例にはハイブリダイゼーション
またはプライマーの伸長を妨害しない、核酸鎖中のヌク
レオチド間に取り込まれたヌクレオチドリンカー（例え
ば、Arnoldら、“ヌクレオチドプローブのための非ヌク
レオチド結合剤”欧州特許出願第88308766−０号）の使
用が含まれる。増幅オリゴヌクレオチドはまた所望の修
飾および天然のヌクレオチドの混合物も含んでいる。

増幅オリゴヌクレオチドの３′末端はまた、“核酸配
列増幅”と題された米国特許出願第07/925,405号（本発
明と共通の所有権を享有し、本明細書において援用され
る）にMaDonoughにより記載されているようにDNA合成の
開始を防止するために保護されている。異なった３′保
護増幅オリゴヌクレオチドはここに記載されているよう
に核酸増幅の効率を増加させる。

前記のように、オリゴヌクレオチドの５′末端はいく
つかの核酸ポリメラーゼに存在する５′−エキソヌクレ
アーゼ活性に耐性となるように修飾されている。そのよ
うな修飾は、前に本明細書において援用された“ヌクレ
オチドプローブのための非ヌクレオチド結合剤”と題し
てArnoldらにより記載されているような技術を用いてプ
ライマーの末端５′ヌクレオチドへ非ヌクレオチド基を
付加させることにより実施できる。

一度合成されたら、選択されたオリゴヌクレオチドプ
ローブはいくつかの既知の方法により標識される（例え
ば、J.Sambrook、上記文献）。有用な標識には放射性同
位元素ならびに非放射活性レポート基が含まれる。同位
元素標識には³H、³⁵S、³²P、¹²⁵I、⁵⁷Coおよび¹⁴Cが含
まれる。同位元素標識は、ニックトランスレーション、
末端標識、第二鎖合成、逆転写の使用および化学的方法
のような本分野では既知の技術によりオリゴヌクレオチ
ド内へ導入できる。放射性標識プローブを使用した場
合、ハイブリダイゼーションはオートラジオグラフィ
ー、シンチレーション計数またはガンマ計数により検出
できる。選択される検出法は標識に使用された特定の放
射性同位元素に依存するであろう。

非同位元素物質もまた標識に使用でき、核酸配列の内
部にまたは核酸配列の末端に導入される。修飾ヌクレオ
チドは酵素的にまたは化学的に取り込まれる。プローブ
の化学修飾は、例えば、Arnoldら（“ヌクレオチドプロ
ーブのための非ヌクレオチド結合剤”と題したEPO出願
番号第88308766−０号、公開番号第313219号、本明細書
において援用される）により記載されたような非ヌクレ
オチドリンカー基の使用により、プローブ合成の間また
は後で実行される。非同位元素標識には蛍光分子、化学
発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテンまたはそ
の他のリガンドが含まれる。

好適には、プローブはアクリジニウムエステルで標識
される。アクリジニウムエステル標識はArnoldら（“ア
クリジニウムエステル標識およびヌクレオチドプローブ
の精製”と題して1993年２月９日に公開された米国特許
第5,185,439号、本明細書において援用される）により
記載されたように実施される。

2.ボレリアrRNAおよびrDNAの増幅 本発明の増幅オリゴヌクレオチドは特定のボレリア16
Sまたは23S rRNAヌクレオチド配列またはそれらのrDNA
対応物に方向付けられている。これらの増幅オリゴヌク
レオチドは、核酸増幅アッセイにおいてボレリアの存在
を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイプロ
ーブとして使用された少なくとも一つの標的ヌクレオチ
ド配列内に隣接または含まれている。本明細書において
記載され特許請求された増幅オリゴヌクレオチドは二つ
の組の増幅オリゴヌクレオチドを含んでいる。増幅オリ
ゴヌクレオチドの組の組成物は以下のヌクレオチド配列
の一つを持つかまたは実質的に対応している核酸とハイ
ブリダイズできる： 好適な態様において、これらの増幅オリゴヌクレオチド
は以下の配列を持つかまたは実質的に対応している： これらのオリゴヌクレオチドはまた、その５′末端にRN
Aポリメラーゼを結合でき、鋳型として標的核酸を用い
るRNA転写を指図するプロモーター配列を含む追加の非
相補的塩基を持っている。

ボレリアの16S rRNAへ方向付けられた好適な増幅プ
ライマーは以下の配列を持つかまたは実質的に対応して
いる： これらの16S rRNA増幅オリゴヌクレオチドは特定のボ
レリア16S rRNA核酸配列、rDNA対応物に方向付けるこ
とができ、部分的または完全にこれらの配列と重複して
いる。

好適であるはヌクレオチド配列： に実質的に対応するヌクレオチド配列を持つ16S増幅オ
リゴヌクレオチドである。

最も好適であるのはヌクレオチド配列： （式中、19の最も３′のヌクレオチドが示された通り厳
密であるである）に実質的に対応するヌクレオチド配列
を持つ16S増幅オリゴヌクレオチドである。

ボレリアの236S rRNAへ方向付けられた好適な増幅プ
ライマーは以下の配列を持つかまたは実質的に対応して
いる： これらの23S rRNA増幅オリゴヌクレオチドは特定のボ
レリア23S rRNA核酸配列、rDNA対応物に方向付けるこ
とができ、部分的または完全にこれらの配列と重複して
いる。

本発明のすべての増幅オリゴヌクレオチドはこれらの
配列への修飾または付加を含まない配列を持っている。
増幅オリゴヌクレオチドはまた、またはもしくは、保護
された３′および／または５′末端またはRNAポリメラ
ーゼにより認識される特異的ヌクレオチド配列（例え
ば、T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼのためのプロモ
ーター配列）の付加、RNAポリメラーゼによるRNA転写の
開始または延長を促進する配列の付加、または分子内塩
基対合を提供し、二次または三次核酸構造の形成を助長
する配列の付加を含む（これらに制限されるわけではな
い）付加のような修飾を持っていてもよい。

ポリメラーゼ連鎖反応またはKacianおよびFUltz、上
記文献,Dattaguptaら、上記文献、およびSninskyら、米
国特許第5,079,351号（どちらも本明細書において援用
され、最初の二つは本発明と共通の所有権を享有してい
る）により記載されたようなRNAポリメラーゼ、DNAポリ
メラーゼおよびRNAse Ｈまたはその均等物を用いる増
幅反応のような核酸増幅反応で増幅オリゴヌクレオチド
が使用される。

増幅された標的配列の検出に広範囲の方法が利用でき
る。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマーは新た
に合成されるDNA内へ取り込まれる検出可能な標識を含
むことができる。生じた標識増幅生成物は次に、未使用
の標識ヌクレオチドまたはプライマーから分離され、標
識は分離された生成物分画で検出される。

有用な検出可能標識として働くことができる物質は本
分野ではよく知られており、放射性同位元素、蛍光化合
物、化学発光化合物、発色団、ならびにビオチンおよび
ハプテンのようなリガンド（これらは直接的には検出可
能ではないが、例えば、各々アビジンおよび抗体のよう
なそれらの特異的結合相手の標識形との反応により容易
に検出できる）が含まれる。

増幅生成物を検出する別の方法は、検出可能なように
標識した核酸プローブとハイブリダイゼーションさせ、
生じたハイブリッドを通常の様式で測定する方法であ
る。特に、生成物は標的配列へ化学発光アクリジニウム
エステル標識核酸プローブをハイブリダイズさせ、ハイ
ブリダイズしていないプローブ上に存在するアクリジニ
ウムエステルを選択的に加水分解し、ルミノメーターで
残存するアクリジニウムエステルから発生する化学発光
を測定することによりアッセイできる。（例えば、Arno
ldら、上記文献、PCT出願番号US88/02746、およびNelso
nら、“Non−Isotopic DNA Probe Technologies",Ac
ademic Preess,San Diego（Kricka編、1992年）、両
方の参照文献ともに本明細書において援用される、を参
照されたい。） D.ボレリアrRNAおよびrDNAに対するオリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ 本明細書において開示および請求されているオリゴヌ
クレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは
系統発生学的に密接に関連した細菌種の核酸を制して、
ライム病関連ボレリアrRNAまたはrDNAヌクレオチド配列
を含む標的核酸へ優先的にハイブリダイズできる。これ
らのハイブリダイゼーションプローブは、ライム病関連
ボレリアおよび該系統発生学的に密接に関連した種のヌ
クレオチド配列の比較に基づいて設計され、選択されお
よび／または決められた。好適な態様において、これら
のプローブはボレリア ヘルムシーの核酸を制してライ
ム病関連ボレリアの核酸に選択的にハイブリダイズす
る。

本発明はライム病関連ボレリアまたはボレリア ヘル
ムシーを含むボレリア種の核酸に選択的にハイブリダイ
ズするが密接に関連した微生物の核酸とはハイブリダイ
ズしないオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプ
ローブを企図しており、以下の核酸配列を持つまたは実
質的に対応する核酸配列が含まれる： ライム病関連ボレリアの核酸に選択的ハイブリダイズす
る本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは
以下の核酸配列を持つまたは実質的に対応する： 現在の所、ライム病関連ボレリアの16S rRNAに方向付
けられたこれらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションアッセイプローブの好適な態様は以下のヌクレオ
チド配列を持つまたは実質的に対応する： ライム病関連ボレリアの23S rRNAに方向付けられたこ
れらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイプローブの好適な態様は以下のヌクレオチド配列を
持つまたは実質的に対応する： 本発明の多くのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ
ョンアッセイプローブは他の系統発生学的に密接に関連
した細菌種の核酸を制して、ボレリア ヘルムシーrRNA
またはrDNAヌクレオチド配列を含む標的核酸へ好適にハ
イブリダイズする。好適な態様において、これらのハイ
ブリダイゼーションアッセイプローブは他のボレリア核
酸からボレリア ヘルムシー核酸を区別できる。

ボレリア ヘルムシーに由来する核酸に選択的にハイ
ブリダイズする本発明のハイブリダイゼーションプロー
ブは以下のヌクレオチド配列を持つまたは実質的に対応
する： ボレリア ヘルムシーの16S rRNAに方向付けられたこ
れらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイプローブの好適な態様は以下のヌクレオチド配列を
持つまたは実質的に対応する： ボレリア ヘルムシーの23S rRNAに方向付けられたこ
れらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ
セイプローブの好適な態様は以下のヌクレオチド配列を
持つまたは実質的に対応する： 本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションア
ッセイプローブは、標的配列へプローブがハイブリダイ
ズしたことを検出または確認するために使用できる放射
性同位元素、蛍光性または化学発光性残基、酵素または
その他のリガンドのようなレポーター基残基で好適に標
識される。標識として化学発光性アクリジニウムエステ
ルの使用が最も好ましい。本出願と共通の所有権を享有
し、本明細書において援用されるArnoldらによる米国特
許第5,185,439号を参照されたい。アッセイプローブ
は、相補性領域中での水素結合形成により二つの鎖のア
ニーリングを可能にするために適したハイブリダイゼー
ション条件下、標的配列を持っている核酸を含むと疑わ
れる試料と混合する。プローブは標的ボレリアヌクレオ
チド配列を持っている核酸との結合を容易にするため、
一つまたはそれ以上の非標識ヘルパーオリゴヌクレオチ
ドとも結合されているであろう。プローブは試料中に存
在する標的核酸へハイブリダイズする；生じたハイブリ
ッドデュープレックスは分離され、ヒドロキシアパタイ
ト吸着および放射活性モニタリングのような本分野では
よく知られている種々の技術により検出される。本出願
と共通の所有権を享有し、本明細書において援用される
Arnoldらによる米国特許第5,283,174号に開示されてい
るような、ハイブリダイズしていないプローブ上に存在
する標識を選択的に分解し、続いて残存するハイブリダ
イズしたプローブに付随する標識の量を測定することを
含む技術もこれらの技術の中に含まれている。この後者
の技術が現在のところ好ましい。

E.ボレリアの検出に使用されるヘルパーオリゴヌクレオ
チド 特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドが標的核酸へのハ
イブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイ
ゼーションを容易にするために使用された。ヘルパーオ
リゴヌクレオチドは、本出願と共通の所有権を享有し、
本明細書において援用される“核酸ハイブリダイゼーシ
ョンを促進するための手段および方法”と題されたHoga
nおよびMillimanによる米国特許第5,030,557号に開示さ
れている。

ヘルパープローブはハイブリダイゼーションアッセイ
プローブにより標的化された領域近くに位置する核酸配
列へハイブリダイズするように選択される。ヘルパープ
ローブのハイブリダイゼーションは標的核酸の二次およ
び三次構造を変化させ、標的核酸へのプローブのハイブ
リダイゼーションを容易にする。

ボレリア核酸の特異的検出を容易にするための特異的
ヘルパーオリゴヌクレオチドはこれらのヌクレオチド配
列の一つを持っているかまたは実質的に対応している： 別の態様において、ボレリア核酸の特異的検出を容易に
するための特異的ヘルパーオリゴヌクレオチドは以下の
ヌクレオチド配列の一つを持っているかまたは実質的に
対応している： 好適な態様において、ヘルパーオリゴヌクレオチドと一
緒にプローブ混合物で使用されるライム病関連ボレリア
の16Sリボソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブは以下のヌクレオチド配列を
持っているかまたは実質的に対応している： 最も好適な態様において、実質的に に対応するライム病関連ボレリア16Sリボソーム核酸に
方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下
のヌクレオチド配列： を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。

最も好適な態様において、実質的に に対応するライム病関連ボレリア16Sリボソーム核酸に
方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下
のヌクレオチド配列： を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。

好適な態様において、ヘルパーオリゴヌクレオチドと
一緒にプローブ混合物で使用されるライム病関連ボレリ
アの23S核酸に方向付けられたハイブリダイゼーション
アッセイプローブは以下のヌクレオチド配列を持ってい
るかまたは実質的に対応している： 最も好適な態様において、実質的に に対応するライム病関連ボレリア23Sリボソーム核酸に
方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下
のヌクレオチド配列： を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。

好適な態様において、実質的に配列ID番号10または配
列ID番号33に対応するボレリア ヘルムシー16Sリボソ
ーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションプロ
ーブは以下のヌクレオチド配列： を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。

好適な態様において、実質的に に対応するボレリア ヘルムシー16Sリボソーム核酸に
方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下
のヌクレオチド配列： を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。

好適な態様において、ボレリア ヘルムシー23Sリボ
ソーム核酸に方向付けられたハイブリダイゼーションプ
ローブは以下のヌクレオチド配列： を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。

好適な態様において、実質的に に対応するボレリア ヘルムシー23Sリボソーム核酸に
方向付けられたハイブリダイゼーションプローブは以下
のヌクレオチド配列： を持つまたは実質的に対応するヘルパーオリゴヌクレオ
チドと一緒にプローブ混合物で使用される。

ヘルパーオリゴヌクレオチドは一般的にはストリンジ
ェントハイブリダイゼーション条件下で使用されるが、
特異性においては種特異的である必要はない；すなわ
ち、ヘルパーオリゴヌクレオチドのための標的ヌクレオ
チド配列は種ボレリアに独特である必要はない。

F.核酸組成物 別の関連する態様において、本発明はハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブおよびそれに対して実質的に
相補的である核酸配列間の核酸ハイブリッド（プロー
ブ：標的）を含む組成物を特色としている。プローブお
よび標的間で形成されたハイブリッドの一つの使用は標
的配列の存在を検出することである。例えば、ハイブリ
ッドに存在するアクリジニウムエステル（“AE"）はア
ルカリ溶液での加水分解に抵抗するが、一方一本鎖核酸
に存在するAEはアルカリ溶液で加水分解される（Arnold
ら、“同質保護アッセイ”と題されたEPO出願番号第883
08767.8号、公開番号第309230号、および米国特許番号
第5,238,174号、本明細書において援用される）。従っ
て、非結合AE−標識プローブの加水分解後、核酸ハイブ
リッドに付随する残存アクリジニウムエステルの化学発
光を測定することにより標的核酸の存在が検出できる。

本発明はまた増幅オリゴヌクレオチドおよびそれに対
して実質的に相補的な核酸配列間の核酸ハイブリッド
（プライマー：標的）を含む組成物も企図している。プ
ライマーおよび標的間で形成された核酸ハイブリッドの
一つの使用は増幅オリゴヌクレオチドの３′末端にポリ
メラーゼのための開始部位を提供することである。例え
ば、ハイブリッドは逆転写酵素、Taqポリメラーゼのよ
うなDNAポリメラーゼおよびT7ポリメラーゼ、SP6ポリメ
ラーゼおよびT3ポリメラーゼなどのようなDNAポリメラ
ーゼのための開始部位を形成するであろう。

本発明はまた、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびそ
れに対して実質的に相補的である核酸配列間の核酸ハイ
ブリッド（ヘルパーオリゴヌクレオチド：標的）を含む
組成物を特色とする。ヘルパーオリゴヌクレオチドおよ
び標的間のハイブリッドの一つの使用は特別の核酸配列
をハイブリダイゼーションに利用できることにすること
である。例えば、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよびそ
の標的間のハイブリッドは核酸配列をハイブリダイゼー
ションプローブとのハイブリダイゼーションに利用可能
な標的配列へハイブリダイズできるようにするであろ
う。ヘルパーオリゴヌクレオチド使用の完全な記述はHo
ganおよびMillimanによる米国特許第5,030,557号に提供
されている。

本発明の組成物にはボレリア核酸および下記の核酸配
列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つ
オリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを
含むボレリア核酸を検出するための組成物が含まれる： 本発明の好適な組成物にはボレリア核酸および下記の核
酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を
持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッ
ドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物
が含まれる： 本発明の好適な組成物にはボレリア核酸および下記の核
酸配列の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を
持つオリゴヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッ
ドを含むライム病関連ボレリアを検出するための組成物
が含まれる： 本発明はまた、ボレリア核酸および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドを持つ核酸ハイブリッドを含むライム
病関連ボレリアを検出するための組成物も企図してい
る。

本発明はまた、ボレリア核酸および に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むライム
病関連ボレリアを検出するための組成物も企図してい
る。

本発明の好適な組成物にはボレリア ヘルムシー核酸
および下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応
する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成された
核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出す
るための組成物が含まれる： 本発明のより好適な組成物にはボレリア ヘルムシー核
酸および下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対
応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド間で形成され
た核酸ハイブリッドを含むボレリア ヘルムシーを検出
するための組成物が含まれる： 本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、以下の核酸配列： の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持つ核酸ハイブリッドを含むボレリ
ア ヘルムシーを検出するための組成物も企図してい
る。

本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： の少なくとも一つと実質的に対応した核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドを持つ核酸ハイブリッドを含むボレリ
ア ヘルムシーを検出するための組成物も企図してい
る。

本発明はまた本発明のプローブおよび下記の核酸配列
の少なくとも一つに実質的に対応する核酸配列を持つ少
なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチドを含む核酸
ハイブリッドを企図している： 本発明はまた、ボレリア核酸および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るライム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図
している。

本発明はまた、ボレリア核酸および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るライム病関連ボレリアを検出するための組成物を企図
している。

本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図
している。

本発明はまた、ボレリア ヘルムシー核酸および に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
間で形成され、および、また以下の核酸配列： の少なくとも一つと実質的に対応する核酸配列を持つオ
リゴヌクレオチドも持ち、および随意に以下の配列： の一つに実質的に対応する配列を持つ一つまたはそれ以
上のオリゴヌクレオチドを含む核酸ハイブリッドからな
るボレリア ヘルムシーを検出するための組成物も企図
している。

好適な態様において、本発明はまた本発明のプローブ
および下記の核酸配列の少なくとも一つに実質的に対応
する核酸配列を持つ少なくとも一つのヘルパーオリゴヌ
クレオチドを含む核酸ハイブリッドを企図している： 本発明はまた、ボレリア核酸および （ここで19の最も３′のヌクレオチドは示されたように
厳密である）に実質的に対応した核酸配列を持つオリゴ
ヌクレオチド間で形成された核酸ハイブリッドを含むラ
イム病関連ボレリアを検出するための組成物も企図して
いる。

G.アッセイ法 本発明は試料内のボレリア核酸の存在をアッセイする
ための種々の方法を企図している。使用される厳密なア
ッセイ条件、プローブまたはプライマーは、使用される
特定のアッセイ型および試料源に依存して変化するであ
ろうことが当業者には理解されるであろう。

一般に、本発明はストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件下でボレリア標的核酸とハイブリダイ
ズできるが、密接に関連した微生物からの核酸とはハイ
ブリダイズできない核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イプローブと接触させることによりボレリア微生物の存
在を検出する方法を企図しており、該標的核酸は： から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸
配列を持っている。

ライム病関連ボレリアの存在を検出するための好適な
方法は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件
下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件下でライム病関連ボレリア標的核酸とハイブリダ
イズできるが、ボレリア ヘルムシーのような密接に関
連した細菌の核酸配列とはハイブリダイズできない核酸
ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる
工程を含み、該標的核酸配列は： から成るより選択される配列に実質的に対応する。

ライム病関連ボレリアの存在を検出するためのより好
適な方法は、ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下でライム病関連ボレリア標的核酸とハイブ
リダイズできるが、ボレリア ヘルムシーのような密接
に関連した細菌の核酸配列とはハイブリダイズできない
核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触さ
せる工程を含み、該標的核酸配列は： から成るより選択される配列に実質的に対応する。

本発明はまた、ストリンジェントハイブリダイゼーシ
ョン条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイ
ゼーション条件下でボレリア16Sリボソーム核酸配列と
ハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの
核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブと接触させることによりボ
レリア微生物の存在を検出する方法を企図しており、該
標的核酸配列は： から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。

一般に、本発明はストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件下でボレリア23Sリボソーム核酸とハ
イブリダイズできるが、密接に関連した微生物からの核
酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブと接触させることによりボレ
リア微生物の存在を検出する方法を企図しており、該標
的核酸配列は： から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。

本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条
件下、試験試料はストリンジェントハイブリダイゼーシ
ョン条件下でボレリア16Sリボソーム核酸配列とハイブ
リダイズできるが、ボレリア ブルグドルフェリおよび
他のライム病関連ボレリアのような密接に関連した微生
物からの核酸とはハイブリダイズできない核酸ハイブリ
ダイゼーションアッセイプローブと接触させることによ
りボレリア ヘルムシー微生物の存在を検出する方法を
企図しており、該標的核酸配列は： から成る群より選択される配列に実質的に対応するヌク
レオチド配列を持っている。

本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条
件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーシ
ョン条件下でボレリア23Sリボソーム核酸配列とハイブ
リダイズできるが、ボレリア ブルグドルフェリおよび
他のライム病関連ボレリアのような密接に関連した微生
物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイ
ブリダイゼーションアッセイプローブと接触させること
によりボレリア ヘルムシー微生物の存在を検出する方
法を企図しており、該標的核酸配列は： から成る群より選択される配列に実質的に対応する。

本発明はまた、ストリンジェントハイブリダイゼーシ
ョン条件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイ
ゼーション条件下でライム病関連ボレリア16Sリボソー
ム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した
微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸
ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる
ことによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出す
る方法を企図しており、該標的核酸配列は： から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。

最も好適であるのはストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア16Sリボ
ソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連
した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない
核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触さ
せることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検
出する方法であり、該標的核酸配列は： から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。

本発明はストリンジェントハイブリダイゼーション条
件下、試験試料をストリンジェントハイブリダイゼーシ
ョン条件下でライム病関連ボレリア23Sリボソーム核酸
配列とハイブリダイズできるが、密接に関連した微生物
からの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイプローブと接触させることに
よりライム病関連ボレリア微生物の存在を検出する方法
を企図しており、該標的核酸配列は： から成る群より選択される配列に実質的に対応してい
る。

最も好適であるのはストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件下、試験試料をストリンジェントハイブリ
ダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア23Sリボ
ソーム核酸配列とハイブリダイズできるが、密接に関連
した微生物からの核酸配列とはハイブリダイズできない
核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触さ
せることによりライム病関連ボレリア微生物の存在を検
出する方法であり、該標的核酸配列はヌクレオチド配
列： に実質的に対応している。

本発明はまた、最初にボレリア核酸の一部を増幅し、
次に随意に本発明のハイブリダイゼーションアッセイプ
ローブを用いて本発明のプライマーにより増幅された特
異的ボレリア核酸をアッセイすることによるボレリア微
生物の検出法も企図している。増幅された核酸はゲル電
気泳動を含む多くの方法で検出できる。

好適な態様において、本発明は最初に以下の配列： の一つまたはそれ以上へ結合するまたは延長を起こすで
あろう少なくとも一つの増幅オリゴヌクレオチドで該核
酸を増幅するボレリア核酸の検出法を企図しており、こ
こで該増幅オリゴヌクレオチドは随意にRNAポリメラー
ゼにより認識されるまたはRNAポリメラーゼによる延長
の開始を促進する核酸配列を持っている。

この最初の方法工程に続いて、増幅工程で産生された
増幅核酸をストリンジェントハイブリダイゼーション条
件下、ボレリア核酸に特異的にハイブリダイズできるオ
リゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプロ
ーブで検出する。

本発明の方法で使用される増幅オリゴヌクレオチドは
随意にRNAポリメラーゼにより認識されるまたはRNAポリ
メラーゼによる延長の開始を促進する核酸配列を持って
いる。

H.診断システム 本発明はまたキットの形での診断システムも企図して
いる。本発明の診断システムには、少なくとも１回のア
ッセイに十分な量の増幅プライマーおよび／または本発
明のハイブリダイゼーションアッセイプローブを包装素
材内に包含するキットを含まれる。典型的には、キット
にはまた包装されたプライマーおよび／またはプローブ
を使用するための説明書も含まれているであろう。

診断システムのさまざまな構成要素は種々の形で提供
される。例えば、必要とされる酵素、ヌクレオチド三リ
ン酸、プライマーおよびプローブは凍結乾燥された試薬
として提供される。これらの凍結乾燥された試薬は再構
成された場合、各々の成分の適正な比を持ちアッセイに
即座に使用できる完全な混合物を形成させるために凍結
乾燥に先立って混合されているであろう。さらに、本発
明の診断システムはキットの凍結乾燥試薬再構築のため
の再構築試薬を含んでいるであろう。好適なキットにお
いて、酵素、ヌクレオチド三リン酸および酵素に必要と
される補助因子は単独の凍結乾燥試薬として提供され、
再構築された場合に本方法で使用する適切な試薬を形成
する。これらの好適なキットにおいて、凍結乾燥プライ
マー試薬もまた提供される。別の好適なキットにおいて
は凍結乾燥プローブ試薬が提供される。

典型的な包装素材には本発明のハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブまたは増幅プライマーを固定した範
囲内に保つことができるガラス、プラスチック、紙、お
よびホイルのような固体マトリックスが含まれるであろ
う。従って、例えば、包装素材から作製された包装とは
企図されたプライマーまたはハイブリダイゼーションア
ッセイプローブのマイクログラムからミリグラム量を包
含させるためのガラスバイアルであろうし、または本発
明のプローブおよび／またはプライマーが作動可能なよ
うに付着されている（すなわち、本発明の検出法に関与
できるように結合されている）マイクロタイタープレー
トであろう。

使用説明書は典型的には種々の試薬および／または試
薬の濃度を記載している明確な表現、および少なくとも
一つのアッセイ法パラメーター（例えば、試料量当たり
の試薬の相対量であろう）を含んでいる。さらに、メン
テナンス、時間、温度および緩衝液条件のような明細書
も含まれているであろう。

本発明は本発明の組成物のオリゴヌクレオチドを含む
診断システムまたはキットを企図している。本発明はま
た、本発明の方法を実施するのに必要なオリゴヌクレオ
チドを含む診断システムまたはキットを企図している。

本発明は： から成る群より選択される核酸配列に実質的に対応して
いる核酸を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを
含む診断システムまたはキットを企図している。

本発明は： 該オリゴヌクレオチドが である場合： 該オリゴヌクレオチドが である場合： または、該オリゴヌクレオチドが である場合： から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸
配列を持つ少なくとも一つのヘルパープローブを随意に
持つ診断システムまたはキットを企図している。

本発明は、随意にRNAポリメラーゼにより認識され
る、またRNAポリメラーゼによる開始または延長を促進
する５′配列を持つ： から成る群より選択される核酸配列に実質的に対応して
いる核酸を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを
含む診断システムまたはキットを企図している。

本発明は： 該二つのオリゴヌクレオチドが： から選択される場合は： または、該オリゴヌクレオチドが から選択される場合は： から選択される核酸配列に実質的に対応する核酸配列持
つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを随意に持つ診
断システムまたはキットを企図している。

本発明は以下の配列： に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。

本発明は以下の配列： に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。

本発明は以下の配列： 実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを
含む診断システムまたはキットを企図している。

本発明は以下の配列： に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。

本発明は以下の配列： に実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
を含む診断システムまたはキットを企図している。

実施例： 本発明の異なった特色および態様を例示するために以
下に実施例が提供される。これらの実施例は開示された
発明を制限することを意図しているものではない。

ボレリア ブルグドルフェリを含むライム病関連ボレ
リアに対して特異的なプローブは報告および決定されて
いる16Sおよび23S rRNA配列から同定された。系統発生
的に近い近縁種B.ヘルムシー、B.トゥリカテ、B.アンセ
リナおよびB.コリアセエからの核酸配列は変異領域を同
定するためにB.ブルグドルフェリの核酸配列との比較に
使用された。

以下のハイブリダイゼーションアッセイプローブ配列
は以下の実施例に特徴が示されている：配列ID番号:1、
配列ID番号:2および配列ID番号:21はB.ブルグドルフェ
リに方向付けられており、および配列ID番号:10および2
2はB.ヘルムシーに方向付けられている。

プローブはArnoldら（上記文献“ヌクレオチドプロー
ブのための非ヌクレオチド結合剤”）により記載されて
いるように非ヌクレオチドリンカーで合成され、次にAr
noldら（上記文献、米国特許第5,185,439号）により記
載されているように化学発光性アクリジニウムエステル
で標識された。ライム病関連ボレリアに対する反応性お
よび特異性はArnoldら（上記文献、“均質保護アッセ
イ”）およびArnoldら（Clin.Chem.35:1588（1989）、
本明細書において援用される）により記載されているよ
うな均質アッセイフォーマットを用いて示された。結果
はルミノメーターにより検出された光子計測の相対的光
ユニット（RLU）として与えられた。プローブは細胞溶
解物の核酸または標的増幅反応の生成物とハイブリダイ
ズされた。以下の実施例はボレリア ブルグドルフェリ
を含むライム病関連ボレリアを標的とするハイブリダイ
ゼーションアッセイプローブおよび増幅オリゴヌクレオ
チド、およびハイブリダイゼーションおよび増幅／ハイ
ブリダイゼーションアッセイにおけるそれらの使用を記
載している。

実施例1. 16S rRNAを標的とするプローブを用いたラ
イム病関連ボレリアの検出 この実施例はB.ブルグドルフェリからのライム病関連
ボレリア核酸を直接検出するために（しかしB.ヘルムシ
ーは検出しない）ライム病関連ボレリア16S rRNAを標
的としたプローブの能力を例示している。プローブ溶液
は配列、配列ID番号:1で合成されたアクリジニウムエス
テル標識プローブおよび配列ID番号:3および配列ID番
号:5を持つ対応する非標識ヘルパーオリゴヌクレオチド
を含んでいる。配列ID番号:1からなるプローブの標的配
列はライム病関連ボレリア群を示す株で同一になるよう
に選択され、従ってこのプローブはライム病に関連する
三つすべての亜種または種（VS461、B.ブルグドルフェ
リ センス ストリクチュおよびB.ガリニー）を検出す
ることが期待される。

B.ブルグドルフェリ、B.ヘルムシーおよび大腸菌16S
の領域を整列させたものが以下に示されており、点は配
列における類似点を示している： 以下の実験において、細胞溶解物から放出された核酸が
直接アッセイされた。溶解物を調製するための方法の例
はMurphyら（EPO公開番号第288618号、本明細書におい
て援用される）により提供されている。各々の細胞の50
μｌおよび100mMコハク酸リチウム pH5、２％（w/v）
ラウリル硫酸リチウム、1.2M塩化リチウム、20mMエチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）、およびエチレングリコール
ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）N,N,N′,N′四
酢酸（EGTA）を含む50μｌのプローブ溶液を混合し、60
℃で20分インキュベートし、続いて0.3mlの0.15M四ホウ
酸ナトリウムpH8.5、１％トリトンＸ−100を加え、60℃
で15分間インキュベートした。反応液を冷却し、0.1％
過酸化水素を含む1mM硝酸の自動注入、続いての1M水酸
化ナトリウム溶液の注入後、ハイブリダイズしたアクリ
ジニウムエステル標識プローブからの残存する化学発光
をルミノメーターで測定した。結果は相対的光ユニット
またはRLUで与えられた。配列ID番号:58−63を含むヘル
パーオリゴヌクレオチドとともに全細菌／酵母プローブ
混合物が細菌核酸の存在を示すために対照として使用さ
れた。Hoganら（上記文献、“非ウイルス生物体の検出
および／または定量のための核酸プローブ”と題され
た）は適した全細菌／酵母プローブ混合物の例を与えて
いる。データは、プローブはライム病関連ボレリア種ボ
レリア ブルグドルフェリとハイブリダイズし、それを
その密接な系統発生学的近縁種ボレリア ヘルムシーと
区別していることを示している。

実施例2. 増幅に続いてのオリゴヌクレオチドプローブ
を用いるボレリア生物体の検出 少数のボレリア生物体の検出はハイブリダイゼーショ
ンによるアッセイに先だってのrRNAまたはrDNAの増幅に
より促進できる。この実験において、約30,000生物体か
らの精製B.ブルグドルフェリDNAがB.ブルグドルフェリr
RNA配列と相補的または相同なオリゴヌクレオチドで増
幅された。一つの増幅オリゴヌクレオチドは３′末端の
配列ID番号:7および５′末端のT7プロモーター配列配列
ID番号:43から合成されたプロモーター−プライマーか
ら成り（以後プロモーター−プライマーはその標的結合
領域の配列ID番号で同定されるであろう）、および第二
のオリゴヌクレオチドは配列、配列ID番号:8または９の
プライマーから成っている。増幅混合物は50mMトリスHC
l、pH8.5、40mM酢酸カリウム、6mM GTP、6mM ATP,2.5
mM UTP、2.5mM CTP、0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2
mM dCTP、0.2mM dGTP、17.5mM MgCl₂、10mM ジチオ
スレイトール、10％（v/v）グリセロール、2mMスペルミ
ジン、30ピコモルのプロモーター−プライマー配列ID番
号:7および30ピコモルのプロモーター−プライマー配列
ID番号:8または９を100μｌの最終容量に含んでいた。
混合物は95℃で８分加熱し、42℃まで冷却して900単位
のMMLV逆転写酵素（RT）および400単位のT7 RNAポリメ
ラーゼを添加した。42℃で２時間インキュベーション
後、増幅反応液の20μｌが非標識ヘルパー配列ID番号:3
および５を持つ配列ID番号：のアクリジニウムエステル
標識プローブとのハイブリダイゼーションによりアッセ
イされた。二回の反応の結果が報告されている。

これらのデータは、ボレリアRNAに相補的な配列ID番
号:1のプローブはrRNA配列の直接的検出または増幅生成
物の検出に使用してもよいことを示している。これらの
結果は、配列ID番号:7（５′末端に配列ID番号:43を加
えて）および配列ID番号:8かまたは９を持つプライマー
の組はB.ブルグドルフェリ核酸を増幅できることを示し
ている。配列ID番号:9がより有効な負のセンスプライマ
ーであることも明かである。

実施例３ 16S rRNA配列へハイブリダイズするプライ
マーを用いるボレリア核酸の増幅 この実施例において、ボレリアからの核酸が16Sリボ
ソームRNA配列に相補的または相同的なプライマーで増
幅された。B.ブルグドルフェリまたはB.ヘルムシー細胞
からの溶解物がRNAの保存領域へ方向付けられたプロー
ブによるハイブリダイゼーションにより定量された。RN
Aは希釈され、30ピコモルの５′末端に配列、配列ID番
号:43を持つ配列ID番号:8のプロモーター−プライマー
および30ピコモルのプライマー配列ID番号:7を含む反応
混合物へ加えられた。最終反応条件は、100mMトリスHC
l、pH8.5、35mM塩化カリウム、4mM GTP、4mM ATP、4m
M UTP、4mM CTP、0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM
dCTP、0.2mM dGTP、20mM MgCl₂、10mM ジチオスレ
イトール、10％（v/v）グリセロール、2mMスペルミジン
であった。混合物は95℃で５分加熱し、42℃まで冷却し
て800単位のMMLV RTおよび400単位のT7 RNAポリメラ
ーゼを添加した。42℃で２時間インキュベーション後、
反応液の20μｌが、15mMのアルドリチオール存在下、配
列、配列ID番号:2で合成されたプローブ、および配列ID
番号:4および６の非標識ヘルパープローブを用いて実施
例１に記載したようにハイブリダイゼーションによりア
ッセイされた。結果はプライマーでのボレリア ブルグ
ドルフェリ核酸の増幅は成功し、少量のボレリアrRNAの
検出を可能にした。大過剰のB.ヘルムシー核酸存在下で
さえも有意な交差反応は観察されなかった。３回の反応
の結果が報告されている。

実施例４ ハイブリダイゼーションアッセイプローブ番
号２および10を用いるボレリアの増幅および検出 この実施例においては、増幅は実施例３のように実行
されるが、ただし配列ID番号:8のプロモーター−プライ
マー（配列ID番号:43の５′プロモーター配列を持つ）
および配列ID番号:11のプライマーが使用され、および
配列ID番号:10のプローブが使用された。この実施例で
使用されたアクリジニウムエステル標識プローブおよび
非標識ヘルパープローブは表に示されている。これらの
データは、これらのプライマーがB.ブルグドルフェリお
よびB.ヘルムシーrRNA配列の両方を増幅でき、プローブ
は開示されたアッセイシステムで二つの生物体間を区別
したことを示している。

実施例５ 23SリボソームRNAへ方向付けられたプローブ
を用いるボレリアの検出 B.ブルグドルフェリの23S rRNA配列は報告されてい
る、J.Clin.Microbiol.30:3082（1992）およびJ.Baoter
iol.174:3766−3774（1992）。ボレリア23S rRNA配列
へ方向付けられた特異的プライマーおよびプローブを設
計するため、密接に関連した生物体の配列が必要とされ
た。ボレリア ヘルムシー、ボレリア コリアセエおよ
び ボレリア トゥリカテをBSK Ｈブロス（Sigma）中
で数日増殖させ、ペレット化し、50mMトリスHCl pH8.0
に再懸濁した。DNAは溶解に続いてトリスHCl［pH8.0］
で平衡化したフェノール中に調製された。最終生成物は
エタノール沈澱により単離した。23S rDNA配列の５′
および３′部分をポリメラーゼ連鎖反応およびAmpliTaq
ポリメラーゼ（Perkin−Elmer）を用いて、ボレリア種
の保存領域またはB.ブルグドルフェリ特異的配列に方向
付けられたプライマーで増幅した。精製アンプリコンは
³⁵S−dNTP取り込みを用い、Promege（fmolキット）また
はNew England Biolabs（サーカムベントキット）か
らの市販品として入手可能なキットを使用して配列決定
した。得られた配列は報告されているボレリア ブルグ
ドルフェリ配列（Gen−Bank寄託番号M88330、J.Clin.Mi
crobiol.30:3082（1992）およびJ.Bacteriol.174:3766
−3774（1992））と比較した。B.ブルグドルフェリがB.
ヘルムシーおよびB.トゥリカテから変異している特異的
配列が23Sプローブ設計のために選ばれた。この領域は
大腸菌の塩基1478−1500に対応し、B.ヘルムシーおよび
B.トゥリカテはこの領域に同一のヌクレオチド配列を持
っていたが、B.ブルグドルフェリでは４塩基変化してい
た。一つのプローブがB.ブルグドルフェリに設計され、
第二のプローブはB.ヘルムシーおよびB.トゥリカテに設
計された（配列ID番号:22）。rRNA配列は以下に示され
ている： 増幅効率およびプローブ特異性を示すため、以下の実験
が実施さた。7mlの培養物を0.75mlの10mM Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−システイン、2mM EDTA、40mMトリスHCl pH8
を含む0.75mlの溶液を再懸濁し、60℃で５分間加熱する
ことにより細胞溶解物をB.ブルグドルフェリ株N40およ
びB.トゥリカテの培養物から調製した。各々の試料中の
核酸の量を定量すため、実施例１に記載したように異な
った量の試料およびボレリア23S rRNAの保存領域に方
向付けられたプローブとハイブリダイゼーションを実施
した。得られた値は既知の標品の結果と比較した。

B.ブルグドルフェリまたはB.トゥリカテ溶解物中の既
知量の核酸を、30ピコモルの５′プロモーター配列（配
列ID番号:43）および配列ID番号:19かまたは配列ID番
号:20の３′標的ハイブリダイゼーション領域で合成し
たプロモーター−プライマーおよび配列ID番号:18を持
つプライマーを含む100μｌの反応液で増幅した。溶解
物は適当な濃度に水で希釈し、プライマーおよびプロモ
ーター−プライマーを含む溶液に加え、95℃で15分加熱
した。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（MMLV
RT）900単位および400単位のT7 RNAポリメラーゼを
加えた。最終増幅混合物は50mMトリスHCl、pH8.5、35mM
塩化カリウム、4mM GTP、4mM ATP、4mM UTP、4mM C
TP、1mM dATP、1mM dTTP、1.2mM dCTP、1mM dGTP、
20mM MgCl₂、20mM Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、
５％グリセロールを含んでいる。42℃で２時間インキュ
ベーション後、全100μｌの増幅反応液を配列ID番号:21
のアクリジニウムエステル標識プローブによるハイブリ
ダイゼーションでアッセイした。ハイブリダイゼーショ
ンは0.05Mコハク酸リチウム pH5、0.6M LiCl、１％
（w/v）ラウリル硫酸リチウム、10mM EDTA、および10m
M EGTAを含む200μｌの溶液中、60℃で10分間で実施
し、続いて300μｌの0.15M四ホウ酸ナトリウムpH8.5、
１％トリトン^RX−100を加えた。この混合物は60℃で15
分間インキュベートし、室温まで冷却した。各々のチュ
ーブの残存化学発光を、1mM硝酸および0.1％過酸化水素
の自動注入、続いて1Nの水酸化ナトリウムを注入装置を
備えた続いてGen−Probe LEADER^R Ｉルミノメータで
アッセイした。結果はRLUで示されている。

別の実験において、配列、配列ID番号:19を持つオリ
ゴヌクレオチドがプライマーとして使用された。配列ID
番号:18および19および配列ID番号:23および19を持つプ
ライマーはB.ブルグドルフェリ株B21およびBN40両方のr
RNA配列を増幅することが示された（データは示されて
いない）。

実施例６ 23S rRNAへ方向付けられたハイブリダイゼ
ーションアッセイプローブを用いるボレリア ヘルムシ
ーの特異的検出 この実施例においては、B.ヘルムシーに対するプロー
ブの特異性が示される。B.ブルグドルフェリ、B.ヘルム
シーおよびB.トゥリカテは23S rRNA核酸配列レベルで
非常に密接に関係している。B.ブルグドルフェリ23S r
RNAプローブのように、23S rRNAの同一の領域でB.ヘル
ムシーおよびB.トゥリカテの両方を検出するようにプロ
ーブが設計された。B.ブルグドルフェリまたはB.ヘルム
シー/B.トゥリカテ配列の両方を含む二つの合成標的が
合成され、各々の標的がハイブリダイゼーションが55℃
で15分実施されることを除いて前記の条件下で配列ID番
号:22のプローブとハイブリダイズさせた。0.15M四ホウ
酸ナトリウムpH8.5、１％トリトン^RX−100を含む300μ
ｌの溶液を加えた後、反応液は55℃で５分インキュベー
トされた。試料は上記のようにルミノメーターで読みと
られた。結果は、本プローブはB.ブルグドルフェリ配列
からB.ヘルムシー配列を区別できることを示している。

実施例７ 23S rRNAハイブリダイゼーションアッセイ
プローブを用いるボレリアの増幅および検出 次に、B.トゥリカテ核酸の増幅および検出が示され
る。B.トゥリカテ細胞溶解物は30ピコモルの配列、配列
ID番号:18から合成されたプライマーおよび30ピコモル
の５′配列、配列ID番号:43および３′標的ハイブリダ
イゼーション領域配列ID番号:19を持つプロモーター−
プライマーで増幅された。全増幅反応液は2.5ピコモル
の非標識ヘルパープローブ配列ID番号:23の存在下、配
列ID番号:22のプローブを用い、55℃で15分ハイブリダ
イズされ、0.15M四ホウ酸ナトリウムpH8.5、１％トリト
ン^RX−100を加え、ルミノメーターで読みとられた。B.
ヘルムシーと同一の信号が予期され、なぜなら、23S r
RNAのこの領域は二つの生物体の配列が同一であるから
である。

実施例８ 血液中に観察される微生物存在下でのボレリ
アの特異的増幅および特異的検出 プライマー配列ID番号:18および３′末端に配列ID番
号:20を持つプロモーター−プライマーが血液単離物に
観察されることが予期される一団の生物体から調製され
る細胞溶解物の増幅に使用された。各々の細胞溶解物か
ら少なくとも3x10^-19モルのrRNAがヌクレオチド配列配
列ID番号:21（表８）または配列ID番号:22（データは示
されていない）で合成されたプローブで試験された。両
方のプローブとも非ボレリア種との交差反応は観察され
なかった。配列ID番号:22のプローブはB.トゥリカテ培
養物で強い信号を与え（＞2,000,000RLU）、B.トゥリカ
テ細胞の存在が確認された。配列ID番号:21による検出
の結果は下記の表に示されている。

上記のデータは本明細書で開示および請求された新規
増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブはボレリアrRNA
配列を増幅できおよびライム病関連ボレリア（ボレリア
ブルグドルフェリ）を他の細菌およびボレリア属の他
の構成菌から区別できることが確認された。

実施例９ 16Sリボソームプローブを用いるボレリアの
増幅および特異的検出 16Sリボソーム核酸に特異的なハイブリダイゼーショ
ンアッセイプローブ配列ID番号:1がボレリア存在を検出
するため、およびこのハイブリダイゼーションアッセイ
プローブが血液中に普通に観察される他の生物体と交差
反応しないことを決定するために使用された。ハイブリ
ダイゼーションプローブは細胞溶解物中で、ヘルパーオ
リゴヌクレオチド配列ID番号:3および５の存在下、ボレ
リア核酸にハイブリダイズされた。アッセイは上記実施
例１に記載されたように直接ハイブリダイゼーションフ
ォーマットを用いて実施された。各々の試料中のリボソ
ームrRNAの存在は試料を全細胞プローブおよびヘルパー
オリゴヌクレオチド配列ID番号:58、59、60および61、
または真菌プローブおよびヘルパープローブ配列ID番
号:62および63とハイブリダイズすることにより確認さ
れた。このアッセイでは、30,000相対的光ユニット（RL
U）より大きな値は陽性と考えられる。このアッセイの
結果は下記表９に示されている。

実施例10 三つの異なった系統発生学的群からのライム
病関連ボレリアの増幅および検出 報告されている配列は異なったライム病関連ボレリア
間のプローブ配列ID番号:2により標的とされる部位にrR
NA配列の保存が示されている。以下のデータは本発明の
プライマーおよびプローブが、ライム病に関連したボレ
リアの三つの系統発生学的グループ化を示す一つ以上の
地理的場所からの単離物の増幅および検出に有用である
ことを示している。溶解物はB.ブルグドルフェリ株N40
（グループＩ）、B.ガリニー株IP−90（ロシア単離物）
および株014A（NBS16）（グループII）およびB.アフゼ
リー株IP−３（ロシア単離物）および株09A（ACA1、ス
エーデン単離物）からの培養物から、約15mlの培養液か
らの細胞を30mMリン酸ナトリウム、pH6.8、1mM EDTA、
1mM EGTAおよび３％（w/v）ラウリル硫酸リチウムを含
む0.1mlの溶液に再懸濁することにより調製される。各
々の溶解物中の核酸量を定量するため、異なった量の溶
解物および23S rRNA保存領域に方向付けられたプロー
ブでハイブリダイゼーションを実施した。得られた値は
既知の標品の結果と比較された。既知の量のB.ブルグド
ルフェリ、B.ガリニーおよびB.アフゼリー溶解物（約＝
3x10−19モルのRNA）は、配列ID番号:8の３′標的ハイ
ブリダイズ領域（B.ブルグドルフェリ16S rRNAと相補
的）の50ピコモルのプライマー、および配列ID番号:11
のrRNAとして同じセンスのプライマー、および50mMトリ
スHCl、pH8、25mM KCl,2mM MgCl₂,2.5U AmpliTaqポ
リメラーゼ（Perkin−Elmer）を含むポリメラーゼ連鎖
反応により増幅された。反応液は95℃で２分間加熱し、
次に55℃１分、72℃１分、95℃0.5分のサイクルを35回
行い、続いてアッセイまでに４℃に冷却する。アガロー
スゲル電気泳動は、三つすべての系統発生学的群からの
核酸はエチジウムプロミド染色により検出可能な175塩
基対断片を産生した。B.アフゼリー株09A核酸を含む試
料の配列ID番号:2アクリジニウムエステル標識プローブ
への56℃でのハイブリダイゼーションはこのプローブで
の陽性信号を明らかにした（バックグラウンドの少なく
とも19倍）。B.ブルグドルフェリ、B.ガリニー株IP−90
または株014AまたはB.アフゼリー株IP−３核酸は60℃で
ハイブリダイズさせた場合、少なくともバックグラウン
ドの178倍の信号を与えた。B.アフガリー098株は他の単
離物よりも低いハイブリダイゼーション信号を与えた
が、しかし、バックグラウンドを制して明らかに検出さ
れた。

実施例11 56℃でのライム病関連ボレリアの特異的増幅
および検出 この実施例では、配列、配列ID番号:8から合成された
30ピコモルのプロモーター−プライマーおよび配列ID番
号:11のプライマーを含む100μｌの反応液が使用され
た。溶解物は水で適した濃度に希釈され、プロモーター
プライマーを含む溶液に加えられ、95℃で15分加熱し、
５分で42℃まで冷却した。モロニーマウス白血病ウイル
ス逆転写酵素（MMUV RT）90単位、および400単位のT7R
NAポリメラーゼを加えた。最終増幅混合物は50mMトリス
HCl、pH8.5、35mM塩化カリウム、4mM GTP、4mM ATP、
4mM UTP、4mM CTP、1mM dATP、1mM dTTP、1.2mM d
CTP、1mM dGTP、20mM MgCl₂、20mM Ｎ−アセチル−
Ｌ−システイン、５％グリセロールを含んでいる。42℃
で２時間インキュベーション後、全100μｌの増幅反応
液を配列ID番号:2のアクリジニウムエステル標識プロー
ブおおび非標識ヘルパープローブ配列ID番号:4および６
または配列ID番号:10と非標識ヘルパー配列ID番号:4お
よび６によるハイブリダイゼーションでアッセイした。
ハイブリダイゼーションは0.05Mコハク酸リチウム pH
5、0.6M LiCl、１％（w/v）ラウリル硫酸リチウム、10
mM EDTA、および10mM EGTAを含む200μｌの溶液中、5
6℃で15分間で実施し、続いて300μｌの0.15M四ホウ酸
ナトリウムpH8.5、１％トリトン^RX−100を加えた。この
混合物は56℃で15分間インキュベートし、室温まで冷却
した。各々のチューブの残存化学発光を、1mM硝酸およ
び0.1％過酸化水素の自動注入、続いて1Nの水酸化ナト
リウムを注入装置を備えた続いてGen−Probe LEADER^R
Ｉルミノメータでアッセイした。結果はRLUで示され
ている。

これらのデータは温度56℃でのプローブ配列ID番号:2
のハイブリダイゼーションでもB.ブルグドルフェリおよ
びB.ヘルムシー間の明瞭な区別が可能であることを示し
ている。

実施例12 プロモーター配列を含む増幅プライマーを用
いるボレリア核酸の増幅 プライマーなしでプロモーター−プライマーのみを用
いる方式で増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブを使
用してもよい。この方式はPCT公開番号WO93/22461号に
記載されている。二つのプロモータープライマーが合成
され、各々が５′末端で標的相補的配列（配列ID番号:
8）の３′末端に共有結合で結合されたT7 RNAポリメラ
ーゼプロモーター配列、配列ID番号:43、５′−AATTTAA
TACGACTCACTATAGGGAGA−３′を含んでいる。一つのプロ
モータープライマーは遊離の３′OH基を持つように合成
され、100μｌ反応液当たり４ピコモルで使用された。
第二のプロモータープライマーは３′末端にアルカンジ
オールを持つように合成され、100μｌ反応液当たり26
ピコモルで使用された。ボレリア溶解物は水で適した濃
度に希釈され、プロモータープライマーを含む溶液に加
えられ、95℃で５分加熱し、15分で42℃まで冷却した。
モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（MMLV RT）
900単位、および400単位のT7RNAポリメラーゼを加え
た。最終増幅混合物は50mMトリスHCl、pH8.5、35mM塩化
カリウム、4mM GTP、4mM ATP、4mM UTP、4mM CTP、
1mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、1mM dGTP、20mM
UTP、4mM CTP、1mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、1m
M dGTP、20mM MgCl₂、20mM Ｎ−アセチル−Ｌ−シス
テイン、５％グリセロールを含んでいる。42℃で3.5時
間インキュベーション後、30μｌの増幅反応液を配列ID
番号:2のアクリジニウムエステル標識プローブおよび非
標識ヘルパープローブ配列ID番号:4および６によるハイ
ブリダイゼーションでアッセイした。ハイブリダイゼー
ションは0.05Mコハク酸リチウム pH5、0.6M LiCl、１
％（w/v）ラウリル硫酸リチウム、10mM EDTA、および1
0mM EGTAを含む200μｌの溶液中、60℃で15分間で実施
し、続いて300μｌの0.15M四ホウ酸ナトリウムpH8.5、
１％トリトン^RX−100を加えた。この混合物は60℃で15
分間インキュベートし、室温まで冷却した。各々のチュ
ーブの残存化学発光を、Gen−Probe LEADER^R Ｉルミ
ノメータでアッセイした。表には同一条件下、同一のプ
ロモーター配列、配列ID番号:43、５′−AATTTAATACGAC
TCACTATAGGGAGA−３′および３′標的相補的領域配列ID
番号:9を含んでいるプロモーター−プライマー対を用い
て得られたデータも示されている。100μｌ当たり遊離
３′OHを持つ４ピコモルのプロモーター−プライマーお
よび３′アルカンジオール基を持つように合成された26
ピコモルの同じプロモータープライマーが使用された。

他の態様は以下の請求の範囲内に存在する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カーター，ニック アメリカ合衆国カリフォルニア州92116, サン・ディエゴ，ノース・アベニュー 4620，アパートメント ナンバー10 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，30 （1992）ｐ．628−632 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，30 （1992）ｐ．2830−2834 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，30 （1992）ｐ．3082−3088 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ZNA ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)

Claims (24)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ボレリア属のメンバーを検出するためのハ
   イブリダイゼーションアッセイプローブであって、スト
   リンジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア
   核酸配列の少なくとも一部にハイブリダイズする10から
   100ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプローブを含
   み、該ボレリア核酸配列は： から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
   を特徴とするプローブ。
2. 【請求項２】該プローブが、該ストリンジェントハイブ
   リダイゼーション条件下、ボレリア核酸配列とは優先的
   にハイブリダイズするが、系統発生学的に密接に関連し
   た微生物の核酸とはハイブリダイズしない、請求項第１
   項に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイプロー
   ブ。
3. 【請求項３】 から成る群より選択される核酸配列を持つオリゴヌクレ
   オチドプローブと実質的に対応し、ストリンジェントハ
   イブリダイゼーション条件下でボレリア属のメンバーを
   検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイプ
   ローブ。
4. 【請求項４】請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド
   および少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチドを
   含むプローブ混合物。
5. 【請求項５】該ヘルパーオリゴヌクレオチドが10−100
   ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリン
   ジェントハイブリダイゼーション条件下、ボレリア核酸
   配列にハイブリダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオチ
   ドは： から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
   配列を持つ、請求項第４項に記載のプローブ混合物。
6. 【請求項６】該オリゴヌクレオチドが： と実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘ
   ルパーオリゴヌクレオチドが核酸配列： と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
   である、請求項第４項に記載のプローブ混合物。
7. 【請求項７】ライム病関連ボレリアを検出するためのハ
   イブリダイゼーションアッセイプローブであって、スト
   リンジェントハイブリダイゼーション条件下、ライム病
   関連ボレリア核酸配列に優先的にハイブリダイズする
   が、ボレリア ヘルムシーに存在する核酸配列とはハイ
   ブリダイズしない10から100ヌクレオチド長のオリゴヌ
   クレオチドプローブを含み、該核酸配列は： から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
   を特徴とするプローブ。
8. 【請求項８】請求項第７項に記載のオリゴヌクレオチド
   および少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチドを
   含むプローブ混合物。
9. 【請求項９】該プローブが： と実質的に対応する核酸配列を持ち、該ヘルパーオリゴ
   ヌクレオチド10−100ヌクレオチド長のオリゴヌクレオ
   チドであり、およびストリンジェントハイブリダイゼー
   ション条件下でライム病関連ボレリア核酸配列にハイブ
   リダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
   配列を持つ、請求項第８項に記載のプローブ混合物。
10. 【請求項１０】ボレリア核酸と、 から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
    核酸配列を持つオリゴヌクレオチドとの間で形成される
    核酸ハイブリッドを含む、ボレリア属のメンバーを検出
    するための組成物。
11. 【請求項１１】ボレリア核酸と、 から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
    核酸配列を持つオリゴヌクレオチドとの間で形成される
    核酸ハイブリッドを含む、ライム病関連ボレリアを検出
    するための組成物。
12. 【請求項１２】ライム病関連ボレリアの存在を検出する
    ための方法であって、ストリンジェントハイブリダイゼ
    ーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリ
    ダイゼーション条件下でライム病関連ボレリア標的23S
    核酸配列とはハイブリダイズできるが、ボレリア ヘル
    ムシーからの核酸配列とはハイブリダイズできない核酸
    ハイブリダイゼーションアッセイプローブを接触させる
    工程を含み、該標的核酸配列は： から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
    を特徴とする方法。
13. 【請求項１３】 から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
    核酸配列を持つ少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを
    含むキット。
14. 【請求項１４】該オリゴヌクレオチドが から成る群より選択される配列に実質的に対応する核酸
    配列を持つ少なくとも一つのヘルパープローブを持つ、
    請求項第13項に記載のキット。
15. 【請求項１５】以下の配列： と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
    を含むキット。
16. 【請求項１６】以下の配列： と実質的に対応する核酸配列を持つオリゴヌクレオチド
    を含むキット。
17. 【請求項１７】ボレリア ヘルムシーを検出するための
    ハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、ス
    トリンジェントハイブリダイゼーション条件下でボレリ
    アヘルムシー核酸配列とは優先的にハイブリダイズする
    が、ボレリア ブルグドルフェリに存在する核酸配列と
    はハイブリダイズしない、10から1000ヌクレオチド長の
    オリゴヌクレオチドプローブを含み、該ボレリア ヘル
    ムシー核酸配列は： から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
    を特徴とするプローブ。
18. 【請求項１８】請求項第17項に記載のオリゴヌクレオチ
    ドおよび少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレオチド
    を含むプローブ混合物。
19. 【請求項１９】オリゴヌクレオチドが： に実質的に対応するヌクレオチド配列を持ち、かつ該ヘ
    ルパーオリゴヌクレオチドが10から100ヌクレオチド長
    のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントハイブ
    リダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー核酸配
    列とハイブリダイズし、該ヘルパーオリゴヌクレオチド
    が： から成る群より選択される配列と実質的に対応する核酸
    配列を持つ、請求項第18項に記載のプローブ混合物。
20. 【請求項２０】ボレリア ヘルムシーの存在を検出する
    ための方法であって、ストリンジェントハイブリダイゼ
    ーション条件下、試験試料とストリンジェントハイブリ
    ダイゼーション条件下でボレリア ヘルムシー標的核酸
    配列とはハイブリダイズするであろうが、ボレリア ブ
    ルグドルフェリからの核酸配列とはハイブリダイズしな
    いであろう核酸ハイブリダイゼーションアッセイプロー
    ブを接触させる工程を含み、該ボレリア ヘルムシー標
    的核酸配列は： から成る群より選択される配列と実質的に対応すること
    を特徴とする方法。
21. 【請求項２１】ボレリア ヘルムシー核酸と、 から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
    核酸配列を持つオリゴヌクレオチドとの間で形成される
    核酸ハイブリッドを含む組成物。
22. 【請求項２２】少なくとも一つのヘルパーオリゴヌクレ
    オチドをさらに含む、請求項第21項に記載の組成物。
23. 【請求項２３】 から成る群より選択される配列と実質的に対応するヌク
    レオチド配列を持つ第二のオリゴヌクレオチドをさらに
    含み、ここで該ヘルパーオリゴヌクレオチドは： から成る群より選択される核酸配列と実質的に対応する
    オリゴヌクレオチドである、請求項第22項に記載の組成
    物。
24. 【請求項２４】さらにヘルパープローブを含む、請求項
    10に記載の組成物。